Artykuł metodologiczny

Polimeryzacja anionowa kopolimeru amfifilowego do otrzymywania miceli kopolimeru blokowego stabilizowanego oddziaływaniami π-π stacking

DOI:

10.3791/54422

⸱

10 października 2016

 ,  , 
1Leslie Dan Faculty of Pharmacy, University of Toronto

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kluczowe etapy żywej anionowej polimeryzacji eteru fenyloglicydylowego (PheGE) na glikolu metoksy-polietylenowym (mPEG-b-PPheGE) są opisane. Otrzymane micele kopolimeru blokowego (BCM) obciążono doksorubicyną w 14% (wag.) i uzyskano trwałe uwalnianie leku przez 4 dni w fizjologicznie istotnych warunkach.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym badaniu, amfifilowy kopolimer, który zawiera blok tworzący rdzeń z grupami fenylowymi, został zsyntetyzowany przez żywą anionową polimeryzację eteru fenyloglicydylowego (PheGE) na glikolu metoksy-polietylenowym (mPEG-b-PPheGE). Charakterystyka kopolimeru ujawniła wąski rozkład molekularny (PDI < 1,03) i potwierdziła stopień polimeryzacji mPEG122-b-(PheGE)15. Krytyczne stężenie miceli w kopolimerze oceniano przy użyciu ustalonej metody fluorescencji z zachowaniem agregacji ocenianym za pomocą dynamicznego rozpraszania światła i transmisyjnej mikroskopii elektronicznej. Potencjał kopolimeru do wykorzystania w aplikacjach związanych z dostarczaniem leków został wstępnie oceniony, w tym w zakresie biokompatybilności in vitro, ładowania i uwalniania hydrofobowego leku przeciwnowotworowego doksorubicyny (DOX). Przygotowano stabilną formułę miceli DOX o poziomie obciążenia lekiem do 14% (wag.), skuteczności ładowania leku > 60% (w/w) i przedłużonym uwalnianiu leku przez 4 dni w fizjologicznie istotnych warunkach (kwaśne i obojętne pH, obecność albuminy). Wysoki poziom obciążenia lekiem i przedłużone uwalnianie przypisuje się stabilizowaniu interakcji π-π między DOX a blokiem tworzącym rdzeń miceli.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W środowisku wodnym, amfifilowe kopolimery blokowe łączą się, tworząc nano-rozmiarowe micele kopolimeru blokowego (BCM), które składają się z hydrofobowego rdzenia otoczonego hydrofilową powłoką lub koroną. Rdzeń miceli może służyć jako zbiornik do wprowadzania leków hydrofobowych; Podczas gdy korona hydrofilowa zapewnia interfejs między rdzeniem a ośrodkiem zewnętrznym. Poli(glikol etylenowy) (PEG) i jego pochodne są jedną z najważniejszych klas polimerów i jedną z najczęściej stosowanych w formulacjach leków. 1-3 BCM okazały się godną platformy dostarczania leków, a kilka preparatów opartych na tej technologii znajduje się obecnie w późnej fazie rozwoju klinicznego. 4 Najczęściej hydrofobowy blok kopolimeru składa się z polikaprolaktonu, poli(D,L-laktydu), poli(tlenku propylenu) lub poli(β-benzylo-L-asparaginianu). 5-9

Grupa Kataoki badała sferyczne micele utworzone z PEO-b-PBLA i poli(tlenku etylenu)-b-(doksorubicyny sprzężonej z kwasem poliasparaginowym) do dostarczania doksorubicyny (DOX). 10,11 W swoich raportach twierdzą, że interakcje π-π między lekiem sprzężonym z polimerem lub PBLA a wolnym DOX działają stabilizująco na rdzeń micelowy, powodując wzrost obciążenia i retencji leku. Ustalono, że kompatybilność lub interakcje między lekiem a blokiem tworzącym rdzeń są determinantami kluczowych parametrów związanych z wydajnością. 12 Oprócz DOX wiele leków przeciwnowotworowych obejmuje pierścienie aromatyczne w swojej podstawowej strukturze (np. metotreksat, olaparyb, SN-38).

W rezultacie istnieje duże zainteresowanie syntezą kopolimerów, które zawierają pierścienie benzylowe w swoich blokach tworzących rdzenie. Polimeryzacja anionowa PEG i jego pochodnych z otwarciem pierścienia umożliwia kontrolę masy cząsteczkowej i skutkuje materiałami o niskiej polidyspersyjności przy dobrej wydajności. Pytania z kategorii 13,14 Tlenek etylenu z eterem fenyloglicydowym (PheGE) lub tlenkiem styrenu (SO) może być (ko)polimeryzowany w celu utworzenia kopolimerów blokowych, które tworzą micele do rozpuszczania leków hydrofobowych. 15-18 W niniejszym raporcie opisano niezbędne etapy żywej polimeryzacji anionowej monomeru eteru fenyloglicydylowego na mPEG-OH jako makroinicjatorze (Rysunek 1). Otrzymany kopolimer blokowy i jego agregaty są następnie charakteryzowane pod względem właściwości istotnych do wykorzystania w dostarczaniu leków.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-protocol-1
Rysunek 1. Schemat przedstawiający dziewięć kluczowych etapów syntezy kopolimeru mPEG-b-PPheGE. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

1. Przygotowanie odczynników w warunkach bezwodnych

  1. Przygotowanie odczynników.
    1. Odważyć 15 g mPEG-5K (Mn=5,400 g/mol, PDI 1.03) i umieścić w temperaturze 50 °C w piecu próżniowym na 48 hr przed użyciem.
    2. Osuszyć 200 ml dimetylosulfotlenku (DMSO) nad wodorkiem wapnia (CaH2) (~1 g), poddać działaniu próżni przez 30 min, przepłukać argonem i mieszać przez 48 hr przed użyciem.
    3. Wlać 50 ml monomeru PheGE do suchej i czystej kolby (100 ml), dodać 1 g CaH2, zamknąć pod próżnią na 15 min w lodzie, przepłukać argonem i pozostawić do mieszania przez 24 hr w atmosferze argonu przed użyciem.

2. Przygotowanie naftalenu potasowego

  1. Ostrożnie odciąć małe kawałki sodu (~ 1,5 g) osuszonego heksanem w celu usunięcia nadmiaru oleju mineralnego i dodać je do kolby okrągłej zawierającej tetrahydrofuran (THF) (v = 500 ml).
    UWAGA: Kawałki sodu nie mogą być długo wystawione na działanie powietrza ze względu na ryzyko pożaru.
  2. Dodać benzofenon (~5 g), przepłukać argonem i zamknąć kolbę okrągłą (dwuszyjkową) szklanymi korkami.
  3. Po mieszaniu pod osłoną argonu przez 24 h, podłączyć kolbę okrągłodenną do zestawu do destylacji (Rycina 2), destylować ciemny roztwór pod osłoną argonu podczas cofania (t.j. gotować z chłodnicą zwrotną przez około 2 h po tym, jak roztwór stanie się niebieski). Rozpocząć pobieranie pożądanej objętości ~ 150 ml THF poprzez zamknięcie lewego zaworu (znajdującego się w środku aparatu do destylacji).
    UWAGA: Jeśli roztwór nie stanie się niebieski, należy przerwać destylację, schłodzić go do temperatury pokojowej (RT) i dodać więcej benzofenonu lub sodu, a następnie wznowić destylację. Jest to sygnał, że THF nadal zawiera wodę.
  4. Do suchej kolby Erlenmeyera dodać destylowany THF (v = 100 ml) i rozpuścić 3,9 g naftalenu.
    UWAGA: Należy przerwać destylację, schłodzić do RT i otworzyć prawy zawór, aby przenieść objętość THF.
  5. Zgodnie z opisem w punkcie 2.1, odciąć małe kawałki potasu (1,1 g) i dodać je do roztworu zawierającego naftalen (stężenie końcowe ~0,3 mol/L). Zamknąć kolbę Erlenmeyera adapterem do przepłukiwania (T) (on/off) z septem na górze i przepłukać argonem.
  6. Po mieszaniu pod osłoną argonu przez 24 h, uzyskany roztwór zasady potasowej naftalenu powinien mieć jednorodny, ciemnozielony kolor.
  7. W warunkach obojętnych, pobrać strzykawką 5 ml alikwotu roztworu zasadowego z kolby i dodać do 10 ml wody destylowanej. Następnie dodać do roztworu 1-2 krople wskaźnika fenoloftaleinowego, co spowoduje zabarwienie roztworu na kolor fuksjowy.
  8. Za pomocą biurety miareczkować roztwór potasowej zasady naftalenu standardowym roztworem kwasu solnego (0,1 N) aż do momentu odbarwienia roztworu.

3. Materiały i niezbędne środki ostrożności dla efektywnej żyjącej polimeryzacji anionowej

  1. Układ kolektora argon/próżnia.
    UWAGA: Jak opisano w Rysunek 2Do przełączania między doprowadzaniem argonu a warunkami próżni w aparaturze szklanej wykorzystuje się podwójny kolektor szklany z pustymi w środku kurkami szklanymi.
    1. Podłączyć butlę z argonem (z manometrem) do suchej kolumny osuszającej oraz do linii rozdzielczej za pomocą obojętnych wężyków gumowych. Na drugim końcu linii argonowej podłączyć bulbulator (zawierający olej mineralny).
    2. Do szklanych kurków podłącz elastyczne rurki obojętne i igły. Do drugiej linii kolektora podłącz pułapkę szklaną zanurzoną w chłodnej kolbie Dewara (wypełnionej lodem z wodą lub ciekłym azotem), a następnie podłącz ją do pompy wysokopróżniowej.
  2. Aparatura do destylacji monomeru i DMSO.
    UWAGA: Wygodny (t. j. stosuje się aparat do destylacji wysokopróżniowej (wszystko w jednym) (Rysunek 2). Suche szkło laboratoryjne wyposażono w zawory wysokopróżniowe oraz wbudowane chłodnice z wewnętrzną chłodnicą zwrotną.
    1. Podłącz przepływ wody przez wlot (A) i wylot (B) jednostki chłodzącej (litera). Podłącz pozostały wlot/wylot (C) do podwójnego rozdzielacza argonu/próżni. Zamontuj i uszczelnij septum (druty metalowe) w porcie dozowania/ekstrakcji i podłącz stalową kaniulę do przenoszenia cieczy wrażliwych na działanie powietrza (D) (u góry/pętla).
    2. Przed polimeryzacją należy poddać destylacji PheGE oraz DMSO w półsferycznych płaszczach grzejnych w temperaturze 100 °C i 70 °Codpowiednio, przez 2 h w próżni przy mieszaniu. Temperatura wrzenia monomeru PheGE wynosi 254 °C podczas gdy temperatura wrzenia DMSO wynosi 189 °C przy (1 atm).
  3. Szkło laboratoryjne do polimeryzacji anionowej.
    1. Oprócz układu do destylacji należy stosować wyłącznie szkło odporne na wysoką próżnię, w tym kolby okrągłodenne (certyfikowane przez producenta), cylindry miarowe (do przenoszenia objętości rozpuszczalnika, zasady i monomerów), kanule, septa oraz druty metalowe do uszczelniania sept.
      UWAGA: W przypadku polimeryzacji żyjącej należy ostrożnie podgrzać (w próżni), a następnie schłodzić całe szkło laboratoryjne w strumieniu argonu przed użyciem. Opalarkę należy trzymać w odległości ok. 10 cm od szkła.

figure-protocol-2
Rycina 2. Montaż i kluczowe etapy destylacji/transferu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

4. Opis kluczowych etapów żyjącej polimeryzacji anionowej: destylacja i przenoszenie

  1. Odważyć mPEG-5K (2 mmol, 10 g) do suchej kolby/kolby Schlenka (wysuszonej w piekarniku) zawierającej mieszadło magnetyczne i zamknąć adapter do płukania (T) (on/off) od góry septem.
  2. Podłączyć kolbę do manifoldu i przepłukać ją argonem przez 2-3 min. Przekręcić zawór w pozycję próżni, aby odessać powietrze z kolby.
  3. Obracać kolbę ręcznie i homogenicznie osuszać naczynie reakcyjne za pomocą suszarki (opaliarki), aż mPEG-5K się stopi.
    UWAGA: Trzymać opaliarkę w odległości ok. 10 cm od kolby.
  4. Po 1 min przerwać próżnię, przekręcając zawór na manifoldzie w stronę pozycji argonu kilkoma szybkimi ruchami.
    UWAGA: W bulbulatorze musi być widoczny ciągły przepływ argonu. Gdy przepływ jest ciągły, zawór pozostaje w pozycji argonu. Powtórzyć etapy ogrzewania i chłodzenia dwukrotnie, aby usunąć wszelkie ślady wilgoci.
  5. Utrzymywać polimerowy makroinicjator pod próżnią przez ok. 2 h, a następnie pod argonem przed rozpoczęciem reakcji.
  6. Zamontować pod dygestorium dwa zestawy do destylacji w wysokiej próżni (Rysunek 2); jeden do destylacji DMSO, a drugi do destylacji monomeru (PheGE).
  7. Podłączyć osobne kolby zawierające DMSO i monomer do obu zestawów i umieścić każdy z nich na półsferycznym płaszczu grzejnym (lub w kąpieli olejowej). Podłączyć zimną wodę do górnej części zestawu (in/out) oraz do manifoldu (argon/vacuum).
  8. Upewnić się, że każdy zestaw jest stabilny i szczelny. Włączyć próżnię za pomocą zaworu.
    UWAGA: Zgodnie z opisem w kroku 3.3., powtórzyć etapy ogrzewania i chłodzenia dwukrotnie, aby usunąć wszelkie ślady wilgoci.
  9. Ustawić ogrzewanie za pomocą kontrolera temperatury i rozpocząć mieszanie roztworów. Po 2 h cyrkulacji/destylacji DMSO zamknąć zawór wysokiej próżni (znajdujący się w środkowej części zestawu do destylacji), aby zebrać około 20 ml roztworu (w celu przemycia wnętrza zestawu). Następnie przelać tę frakcję do kolby i powtórzyć operację jeszcze raz, aby zapewnić czystość frakcji docelowej, która zostanie zebrana później.
  10. Ogrzewać kolbę zawierającą mPEG-5K (pod próżnią) opaliarką, aż polimer (mPEG-5K) się stopi. Ponownie przepłukać argonem.
    UWAGA: Procedura ta ułatwi rozpuszczanie po przeniesieniu DMSO.
  11. Po 2 h zamknąć zawór wysokiej próżni i zebrać objętość rozpuszczalnika (VDMSO = ~ 100 ml). Wyłączyć ogrzewanie i przerwać próżnię z manifoldu. Wpuścić argon (krótkimi impulsami) do komory, jak opisano powyżej.
  12. Pod nadciśnieniem argonu podłączyć jeden koniec kaniuli (trzymając ją przy kurku zestawu) do cylindra miarowego lub bezpośrednio do kolby zawierającej mPEG-5K (jeśli zestaw do destylacji posiada podziałkę), a drugi koniec ostrożnie zanurzyć w świeżo zdestylowanej frakcji.
  13. Wykorzystując ciśnienie argonu, przetłoczyć DMSO przez kaniulę do kolby reakcyjnej. Podłączyć dodatkowy bulbulator do kolby (lub cylindra, jeśli jest on potrzebny do pomiaru) i zamknąć szklany kurek połączony z bulbulatorem po przeciwnej stronie manifoldu.
    UWAGA: Podczas usuwania jednego końca kaniuli w celu transferu, należy upewnić się, że przyłożone jest nadciśnienie argonu.
  14. Aby uniknąć wypadków spowodowanych ciśnieniem argonu, otwierać szklany kurek na 1-2 s i zamykać go ponownie, aby kontynuować przepływ DMSO (powtarzać raz co 0,5 min), aż do zakończenia pełnego transferu. Po zakończeniu ponownie otworzyć kurek.
    UWAGA: Tę samą procedurę należy teraz zastosować do destylacji i zbierania monomeru. Rozpuszczalnika i monomeru nie można zbierać jednocześnie.
  15. Przenieść 5 ml 0,3 M naftalenu potasowego za pomocą kaniulacji do cylindra miarowego zamkniętego septem z włożoną kaniulą (pętla).
    UWAGA: Należy zachować te same środki ostrożności, które opisano w UWADZE 4.13. Należy najpierw utrzymać nadciśnienie argonu od kolby z naftalenem potasowym do cylindra, a następnie z cylindra do kolby reakcyjnej, aby uniknąć zanieczyszczenia powietrzem/wodą.
  16. Włożyć drugą igłę z manifoldu do cylindra (argon). Ostrożnie usunąć kaniulę podłączoną do systemu destylacji i szybko włożyć ją do kolby reakcyjnej.
    UWAGA: Tę technikę należy stosować przy transferze zasady i monomeru.
  17. Dodawać zasadę kroplami, aż roztwór stanie się ciemny. Po powolnym zaniku koloru dodać kolejną porcję, aż ciemny kolor pojawi się ponownie i powtarzać czynność do pełnego transferu.
  18. Przenieść wymaganą objętość monomeru (VPheGE = 5 ml), aby osiągnąć stopień polimeryzacji PPheGE ~ n=18-20.
  19. Pozostawić reakcję na 48 h w temperaturze 80 °C w atmosferze argonu przy ciągłym mieszaniu, aby zapewnić pełną polimeryzację.
  20. Zatrzymać reakcję poprzez dodanie kropel HCl 1 N w metanolu (mierząc papierkiem lakmusowym (neutralne pH)) i obserwować zanik koloru.
  21. Wyekstrahować naftalen z roztworu DMSO za pomocą heksanu (3×50 ml). Usunąć DMSO poprzez destylację w próżni ~ 70 ml (tym samym zestawem). Ochłodzić zawiesinę i dodać 50 ml THF.
  22. Usunąć sól z zawiesiny poprzez wirowanie przy 5,000 x g przez 10 min. Przenieść nadsącz i dodawać kroplami do 500 ml zimnego eteru dietylowego.
  23. Zebrać osad poprzez filtrację lub wirowanie (powtórzyć dwukrotnie) i suszyć w próżni w 30 °C przez 24-48 h (wydajność 85%).
    UWAGA: Kopolimer jest teraz gotowy do charakterystyki.

5. Charakterystyka kopolimerów

  1. Odważić 5-10 mg kopolimeru (zapisać rzeczywistą masę) do aluminiowego tygla z próbką i zamknąć go hermetycznie aluminiową pokrywką. Umieścić tygiel z próbką oraz tygiel referencyjny (pusty) w różnicowym kalorymetrze skaningowym.
  2. Zaprogramować cykl metody („grzanie/chłodzenie/grzanie”): 1) grzanie od 40 °C do 100 °C z szybkością 10 °C/min, 2) chłodzenie do -70 °C z szybkością 10 °C/min, 3) grzanie do 100 °C z szybkością 10 °C/min. Powtórzyć kroki 2) i 3) dwukrotnie. Wyznaczyć temperaturę topnienia (Tm), krystalizacji (Tc), temperaturę przejścia szklistego (Tg) oraz ciepło topnienia (ΔHf) na podstawie krzywych termicznych z trzeciego cyklu (jeśli dotyczy).
  3. Rozpuścić polimery w THF (2 mg/ml) i przefiltrować przez filtr PTFE o rozmiarze oczek 0,2 µm. Wstrzyknąć próbkę (50 µl) do systemu chromatografii żelowej i wykorzystać czas retencji próbki oraz krzywą kalibracyjną sporządzoną z serii standardów polistyrenu, aby wyznaczyć masę cząsteczkową polimeru.19
  4. Rozpuścić (ko)polimery (15 mg/ml) w d6 DMSO w celu przeprowadzenia analizy spektroskopowej 1H NMR.19
  5. Wyznaczyć krytyczne stężenie miceli (CMC) kopolimeru, wykorzystując 1,6-difenylo-1,3,5-heksatrien (DPH) jako sondę fluorescencyjną.9
    1. Przygotować w ciemności roztwór zapasowy DPH w THF (2,32 mg/L) i dodać 100 µl tego roztworu zapasowego do każdego z szeregu fiolek.
    2. Przygotować roztwór zapasowy kopolimeru w THF i dodać alikwoty o tej samej objętości (2 ml) do szeregu fiolek (każda zawierająca alikwot roztworu zapasowego DPH), tak aby końcowe stężenia kopolimeru mieściły się w zakresie od 0,01 do 1000 µg kopolimeru/ml.
    3. Następnie wymieszać roztwory kopolimeru i DPH w wortexie i dodać kroplami do 10 ml wody dwukrotnie destylowanej z mieszadłem magnetycznym. Roztwory należy następnie energicznie mieszać w ciemności przez 48 h w strumieniu azotu, aby umożliwić powolne odparowanie THF. Końcowe stężenie DPH w każdym roztworze wynosi 0,232 mg/L.
    4. Zmierzyć emisję fluorescencji próbek przy 430 nm (λex = 350 nm) przy użyciu mikro płytkowego spektrofluorometru ze skanowaniem podwójnym i wykreślić zależność fluorescencji od log[polimeru]. Punkt przecięcia dwóch linii prostych wyznacza wartość CMC kopolimeru.

6. Procedura ładowania doksorubicyny do BCM

  1. Rozpuścić 12 mg DOX w 1 ml acetonitrylu, dodać 10 µl trietyloaminy i mieszać roztwór w ciemności przez 2 hr.
  2. Rozpuścić kopolimer (45 mg) w 1 ml THF i mieszać przez ten sam czas. Dodać roztwór kopolimeru do roztworu DOX, a fiolkę zawierającą pozostałości kopolimeru wypłukać dodatkową objętością THF (0.5 ml).
  3. Mieszaninę kopolimeru z lekiem (2.5 ml) dodawać kroplami do fiolki (20 ml) zawierającej 15 ml soli fizjologicznej 0.9% (NaCl) przy ciągłym mieszaniu.
  4. Przenieść roztwór do worka dializacyjnego (cut off 3.5 kDa) i dializować przeciwko soli fizjologicznej 0.9% (500 ml).
    UWAGA: Wymienić zewnętrzną sól fizjologiczną po 6 hr i kontynuować dializę przez 24 hr przy mieszaniu w ciemności w RT.
  5. Przenieść dializat do probówki 50 ml i wirować przy 5,000 x g przez 15 min.
  6. Przenieść nadsącz do systemu ultrafiltracyjnego (o pojemności 10 ml) zawierającego membranę dializacyjną (cut off 10 kDa). Włożyć adapter do mieszania do systemu ultrafiltracyjnego, zamknąć pokrywę i wystawić na strumień azotu.
  7. Skoncentrować roztwór BCM do objętości 4 ml, dodać 6 ml świeżej soli fizjologicznej i powtórzyć tę procedurę dwukrotnie.
  8. Skoncentrować roztwór BCM do 4 ml, wypłukać komorę 0.5 ml soli fizjologicznej i dodać do roztworu. Przechowywać w brązowych fiolkach w RT w ciemności do czasu dalszego użycia.

7. Ocena stopnia załadowania doksorubicyny do DOX-BCMs

  1. Rozpuścić DOX-BCM w dimetyloformamidzie (100 µl w 400 µl), aby rozbić micele, a następnie rozcieńczyć w wodnym roztworze HCl (0,1 N) przed analizą (100 µl w 900 µl HCl 0,1 N).
  2. Zmierzyć zawartość leku przy 490 nm za pomocą laboratoryjnego spektrofotometru do mikropłytek. Do wyznaczenia pojemności załadunku leku (DLC) oraz wydajności załadunku leku (DLE) zastosować następujące wzory:
    DLC (wt%) = (masa załadowanego leku / całkowita masa BCMs) x 100%
    DLE (%) = (masa załadowanego leku / masa leku w mieszaninie wyjściowej) x 100%

8. Ocena uwalniania DOX z DOX-BCMs in vitro

  1. Zbadaj uwalnianie DOX z BCM w temperaturze 37 °C w 0,1 M soli fosforanowej w buforze (PBS, pH 7,4) w porównaniu do PBS pH 7,4 zawierającego 0,1% (w/v) Tween 80, BCM + BSA (50 mg/ml) w porównaniu do PBS pH 7,4 oraz w 0,1 M buforze octanowym o pH = 5,5.20,21
  2. Rozcieńcz formulację BCM-DOX (700 µl) w wybranym buforze (2,3 ml), aby uzyskać całkowitą ilość ≈ 0,6-0,7 mg DOX w worku dializacyjnym.
  3. Umieść roztwór w worku dializacyjnym, zamknij go zaciskami i zanurz worek w 200 ml odpowiedniego medium zewnętrznego.
  4. Pobierz 2 ml roztworu z zewnątrz worka dializacyjnego w określonych punktach czasowych i zastąp go taką samą objętością świeżego buforu.
  5. Przechowuj pobrane alikwoty w temperaturze -20 °C przed analizą za pomocą spektrofotometrii UV-Vis (Abs490 nm). Skumulowany procent uwolnionego leku (Er) można obliczyć za pomocą następującego równania:
    figure-protocol-3
    UWAGA: gdzie mDOX oznacza ilość DOX w BCM, V0 to całkowita objętość medium uwalniającego (200 ml), Vt to objętość zastąpionego medium (Vt = 2 ml), Ci to stężenie przed korektą, a Cn reprezentuje stężenie DOX w próbce.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
Rysunek 3. Ilustracja polimeryzacji anionowej fenyloglicydylowego eteru na makroinicjatorze mPEG w celu otrzymania mPEG-b-(PheGE)15 do przygotowania miceli kopolimerowych do załadunku doksorubicyny. Schemat przedstawia deprotonację grupy hydroksylowej mPEG przy użyciu naftalenu potasowego jako rodnika anionowego, a następnie pol...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ze względu na dobrą kontrolę, jaką polimeryzacja anionowa zapewnia nadmierną masę cząsteczkową, jest to jeden z najczęściej stosowanych procesów w przemyśle do wytwarzania polimerów na bazie monomerów oksiranu (PEG i PPG). Aby osiągnąć pomyślną polimeryzację, należy zastosować optymalne i rygorystyczne warunki. Rygorystyczne oczyszczanie wszystkich odczynników i odpowiednia aparatura są niezbędne dla żywego charakteru syntezy. Ograniczenia obecnej konfiguracji są głównie związane z techniką transferu, która opiera się na...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CA dziękuje za grant Discovery od Kanadyjskiej Rady Badań Nauk Przyrodniczych i Inżynierii. CA uznaje stanowisko Katedry Farmacji i Dostarczania Leków w GSK. Autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów finansowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
DMEM/HAMF12Gibco, Life Technologies12500Uzupełnione o 10% FBS. Ciepło w 37 stopniach; C Łaźnia wodna.
Trypsyna-EDTA (0,25%)Sigma-AldrichT4049Ciepły w 37 stopniach; C kąpiel wodna
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Sigma-AldrichF1051pochodzenie
kanadyjskie MDA-MB-468 linia komórkowaATCCHTB-132
MTS odczynnik tetrazolowyPROMEGAG111B
Etosiarczan fenazyny (PES)Sigma-AldrichP4544>95%
mPEG5K (Mn 5,400 g/mol)Sigma-Aldrich81323PDI=1,02
Tlenek dimetylu (DMSO)Sigma-AldrichD4540>99.5%
NaftalenSigma-Aldrich147141>99%
Eter fenyloglicydowySigma-AldrichA32608>85%
BenzofenonSigma-Aldrich427551>99%
PotasSigma-Aldrich451096>98%
TetrahydrofuranCaledon Laboratory Chemicals8900 1ACS
HexaneCaledon Laboratory Chemicals5500 1ACS
Wodorek wapnia (CaH2)ACPC-0460>99.5%
Eter dietylowyCaledon Laboratory Chemicals1/10/4800ACS
Czytnik mikropłytekBioTek Instruments
Różnicowa kalorymetria skaningowa (DSC)TA Instruments IncDSC Q100
Chromatografia żelowa (GPC)Pleśń separacyjna Waters 2695 / detektor 2414 2 kolumny: Agilent Plgel 5 i mikro; m Mixed-D
Spektroskopia NMRVarian Mercury 400MHz
Chloroform-dSigma-Aldrich15185899,96%
DMSO-dSigma-Aldrich15691499,96%
Pompa próżniowaGardner Denver Welch Vacuum Tech, Inc.Ciśnienie końcowe 1x10-4 torr
Drierit ze wskaźnikiem, 8 meshSigma-Aldrich238988Regenerowany przy 230  ° C przez 2 godziny

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dickerson, T. J., Reed, N. N., Janda, K. D. Soluble Polymers as Scaffolds for Recoverable Catalysts and Reagents. Chemical Reviews. 102, 3325-3344 (2002).
  2. van Heerbeek, R., Kamer, P. C. J., van Leeuwen, P. W. N. M., Reek, J. N. H. Dendrimers as Support for Recoverable Catalysts and Reagents. Chemical Reviews. 102 (10), 3717-3756 (2002).
  3. Knop, K., Hoogenboom, R., Fischer, D., Schubert, U. S. Poly(ethylene glycol) in Drug Delivery: Pros and Cons as Well as Potential Alternatives. Angewandte Chemie International Edition. 49 (36), 6288-6308 (2010).
  4. Eetezadi, S., Ekdawi, S. N., Allen, C. The challenges facing block copolymer micelles for cancer therapy: In vivo barriers and clinical translation. Advanced Drug Delivery Reviews. 91, 7-22 (2015).
  5. Attwood, D., Booth, C., Yeates, S. G., Chaibundit, C., Ricardo, N. Block copolymers for drug solubilisation: Relative hydrophobicities of polyether and polyester micelle-core-forming blocks. International Journal of Pharmaceutics. 345 (1-2), 35-41 (2007).
  6. Matsumura, Y., Kataoka, K. Preclinical and clinical studies of anticancer agent-incorporating polymer micelles. Cancer Science. 100 (4), 572-579 (2009).
  7. Chan, A. S., Chen, C. H., Huang, C. M., Hsieh, M. F. Regulation of particle morphology of pH-dependent poly(epsilon-caprolactone)-poly(gamma-glutamic acid) micellar nanoparticles to combat breast cancer cells. Journal of Nanoscience and Nanotechnology. 10 (10), 6283-6297 (2010).
  8. Diao, Y. Y., et al. Doxorubicin-loaded PEG-PCL copolymer micelles enhance cytotoxicity and intracellular accumulation of doxorubicin in adriamycin-resistant tumor cells. International Journal of Nanomedicine. 6, 1955-1962 (2011).
  9. Mikhail, A. S., Allen, C. Poly(ethylene glycol)-b-poly(ε-caprolactone) Micelles Containing Chemically Conjugated and Physically Entrapped Docetaxel: Synthesis, Characterization, and the Influence of the Drug on Micelle Morphology. Biomacromolecules. 11 (5), 1273-1280 (2010).
  10. Kataoka, K., Harada, A., Nagasaki, Y. Block copolymer micelles for drug delivery: design, characterization and biological significance. Advanced Drug Delivery Reviews. 47 (1), 113-131 (2001).
  11. Nakanishi, T., et al. Development of the polymer micelle carrier system for doxorubicin. Journal of Controlled Release. 74 (1-3), 295-302 (2001).
  12. Liu, J., Xiao, Y., Allen, C. Polymer-drug compatibility: A guide to the development of delivery systems for the anticancer agent, ellipticine. Journal of Pharmaceutical Sciences. 93 (1), 132-143 (2004).
  13. Flory, P. J. Molecular Size Distribution in Ethylene Oxide Polymers. Journal of the American Chemical Society. 62 (6), 1561-1565 (1940).
  14. Kazanskii, K. S., Solovyanov, A. A., Entelis, S. G. Polymerization of ethylene oxide by alkali metal-naphthalene complexes in tetrahydrofuran. European Polymer Journal. 7 (10), 1421-1433 (1971).
  15. Crothers, M., et al. Micellization and Gelation of Diblock Copolymers of Ethylene Oxide and Styrene Oxide in Aqueous Solution. Langmuir. 18 (22), 8685-8691 (2002).
  16. Taboada, P., et al. Block Copolymers of Ethylene Oxide and Phenyl Glycidyl Ether: Micellization, Gelation, and Drug Solubilization. Langmuir. 21 (12), 5263-5271 (2005).
  17. Taboada, P., et al. Micellization and Drug Solubilization in Aqueous Solutions of a Diblock Copolymer of Ethylene Oxide and Phenyl Glycidyl Ether. Langmuir. 22 (18), 7465-7470 (2006).
  18. Attwood, D., Booth, C. Colloid Stability. , Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. 61-78 (2010).
  19. Le Devedec, F., et al. Postalkylation of a Common mPEG-b-PAGE Precursor to Produce Tunable Morphologies of Spheres, Filomicelles, Disks, and Polymersomes. ACS Macro Letters. 5 (1), 128-133 (2016).
  20. Chtryt, V., Ulbrich, K. Conjugate of Doxorubicin with a Thermosensitive Polymer Drug Carrier. Journal of Bioactive and Compatible Polymers. 16 (6), 427-440 (2001).
  21. Kataoka, K., et al. Doxorubicin-loaded poly(ethylene glycol)-poly(β-benzyl-l-aspartate) copolymer micelles: their pharmaceutical characteristics and biological significance. Journal of Controlled Release. 64 (1-3), 143-153 (2000).
  22. Cammas, S., Matsumoto, T., Okano, T., Sakurai, Y., Kataoka, K. Design of functional polymeric micelles as site-specific drug vehicles based on poly (α-hydroxy ethylene oxide-co-β-benzyl l-aspartate) block copolymers. Materials Science and Engineering: C. 4 (4), 241-247 (1997).
  23. Lv, S., et al. Doxorubicin-loaded amphiphilic polypeptide-based nanoparticles as an efficient drug delivery system for cancer therapy. Acta Biomaterialia. 9 (12), 9330-9342 (2013).
  24. Kim, J. O., Oberoi, H. S., Desale, S., Kabanov, A. V., Bronich, T. K. Polypeptide nanogels with hydrophobic moieties in the cross-linked ionic cores: synthesis, characterization and implications for anticancer drug delivery. Journal of Drug Targeting. 21 (10), 981-993 (2013).
  25. Zhao, C. L., Winnik, M. A., Riess, G., Croucher, M. D. Fluorescence probe techniques used to study micelle formation in water-soluble block copolymers. Langmuir. 6 (2), 514-516 (1990).
  26. Wilhelm, M., et al. Poly(styrene-ethylene oxide) block copolymer micelle formation in water: a fluorescence probe study. Macromolecules. 24 (5), 1033-1040 (1991).
  27. Cammas, S., Kataoka, K. Functional poly[(ethylene oxide)-co-(β-benzyl-L-aspartate)] polymeric micelles: block copolymer synthesis and micelles formation. Macromolecular Chemistry and Physics. 196 (6), 1899-1905 (1995).
  28. Kwon, G., et al. Micelles based on AB block copolymers of poly(ethylene oxide) and poly(.beta.-benzyl L-aspartate). Langmuir. 9 (4), 945-949 (1993).
  29. Ahmed, F., Discher, D. E. Self-porating polymersomes of PEG-PLA and PEG-PCL: hydrolysis-triggered controlled release vesicles. Journal of Controlled Release. 96 (1), 37-53 (2004).
  30. Uhrig, D., Mays, J. W. Experimental techniques in high-vacuum anionic polymerization. Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry. 43 (24), 6179-6222 (2005).
  31. Parker, A. J. The effects of solvation on the properties of anions in dipolar aprotic solvents. Quarterly Reviews, Chemical Society. 16 (2), 163-187 (1962).
  32. Cram, D. J. Fundamentals o] Carbanion Chemistry. , (1965).
  33. Szwarc, M. ACS Symposium Series. 166, American chemistry society. 1-15 (1981).
  34. Cho, Y. W., Lee, J., Lee, S. C., Huh, K. M., Park, K. Hydrotropic agents for study of in vitro paclitaxel release from polymeric micelles. Journal of Controlled Release. 97, 249-257 (2004).
  35. Dewhurst, P. F., Lovell, M. R., Jones, J. L., Richards, R. W., Webster, J. R. P. Organization of Dispersions of a Linear Diblock Copolymer of Polystyrene and Poly(ethylene oxide) at the Air−Water Interface. Macromolecules. 31 (22), 7851-7864 (1998).
  36. Opanasopit, P., et al. Block Copolymer Design for Camptothecin Incorporation into Polymeric Micelles for Passive Tumor Targeting. Pharmaceutical Research. 21 (11), 2001-2008 (2004).
  37. Allen, G., Booth, C., Price, C. VI-The physical properties of poly(epoxides). Polymer. 8, 414-418 (1967).
  38. Jada, A., Hurtrez, G., Siffert, B., Riess, G. Structure of polystyrene-block-poly(ethylene oxide) diblock copolymer micelles in water. Macromolecular Chemistry and Physics. 197 (11), 3697-3710 (1996).
  39. Attwood, D., Florence, A. T. Surfactant systems : their chemistry, pharmacy, and biology. , Chapman and Hall. (1983).
  40. Rekatas, C. J., et al. The effect of hydrophobe chemical structure and chain length on the solubilization of griseofulvin in aqueous micellar solutions of block copoly(oxyalkylene)s. Physical Chemistry Chemical Physics. 3 (21), 4769-4773 (2001).
  41. Encyclopædia Britannica Online. , http://www.britannica.com/EBchecked/topic/479680/protein/72559/Proteins-of-the-blood-serum (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

fenyloglicydylowy eterkrytyczne st enie micelarnedynamiczne rozpraszanie wiat atransmisyjna mikroskopia elektronowawydajno adowania lekuprzed u one uwalnianieoddzia ywania pi pi

Powiązane artykuły