Artykuł metodologiczny

Polimeryzacja anionowa kopolimeru amfifilowego do otrzymywania miceli kopolimeru blokowego stabilizowanego oddziaływaniami π-π stacking

DOI:

10.3791/54422

⸱

10 października 2016

 ,  , 
1Leslie Dan Faculty of Pharmacy, University of Toronto

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kluczowe etapy żywej anionowej polimeryzacji eteru fenyloglicydylowego (PheGE) na glikolu metoksy-polietylenowym (mPEG-b-PPheGE) są opisane. Otrzymane micele kopolimeru blokowego (BCM) obciążono doksorubicyną w 14% (wag.) i uzyskano trwałe uwalnianie leku przez 4 dni w fizjologicznie istotnych warunkach.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym badaniu, amfifilowy kopolimer, który zawiera blok tworzący rdzeń z grupami fenylowymi, został zsyntetyzowany przez żywą anionową polimeryzację eteru fenyloglicydylowego (PheGE) na glikolu metoksy-polietylenowym (mPEG-b-PPheGE). Charakterystyka kopolimeru ujawniła wąski rozkład molekularny (PDI < 1,03) i potwierdziła stopień polimeryzacji mPEG122-b-(PheGE)15. Krytyczne stężenie miceli w kopolimerze oceniano przy użyciu ustalonej metody fluorescencji z zachowaniem agregacji ocenianym za pomocą dynamicznego rozpraszania światła i transmisyjnej mikroskopii elektronicznej. Potencjał kopolimeru do wykorzystania w aplikacjach związanych z dostarczaniem leków został wstępnie oceniony, w tym w zakresie biokompatybilności in vitro, ładowania i uwalniania hydrofobowego leku przeciwnowotworowego doksorubicyny (DOX). Przygotowano stabilną formułę miceli DOX o poziomie obciążenia lekiem do 14% (wag.), skuteczności ładowania leku > 60% (w/w) i przedłużonym uwalnianiu leku przez 4 dni w fizjologicznie istotnych warunkach (kwaśne i obojętne pH, obecność albuminy). Wysoki poziom obciążenia lekiem i przedłużone uwalnianie przypisuje się stabilizowaniu interakcji π-π między DOX a blokiem tworzącym rdzeń miceli.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W środowisku wodnym, amfifilowe kopolimery blokowe łączą się, tworząc nano-rozmiarowe micele kopolimeru blokowego (BCM), które składają się z hydrofobowego rdzenia otoczonego hydrofilową powłoką lub koroną. Rdzeń miceli może służyć jako zbiornik do wprowadzania leków hydrofobowych; Podczas gdy korona hydrofilowa zapewnia interfejs między rdzeniem a ośrodkiem zewnętrznym. Poli(glikol etylenowy) (PEG) i jego pochodne są jedną z najważniejszych klas polimerów i jedną z najczęściej stosowanych w formulacjach leków. 1-3 BCM okazały się godną platformy dostarczania leków, a kilka preparatów opartych na tej technologii znajduje się obecnie w późnej fazie rozwoju klinicznego. 4 Najczęściej hydrofobowy blok kopolimeru składa się z polikaprolaktonu, poli(D,L-laktydu), poli(tlenku propylenu) lub poli(β-benzylo-L-asparaginianu). 5-9

Grupa Kataoki badała sferyczne micele utworzone z PEO-b-PBLA i poli(tlenku etylenu)-b-(doksorubicyny sprzężonej z kwasem poliasparaginowym) do dostarczania doksorubicyny (DOX). 10,11 W swoich raportach twierdzą, że interakcje π-π między lekiem sprzężonym z polimerem lub PBLA a wolnym DOX działają stabilizująco na rdzeń micelowy, powodując wzrost obciążenia i retencji leku. Ustalono, że kompatybilność lub interakcje między lekiem a blokiem tworzącym rdzeń są determinantami kluczowych parametrów związanych z wydajnością. 12 Oprócz DOX wiele leków przeciwnowotworowych obejmuje pierścienie aromatyczne w swojej podstawowej strukturze (np. metotreksat, olaparyb, SN-38).

W rezultacie istnieje duże zainteresowanie syntezą kopolimerów, które zawierają pierścienie benzylowe w swoich blokach tworzących rdzenie. Polimeryzacja anionowa PEG i jego pochodnych z otwarciem pierścienia umożliwia kontrolę masy cząsteczkowej i skutkuje materiałami o niskiej polidyspersyjności przy dobrej wydajności. Pytania z kategorii 13,14 Tlenek etylenu z eterem fenyloglicydowym (PheGE) lub tlenkiem styrenu (SO) może być (ko)polimeryzowany w celu utworzenia kopolimerów blokowych, które tworzą micele do rozpuszczania leków hydrofobowych. 15-18 W niniejszym raporcie opisano niezbędne etapy żywej polimeryzacji anionowej monomeru eteru fenyloglicydylowego na mPEG-OH jako makroinicjatorze (Rysunek 1). Otrzymany kopolimer blokowy i jego agregaty są następnie charakteryzowane pod względem właściwości istotnych do wykorzystania w dostarczaniu leków.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-protocol-1
Rysunek 1. Schemat przedstawiający dziewięć kluczowych etapów przygotowania kopolimeru mPEG-b-PPheGE. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

1. Przygotowanie odczynników w suchych warunkach

  1. Przygotowanie odczynników.
    1. Odważyć 15 g mPEG-5K (Mn=5 400 g/mol, PDI 1,03) i umieścić w temperaturze 50 °C w piekarniku pod próżnią na 48 godzin przed użyciem.
    2. Wysuszyć 200 ml dimetylosulfotlenku (DMSO) na wodorku wapnia (CaH2) (~ 1 g), umieścić w próżni na 30 minut, przepłukać argonem i mieszać przez 48 godzin przed użyciem.
    3. Umieścić 50 ml monomeru PheGE w suchej i czystej kolbie (100 ml), dodać 1 g CaH2, zamknąć w próżni na 15 minut na lodzie, oczyścić pod wpływem argonu i pozostawić do mieszania przez 24 godziny pod argonem przed użyciem.

2. Przygotowanie naftalenu potasowego

  1. Ostrożnie pokrój małe kawałki sodu (~ 1,5 g) osuszone heksanem w celu usunięcia nadmiaru oleju mineralnego i dodaj do okrągłej kolby zawierającej tetrahydrofuran (THF) (v = 500 ml).
    UWAGA: Kawałki sodu nie mogą być długo wystawione na działanie powietrza ze względu na ryzyko pożaru.
  2. Dodać benzofenon (~5 g), przepłukać argonem i zamknąć okrągłą kolbę (2 szyjki) szklanymi korkami.
  3. Po mieszaniu z argonem przez 24 godziny, podłączyć kolbę okrągłodenną do aparatu destylacyjnego (rysunek 2), destylować ciemny roztwór pod argonem podczas refluksu (tj. refluksu przez około 2 godziny po tym, jak roztwór zmieni kolor na niebieski). Rozpocznij zbieranie żądanej objętości ~ 150 ml THF, zamykając lewy zawór (znajdujący się w środku aparatu destylacyjnego).
    UWAGA: Jeśli ten roztwór nie zmieni koloru na niebieski, przerwij destylację, ostudź w temperaturze pokojowej (RT) i dodaj więcej benzofenonu lub sodu i ponownie rozpocznij destylację. Jest to wskazówka, że THF nadal zawiera wodę.
  4. Do suchego naczynia Erlenmeyera dodać destylowany THF (v=100 ml) i rozpuścić 3,9 g naftalenu.
    UWAGA: Zatrzymaj destylację, schłodź w temperaturze pokojowej i otwórz prawy zawór, aby przenieść objętość THF.
  5. Jak opisano w ppkt 2.1, pokroić małe kawałki potasu (1,1 g) i dodać do roztworu zawierającego naftalen (stężenie końcowe ~0,3 mol/l). Uszczelnić Erlenmeyera za pomocą adaptera do spłukiwania (T) (wł./wył.) z przegrodą u góry i przepłukać argonem.
  6. Po mieszaniu w argonie przez 24 godziny obserwować otrzymany roztwór zasady naftalenu potasowego o jednorodnym ciemnozielonym kolorze.
  7. W warunkach obojętnych usunąć strzykawką z kolby 5 ml podwielokrotności roztworu zasadowego i dodać do 10 ml wody destylowanej. Następnie dodaj 1-2 krople wskaźnika fenoloftaleiny do tego roztworu, który zmieni kolor roztworu na kolor fuksji.
  8. Za pomocą biurety miareczkować roztwór naftalenu potasu mianowanym roztworem kwasu solnego (0,1 N) do momentu, aż roztwór stanie się bezbarwny.

3. Materiały i niezbędne środki ostrożności dla efektywnej żywej polimeryzacji anionowej

  1. System argon/kolektor próżniowy.
    UWAGA: Jak opisano na rysunku 2, dwuszklany kolektor z pustymi szklanymi kurkami służy do przełączania między warunkami dostarczania argonu i próżni w naczyniu szklanym.
    1. Podłączyć zbiornik argonu (z manometrem) do suchej kolumny osuszającej i do przewodu kolektora za pomocą obojętnej gumowej rurki. Na drugim końcu linii argonowej podłącz bełkotkę (zawierającą olej mineralny).
    2. Do szklanych kurków podłączyć elastyczne obojętne rurki i igły. Do drugiej linii kolektora podłączyć szklaną pułapkę zanurzoną w zimnej kolbie Dewara (wypełnionej lodem/wodą lub ciekłym azotem) do pompy wysokopróżniowej.
  2. Aparatura do destylacji monomeru i DMSO.
    UWAGA: Zastosowano wygodne (tj. wszystko w jednym) urządzenie do destylacji wysokopróżniowej (rysunek 2). Suche szkło jest wykonane z zaworami wysokiego podciśnienia i wbudowanymi skraplaczami z wewnętrzną głowicą chłodniczą.
    1. Podłącz przepływ wody przez wlot (A) i wylot (B) jednostki chłodzącej (litera). Podłącz drugi wlot/wylot (C) do podwójnego kolektora dla argonu/próżni. Dodaj i uszczelnij przegrodę (metalowe druty) w porcie tłocznym/ekstrakcyjnym i podłącz kaniulę ze stali nierdzewnej do przenoszenia cieczy wrażliwych na powietrze (D) (na górze/pętli).
    2. Przed polimeryzacją destylować PheGE i DMSO na półkulistych płaszczach grzewczych odpowiednio w temperaturze 100 °C i 70 °C przez 2 godziny w próżni z mieszaniem. Temperatura wrzenia monomeru PheGE wynosi 254 °C, podczas gdy temperatura wrzenia DMSO wynosi 189 °C przy (1 atm).
  3. Wyroby szklane do polimeryzacji anionowej.
    1. Oprócz systemu destylacji należy używać wyłącznie naczyń szklanych odpornych na wysoką próżnię, w tym kolb okrągłodennych (certyfikowanych przez producenta), cylindrów miarowych (do przenoszenia objętości rozpuszczalnika, zasady i monomerów), kaniul, przegród i metalowych drutów do uszczelniania przegród.
      UWAGA: W przypadku żywej polimeryzacji przed użyciem należy dokładnie podgrzać (pod próżnią) i schłodzić wszystkie szklane naczynia pod strumieniem argonu. Opalarkę należy trzymać w odległości ~10 cm od szkła.

figure-protocol-2
Rysunek 2. Montaż i kluczowe etapy destylacji/transferu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Opis kluczowych etapów żywej polimeryzacji anionowej: destylacja i transfer

  1. Zważyć mPEG-5K (2 mmol, 10 g) w suchej kolbie/Schlenk (piekarniku) zawierającej mieszadło i uszczelnić adapter do spłukiwania (T) (wł./wył.) z przegrodą u góry.
  2. Podłączyć kolbę do kolektora i przepłukiwać kolbę przez 2-3 minuty płukaniem argonem. Przekręć zawór do pozycji podciśnienia, aby przepłukać kolbę.
  3. Obrócić kolbę ręcznie i równomiernie wysuszyć naczynie reakcyjne za pomocą suszarki nadmuchowej (opalarki), aż mPEG-5K się rozpuści.
    UWAGA: Opalarkę należy trzymać w odległości ~10 cm od kolby.
  4. Po 1 minutach przerwij podciśnienie, przekręcając zawór na kolektorze w kierunku pozycji argonu za pomocą kilku szybkich trzasków.
    UWAGA: W bełkotce należy obserwować ciągły przepływ argonu. Gdy przepływ jest ciągły, zawór pozostaje w pozycji argonu. Powtórz kroki ogrzewania i chłodzenia dwukrotnie, aby usunąć wszelkie ślady wilgoci.
  5. Przechowywać makroinicjator polimerowy w próżni przez ~ 2 godziny i pod argonem przed rozpoczęciem reakcji.
  6. Pod pokrywą silnika zamontować dwa aparaty do destylacji wysokopróżniowej (rysunek 2); jeden do destylacji DMSO i jeden do destylacji monomeru (PheGE).
  7. Podłączyć oddzielne kolby zawierające DMSO i monomer do dwóch aparatów i zainstalować każdą z nich na półkulistym płaszczu grzewczym (lub w kąpieli olejowej). Podłącz zimną wodę do górnej części aparatu (wejście/wyjście) i do kolektora (argon/próżnia).
  8. Upewnij się, że każde urządzenie jest bezpieczne i dobrze uszczelnione. Włącz podciśnienie za pomocą zaworu.
    UWAGA: Zgodnie z opisem w kroku 3.3 powtórz dwukrotnie kroki ogrzewania i chłodzenia, aby usunąć wszelkie ślady wilgoci.
  9. Ustaw ogrzewanie za pomocą regulatora temperatury i zacznij mieszać roztwory. Po 2 godzinach cyrkulacji/destylacji DMSO zamknij zawór wysokiego podciśnienia (znajdujący się w środku aparatu destylacyjnego), aby zebrać około 20 ml roztworu (w celu umycia wnętrza aparatu). Następnie uwolnij frakcję do kolby i powtórz operację jeszcze raz, aby zapewnić czystość pożądanej frakcji, która jest później zbierana.
  10. Podgrzej kolbę zawierającą mPEG-5K (w próżni) za pomocą opalarki, aż polimer (mPEG-5K) się rozpuści. Ponownie przepłucz argonem.
    UWAGA: Procedura pomoże w rozwiązaniu po przeniesieniu DMSO.
  11. Po 2 godzinach zamknij zawór wysokiego podciśnienia i zbierz objętość rozpuszczalnika (VDMSO = ~ 100 ml). Zatrzymaj ogrzewanie i odetnij podciśnienie od kolektora. Uwolnij argon (za pomocą zatrzasków) do komory, jak opisano powyżej.
  12. Pod dodatnim ciśnieniem argonu podłączyć jedną stronę kaniuli (przytrzymać za zawór odcinający aparatu) do cylindra z podziałką lub bezpośrednio do kolby zawierającej mPEG-5K (jeśli aparat do destylacji ma podziałkę) i ostrożnie zanurzyć drugi koniec w świeżo destylowanej frakcji.
  13. Używając ciśnienia argonu, przeprowadź DMSO przez kaniulę do kolby reakcyjnej. Podłączyć dodatkowy bełkot do kolby (lub cylindra, jeśli jest potrzebny do pomiaru) i zamknąć szklany kran podłączony do bełkotki po przeciwnej stronie kolektora.
    UWAGA: Po wyjęciu jednej strony kaniuli w celu transferu upewnij się, że zastosowano dodatnie ciśnienie argonu.
  14. Aby uniknąć wypadków spowodowanych ciśnieniem argonu, otwórz szklany kran na 1-2 sekundy i ponownie zamknij, aby kontynuować przepływ DMSO (powtarzany raz na 0,5 minuty), aż do zakończenia pełnego transferu. Po zakończeniu ponownie otwórz kran odcinający.
    UWAGA: Ta sama procedura musi być teraz wykonana w przypadku destylacji i zbierania monomeru. Rozpuszczalnik i monomer nie mogą być zbierane w tym samym czasie.
  15. Przenieść 5 ml 0,3 M naftaleno-potasu przez kaniulację w cylindrze miarowym uszczelnionym przegrodą z wprowadzoną kaniulą (pętlą).
    UWAGA: Należy zastosować takie same środki ostrożności, jak opisane w UWAGA 4.13. Aby uniknąć zanieczyszczenia powietrzem/wodą, należy najpierw utrzymać dodatnie ciśnienie argonu od kolby naftalenowo-potasowej do cylindra, a następnie od butli do kolby reakcyjnej.
  16. Włóż kolejną igłę z kolektora do cylindra (argon). Ostrożnie wyjąć kaniulę podłączoną do systemu destylacji i szybko włożyć do kolby reakcyjnej.
    UWAGA: Użyj tej techniki do przenoszenia zasady i monomeru.
  17. Dodawaj bazę kropla po kropli, aż roztwór stanie się ciemny. Po powolnym zaniku koloru dodaj kolejną porcję, aż ciemny kolor pojawi się ponownie, i powtarzaj aż do pełnego transferu.
  18. Przenieś żądaną objętość monomeru (VPheGE = 5 ml), aby osiągnąć stopień polimeryzacji PPheGE ~ n = 18-20.
  19. Pozostawić reakcję na 48 godzin w temperaturze 80 °C w atmosferze argonu, ciągle mieszając, aby zapewnić całkowitą polimeryzację.
  20. Ugasić reakcję przez dodanie kropli HCl 1 N do metanolu (mierzone za pomocą papierka lakmusowego (neutralne pH)) i obserwowane przez zanik koloru.
  21. Ekstrahować naftalen z roztworu DMSO za pomocą heksanu (3×50 ml). Usunąć DMSO przez destylację w próżni ~ 70 ml (ten sam aparat). Ostudzić roztwór gnojowicy i dodać 50 ml THF.
  22. Usunąć sól z roztworu zawiesiny przez odwirowanie przy 5 000 x g przez 10 minut. Przenieść supernatant i dodać kroplami do 500 ml zimnego eteru dietylowego.
  23. Zebrać osad przez filtrację lub odwirowanie (powtórzyć dwukrotnie) i wysuszyć w próżni w temperaturze 30 °C przez 24-48 godzin (wydajność 85%).
    UWAGA: Kopolimer jest teraz gotowy do charakteryzacji.

5. Charakterystyka kopolimerów

  1. Odważyć 5-10 mg kopolimeru (zapisać rzeczywistą masę) w aluminiowej szalce na próbkę i hermetycznie zamknąć aluminiową pokrywką. Załadować szalkę na próbkę i szalkę odniesienia (pustą) do różnicowego kalorymetru skaningowego.
  2. Zaprogramuj cykl metody ("ciepło/chłodzenie/ogrzewanie"): 1) podgrzanie od 40 °C do 100 °C przy 10 °C/min, 2) schłodzenie do -70 °C przy 10 °C/min, 3) podgrzanie do 100 °C przy 10 °C/min. Powtórz 2) i 3) dwa razy. Oznaczyć temperaturę topnienia (Tm), temperaturę krystalizacji (Tc) i temperatury zeszklenia (Tg) oraz ciepło topnienia (ΔHf) na podstawie naśladowań termicznych z trzeciego cyklu (w stosownych przypadkach).
  3. Rozpuść polimery w THF (2 mg/ml) i przefiltruj przez filtr PTFE 0,2 μm. Wstrzyknąć próbkę do systemu chromatografii żelowej (50 μl) i wykorzystać czas retencji próbki oraz krzywą kalibracyjną wytworzoną przy użyciu szeregu wzorców polistyrenowych w celu określenia masy cząsteczkowej polimeru. Rozdział 19
  4. Rozpuścić (ko)polimery (15 mg/ml) w d6 DMSO do analizy spektroskopii 1H NMR. Rozdział 19
  5. Oznaczyć krytyczne stężenie miceli (CMC) kopolimeru za pomocą 1,6-difenylo-1,3,5-heksatrienu (DPH) jako sondy fluorescencyjnej. 9
    1. Przygotować roztwór podstawowy DPH w THF (2,32 mg/l) w ciemności i dodać 100 μl tego roztworu podstawowego do każdej z serii fiolek.
    2. Przygotować roztwór podstawowy kopolimeru w THF i dodać podwielokrotności o równej objętości (2 ml) do serii fiolek (z których każda zawiera podwielokrotność roztworu podstawowego DPH), uzyskując końcowe stężenia kopolimeru w zakresie od 0,01 do 1 000 μg kopolimeru/ml.
    3. Następnie zmieszać roztwory kopolimeru-DPH i dodać kroplami do 10 ml podwójnie destylowanej wody za pomocą mieszadła. Roztwory należy następnie energicznie mieszać w ciemności przez 48 godzin pod strumieniem azotu, aby umożliwić powolne odparowywanie THF. Końcowe stężenie DPH w każdym roztworze wynosi 0,232 mg/L.
    4. Zmierzyć emisję fluorescencji próbek przy 430 nm (λex = 350 nm) za pomocą spektrofluorometru z podwójnym skanowaniem mikropłytkowym i wykreślić fluorescencję w funkcji log[polimeru]. Punkt przecięcia między dwoma nachyleniami liniowymi zapewnia wartość CMC dla kopolimeru.

6. Procedura ładowania doksorubicyny do BCM

  1. Rozpuścić 12 mg DOX w 1 ml acetonitrylu, dodać 10 μl trietyloaminy i pozostawić roztwór mieszać w ciemności przez 2 godziny.
  2. Rozpuścić kopolimer (45 mg) w 1 ml THF i mieszać przez ten sam okres czasu. Dodać roztwór kopolimeru do roztworu DOX i przepłukać fiolkę zawierającą resztki kopolimeru dodatkową objętością THF (0,5 ml).
  3. Mieszaninę kopolimeru i leku (2,5 ml) dodawać kroplami do fiolki (20 ml) zawierającej 15 ml soli fizjologicznej o zawartości soli fizjologicznej 0,9% (NaCl), mieszając.
  4. Przenieść roztwór do worka dializacyjnego (odcięte 3,5 kDa) i dializować z roztworem soli fizjologicznej 0,9% (500 ml).
    UWAGA: Wymienić sól fizjologiczną zewnętrzną po 6 godzinach i pozostawić dializę na 24 godziny z mieszaniem w ciemności w temperaturze pokojowej.
  5. Przenieść dialilat do probówki o pojemności 50 ml i odwirować przy 5 000 x g przez 15 minut.
  6. Przenieść supernatant do systemu ultrafiltracji (o pojemności 10 ml), który zawiera membranę do dializy (odciąć 10 kDa). Włóż mieszadło do systemu ultrafiltracji, zamknij pokrywę i otwórz na strumień azotu.
  7. Zagęścić roztwór BCM do objętości 4 ml i dodać 6 ml świeżej soli fizjologicznej i powtórzyć procedurę dwukrotnie.
  8. Zagęścić roztwór BCM do 4 ml, przepłukać komorę 0,5 ml soli fizjologicznej i dodać do roztworu. Przechowywać w brązowych fiolkach w temperaturze pokojowej w ciemności przed dalszym użyciem.

7. Ocena obciążenia doksorubicyną w DOX-BCM

  1. Rozpuścić DOX-BCM w dimetyloformamidzie (100 μl w 400 μl) w celu rozbicia miceli i rozcieńczyć w roztworze wodnym HCl (0,1 N) przed oceną (100 μl w 900 μl HCl 0,1 N).
  2. Zmierzyć obciążenie lekiem przy długości fali 490 nm za pomocą laboratoryjnego systemu spektrofotometrycznego do mikropłytek. Użyj następujących równań, aby określić zdolność ładowania leku (DLC) i wydajność ładowania leku (DLE):
    DLC (wt%) = (masa załadowanego leku / całkowita waga BCM) x 100%
    DLE (%) = (waga załadowanego leku / waga leku w paszy) x 100%

8. Ocena wydania in vitro DOX z DOX-BCM

  1. Zbadać uwalnianie DOX z BCM w temperaturze 37 °C w 0,1 M roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS, pH 7,4) w porównaniu z PBS pH 7,4 zawierającym 0,1% (w/v) Tween 80, BCM + BSA (50 mg/ml) w stosunku do PBS pH 7,4 i 0,1 M octanu-buforu przy pH = 5,5. 20,21
  2. Rozcieńczyć preparat BCM-DOX (700 μl) w wybranym buforze (2,3 ml), aby uzyskać całkowitą ilość ≈ 0,6-0,7 mg DOX w worku dializacyjnym.
  3. Umieścić roztwór w worku do dializy, zamknąć klipsami i zanurzyć worek w 200 ml odpowiedniego podłoża zewnętrznego.
  4. Usunąć 2 ml roztworu na zewnątrz worka dializacyjnego w określonych wcześniej punktach czasowych i zastąpić taką samą objętością świeżego buforu.
  5. Przechowywać usunięte podwielokrotności w temperaturze -20 °C przed analizą za pomocą spektrofotometrii UV-Vis (Abs490 nm). Skumulowany procent uwalnianego leku (Er) można obliczyć za pomocą następującego równania:
    figure-protocol-3
    UWAGA: Gdzie mDOX oznacza ilość DOX w BCM, V0 oznacza całkowitą objętość pożywki antyadhezyjnej (200 ml), Vt jest objętością zastąpionej pożywki (Vt = 2 ml), Ci jest stężeniem przed korektą, a Cn oznacza stężenie DOX w próbce.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
Rysunek 3. Ilustracja anionowej polimeryzacji eteru fenyloglicydowego na makroinicjatorze mPEG w celu wytworzenia mPEG-b-(PheGE)15 do otrzymywania miceli kopolimeru blokowego do ładowania doksorubicyny. Schemat ilustruje deprotonację grupy hydroksylowej mPEG przy użyciu naftalenu potasu jako anionu rodnikowego, a następnie polimeryz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ze względu na dobrą kontrolę, jaką polimeryzacja anionowa zapewnia nadmierną masę cząsteczkową, jest to jeden z najczęściej stosowanych procesów w przemyśle do wytwarzania polimerów na bazie monomerów oksiranu (PEG i PPG). Aby osiągnąć pomyślną polimeryzację, należy zastosować optymalne i rygorystyczne warunki. Rygorystyczne oczyszczanie wszystkich odczynników i odpowiednia aparatura są niezbędne dla żywego charakteru syntezy. Ograniczenia obecnej konfiguracji są głównie związane z techniką transferu, która opiera się na...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CA dziękuje za grant Discovery od Kanadyjskiej Rady Badań Nauk Przyrodniczych i Inżynierii. CA uznaje stanowisko Katedry Farmacji i Dostarczania Leków w GSK. Autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów finansowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
DMEM/HAMF12Gibco, Life Technologies12500Uzupełnione o 10% FBS. Ciepło w 37 stopniach; C Łaźnia wodna.
Trypsyna-EDTA (0,25%)Sigma-AldrichT4049Ciepły w 37 stopniach; C kąpiel wodna
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Sigma-AldrichF1051pochodzenie
kanadyjskie MDA-MB-468 linia komórkowaATCCHTB-132
MTS odczynnik tetrazolowyPROMEGAG111B
Etosiarczan fenazyny (PES)Sigma-AldrichP4544>95%
mPEG5K (Mn 5,400 g/mol)Sigma-Aldrich81323PDI=1,02
Tlenek dimetylu (DMSO)Sigma-AldrichD4540>99.5%
NaftalenSigma-Aldrich147141>99%
Eter fenyloglicydowySigma-AldrichA32608>85%
BenzofenonSigma-Aldrich427551>99%
PotasSigma-Aldrich451096>98%
TetrahydrofuranCaledon Laboratory Chemicals8900 1ACS
HexaneCaledon Laboratory Chemicals5500 1ACS
Wodorek wapnia (CaH2)ACPC-0460>99.5%
Eter dietylowyCaledon Laboratory Chemicals1/10/4800ACS
Czytnik mikropłytekBioTek Instruments
Różnicowa kalorymetria skaningowa (DSC)TA Instruments IncDSC Q100
Chromatografia żelowa (GPC)Pleśń separacyjna Waters 2695 / detektor 2414 2 kolumny: Agilent Plgel 5 i mikro; m Mixed-D
Spektroskopia NMRVarian Mercury 400MHz
Chloroform-dSigma-Aldrich15185899,96%
DMSO-dSigma-Aldrich15691499,96%
Pompa próżniowaGardner Denver Welch Vacuum Tech, Inc.Ciśnienie końcowe 1x10-4 torr
Drierit ze wskaźnikiem, 8 meshSigma-Aldrich238988Regenerowany przy 230  ° C przez 2 godziny

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dickerson, T. J., Reed, N. N., Janda, K. D. Soluble Polymers as Scaffolds for Recoverable Catalysts and Reagents. Chemical Reviews. 102, 3325-3344 (2002).
  2. van Heerbeek, R., Kamer, P. C. J., van Leeuwen, P. W. N. M., Reek, J. N. H. Dendrimers as Support for Recoverable Catalysts and Reagents. Chemical Reviews. 102 (10), 3717-3756 (2002).
  3. Knop, K., Hoogenboom, R., Fischer, D., Schubert, U. S. Poly(ethylene glycol) in Drug Delivery: Pros and Cons as Well as Potential Alternatives. Angewandte Chemie International Edition. 49 (36), 6288-6308 (2010).
  4. Eetezadi, S., Ekdawi, S. N., Allen, C. The challenges facing block copolymer micelles for cancer therapy: In vivo barriers and clinical translation. Advanced Drug Delivery Reviews. 91, 7-22 (2015).
  5. Attwood, D., Booth, C., Yeates, S. G., Chaibundit, C., Ricardo, N. Block copolymers for drug solubilisation: Relative hydrophobicities of polyether and polyester micelle-core-forming blocks. International Journal of Pharmaceutics. 345 (1-2), 35-41 (2007).
  6. Matsumura, Y., Kataoka, K. Preclinical and clinical studies of anticancer agent-incorporating polymer micelles. Cancer Science. 100 (4), 572-579 (2009).
  7. Chan, A. S., Chen, C. H., Huang, C. M., Hsieh, M. F. Regulation of particle morphology of pH-dependent poly(epsilon-caprolactone)-poly(gamma-glutamic acid) micellar nanoparticles to combat breast cancer cells. Journal of Nanoscience and Nanotechnology. 10 (10), 6283-6297 (2010).
  8. Diao, Y. Y., et al. Doxorubicin-loaded PEG-PCL copolymer micelles enhance cytotoxicity and intracellular accumulation of doxorubicin in adriamycin-resistant tumor cells. International Journal of Nanomedicine. 6, 1955-1962 (2011).
  9. Mikhail, A. S., Allen, C. Poly(ethylene glycol)-b-poly(ε-caprolactone) Micelles Containing Chemically Conjugated and Physically Entrapped Docetaxel: Synthesis, Characterization, and the Influence of the Drug on Micelle Morphology. Biomacromolecules. 11 (5), 1273-1280 (2010).
  10. Kataoka, K., Harada, A., Nagasaki, Y. Block copolymer micelles for drug delivery: design, characterization and biological significance. Advanced Drug Delivery Reviews. 47 (1), 113-131 (2001).
  11. Nakanishi, T., et al. Development of the polymer micelle carrier system for doxorubicin. Journal of Controlled Release. 74 (1-3), 295-302 (2001).
  12. Liu, J., Xiao, Y., Allen, C. Polymer-drug compatibility: A guide to the development of delivery systems for the anticancer agent, ellipticine. Journal of Pharmaceutical Sciences. 93 (1), 132-143 (2004).
  13. Flory, P. J. Molecular Size Distribution in Ethylene Oxide Polymers. Journal of the American Chemical Society. 62 (6), 1561-1565 (1940).
  14. Kazanskii, K. S., Solovyanov, A. A., Entelis, S. G. Polymerization of ethylene oxide by alkali metal-naphthalene complexes in tetrahydrofuran. European Polymer Journal. 7 (10), 1421-1433 (1971).
  15. Crothers, M., et al. Micellization and Gelation of Diblock Copolymers of Ethylene Oxide and Styrene Oxide in Aqueous Solution. Langmuir. 18 (22), 8685-8691 (2002).
  16. Taboada, P., et al. Block Copolymers of Ethylene Oxide and Phenyl Glycidyl Ether: Micellization, Gelation, and Drug Solubilization. Langmuir. 21 (12), 5263-5271 (2005).
  17. Taboada, P., et al. Micellization and Drug Solubilization in Aqueous Solutions of a Diblock Copolymer of Ethylene Oxide and Phenyl Glycidyl Ether. Langmuir. 22 (18), 7465-7470 (2006).
  18. Attwood, D., Booth, C. Colloid Stability. , Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. 61-78 (2010).
  19. Le Devedec, F., et al. Postalkylation of a Common mPEG-b-PAGE Precursor to Produce Tunable Morphologies of Spheres, Filomicelles, Disks, and Polymersomes. ACS Macro Letters. 5 (1), 128-133 (2016).
  20. Chtryt, V., Ulbrich, K. Conjugate of Doxorubicin with a Thermosensitive Polymer Drug Carrier. Journal of Bioactive and Compatible Polymers. 16 (6), 427-440 (2001).
  21. Kataoka, K., et al. Doxorubicin-loaded poly(ethylene glycol)-poly(β-benzyl-l-aspartate) copolymer micelles: their pharmaceutical characteristics and biological significance. Journal of Controlled Release. 64 (1-3), 143-153 (2000).
  22. Cammas, S., Matsumoto, T., Okano, T., Sakurai, Y., Kataoka, K. Design of functional polymeric micelles as site-specific drug vehicles based on poly (α-hydroxy ethylene oxide-co-β-benzyl l-aspartate) block copolymers. Materials Science and Engineering: C. 4 (4), 241-247 (1997).
  23. Lv, S., et al. Doxorubicin-loaded amphiphilic polypeptide-based nanoparticles as an efficient drug delivery system for cancer therapy. Acta Biomaterialia. 9 (12), 9330-9342 (2013).
  24. Kim, J. O., Oberoi, H. S., Desale, S., Kabanov, A. V., Bronich, T. K. Polypeptide nanogels with hydrophobic moieties in the cross-linked ionic cores: synthesis, characterization and implications for anticancer drug delivery. Journal of Drug Targeting. 21 (10), 981-993 (2013).
  25. Zhao, C. L., Winnik, M. A., Riess, G., Croucher, M. D. Fluorescence probe techniques used to study micelle formation in water-soluble block copolymers. Langmuir. 6 (2), 514-516 (1990).
  26. Wilhelm, M., et al. Poly(styrene-ethylene oxide) block copolymer micelle formation in water: a fluorescence probe study. Macromolecules. 24 (5), 1033-1040 (1991).
  27. Cammas, S., Kataoka, K. Functional poly[(ethylene oxide)-co-(β-benzyl-L-aspartate)] polymeric micelles: block copolymer synthesis and micelles formation. Macromolecular Chemistry and Physics. 196 (6), 1899-1905 (1995).
  28. Kwon, G., et al. Micelles based on AB block copolymers of poly(ethylene oxide) and poly(.beta.-benzyl L-aspartate). Langmuir. 9 (4), 945-949 (1993).
  29. Ahmed, F., Discher, D. E. Self-porating polymersomes of PEG-PLA and PEG-PCL: hydrolysis-triggered controlled release vesicles. Journal of Controlled Release. 96 (1), 37-53 (2004).
  30. Uhrig, D., Mays, J. W. Experimental techniques in high-vacuum anionic polymerization. Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry. 43 (24), 6179-6222 (2005).
  31. Parker, A. J. The effects of solvation on the properties of anions in dipolar aprotic solvents. Quarterly Reviews, Chemical Society. 16 (2), 163-187 (1962).
  32. Cram, D. J. Fundamentals o] Carbanion Chemistry. , (1965).
  33. Szwarc, M. ACS Symposium Series. 166, American chemistry society. 1-15 (1981).
  34. Cho, Y. W., Lee, J., Lee, S. C., Huh, K. M., Park, K. Hydrotropic agents for study of in vitro paclitaxel release from polymeric micelles. Journal of Controlled Release. 97, 249-257 (2004).
  35. Dewhurst, P. F., Lovell, M. R., Jones, J. L., Richards, R. W., Webster, J. R. P. Organization of Dispersions of a Linear Diblock Copolymer of Polystyrene and Poly(ethylene oxide) at the Air−Water Interface. Macromolecules. 31 (22), 7851-7864 (1998).
  36. Opanasopit, P., et al. Block Copolymer Design for Camptothecin Incorporation into Polymeric Micelles for Passive Tumor Targeting. Pharmaceutical Research. 21 (11), 2001-2008 (2004).
  37. Allen, G., Booth, C., Price, C. VI-The physical properties of poly(epoxides). Polymer. 8, 414-418 (1967).
  38. Jada, A., Hurtrez, G., Siffert, B., Riess, G. Structure of polystyrene-block-poly(ethylene oxide) diblock copolymer micelles in water. Macromolecular Chemistry and Physics. 197 (11), 3697-3710 (1996).
  39. Attwood, D., Florence, A. T. Surfactant systems : their chemistry, pharmacy, and biology. , Chapman and Hall. (1983).
  40. Rekatas, C. J., et al. The effect of hydrophobe chemical structure and chain length on the solubilization of griseofulvin in aqueous micellar solutions of block copoly(oxyalkylene)s. Physical Chemistry Chemical Physics. 3 (21), 4769-4773 (2001).
  41. Encyclopædia Britannica Online. , http://www.britannica.com/EBchecked/topic/479680/protein/72559/Proteins-of-the-blood-serum (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

fenyloglicydylowy eterkrytyczne st enie micelarnedynamiczne rozpraszanie wiat atransmisyjna mikroskopia elektronowawydajno adowania lekuprzed u one uwalnianieoddzia ywania pi pi

Powiązane artykuły