Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Polimeryzacja anionowa kopolimeru amfifilowego do otrzymywania miceli kopolimeru blokowego stabilizowanego oddziaływaniami π-π stacking

13K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54422

⸱

10 października 2016

 ,  , 
1Leslie Dan Faculty of Pharmacy, University of Toronto

W tym artykule

Podsumowanie

Kluczowe etapy żywej anionowej polimeryzacji eteru fenyloglicydylowego (PheGE) na glikolu metoksy-polietylenowym (mPEG-b-PPheGE) są opisane. Otrzymane micele kopolimeru blokowego (BCM) obciążono doksorubicyną w 14% (wag.) i uzyskano trwałe uwalnianie leku przez 4 dni w fizjologicznie istotnych warunkach.

Streszczenie

W tym badaniu, amfifilowy kopolimer, który zawiera blok tworzący rdzeń z grupami fenylowymi, został zsyntetyzowany przez żywą anionową polimeryzację eteru fenyloglicydylowego (PheGE) na glikolu metoksy-polietylenowym (mPEG-b-PPheGE). Charakterystyka kopolimeru ujawniła wąski rozkład molekularny (PDI < 1,03) i potwierdziła stopień polimeryzacji mPEG122-b-(PheGE)15. Krytyczne stężenie miceli w kopolimerze oceniano przy użyciu ustalonej metody fluorescencji z zachowaniem agregacji ocenianym za pomocą dynamicznego rozpraszania światła i transmisyjnej mikroskopii elektronicznej. Potencjał kopolimeru do wykorzystania w aplikacjach związanych z dostarczaniem leków został wstępnie oceniony, w tym w zakresie biokompatybilności in vitro, ładowania i uwalniania hydrofobowego leku przeciwnowotworowego doksorubicyny (DOX). Przygotowano stabilną formułę miceli DOX o poziomie obciążenia lekiem do 14% (wag.), skuteczności ładowania leku > 60% (w/w) i przedłużonym uwalnianiu leku przez 4 dni w fizjologicznie istotnych warunkach (kwaśne i obojętne pH, obecność albuminy). Wysoki poziom obciążenia lekiem i przedłużone uwalnianie przypisuje się stabilizowaniu interakcji π-π między DOX a blokiem tworzącym rdzeń miceli.

Wprowadzenie

W środowisku wodnym, amfifilowe kopolimery blokowe łączą się, tworząc nano-rozmiarowe micele kopolimeru blokowego (BCM), które składają się z hydrofobowego rdzenia otoczonego hydrofilową powłoką lub koroną. Rdzeń miceli może służyć jako zbiornik do wprowadzania leków hydrofobowych; Podczas gdy korona hydrofilowa zapewnia interfejs między rdzeniem a ośrodkiem zewnętrznym. Poli(glikol etylenowy) (PEG) i jego pochodne są jedną z najważniejszych klas polimerów i jedną z najczęściej stosowanych w formulacjach leków. 1-3 BCM okazały się godną platformy dostarczania leków, a kilka preparatów opartych na tej technologii znajduje się obecnie w późnej fazie rozwoju klinicznego. 4 Najczęściej hydrofobowy blok kopolimeru składa się z polikaprolaktonu, poli(D,L-laktydu), poli(tlenku propylenu) lub poli(β-benzylo-L-asparaginianu). 5-9

Grupa Kataoki badała sferyczne micele utworzone z PEO-b-PBLA i poli(tlenku etylenu)-b-(doksorubicyny sprzężonej z kwasem poliasparaginowym) do dostarczania doksorubicyny (DOX). 10,11 W swoich raportach twierdzą, że interakcje π-π między lekiem sprzężonym z polimerem lub PBLA a wolnym DOX działają stabilizująco na rdzeń micelowy, powodując wzrost obciążenia i retencji leku. Ustalono, że kompatybilność lub interakcje między lekiem a blokiem tworzącym rdzeń są determinantami kluczowych parametrów związanych z wydajnością. 12 Oprócz DOX wiele leków przeciwnowotworowych obejmuje pierścienie aromatyczne w swojej podstawowej strukturze (np. metotreksat, olaparyb, SN-38).

W rezultacie istnieje duże zainteresowanie syntezą kopolimerów, które zawierają pierścienie benzylowe w swoich blokach tworzących rdzenie. Polimeryzacja anionowa PEG i jego pochodnych z otwarciem pierścienia umożliwia kontrolę masy cząsteczkowej i skutkuje materiałami o niskiej polidyspersyjności przy dobrej wydajności. Pytania z kategorii 13,14 Tlenek etylenu z eterem fenyloglicydowym (PheGE) lub tlenkiem styrenu (SO) może być (ko)polimeryzowany w celu utworzenia kopolimerów blokowych, które tworzą micele do rozpuszczania leków hydrofobowych. 15-18 W niniejszym raporcie opisano niezbędne etapy żywej polimeryzacji anionowej monomeru eteru fenyloglicydylowego na mPEG-OH jako makroinicjatorze (Rysunek 1). Otrzymany kopolimer blokowy i jego agregaty są następnie charakteryzowane pod względem właściwości istotnych do wykorzystania w dostarczaniu leków.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Schemat procesu polimeryzacji anionowej, przedstawiający etapy dodawania odczynników, polimeryzacji oraz oczyszczania.
Rysunek 1. Schemat przedstawiający dziewięć kluczowych etapów przygotowania mPEG-bkopolimer PPheGE. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

1. Przygotowanie odczynników w warunkach bezwodnych

  1. Przygotowanie odczynników.
    1. Odważyć 15 g mPEG-5K (Mn=5,400 g/mol, PDI 1.03) i umieścić w temperaturze 50 °C w suszarce próżniowej na 48 hr przed użyciem.
    2. Osuszyć 20 ml dimetylosulfotlenku (DMSO) nad wodorkiem wapnia (CaH2) (~1 g), poddać działaniu próżni przez 30 min, przepłukać argonem i mieszać przez 48 hr przed użyciem.
    3. Wlać 50 ml monomeru PheGE do suchej i czystej kolby (10 ml), dodać 1 g CaH2, zamknąć próżniowo na 15 min w lodzie, przepłukać argonem i pozostawić do mieszania przez 24 hr pod osłoną argonu przed użyciem.

2. Przygotowanie naftalenu potasowego

  1. Ostrożnie odciąć małe kawałki sodu (~ 1,5 g) osuszonych heksanem w celu usunięcia nadmiaru oleju mineralnego i dodać je do kolby okrągłej zawierającej tetrahydrofuran (THF) (v = 50 ml).
    UWAGA: Kawałki sodu nie mogą być długo wystawione na działanie powietrza ze względu na ryzyko zapłonu.
  2. Dodać benzofenon (~5 g), przepłukać argonem i zamknąć kolbę okrągłą (dwuszyjną) szklanymi korkami.
  3. Po mieszaniu pod osłoną argonu przez 24 hr, podłączyć kolbę okrągłą do aparatury destylacyjnej (Rysunek 2), destylować ciemny roztwór pod osłoną argonu podczas ogrzewania z powrotem (tj. gotować z powrotem przez około 2 hr po tym, jak roztwór zmieni kolor na niebieski). Rozpocząć zbieranie pożądanej objętości (~ 150 ml) THF, zamykając lewy zawór (znajdujący się w środku aparatury destylacyjnej).
    UWAGA: Jeśli roztwór nie zmieni koloru na niebieski, przerwać destylację, schłodzić do temperatury pokojowej (RT) i dodać więcej benzofenonu lub sodu, a następnie wznowić destylację. Świadczy to o tym, że THF wciąż zawiera wodę.
  4. Do suchej kolby Erlenmeyera dodać destylowany THF (v=10 ml) i rozpuścić 3,9 g naftalenu.
    UWAGA: Przerwać destylację, schłodzić do RT i otworzyć prawy zawór, aby przelać objętość THF.
  5. Zgodnie z opisem w punkcie 2.1, odciąć małe kawałki potasu (1,1 g) i dodać je do roztworu zawierającego naftalen (stężenie końcowe ~0,3 mol/L). Zamknąć kolbę Erlenmeyera adapterem do przepłukiwania (T) (on/off) z septem na górze i przepłukać argonem.
  6. Po mieszaniu pod osłoną argonu przez 24 hr, otrzymać roztwór zasady potasowej naftalenu w postaci jednorodnej, ciemnozielonej cieczy.
  7. W warunkach obojętnych, pobrać strzykawką 5 ml aliquoty roztworu zasadowego z kolby i dodać do 10 ml destylowanej wody. Następnie dodać do tego roztworu 1-2 krople wskaźnika fenolftaleinowego, co spowoduje zabarwienie roztworu na kolor fuksjowy.
  8. Używając biurety, miareczkować roztwór potasu w naftalenie standardowym roztworem kwasu solnego (0,1 N) aż do odbarwienia roztworu.

3. Materiały i niezbędne środki ostrożności dla efektywnej żyjącej polimeryzacji anionowej

  1. System kolektora argon/próżnia.
    UWAGA: Jak opisano w Rycina 2do przełączania między doprowadzaniem argonu a warunkami próżni w aparaturze szklanej używa się podwójnego kolektora szklanego z pustymi w środku szklanymi kurkami.
    1. Podłącz butlę z argonem (z manometrem) do suchej kolumny z osuszaczem oraz do linii rozdzielczej, używając obojętnych gumowych wężyków. Na drugim końcu linii argonowej podłącz bulbulator (zawierający olej mineralny).
    2. Do szklanych kurków podłącz elastyczne rurki obojętne i igły. Do drugiej linii kolektora podłącz pułapkę szklaną zanurzoną w chłodni Dewara (wypełnionej lodem z wodą lub ciekłym azotem), a następnie podłącz ją do pompy wysokopróżniowej.
  2. Aparat do destylacji monomeru i DMSO.
    UWAGA: Wygodny (t. j. stosuje się aparat do destylacji wysokopróżniowej (wszystko w jednym) (Rycina 2). Suche szkło laboratoryjne wyposażone jest w zawory wysokiej próżni oraz wbudowane chłodnice z wewnętrznym chłodzonym głowicą elementem.
    1. Podłącz przepływ wody przez wlot (A) i wylot (B) jednostki chłodzącej (litera). Podłącz drugi wlot/wylot (C) do podwójnego rozdzielacza dla argonu/próżni. Zamontuj i uszczelnij septum (druty metalowe) w porcie dozowania/ekstrakcji i podłącz stalową kaniulę do przenoszenia cieczy wrażliwych na działanie powietrza (D) (na górze/pętli).
    2. Przed polimeryzacją należy przeprowadzić destylację PheGE oraz DMSO przy użyciu półsferycznych płaszczy grzejnych w temperaturze 100 °C i 70 °Codpowiednio, przez 2 h w próżni przy mieszaniu. Punkt wrzenia monomeru PheGE wynosi 254 °C podczas gdy temperatura wrzenia DMSO wynosi 189 °C przy (1 atm).
  3. Szkło laboratoryjne do polimeryzacji anionowej.
    1. Oprócz układu destylacyjnego należy używać wyłącznie szkła odpornego na wysoką próżnię, w tym kolb okrągłodنnych (certyfikowanych przez producenta), cylindrów miarowych (do przenoszenia objętości rozpuszczalnika, zasady i monomerów), kaniul, sept oraz drucików metalowych do uszczelniania sept.
      UWAGA: W przypadku polimeryzacji żyjącej, przed użyciem należy ostrożnie podgrzać (w próżni) i schłodzić całe szkło w przepływie argonu. Pistolet grzany należy trzymać w odległości ok. 10 cm od szkła.

Schemat aparatury do destylacji próżniowej z zaworami wysokopróżniowymi, technikami przenoszenia i konfiguracją bulgotawek.
Rysunek 2. Montaż oraz kluczowe etapy destylacji/przeniesienia. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

4. Opis kluczowych etapów żyjącej polimeryzacji anionowej: destylacja i przeniesienie

  1. Odważ mPEG-5K (2 mmol, 10 g) do suchej kolby/kolby Schlenka (wygrzanej w piecu) zawierającej mieszadło magnetyczne i zamknij adapter do płukania (T) (on/off) za pomocą septa u góry.
  2. Podłącz kolbę do manifoldu i przedmuchaj ją argonem przez 2-3 min. Przekręć zawór w pozycję próżni, aby odessać zawartość kolby.
  3. Obracaj kolbę ręcznie i osusz naczynie reakcyjne w sposób jednorodny za pomocą opalarki, aż mPEG-5K się stopi.
    UWAGA: Opalarkę należy trzymać w odległości ~10 cm od kolby.
  4. Po 1 min przerwij próżnię, przekręcając zawór na manifoldzie w stronę pozycji argonu za pomocą kilku szybkich ruchów.
    UWAGA: W bulgotce musi być widoczny ciągły przepływ argonu. Gdy przepływ jest ciągły, zawór pozostaje w pozycji argonu. Powtórz etapy ogrzewania i chłodzenia dwukrotnie, aby usunąć wszelkie ślady wilgoci.
  5. Utrzymuj polimerowy makroinicjator w próżni przez ~ 2 h oraz pod argonem przed rozpoczęciem reakcji.
  6. Zamontuj pod wyciągiem dwa zestawy do destylacji w wysokiej próżni (Rysunek 2); jeden do destylacji DMSO, a drugi do destylacji monomeru (PheGE).
  7. Podłącz osobne kolby zawierające DMSO i monomer do obu zestawów i umieść każdą z nich na półsferycznym płaszczu grzewczym (lub w łaźni olejowej). Podłącz zimną wodę do górnej części zestawu (wejście/wyjście) oraz do manifoldu (argon/próżnia).
  8. Upewnij się, że każdy zestaw jest stabilny i szczelnie zamknięty. Włącz próżnię za pomocą zaworu.
    UWAGA: Zgodnie z opisem w kroku 3.3., powtórz etapy ogrzewania i chłodzenia dwukrotnie, aby usunąć wszelkie ślady wilgoci.
  9. Ustaw ogrzewanie za pomocą kontrolera temperatury i rozpocznij mieszanie roztworów. Po 2 h cyrkulacji/destylacji DMSO zamknij zawór wysokiej próżni (znajdujący się w środku zestawu destylacyjnego), aby zebrać około 20 ml roztworu (w celu przepłukania wnętrza zestawu). Następnie wlej tę frakcję do kolby i powtórz operację jeszcze raz, aby zapewnić czystość frakcji, która zostanie zebrana później.
  10. Ogrzewaj kolbę zawierającą mPEG-5K (w próżni) opalarką, aż polimer (mPEG-5K) się stopi. Ponownie przedmuchaj argonem.
    UWAGA: Ta procedura ułatwi rozpuszczanie po przeniesieniu DMSO.
  11. Po 2 h zamknij zawór wysokiej próżni i zbierz objętość rozpuszczalnika (VDMSO = ~ 10 ml). Zaprzestań ogrzewania i przerwij próżnię z manifoldu. Wpuść argon (szybkimi ruchami zaworu) do komory, jak opisano powyżej.
  12. Pod nadciśnieniem argonu podłącz jeden koniec kaniuli (trzymając go przy kurku zestawu) do cylindra miernego lub bezpośrednio do kolby zawierającej mPEG-5K (jeśli zestaw destylacyjny posiada skalę), a drugi koniec ostrożnie zanurz w świeżo przedestylowanej frakcji.
  13. Wykorzystując ciśnienie argonu, przetłoocz DMSO przez kaniulę do kolby reakcyjnej. Podłącz dodatkową bulgotkę do kolby (lub cylindra, jeśli jest wymagany pomiar) i zamknij szklany kurek połączony z bulgotką po przeciwnej stronie manifoldu.
    UWAGA: Podczas zdejmowania jednego końca kaniuli w celu transferu, upewnij się, że przyłożone jest nadciśnienie argonu.
  14. Aby uniknąć wypadków spowodowanych ciśnieniem argonu, otwieraj szklany kurek na 1-2 s i zamykaj go ponownie, aby kontynuować przepływ DMSO (powtarzaj raz co 0,5 min), aż do pełnego transferu. Po zakończeniu ponownie otwórz kurek.
    UWAGA: Tę samą procedurę należy zastosować podczas destylacji i zbierania monomeru. Rozpuszczalnika i monomeru nie można zbierać jednocześnie.
  15. Przetłoocz 5 ml 0,3 M naftalenu potasowego za pomocą kaniulacji do cylindra miernego zamkniętego septem z włożoną kaniulą (pętla).
    UWAGA: Stosuj te same środki ostrożności, co w UWAGI 4.13. Nadciśnienie argonu musi być utrzymywane najpierw z kolby z naftalenem potasowym do cylindra, a następnie z cylindra do kolby reakcyjnej, aby uniknąć zanieczyszczenia powietrzem lub wodą.
  16. Włóż kolejną igłę z manifoldu (argon) do cylindra. Ostrożnie wyjmij kaniulę połączoną z systemem destylacyjnym i szybko włóż ją do kolby reakcyjnej.
    UWAGA: Stosuj tę technikę podczas przenoszenia zasady i monomeru.
  17. Dodawaj zasadę kropla po kropli, aż roztwór stanie się ciemny. Po powolnym zaniku koloru dodaj kolejną porcję, aż ciemny kolor pojawi się ponownie; powtarzaj do pełnego przetoczenia.
  18. Przetłoocz wymaganą objętość monomeru (VPheGE = 5 ml), aby osiągnąć stopień polimeryzacji PPheGE ~ n=18-20.
  19. Pozostaw reakcję na 48 h w temperaturze 80 °C w atmosferze argonu przy ciągłym mieszaniu, aby zapewnić całkowitą polimeryzację.
  20. Zatrzymaj reakcję poprzez dodanie kropel 1 N HCl w metanolu (mierząc papierem lakmusowym (neutralne pH)) i obserwując zanik koloru.
  21. Wyekstrahuj naftalen z roztworu DMSO heksanem (3×50 ml). Usuń DMSO poprzez destylację w próżni (~ 70 ml, ten sam zestaw). Ochłodź zawiesinę i dodaj 50 ml THF.
  22. Usuń sól z zawiesiny poprzez wirowanie przy 5,0 x g przez 10 min. Przenieś nadfiltr i dodaj go kroplami do 50 ml zimnego eteru dietylowego.
  23. Zbierz osad poprzez filtrację lub wirowanie (powtórz dwukrotnie) i susz w próżni w temperaturze 30 °C przez 24-48 h (wydajność 85%).
    UWAGA: Kopolimer jest teraz gotowy do charakterystyki.

5. Charakterystyka kopolimerów

  1. Odważić 5-10 mg kopolimeru (zapisać rzeczywistą masę) do aluminiowej kuwetki na próbkę i szczelnie zamknąć aluminiową pokrywką. Umieścić kuwetkę z próbką oraz kuwetkę referencyjną (pustą) w różnicowym kalorymetrze skaningowym.
  2. Zaprogramować cykl metody („grzanie/chłodzenie/grzanie”): 1) ogrzewanie od 40 °C do 10 °C z prędkością 10 °C/min, 2) chłodzenie do -70 °C z prędkością 10 °C/min, 3) ogrzewanie do 10 °C z prędkością 10 °C/min. Powtórzyć kroki 2) i 3) dwukrotnie. Wyznaczyć temperaturę topnienia (Tm), temperaturę krystalizacji (Tc), temperaturę przejścia szklistego (Tg) oraz ciepło topnienia (ΔHf) na podstawie krzywych termicznych z trzeciego cyklu (jeśli dotyczy).
  3. Rozpuścić polimery w THF (2 mg/ml) i przefiltrować przez filtr PTFE 0,2-µm. Wprowadzić próbkę (50 µl) do systemu chromatografii żelowej i, wykorzystując czas retencji próbki oraz krzywą kalibracyjną sporządzoną za pomocą szeregu standardów polistyrenu, wyznaczyć masę cząsteczkową polimeru.19
  4. Rozpuścić (ko)polimery (15 mg/ml) w d6 DMSO do analizy spektroskopowej 1H NMR.19
  5. Wyznaczyć krytyczne stężenie micelarne (CMC) kopolimeru, wykorzystując 1,6-difenylo-1,3,5-heksatrien (DPH) jako sondę fluorescencyjną.9
    1. Przygotować w ciemności roztwór zapasowy DPH w THF (2,32 mg/L) i dodać 10 µl tego roztworu do każdego z serii probówek.
    2. Przygotować roztwór zapasowy kopolimeru w THF i dodać aliquoty o jednakowej objętości (2 ml) do serii probówek (każda zawierająca aliquot roztworu zapasowego DPH), tak aby końcowe stężenia kopolimeru mieściły się w zakresie od 0,01 do 1 0 µg kopolimeru/ml.
    3. Następnie wymieszać roztwory kopolimer-DPH wstrząsarku wortex i dodać kroplami do 10 ml wody dwukrotnie destylowanej z mieszadłem magnetycznym. Roztwory należy następnie intensywnie mieszać w ciemności przez 48 hr pod strumieniem azotu, aby umożliwić powolne odparowanie THF. Końcowe stężenie DPH w każdym roztworze wynosi 0,232 mg/L.
    4. Zmierzyć emisję fluorescencji próbek przy 430 nm (λex = 350 nm) przy użyciu mikroplatejnego spektrofluorometru z podwójnym skanowaniem i wykreślić fluorescencję w funkcji log[polimeru]. Punkt przecięcia dwóch linii prostych wyznacza wartość CMC dla kopolimeru.

6. Procedura ładowania doksorubicyny do BCM

  1. Rozpuścić 12 mg DOX w 1 ml acetonitrylu, dodać 10 µl trietyloaminy i mieszać roztwór w ciemności przez 2 hr.
  2. Rozpuścić kopolimer (45 mg) w 1 ml THF i mieszać przez ten sam czas. Dodać roztwór kopolimeru do roztworu DOX, a fiolkę zawierającą pozostałości kopolimeru wypłukać dodatkową objętością THF (0,5 ml).
  3. Mieszaninę kopolimer-lek (2,5 ml) dodawać kroplami do fiolki (20 ml) zawierającej 15 ml soli fizjologicznej 0,9% (NaCl) przy jednoczesnym mieszaniu.
  4. Przenieść roztwór do worka dializacyjnego (cut off 3,5 kDa) i dializować przeciwko soli fizjologicznej 0,9% (50 ml).
    UWAGA: Wymienić zewnętrzną sól fizjologiczną po 6 hr i kontynuować dializę przez 24 hr przy mieszaniu w ciemności w RT.
  5. Przenieść dializat do probówki 50 ml i odwirować przy 5 0 x g przez 15 min.
  6. Przenieść supernatant do systemu ultrafiltracyjnego (o pojemności 10 ml) zawierającego membranę dializacyjną (cut off 10 kDa). Włożyć adapter do mieszania do systemu ultrafiltracyjnego, zamknąć pokrywę i wystawić na strumień azotu.
  7. Skoncentrować roztwór BCM do objętości 4 ml, dodać 6 ml świeżej soli fizjologicznej i powtórzyć tę procedurę dwukrotnie.
  8. Skoncentrować roztwór BCM do 4 ml, wypłukać komorę 0,5 ml soli fizjologicznej i dodać do roztworu. Przechowywać w brązowych fiolkach w RT w ciemności przed dalszym użyciem.

7. Ocena załadunku doksorubicyny w DOX-BCMs

  1. Rozpuścić DOX-BCM w dimetyluformamidzie (10 µl w 40 µl), aby rozbić micele, a następnie rozcieńczyć w wodnym roztworze HCl (0,1 N) przed analizą (10 µl w 90 µl HCl 0,1 N).
  2. Zmierzyć zawartość leku przy 490 nm, korzystając z laboratoryjnego spektrofotometru do mikropłytek. Do wyznaczenia pojemności załadunku leku (DLC) oraz wydajności załadunku leku (DLE) zastosować następujące wzory:
    DLC (wt%) = (masa załadowanego leku / całkowita masa BCMs) x 10%
    DLE (%) = (masa załadowanego leku / masa leku w mieszaninie wyjściowej) x 100%

8. Ocena uwalniania DOX z DOX-BCM in vitro

  1. Badanie uwalniania DOX z BCM w 37 °C w 0,1 M soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo (PBS, pH 7,4) przeciwko PBS o pH 7,4 zawierającemu 0,1% (m/v) Tween 80, BCMs + BSA (50 mg/ml) przeciwko PBS o pH 7,4 oraz w 0,1 M buforze octanowym o pH = 5,5.20,21
  2. Rozcieńczyć preparat BCM-DOX (700 µl) w wybranym buforze (2,3 ml), tak aby całkowita ilość DOX w worku dializacyjnym wynosiła ≈ 0,6–0,7 mg.
  3. Przenieść roztwór do worka dializacyjnego, zamknąć go za pomocą klipsów i zanurzyć worek w 20 ml odpowiedniego medium zewnętrznego.
  4. W określonych punktach czasowych należy pobrać 2 ml roztworu znajdującego się poza workiem dializacyjnym i zastąpić go taką samą objętością świeżego buforu.
  5. Przechowywać pobrane alikwoty w temperaturze -20 °C przed analizą metodą spektrofotometrii UV-Vis (Abs490 nm). Skumulowany procent uwolnionego leku (EProszę o podanie tekstu źródłowego do tłumaczenia.) można obliczyć, korzystając z następującego równania:
    Obliczenie wydajności uwalniania leku, równanie przedstawiające wzór Et(%) dla analizy uwalniania.
    UWAGA: W miejscu mDOX reprezentuje ilość DOX w BCM, V0 całkowita objętość medium uwalniającego (200 ml), Vt jest objętością wymienionego medium (Vt = 2 ml), Ci to stężenie przed korektą, a Cn reprezentuje stężenie DOX w próbce.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Tworzenie micel poprzez oddziaływania π-π; synteza chemiczna, schemat, a. micele o rozmiarze 25 nm, wykres DLS.
Rysunek 3. Ilustracja polimeryzacji anionowej eteru fenyloglicydylowego na makroinicjatorze mPEG w celu otrzymania mPEG-b-(PheGE)15 do przygotowania micel blokowych kopolimerów do załadu...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Ze względu na dobrą kontrolę, jaką polimeryzacja anionowa zapewnia nadmierną masę cząsteczkową, jest to jeden z najczęściej stosowanych procesów w przemyśle do wytwarzania polimerów na bazie monomerów oksiranu (PEG i PPG). Aby osiągnąć pomyślną polimeryzację, należy zastosować optymalne i rygorystyczne warunki. Rygorystyczne oczyszczanie wszystkich odczynników i odpowiednia aparatura są niezbędne dla żywego charakteru syntezy. Ograniczenia obecnej konfiguracji są głównie związane z techniką transferu, która opiera się na...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

CA dziękuje za grant Discovery od Kanadyjskiej Rady Badań Nauk Przyrodniczych i Inżynierii. CA uznaje stanowisko Katedry Farmacji i Dostarczania Leków w GSK. Autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów finansowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
DMEM/HAMF12Gibco, Life Technologies12500Uzupełnione o 10% FBS. Ciepło w 37 stopniach; C Łaźnia wodna.
Trypsyna-EDTA (0,25%)Sigma-AldrichT4049Ciepły w 37 stopniach; C kąpiel wodna
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Sigma-AldrichF1051pochodzenie
kanadyjskie MDA-MB-468 linia komórkowaATCCHTB-132
MTS odczynnik tetrazolowyPROMEGAG111B
Etosiarczan fenazyny (PES)Sigma-AldrichP4544>95%
mPEG5K (Mn 5,400 g/mol)Sigma-Aldrich81323PDI=1,02
Tlenek dimetylu (DMSO)Sigma-AldrichD4540>99.5%
NaftalenSigma-Aldrich147141>99%
Eter fenyloglicydowySigma-AldrichA32608>85%
BenzofenonSigma-Aldrich427551>99%
PotasSigma-Aldrich451096>98%
TetrahydrofuranCaledon Laboratory Chemicals8900 1ACS
HexaneCaledon Laboratory Chemicals5500 1ACS
Wodorek wapnia (CaH2)ACPC-0460>99.5%
Eter dietylowyCaledon Laboratory Chemicals1/10/4800ACS
Czytnik mikropłytekBioTek Instruments
Różnicowa kalorymetria skaningowa (DSC)TA Instruments IncDSC Q100
Chromatografia żelowa (GPC)Pleśń separacyjna Waters 2695 / detektor 2414 2 kolumny: Agilent Plgel 5 i mikro; m Mixed-D
Spektroskopia NMRVarian Mercury 400MHz
Chloroform-dSigma-Aldrich15185899,96%
DMSO-dSigma-Aldrich15691499,96%
Pompa próżniowaGardner Denver Welch Vacuum Tech, Inc.Ciśnienie końcowe 1x10-4 torr
Drierit ze wskaźnikiem, 8 meshSigma-Aldrich238988Regenerowany przy 230  ° C przez 2 godziny

Bibliografia

  1. Dickerson, T. J., Reed, N. N., Janda, K. D. Soluble Polymers as Scaffolds for Recoverable Catalysts and Reagents. Chemical Reviews. 102, 3325-3344 (2002).
  2. van Heerbeek, R., Kamer, P. C. J., van Leeuwen, P. W. N. M., Reek, J. N. H. Dendrimers as Support for Recoverable Catalysts and Reagents. Chemical Reviews. 102 (10), 3717-3756 (2002).
  3. Knop, K., Hoogenboom, R., Fischer, D., Schubert, U. S. Poly(ethylene glycol) in Drug Delivery: Pros and Cons as Well as Potential Alternatives. Angewandte Chemie International Edition. 49 (36), 6288-6308 (2010).
  4. Eetezadi, S., Ekdawi, S. N., Allen, C. The challenges facing block copolymer micelles for cancer therapy: In vivo barriers and clinical translation. Advanced Drug Delivery Reviews. 91, 7-22 (2015).
  5. Attwood, D., Booth, C., Yeates, S. G., Chaibundit, C., Ricardo, N. Block copolymers for drug solubilisation: Relative hydrophobicities of polyether and polyester micelle-core-forming blocks. International Journal of Pharmaceutics. 345 (1-2), 35-41 (2007).
  6. Matsumura, Y., Kataoka, K. Preclinical and clinical studies of anticancer agent-incorporating polymer micelles. Cancer Science. 100 (4), 572-579 (2009).
  7. Chan, A. S., Chen, C. H., Huang, C. M., Hsieh, M. F. Regulation of particle morphology of pH-dependent poly(epsilon-caprolactone)-poly(gamma-glutamic acid) micellar nanoparticles to combat breast cancer cells. Journal of Nanoscience and Nanotechnology. 10 (10), 6283-6297 (2010).
  8. Diao, Y. Y., et al. Doxorubicin-loaded PEG-PCL copolymer micelles enhance cytotoxicity and intracellular accumulation of doxorubicin in adriamycin-resistant tumor cells. International Journal of Nanomedicine. 6, 1955-1962 (2011).
  9. Mikhail, A. S., Allen, C. Poly(ethylene glycol)-b-poly(ε-caprolactone) Micelles Containing Chemically Conjugated and Physically Entrapped Docetaxel: Synthesis, Characterization, and the Influence of the Drug on Micelle Morphology. Biomacromolecules. 11 (5), 1273-1280 (2010).
  10. Kataoka, K., Harada, A., Nagasaki, Y. Block copolymer micelles for drug delivery: design, characterization and biological significance. Advanced Drug Delivery Reviews. 47 (1), 113-131 (2001).
  11. Nakanishi, T., et al. Development of the polymer micelle carrier system for doxorubicin. Journal of Controlled Release. 74 (1-3), 295-302 (2001).
  12. Liu, J., Xiao, Y., Allen, C. Polymer-drug compatibility: A guide to the development of delivery systems for the anticancer agent, ellipticine. Journal of Pharmaceutical Sciences. 93 (1), 132-143 (2004).
  13. Flory, P. J. Molecular Size Distribution in Ethylene Oxide Polymers. Journal of the American Chemical Society. 62 (6), 1561-1565 (1940).
  14. Kazanskii, K. S., Solovyanov, A. A., Entelis, S. G. Polymerization of ethylene oxide by alkali metal-naphthalene complexes in tetrahydrofuran. European Polymer Journal. 7 (10), 1421-1433 (1971).
  15. Crothers, M., et al. Micellization and Gelation of Diblock Copolymers of Ethylene Oxide and Styrene Oxide in Aqueous Solution. Langmuir. 18 (22), 8685-8691 (2002).
  16. Taboada, P., et al. Block Copolymers of Ethylene Oxide and Phenyl Glycidyl Ether: Micellization, Gelation, and Drug Solubilization. Langmuir. 21 (12), 5263-5271 (2005).
  17. Taboada, P., et al. Micellization and Drug Solubilization in Aqueous Solutions of a Diblock Copolymer of Ethylene Oxide and Phenyl Glycidyl Ether. Langmuir. 22 (18), 7465-7470 (2006).
  18. Attwood, D., Booth, C. Colloid Stability. , Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. 61-78 (2010).
  19. Le Devedec, F., et al. Postalkylation of a Common mPEG-b-PAGE Precursor to Produce Tunable Morphologies of Spheres, Filomicelles, Disks, and Polymersomes. ACS Macro Letters. 5 (1), 128-133 (2016).
  20. Chtryt, V., Ulbrich, K. Conjugate of Doxorubicin with a Thermosensitive Polymer Drug Carrier. Journal of Bioactive and Compatible Polymers. 16 (6), 427-440 (2001).
  21. Kataoka, K., et al. Doxorubicin-loaded poly(ethylene glycol)-poly(β-benzyl-l-aspartate) copolymer micelles: their pharmaceutical characteristics and biological significance. Journal of Controlled Release. 64 (1-3), 143-153 (2000).
  22. Cammas, S., Matsumoto, T., Okano, T., Sakurai, Y., Kataoka, K. Design of functional polymeric micelles as site-specific drug vehicles based on poly (α-hydroxy ethylene oxide-co-β-benzyl l-aspartate) block copolymers. Materials Science and Engineering: C. 4 (4), 241-247 (1997).
  23. Lv, S., et al. Doxorubicin-loaded amphiphilic polypeptide-based nanoparticles as an efficient drug delivery system for cancer therapy. Acta Biomaterialia. 9 (12), 9330-9342 (2013).
  24. Kim, J. O., Oberoi, H. S., Desale, S., Kabanov, A. V., Bronich, T. K. Polypeptide nanogels with hydrophobic moieties in the cross-linked ionic cores: synthesis, characterization and implications for anticancer drug delivery. Journal of Drug Targeting. 21 (10), 981-993 (2013).
  25. Zhao, C. L., Winnik, M. A., Riess, G., Croucher, M. D. Fluorescence probe techniques used to study micelle formation in water-soluble block copolymers. Langmuir. 6 (2), 514-516 (1990).
  26. Wilhelm, M., et al. Poly(styrene-ethylene oxide) block copolymer micelle formation in water: a fluorescence probe study. Macromolecules. 24 (5), 1033-1040 (1991).
  27. Cammas, S., Kataoka, K. Functional poly[(ethylene oxide)-co-(β-benzyl-L-aspartate)] polymeric micelles: block copolymer synthesis and micelles formation. Macromolecular Chemistry and Physics. 196 (6), 1899-1905 (1995).
  28. Kwon, G., et al. Micelles based on AB block copolymers of poly(ethylene oxide) and poly(.beta.-benzyl L-aspartate). Langmuir. 9 (4), 945-949 (1993).
  29. Ahmed, F., Discher, D. E. Self-porating polymersomes of PEG-PLA and PEG-PCL: hydrolysis-triggered controlled release vesicles. Journal of Controlled Release. 96 (1), 37-53 (2004).
  30. Uhrig, D., Mays, J. W. Experimental techniques in high-vacuum anionic polymerization. Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry. 43 (24), 6179-6222 (2005).
  31. Parker, A. J. The effects of solvation on the properties of anions in dipolar aprotic solvents. Quarterly Reviews, Chemical Society. 16 (2), 163-187 (1962).
  32. Cram, D. J. Fundamentals o] Carbanion Chemistry. , (1965).
  33. Szwarc, M. ACS Symposium Series. 166, American chemistry society. 1-15 (1981).
  34. Cho, Y. W., Lee, J., Lee, S. C., Huh, K. M., Park, K. Hydrotropic agents for study of in vitro paclitaxel release from polymeric micelles. Journal of Controlled Release. 97, 249-257 (2004).
  35. Dewhurst, P. F., Lovell, M. R., Jones, J. L., Richards, R. W., Webster, J. R. P. Organization of Dispersions of a Linear Diblock Copolymer of Polystyrene and Poly(ethylene oxide) at the Air−Water Interface. Macromolecules. 31 (22), 7851-7864 (1998).
  36. Opanasopit, P., et al. Block Copolymer Design for Camptothecin Incorporation into Polymeric Micelles for Passive Tumor Targeting. Pharmaceutical Research. 21 (11), 2001-2008 (2004).
  37. Allen, G., Booth, C., Price, C. VI-The physical properties of poly(epoxides). Polymer. 8, 414-418 (1967).
  38. Jada, A., Hurtrez, G., Siffert, B., Riess, G. Structure of polystyrene-block-poly(ethylene oxide) diblock copolymer micelles in water. Macromolecular Chemistry and Physics. 197 (11), 3697-3710 (1996).
  39. Attwood, D., Florence, A. T. Surfactant systems : their chemistry, pharmacy, and biology. , Chapman and Hall. (1983).
  40. Rekatas, C. J., et al. The effect of hydrophobe chemical structure and chain length on the solubilization of griseofulvin in aqueous micellar solutions of block copoly(oxyalkylene)s. Physical Chemistry Chemical Physics. 3 (21), 4769-4773 (2001).
  41. Encyclopædia Britannica Online. , http://www.britannica.com/EBchecked/topic/479680/protein/72559/Proteins-of-the-blood-serum (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

fenyloglicydylowy eterkrytyczne stężenie micelarnedynamiczne rozpraszanie światłatransmisyjna mikroskopia elektronowawydajność ładowania lekuprzedłużone uwalnianieoddziaływania pi-pi
Polimeryzacja anionowa kopolimeru amfifilowego do otrzymywania miceli kopolimeru blokowego stabilizowanego oddziaływaniami π-π stacking
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.