Artykuł metodologiczny

Praca z komórkami słuchowymi HEI-OC1

DOI:

10.3791/54425

⸱

3 września 2016

 ,  ,  , 
1Head and Neck Surgery, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

House Ear Institute-Organ of Corti 1 (HEI-OC1) jest jedną z niewielu linii komórek słuchowych myszy dostępnych obecnie do celów badawczych. Protokół ten opisuje, jak pracować z komórkami HEI-OC1 w celu zbadania cytotoksycznego działania leków farmakologicznych, a także właściwości funkcjonalnych białek ucha wewnętrznego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HEI-OC1 to jedna z niewielu linii komórek słuchowych myszy dostępnych do celów badawczych. Pierwotnie zaproponowany jako system in vitro do badań przesiewowych leków ototoksycznych, komórki te zostały wykorzystane do badania aktywowanych przez leki szlaków apoptotycznych, autofagii, starzenia, mechanizmu ochrony komórek, reakcji zapalnych, różnicowania komórek, genetycznych i epigenetycznych skutków leków farmakologicznych, skutków niedotlenienia, stresu oksydacyjnego i endoplazmatycznego retikulum oraz ekspresji kanałów molekularnych i receptorów. Wśród kilku innych ważnych markerów komórek rzęsatych ślimaka, komórki HEI-OC1 endogennie eksprymują prestynę, paradygmatyczne białko motoryczne zewnętrznych komórek rzęsatych. W związku z tym mogą być bardzo przydatne do wyjaśnienia nowych aspektów funkcjonalnych tego ważnego białka słuchowego. Komórki HEI-OC1 są bardzo wytrzymałe, a ich hodowla zwykle nie powoduje dużych powikłań. Wymagają jednak pewnych specjalnych warunków, takich jak unikanie stosowania popularnych koktajli przeciwbakteryjnych zawierających streptomycynę lub inne antybiotyki, a także inkubacja w temperaturze 33 °C w celu stymulacji proliferacji komórek i inkubacja w temperaturze 39 °C w celu wywołania różnicowania komórek. W tym miejscu opisujemy, jak hodować komórki HEI-OC1 i jak je wykorzystywać w niektórych typowych testach, takich jak proliferacja komórek, żywotność, śmierć, autofagia i starzenie się, a także jak wykonywać pomiary pojemności patch-clamp i nieliniowe.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

House Ear Institute-Organ of Corti 1 (HEI-OC1) komórki pochodzą z narządu słuchowego transgenicznej myszy 1,2. Inkubacja dowolnej komórki tej transgenicznej myszy w temperaturze 33 °C/10% CO2 (warunki permisywne) indukuje ekspresję genu unieśmiertelniającego, który wyzwala dedyferencjację i przyspieszoną proliferację; przemieszczenie komórek do 39 °C/5% CO2 (warunki niedopuszczające) prowadzi do zmniejszenia proliferacji, różnicowania i, przynajmniej w przypadku HEI-OC1, śmierci komórki 2,3.

Komórki HEI-OC1 zostały sklonowane i scharakteryzowane w naszym laboratorium ponad dekadę temu, a wstępne badania wykazały, że wyrażają one specyficzne markery komórek rzęsatych ślimaka, takie jak prestyna, miozyna 7a, Atoh1, BDNF, kalbindyna i kalmodulina, ale także markery komórek wspomagających, takie jak koneksyna 26 i receptor czynnika wzrostu fibroblastów (FGF-R) 2. W związku z tym zasugerowano, że HEI-OC1 może reprezentować wspólny prekursor komórek czuciowych i podtrzymujących narząd Cortiego 2. Równoległe badania dostarczyły mocnych dowodów na to, że archetypowe leki ototoksyczne, takie jak cisplatyna, gentamycyna i streptomycyna, indukowały aktywację kaspazy-3 w tych komórkach, podczas gdy leki uważane za nieototoksyczne, takie jak penicylina, nie indukowały 2,3. W związku z tym ta linia komórkowa została zaproponowana jako system in vitro do badania mechanizmów komórkowych i molekularnych związanych z ototoksycznością oraz do badań przesiewowych potencjalnej ototoksyczności lub właściwości otoprotekcyjnych nowych leków farmakologicznych. Szacuje się, że komórki HEI-OC1 zostały wykorzystane w ponad stu pięćdziesięciu badaniach opublikowanych w ciągu ostatnich dziesięciu lat.

Podczas gdy przyjrzenie się potencjalnemu efektowi proapoptotycznemu różnych leków było głównym celem większości badań z udziałem tej linii komórkowej, inne ważne procesy komórkowe, takie jak autofagia i starzenie się, dopiero zaczęły być badane w komórkach HEI-OC14-7. W niedawnym badaniu z naszego laboratorium 8 wykorzystaliśmy komórki HEI-OC1 do zebrania kompleksowego zestawu danych na temat śmierci komórki, przeżycia, proliferacji, starzenia się i autofagii indukowanej przez różne leki farmakologiczne często stosowane w klinice. Porównaliśmy również niektóre odpowiedzi komórek HEI-OC1 z odpowiedziami z HEK-293 (ludzkie embrionalne komórki nerkowe) i HeLa (ludzkie komórki nabłonkowe) otrzymujące identyczne leczenie. Nasze wyniki wskazały, że komórki HEI-OC1 reagują na każdy lek w charakterystyczny sposób, z charakterystyczną zależną od dawki i czasu wrażliwością na co najmniej jeden z badanych mechanizmów. W badaniu tym podkreśliliśmy również, że prawidłowa interpretacja wyników eksperymentu będzie wymagała przeprowadzenia równoległych badań z użyciem więcej niż jednej techniki 8.

W innym badaniu badaliśmy użycie komórek HEI-OC1 do oceny funkcjonalnej odpowiedzi prestyny, białka motorycznego zewnętrznych komórek rzęsatych ślimaka (OHC) 9. Przedstawiono badania cytometrii przepływowej i konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej dotyczące wzorca ekspresji prestyny, a także badania pojemności nieliniowej (NLC) i zaciskania całych komórek w komórkach HEI-OC1 hodowanych w warunkach permisywnych (P-HEI-OC1) i niepermisywnych (NP-HEI-OC1). Nasze wyniki wskazały, że zarówno całkowita ekspresja prestyny, jak i lokalizacja błony plazmatycznej zwiększają się w sposób zależny od czasu w komórkach NP-HEI-OC1. Co ciekawe, odkryliśmy również, że wzrost lokalizacji prestyny na błonie komórkowej komórek NP-HEI-OC1 korelował ze spadkiem Na+K+ATPazy, która translokowała się z błony plazmatycznej do cytoplazmy bez istotnych zmian w całkowitej ekspresji komórki. Ponadto wykazaliśmy, że komórki P-HEI-OC1 mają silne NLC związane z funkcją motoryczną prestyny, która zmniejszała się wraz ze wzrostem gęstości cząsteczek prestyny obecnych na błonie plazmatycznej. Podsumowując, wyniki te silnie potwierdzają przydatność komórek HEI-OC1 do badania białek słuchowych.

W tym artykule wideo opisujemy, jak hodować komórki HEI-OC1, dlaczego wygodnie jest używać komórek rosnących w warunkach dopuszczalnych (P-HEI-OC1) do badań cytotoksyczności, jak ocenić mechanizm/mechanizmy cytotoksyczności wywołanej lekiem i jak przeprowadzić badania elektrofizjologiczne (np. patch-clamp, pojemność nieliniowa (NLC)) w celu zbadania funkcjonalnych właściwości prestyny, molekularnego silnika OHC ślimaka.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hodowla komórkowa

Uwaga: Wszystkie protokoły hodowli komórek muszą być wykonywane przy użyciu odpowiednich technik hodowli komórkowych (w celach informacyjnych zobacz pierwsze 3 rozdziały Cell Biology: A Laboratory Handbook, Volume I 10). Komórki HEI-OC1 nie wymagają dodatkowego powlekania ani obróbki szalek z kultur komórkowych w celu prawidłowego przylegania i wzrostu. Bardzo ważne: nie używaj szklanych naczyń do hodowli komórkowych; zmieni się fenotyp i odpowiedź biologiczna komórek na leki farmakologiczne (G Kalinec & F Kalinec, niepublikowane); Zalecane są konwencjonalne plastikowe naczynia do hodowli komórkowych (patrz Tabela materiałów/wyposażenia). Zwróć szczególną uwagę na techniki aseptyki, aby uniknąć zanieczyszczeń, ale nigdy nie stosuj antybiotyków (np. ampicyliny lub streptomycyny) z komórkami HEI-OC1. W razie potrzeby należy zastosować amfoterycynę B. Podczas gdy komórki HeLa i HEK-293 były używane jako kontrola w poprzednich badaniach z HEI-OC1 8, każda inna linia komórkowa może być akceptowalna do tego celu.

  1. Resuscytacja zamrożonych komórek HEI-OC1
    Uwaga: Protokół ten może być również stosowany z innymi liniami komórkowymi tej samej transgenicznej myszy opracowanej w naszym laboratorium, takimi jak OC-k3 z narządu Cortiego 11,12 i SV-k1 z prążkowia naczyniowego 13,14.
    1. Wyjąć fiolkę z kriokonserwowanymi komórkami HEI-OC1 z cieczy N2 i umieścić ją w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Zanurzyć tylko dolną połowę fiolki i pozostawić do rozmrożenia, aż w fiolce pozostanie tylko niewielka ilość lodu. Przetrzeć zewnętrzną stronę fiolki 70% alkoholem.
    2. Odpipetować komórki z fiolki i powoli, kropla po kropli, dostarczyć całą objętość (~ 1,5 x 10 5 komórek/ml) do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml wstępnie podgrzanej pożywki wzrostowej, takiej jak zmodyfikowana pożywka Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco, uzupełniona 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS).
    3. Usunąć DMSO przez odwirowanie probówki o sile 300-500 x g przez 5 minut, odrzucając supernatant i ponownie zawieszając komórki w 9 ml świeżej pożywki wzrostowej (DMEM + 10% FBS). Rozdzielać grudki lub arkusze komórek przez strumień i refluks zawieszonych komórek, od pipety do pożywki i odwrotnie, trzy do czterech razy, przy czym końcówka pipety dotyka dna probówki.
    4. Umieść całkowitą objętość komórek zawieszonych w pożywce wzrostowej w niepoddanych obróbce, plastikowych naczyniach do hodowli komórkowych o średnicy 100 mm.
    5. Inkubować komórki w temperaturze 33 °C z 10% CO2 (warunki dopuszczalne).
  2. Subkultura komórek HEI-OC1
    Uwaga: Przed konfluencją (~80%) komórki powinny zostać wprowadzone do zawiesiny i podhodowlane, aby zapobiec obumarciu kultury. Protokół ten może być również stosowany z innymi liniami komórkowymi opracowanymi w naszym laboratorium z tej samej myszy transgenicznej, takimi jak OC-k3 z narządu Cortiego 11,12 i SV-k1 z prążkowia naczyniowego 13,14.
    1. Usunąć starą pożywkę i przemyć komórki 2 ml PBS.
    2. Przykryj monowarstwę komórek roztworem 0,25% trypsyny, używając 1 ml na 25cm2 powierzchni. Aby przejść do następnego kroku, ponad 40% komórek musi zostać odłączonych. Zbadaj komórki za pomocą odwróconego mikroskopu i, jeśli to konieczne, delikatnie "uderz lub postukaj" w szalki hodowlane, aby uwolnić wszelkie pozostałe przyczepione komórki.
      Uwaga: Zachowaj ostrożność, ponieważ trypsynizacja przez długi czas może spowodować śmierć komórki; za mało, a przeniesione komórki okażą się niewystarczające do planowanych badań.
    3. Ponownie zawiesić komórki, postępując zgodnie z procedurą opisaną w ppkt 1.1.3, i przenieść je do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
    4. Wirować przez 5 minut przy 300-500 x g, wyrzucić pożywkę, zebrać komórki świeżą pożywką wzrostową i umieścić je w co najmniej czterech szalkach do hodowli komórkowych o średnicy 100 mm. Liczba komórek w naczyniu będzie zależeć od ilości odzyskanych komórek. Inkubować komórki w temperaturze 33 °C z 10% CO2 (P-HEI-OC1) i ponownie dzielić tyle razy, ile jest to konieczne do planowanych doświadczeń lub do wytworzenia nowego stada.
    5. W celu przygotowania wywaru należy zastąpić szalki o średnicy 100 mm kolbami do hodowli komórkowych o pojemności 250-550 ml; w przypadku eksperymentów bardziej odpowiednie mogą być mniejsze szalki lub płytki wielodołkowe.
    6. W celu różnicowania inkubuj komórki HEI-OC1 w warunkach permisywnych, aż osiągną ~80% konfluencji; następnie przenieś szalki do 39 °C z 5% CO2 (NP-HEI-OC1) przez 2 do 3 tygodni.
      Uwaga: Komórki stopniowo przestają się namnażać i umierać. Zmieniaj pożywkę co drugi dzień, aby usunąć martwe komórki. W zależności od pierwotnej liczby komórek, zwykle po ~ 4 tygodniach nie będzie już więcej komórek dostępnych do eksperymentów. Różnicowanie rozpoczyna się, gdy tylko komórki zostaną umieszczone w warunkach NP, ale nie każda komórka różnicuje się w tym samym tempie. Co ważne, ekspresja prestyny i lokalizacja błony wzrasta podczas procesu różnicowania (patrz Reprezentatywne wyniki, Rysunek 4), zapewniając jakościowe i ilościowe wskazanie poziomu różnicowania.

2. Badania cytotoksyczności leków

Uwaga: Komórki HEI-OC1 hodowane w warunkach dopuszczalnych (P-HEI-OC1) są zalecane do tych badań (patrz Reprezentatywne wyniki, Rysunek 1).

  1. Żywotność komórek (test MTT)
    1. Zebrać komórki P-HEI-OC1 postępując zgodnie z procedurą opisaną w ppkt 1.2 i policzyć je za pomocą automatycznego licznika komórek lub hemocytometru. Dostosuj stężenie do 2,0 x 105 komórek/ml.
    2. Wysiewaj komórki na 96-dołkowych, przezroczystych, płaskich płytkach dennych (100 μl na dołek), inkubuj przez noc w celu przyłączenia do substratu, a następnie potraktuj je interesującymi je lekami. Nie zapomnij dołączyć ślepych prób i komórek niepoddanych działaniu środka (kontrola)!
    3. Po leczeniu farmakologicznym (zwykle 24 lub 48 godzin w temperaturze 33 °C) należy wykonać test MTT zgodnie z protokołem producenta. Ogólnie rzecz biorąc, protokoły dla tego testu obejmują następujące kroki:
      1. Dodać 10 μl odczynnika MTT do każdego dołka.
      2. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 2 do 4 godzin, aż do uzyskania fioletowego barwnika, a następnie dodać 100 μl odczynnika detergentowego MTT do każdego dołka. Nie potrząsaj talerzem.
      3. Przykryj płytkę i pozostaw ją w ciemności na 2 do 4 godzin w temperaturze 37 °C.
      4. Za pomocą czytnika mikropłytek zmierzyć absorbancję przy długości fali 570 nm w każdym dołku, łącznie z ślepymi próbami (samo podłoże wzrostowe). Normalizuj dane, używając średniej OD w komórkach kontrolnych jako 100% żywotności.
  2. Test aktywacji kaspazy 3/7
    Uwaga: Do tych badań zalecane są komórki HEI-OC1 hodowane w warunkach permisywnych (P-HEI-OC1).
    1. Zebrać komórki HEI-OC1 postępując zgodnie z procedurą opisaną w ppkt 1.2 i policzyć je za pomocą automatycznego licznika komórek lub hemocytometru. Dostosuj stężenie do 2,0 x 105 komórek/ml.
    2. Wysiewaj komórki na 96-dołkowych płytkach o białych ściankach (100 μl na dołek), inkubuj przez noc w celu przyłączenia do substratu, a następnie potraktuj je interesującymi je lekami. Nie zapomnij dołączyć ślepych prób i komórek niepoddanych działaniu środka (kontrola)!
    3. Po leczeniu farmakologicznym (zwykle 24 lub 48 godzin w temperaturze 33 °C) należy wykonać test kaspazy zgodnie z protokołem odpowiedniego producenta. Ogólnie rzecz biorąc, protokoły dla tego testu obejmują następujące kroki:
      1. Przygotuj odczynniki, dobrze je wymieszaj i pozwól im zrównoważyć się do temperatury pokojowej.
      2. Wyjąć komórki z inkubatora i pozostawić płytki do wyrównania do temperatury pokojowej.
      3. Dodaj wskazaną ilość odczynnika do każdej studzienki, uważając, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego poprzez niedotykanie studzienek zawierających różne próbki tymi samymi końcówkami pipet.
      4. Przykryj płytkę i mieszaj przez 30 sekund za pomocą wytrząsarki do płytek z prędkością 300-500 obr./min.
      5. Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez okres co najmniej 30 minut. Określić empirycznie optymalny okres inkubacji. Jeśli temperatura w pomieszczeniu ulega wahaniom, należy użyć inkubatora o stałej temperaturze, ponieważ wahania temperatury wpłyną na odczyt luminescencji.
      6. Zmierz luminescencję w każdym dołku i znormalizuj wartości, używając średniej luminescencji w komórkach kontrolnych jako 100% aktywacji kaspazy.
  3. Podział komórek (proliferacja)
    1. Zebrać komórki HEI-OC1 postępując zgodnie z procedurą opisaną w ppkt 1.2 i policzyć je za pomocą automatycznego licznika komórek lub hemocytometru. Dostosuj stężenie do 2,0 x 105 komórek/ml.
    2. Wysiewaj komórki na 96-dołkowych, przezroczystych płytkach o płaskim dnie (100 μl na dołek), inkubuj przez noc w dopuszczalnych warunkach w celu przyłączenia do podłoża, a następnie potraktuj je interesującymi je lekami. Nie zapomnij dołączyć ślepych prób i nietraktowanych komórek (kontrola)!
    3. Godzinę po poddaniu działaniu substancji dodać do każdej studzienki 1 μl przygotowanego 100x roztworu BrdU (5-bromo-2′-deoksyurydyny) i umieścić płytki z powrotem w inkubatorze w temperaturze 33 °C.
    4. Po 12, 24 i 48 godzinach usunąć istniejące podłoże z odpowiednich płytek i przemyć każdą studzienkę raz PBS.
    5. Wykonaj test proliferacji komórek zgodnie z protokołem producenta. Ogólnie rzecz biorąc, protokoły dla tego testu obejmują następujące kroki:
      1. Przygotować odczynniki, w tym roztwór utrwalający/denaturujący, bufor do mycia, roztwór do wykrywania przeciwciał pierwszorzędowych, roztwór do wykrywania przeciwciał wtórnych i roztwór BrdU, jak wskazano w protokole producenta.
      2. Do każdej studzienki dodać roztwór utrwalający/denaturujący w ilościach wskazanych w protokole producenta i utrzymywać płytkę w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
      3. Usunąć roztwór utrwalający/denaturujący i dodać przeciwciało pierwszorzędowe w stężeniu wskazanym w protokole producenta. Trzymaj talerz w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
      4. Usunąć roztwór z przeciwciałem pierwszorzędowym, przemyć płytkę 3 razy buforem do przemywania, a następnie dodać przeciwciało drugorzędowe w stężeniu wskazanym w protokole producenta. Płytkę z przeciwciałem drugorzędowym należy przechowywać w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
      5. Usunąć roztwór z przeciwciałem drugorzędowym, przemyć płytkę 3 razy buforem do przemywania i dodać substrat. Po 10 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej dodać roztwór STOP. Bądź ostrożny: kontroluj zmianę koloru; Jeśli roztwór stanie się bardzo ciemny, należy przerwać reakcję przed standardowym czasem rozwoju wynoszącym 10 minut.
      6. Odczytać absorbancję przy 450 nm w ciągu 30 minut od dodania roztworu STOP.
  4. Cytotoksyczność
    Uwaga: Do tych badań zalecane są komórki HEI-OC1 hodowane w warunkach permisywnych (P-HEI-OC1).
    1. Inkubować w warunkach permisywnych, zwykle przez 24-48 godzin, komórki HEI-OC1 w samej pożywce do hodowli komórkowej (kontrolnej) lub pożywce plus interesujące leki.
    2. Pod koniec zabiegu przemyć komórki trzykrotnie PBS i odłączyć od nich 1 ml na 25cm2 powierzchni nieenzymatycznego roztworu do dysocjacji komórek na 3 minuty.
    3. Po odłączeniu, zebrać i zagnieździć komórki przez odwirowanie przy 3 000 x g przez 5 minut, usunąć supernatant i barwić komórki przez 15 minut w ciemności odczynnikiem zawartym w teście cytotoksyczności.
    4. Określić liczbę żywych komórek HEI-OC1 za pomocą cytometrii przepływowej zgodnie ze wskazaniami producenta cytometru przepływowego.
  5. Starzenie się
    1. Inkubować w warunkach permisywnych, zwykle przez 24-48 godzin, komórki HEI-OC1 w samej pożywce do hodowli komórkowej (kontrolnej) lub pożywce plus interesujące leki.
    2. Określ liczbę komórek dodatnich beta-galaktozydazy związanych ze starzeniem się za pomocą cytometrii przepływowej z protokołem opisanym przez Debacq-Chainiaux i wsp. 15 lub inną metodą, o której wiadomo, że zapewnia wiarygodne wyniki. Krótki protokół cytometrii przepływowej jest następujący:
      1. Pod koniec eksperymentalnych zabiegów przemyć komórki trzykrotnie PBS, a następnie inkubować je ze 100 nM bafilomycyną A1 w pożywce do hodowli komórkowych przez 1 godzinę w warunkach permisywnych.
      2. Dodać C12FDG w końcowym stężeniu ~33 μM i kontynuować inkubację komórek przez 1-2 godziny.
      3. Umyć komórki dwukrotnie PBS, zebrać je używając 1 ml na 25cm2 powierzchni nieenzymatycznego roztworu do dysocjacji komórek przez 3 minuty i granulować je przez odwirowanie przy 3 000 x g przez 5 minut.
      4. Ponownie zawiesić komórki w lodowatym PBS i określić liczbę dodatnich komórek HEI-OC1 za pomocą cytometrii przepływowej, zgodnie ze wskazaniami producenta cytometru przepływowego.
  6. Autofagia
    1. Pobrać komórki kontrolne HEI-OC1 i zagłodzone (pozbawione surowicy przez 48 godzin), postępując zgodnie z procedurą opisaną w punkcie 1.2, i przetworzyć je na Western blot zgodnie ze standardowymi protokołami. Ogólnie rzecz biorąc, protokoły dla Western blot mają następujące kroki:
      1. Wysiewać komórki HEI-OC1 na płytkach 6-dołkowych w stężeniu 1,0 x 105 komórek/ml. Po 24 i/lub 48 godzinach umyj komórki lodowatym PBS.
      2. Liza z 200 μl buforu TNESV (1% NP40, 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM NaCl, 2mM EDTA, 1 mM Na3VO4) z koktajlem inhibitorów proteazy i 1 mM PMSF przez 5 minut na lodzie.
      3. Zebrać komórki (poprzez zeskrobanie dna każdej studzienki), przenieść do probówek do mikrowirówek i odwirować przy 16 800 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
      4. Zebrać supernatanty i określić ilościowo stężenie białka za pomocą testu BCA.
      5. Dodaj 5x bufor ładujący i 1 mM DTT do każdej próbki i gotuj przez 5 minut, aby zdenaturować białka.
      6. Uruchom próbki za pomocą SDS-PAGE na 4-12% żelu i przenieś do membran PVDF.
      7. Zatkać błony 5% beztłuszczowym mlekiem w proszku w TBS-T z 0,1% Tween 20 przez 60 minut w temperaturze pokojowej.
      8. Inkubować błony przez noc w temperaturze 4 °C z przeciwciałami pierwszorzędowymi.
      9. Następnego dnia dokładnie przemyj błony TBS-T i inkubuj z drugorzędowym przeciwciałem IgG sprzężonym z peroksydazą chrzanową (HRP) (1:1,500) przez 1 godzinę.
      10. Wykrywanie immunoreaktywności za pomocą systemu wykrywania wzmocnionej chemiluminescencji (ECL). Normalizuj poziomy ekspresji białka za pomocą GAPDH (1:2,000 w TBS-T z 10% beztłuszczowym mlekiem w proszku) w standardzie.
    2. W Western blot bada się ekspresję co najmniej dwóch różnych markerów autofagii, takich jak Beclin-1 i LC3B (zwykle w rozcieńczeniu 1:1000 w TBS-T z 2,5% BSA). Nie zapomnij poszukać kontroli ekspresji białek, takich jak GAPDH lub aktyna.
    3. Oceń ekspresję białka będącego przedmiotem zainteresowania za pomocą densytometrii za pomocą cyfrowego skanera Blot lub oprogramowania komputerowego, takiego jak domena publiczna NIH Image lub ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/nih-image/).

3. Eksperymenty elektrofizjologiczne z komórkami HEI-OC1

  1. Pobieranie komórek
    Uwaga: Użyj komórek rosnących w szalkach hodowlanych o średnicy 100 mm przy zbiegu 50%-80%. Trypsyna, Accutaza, roztwór bezenzymatyczny lub phosphate- b uffered saline + ethylene diamine tetra a cetic acid(PBS-EDTA) mogą być stosowane do podnoszenia komórek bez znaczącego wpływu na liczbę i jakość gigaseals. Jednak w niektórych przypadkach leczenie trypsyną sprawia, że komórki są bardziej kruche. W takich przypadkach pozwól komórkom zregenerować się przez około 30 minut przed rozpoczęciem eksperymentów.
    1. Przemyć komórki dwukrotnie 10 ml PBS bez Ca2+ i Mg2+.
    2. Dodać 2 ml bezenzymatycznego roztworu odłączającego, takiego jak nieenzymatyczny roztwór do dysocjacji komórek, i inkubować szalki przez 3 minuty w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
    3. Użyj odwróconego mikroskopu, aby sprawdzić oderwanie komórek. W razie potrzeby przesuń naczynie do hodowli komórkowych, aby odłączyć więcej komórek, ale rób to delikatnie.
      Uwaga: Nie potrząsaj naczyniem.
    4. Dodaj 10 ml DMEM+10% FBS i delikatnie odpipetuj komórki w górę i w dół pięć razy za pomocą pipety o pojemności 10 ml.
    5. Przyjrzyj się komórkom pod mikroskopem. Jeśli > 80% komórek jest już oddzielonych (pojedynczych), dalsze pipetowanie nie jest potrzebne. Jeśli komórki nadal znajdują się w skupiskach, powtarzaj delikatne pipetowanie, aż więcej niż 80% komórek będzie pojedynczych.
    6. Umieścić ~10 ml zawieszonych komórek w stożkowej probówce o pojemności 15 ml, wirować przez 2 minuty przy 100 x g i odrzucić supernatant.
    7. Użyj ~200 μl zewnętrznego roztworu rejestrującego (pożywka L-15 firmy Leibovitz dostosowana do 305 - 310 mOsm z wodą destylowaną) do ponownego zawieszenia komórek. Kontrola optyczna komórek powinna pokazać wiele pojedynczych, okrągłych komórek z gładkimi krawędziami błony.
  2. Pomiary patch-clamp i NLC
    1. Wykonywanie patch-clampów i pomiarów pojemności nieliniowej zależnej od napięcia (NLC) przy użyciu odpowiednich wzmacniaczy i oprogramowania, a także standardowych technik elektrofizjologicznych. Jako roztwór wewnętrzny (do pipety) należy użyć 150 mM KCl, 1 mM MgCl2, 0,1 mM EGTA, 2 mM ATP-Mg, 0,1 mM GTP-Na i 10 mM HEPES; dostosuj pH do 7,2 za pomocą Tris.
    2. Pod mikroskopem wybierz pojedynczą, zdrową komórkę z okrągłymi i gładkimi krawędziami błony. Przymocuj końcówkę szklanej pipety do powierzchni kuwety i sprawdź rezystancję membrany. Powinno to wynosić około 3-6 megaomów, co odpowiada średnicy wewnętrznej (ID) końcówki pipety wynoszącej ~2 μm.
    3. Delikatnie dociśnij końcówkę mikropipety do błony komórkowej plazmatycznej, a następnie zastosuj odsysanie. Część błony komórkowej zostanie zassana do pipety, generując opór elektryczny rzędu 10 - 100 gigaOhm (gigaseal).
    4. Ustal stan całej komórki, przerywając błonę plazmatyczną za pomocą impulsów ssących.
    5. Użyj komórek, które nie wykazują ekspresji prestyny, takich jak HEK-293, jako kontrolnego 9.
      Uwaga: Odpowiedzi prądowe powinny być filtrowane na częstotliwości 5 kHz i należy wprowadzić poprawki dotyczące wpływu resztkowej rezystancji szeregowej. Całe gromadzenie danych i większość analiz można przeprowadzić za pomocą oprogramowania zwykle dołączonego do wzmacniaczy typu lock-in. Funkcja pojemności może być dopasowana do pierwszej pochodnej dwustanowej funkcji Boltzmanna odnoszącej ładunek nieliniowy do napięcia membrany 16,

       

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W kilku ostatnich publikacjach przedstawiliśmy obszerny zestaw badań mających na celu ocenę odpowiedzi komórek HEI-OC1 na kilka powszechnie stosowanych leków farmakologicznych, a także zbadanie funkcji prestyny 8,9. W badaniach tych wykorzystano wszystkie protokoły opisane w poprzednich sekcjach.

Jednym z wyników tych poprzednich badań było to, że komórki HEI-OC1 hodowane w warunkach niedopuszczalnych (39 °C/10% CO

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W niniejszym raporcie opisano, w jaki sposób hodować komórki HEI-OC1 i wykorzystywać je do oceny mechanizmów cytotoksyczności indukowanej lekami oraz do badania właściwości funkcjonalnych prestyny, molekularnego silnika OHC ślimaka. Procedury techniczne są jednak na tyle ogólne, że można je łatwo dostosować do różnych badań.

Wszystkie opisane tutaj protokoły wymagają prawidłowego stosowania dobrze znanych technik hodowli komórkowych 10. Podobnie jak w przypadku każdej innej linii ko...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak istniejącego lub potencjalnego konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez NIH Grants R01-DC010146 i R01-DC010397. Wyłączną odpowiedzialność za jego treść ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentuje ona oficjalne stanowisko National Institutes of Health.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
HEI-OC1WSZYSTKIE ZESTAWY TESTOWE, URZĄDZENIA 
Klasa II Szafa bezpieczeństwa biologicznegoThe Baker CompanySterilgard IIII FIRMY WSKAZANE W
Wirówka z chłodzeniemEppendorf5810RPOPRZEDNIE 2 KOLUMNY TO TYLKO
Mikroskop odwróconyZeissAxiovert 25PRZYKŁADY I KAŻDY INNY PODOBNY
WaterbathStovallHWB115MOŻE BYĆ UŻYWANY.
Licznik komórekNexcelomCellometer Auto T4
Dwa (2) inkubatory komórkowe, jeden pod kątem 33 & stopni; C/10% CO2 i inne przy 39 stopniach; C/5% CO2Forma Scientific3110
Szalki do hodowli komórkowych, PS, 100 mm x 20 mm z otworami wentylacyjnymiGreinier Bio-One664-160
Szalki do hodowli komórkowych , PS,  60 mm x 15 mm z otworami wentylacyjnymi Greiner Bio-One628160
Kolby do hodowli tkanek Cellstar  250 mlGreiner Bio-One658-175
Cellstar kultura tkankowa  kolby 550 mlGreiner Bio-One660-175
  Płytka do hodowli komórkowych 6 dołków, z pokrywką - CellstarGreiner Bio-One657-160
Microtest Płytka do hodowli tkankowej, 96 dołków, płaskie dno z pokrywkąBecton Dickinson353072
Micro-Assay-Plate, Chimmey, 96-dołkowa biała, przezroczyste dnoGreiner Bio-One655098
50 ml Polipropylenowa probówka stożkowa z nakrętką CellstarsBecton Dickinson 352070
15 ml Probówki stożkowe polipropylenowe z nakrętką-CellstarsGreiner Bio-One188-271
PBS pH 7,4 (1x) Life Technologies10010-023
Dulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł" s Medium (DMEM)Life Technologies11965-084
Płodowa surowica bydlęca (FBS) HycloneSH10073.1
Leibovitz's L-15 Medium, bez czerwieni fenolowejGibco/Invitrogen21083-027
Trypsyna, 0,25% Life Technologies25200-056
Zestaw do oznaczania proliferacji komórek MTT TACSTrevigen4890-25-K
Caspase-Glo 3/7 Astestping  zestawPromega  G8091 
Zestaw do oznaczania proliferacji komórek BrdU Sygnalizacja komórkowa6813
Nieenzymatyczne rozwiązanie do dysocjacji komórek Sigma-AldrichC5789
Zestaw do oznaczania zielonej cytotoksyczności Cell-ToxPromega  G8741 
Instrument FACSAriaIII BD Nauki Biologiczne  FACSAriaIIIZe wzbudzeniem 488 nm (niebieski laser)
Cyfrowy skaner blotLI-CORC-DiGit
Jednostka do elektroforezy i bibułyHoeferSE300 miniVE
Spectra Max 5 Czytnik płytek z oprogramowaniem Soft Max Pro 5.2Urządzenia molekularneSpectraMax 5
Wzmacniacz krosowyHEKAEPC-10
Ściągacz do przygotowania elektrody krosoweSutter InstrumentsP-97
Komórki PRODUKT

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jat, P. S., et al. Direct derivation of conditionally immortall cell lines from an H-2Kb-tsA58 transgenic mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 5096-5100 (1991).
  2. Kalinec, G. M., Webster, P., Lim, D. J., Kalinec, F. A cochlear cell line as an in vitro system for drug ototoxicity screening. Audiol. Neurootol. 8, 177-189 (2003).
  3. Devarajan, P., et al. Cisplatin-induced apoptosis in auditory cells: role of death receptor and mitochondrial pathways. Hear Res. 174, 45-54 (2002).
  4. Chen, F. Q., Hill, K., Guan, Y. J., Schacht, J., Sha, S. H. Activation of apoptotic pathways in the absence of cell death in an inner-ear immortomouse cell line. Hear Res. 284, 33-41 (2012).
  5. Hayashi, K., et al. The autophagy pathway maintained signaling crosstalk with the Keap1-Nrf2 system through p62 in auditory cells under oxidative stress. Cell Signal. 27, 382-393 (2015).
  6. Tsuchihashi, N. A., et al. Autophagy through 4EBP1 and AMPK regulates oxidative stress-induced premature senescence in auditory cells. Oncotarget. 6, 3644-3655 (2015).
  7. Youn, C. K., Kim, J., Park, J. H., Do, N. Y., Cho, S. I. Role of autophagy in cisplatin-induced ototoxicity. Int J Pediatr Otorhinolaryngol. 79, 1814-1819 (2015).
  8. Kalinec, G., Thein, P., Park, C., Kalinec, F. HEI-OC1 cells as a model for investigating drug cytotoxicity. Hear Res. 335, 105-117 (2016).
  9. Park, C., Thein, P., Kalinec, G., Kalinec, F. HEI-OC1 cells as a model for investigating prestin function. Hear Res. 335, 9-17 (2016).
  10. Celis, J. E. Cell Biology: A Laboratory Handbook. 1, 3rd, Elsevier Academic Press. (2006).
  11. Bertolaso, L., et al. Apoptosis in the OC-k3 immortalized cell line treated with different agents. Audiology. 40, 327-335 (2001).
  12. Kalinec, F., Kalinec, G., Boukhvalova, M., Kachar, B. Establishment and characterization of conditionally immortalized organ of corti cell lines. Cell Biol Int. 23, 175-184 (1999).
  13. Belyantseva, I., Kalinec, G. M., Kalinec, F., Kachar, B. In vitro differentiation of two immortalized cell lines derived from the stria vascularis of a transgenic mouse. 21st Midwinter Meeting Association for Research in Otolaryngology. 620a, (1998).
  14. Gratton, M. A., Meehan, D. T., Smyth, B. J., Cosgrove, D. Strial marginal cells play a role in basement membrane homeostasis: in vitro and in vivo evidence. Hear Res. 163, 27-36 (2002).
  15. Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nat Protoc. 4, 1798-1806 (2009).
  16. Santos-Sacchi, J. Reversible inhibition of voltage-dependent outer hair cell motility and capacitance. J. Neurosci. 11, 3096-3110 (1991).
  17. Fink, S. L., Cookson, B. T. Apoptosis, pyroptosis, and necrosis: mechanistic description of dead and dying eukaryotic cells. Infect Immun. 73, 1907-1916 (2005).
  18. Majno, G., Joris, I. Apoptosis, oncosis, and necrosis. An overview of cell death. Am J Pathol. 146, 3-15 (1995).
  19. Vanden Berghe, T., Linkermann, A., Jouan-Lanhouet, S., Walczak, H., Vandenabeele, P. Regulated necrosis: the expanding network of non-apoptotic cell death pathways. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 135-147 (2014).
  20. Sun, L., Wang, X. A new kind of cell suicide: mechanisms and functions of programmed necrosis. Trends Biochem Sci. 39, 587-593 (2014).
  21. Chan, F. K., Luz, N. F., Moriwaki, K. Programmed necrosis in the cross talk of cell death and inflammation. Annu Rev Immunol. 33, 79-106 (2015).
  22. Vercammen, D., et al. Dual signaling of the Fas receptor: initiation of both apoptotic and necrotic cell death pathways. J Exp Med. 188, 919-930 (1998).
  23. Campisi, J. Aging, cellular senescence, and cancer. Annu Rev Physiol. 75, 685-705 (2013).
  24. Bian, S., Koo, B. W., Kelleher, S., Santos-Sacchi, J., Navaratnam, D. S. A highly expressing Tet-inducible cell line recapitulates in situ developmental changes in prestin's Boltzmann characteristics and reveals early maturational events. Am J Physiol Cell Physiol. 299, C828-C835 (2010).
  25. Abe, T., et al. Developmental expression of the outer hair cell motor prestin in the mouse. J Membr Biol. 215, 49-56 (2007).
  26. Oliver, D., Fakler, B. Expression density and functional characteristics of the outer hair cell motor protein are regulated during postnatal development in rat. J Physiol. 519 Pt 3, 791-800 (1999).
  27. Tsunoo, M., Perlman, H. B. Cochlear Oxygen Tension: Relation to Blood Flow and Function. Acta Otolaryngol. 59, 437-450 (1965).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Kultura kom rektest proliferacjitest ywotno cipatch clampnieliniowa pojemnoekspresja prestynycytometria przep ywowainkubacja temperaturowar nicowanie kom rek

Powiązane artykuły