House Ear Institute-Organ of Corti 1 (HEI-OC1) jest jedną z niewielu linii komórek słuchowych myszy dostępnych obecnie do celów badawczych. Protokół ten opisuje, jak pracować z komórkami HEI-OC1 w celu zbadania cytotoksycznego działania leków farmakologicznych, a także właściwości funkcjonalnych białek ucha wewnętrznego.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Praca z komórkami słuchowymi HEI-OC1
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
HEI-OC1 to jedna z niewielu linii komórek słuchowych myszy dostępnych do celów badawczych. Pierwotnie zaproponowany jako system in vitro do badań przesiewowych leków ototoksycznych, komórki te zostały wykorzystane do badania aktywowanych przez leki szlaków apoptotycznych, autofagii, starzenia, mechanizmu ochrony komórek, reakcji zapalnych, różnicowania komórek, genetycznych i epigenetycznych skutków leków farmakologicznych, skutków niedotlenienia, stresu oksydacyjnego i endoplazmatycznego retikulum oraz ekspresji kanałów molekularnych i receptorów. Wśród kilku innych ważnych markerów komórek rzęsatych ślimaka, komórki HEI-OC1 endogennie eksprymują prestynę, paradygmatyczne białko motoryczne zewnętrznych komórek rzęsatych. W związku z tym mogą być bardzo przydatne do wyjaśnienia nowych aspektów funkcjonalnych tego ważnego białka słuchowego. Komórki HEI-OC1 są bardzo wytrzymałe, a ich hodowla zwykle nie powoduje dużych powikłań. Wymagają jednak pewnych specjalnych warunków, takich jak unikanie stosowania popularnych koktajli przeciwbakteryjnych zawierających streptomycynę lub inne antybiotyki, a także inkubacja w temperaturze 33 °C w celu stymulacji proliferacji komórek i inkubacja w temperaturze 39 °C w celu wywołania różnicowania komórek. W tym miejscu opisujemy, jak hodować komórki HEI-OC1 i jak je wykorzystywać w niektórych typowych testach, takich jak proliferacja komórek, żywotność, śmierć, autofagia i starzenie się, a także jak wykonywać pomiary pojemności patch-clamp i nieliniowe.
Wprowadzenie
House Ear Institute-Organ of Corti 1 (HEI-OC1) komórki pochodzą z narządu słuchowego transgenicznej myszy 1,2. Inkubacja dowolnej komórki tej transgenicznej myszy w temperaturze 33 °C/10% CO2 (warunki permisywne) indukuje ekspresję genu unieśmiertelniającego, który wyzwala dedyferencjację i przyspieszoną proliferację; przemieszczenie komórek do 39 °C/5% CO2 (warunki niedopuszczające) prowadzi do zmniejszenia proliferacji, różnicowania i, przynajmniej w przypadku HEI-OC1, śmierci komórki 2,3.
Komórki HEI-OC1 zostały sklonowane i scharakteryzowane w naszym laboratorium ponad dekadę temu, a wstępne b....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Hodowla komórkowa
Uwaga: Wszystkie protokoły hodowli komórek muszą być wykonywane przy użyciu odpowiednich technik hodowli komórkowych (w celach informacyjnych zobacz pierwsze 3 rozdziały Cell Biology: A Laboratory Handbook, Volume I 10). Komórki HEI-OC1 nie wymagają dodatkowego powlekania ani obróbki szalek z kultur komórkowych w celu prawidłowego przylegania i wzrostu. Bardzo ważne: nie używaj szklanych naczyń do hodowli komórkowych; zmieni się fenotyp i odpowiedź biologiczna komórek na leki farmakologiczne (G Kalinec & F Kalinec, niepublikowane); Zalecane są konwencjonalne plastikowe naczynia do hodowli komórkowych (patrz Tab....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W kilku niedawnych publikacjach przedstawiliśmy kompleksowy zestaw badań mających na celu ocenę odpowiedzi komórek HEI-OC1 na kilka powszechnie stosowanych leków farmakologicznych, a także zbadanie funkcji prestyny 8,9. W badaniach tych wykorzystaliśmy wszystkie protokoły opisane w poprzednich sekcjach.
Jednym z wyników tych wcześniejszych badań było to, że komórki HEI-OC1 hodowane w warunkach niepermisywnych (39 °C/1.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W niniejszym raporcie opisano, w jaki sposób hodować komórki HEI-OC1 i wykorzystywać je do oceny mechanizmów cytotoksyczności indukowanej lekami oraz do badania właściwości funkcjonalnych prestyny, molekularnego silnika OHC ślimaka. Procedury techniczne są jednak na tyle ogólne, że można je łatwo dostosować do różnych badań.
Wszystkie opisane tutaj protokoły wymagają prawidłowego stosowania dobrze znanych technik hodowli komórkowych 10. Podobnie jak w przypadku każdej innej linii ko.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak istniejącego lub potencjalnego konfliktu interesów.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez NIH Grants R01-DC010146 i R01-DC010397. Wyłączną odpowiedzialność za jego treść ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentuje ona oficjalne stanowisko National Institutes of Health.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| HEI-OC1 | WSZYSTKIE ZESTAWY TESTOWE, URZĄDZENIA | ||
| Klasa II Szafa bezpieczeństwa biologicznego | The Baker Company | Sterilgard III | I FIRMY WSKAZANE W |
| Wirówka z chłodzeniem | Eppendorf | 5810R | POPRZEDNIE 2 KOLUMNY TO TYLKO |
| Mikroskop odwrócony | Zeiss | Axiovert 25 | PRZYKŁADY I KAŻDY INNY PODOBNY |
| Waterbath | Stovall | HWB115 | MOŻE BYĆ UŻYWANY. |
| Licznik komórek | Nexcelom | Cellometer Auto T4 | |
| Dwa (2) inkubatory komórkowe, jeden pod kątem 33 & stopni; C/10% CO2 i inne przy 39 stopniach; C/5% CO2 | Forma Scientific | 3110 | |
| Szalki do hodowli komórkowych, PS, 100 mm x 20 mm z otworami wentylacyjnymi | Greinier Bio-One | 664-160 | |
| Szalki do hodowli komórkowych , PS, 60 mm x 15 mm z otworami wentylacyjnymi | Greiner Bio-One | 628160 | |
| Kolby do hodowli tkanek Cellstar 250 ml | Greiner Bio-One | 658-175 | |
| Cellstar kultura tkankowa kolby 550 ml | Greiner Bio-One | 660-175 | |
| Płytka do hodowli komórkowych 6 dołków, z pokrywką - Cellstar | Greiner Bio-One | 657-160 | |
| Microtest Płytka do hodowli tkankowej, 96 dołków, płaskie dno z pokrywką | Becton Dickinson | 353072 | |
| Micro-Assay-Plate, Chimmey, 96-dołkowa biała, przezroczyste dno | Greiner Bio-One | 655098 | |
| 50 ml Polipropylenowa probówka stożkowa z nakrętką Cellstars | Becton Dickinson | 352070 | |
| 15 ml Probówki stożkowe polipropylenowe z nakrętką-Cellstars | Greiner Bio-One | 188-271 | |
| PBS pH 7,4 (1x) | Life Technologies | 10010-023 | |
| Dulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł" s Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965-084 | |
| Płodowa surowica bydlęca (FBS) | Hyclone | SH10073.1 | |
| Leibovitz's L-15 Medium, bez czerwieni fenolowej | Gibco/Invitrogen | 21083-027 | |
| Trypsyna, 0,25% | Life Technologies | 25200-056 | |
| Zestaw do oznaczania proliferacji komórek MTT TACS | Trevigen | 4890-25-K | |
| Caspase-Glo 3/7 Astestping zestaw | Promega | G8091 | |
| Zestaw do oznaczania proliferacji komórek BrdU | Sygnalizacja komórkowa | 6813 | |
| Nieenzymatyczne rozwiązanie do dysocjacji komórek | Sigma-Aldrich | C5789 | |
| Zestaw do oznaczania zielonej cytotoksyczności Cell-Tox | Promega | G8741 | |
| Instrument FACSAriaIII | BD Nauki Biologiczne | FACSAriaIII | Ze wzbudzeniem 488 nm (niebieski laser) |
| Cyfrowy skaner blot | LI-COR | C-DiGit | |
| Jednostka do elektroforezy i bibuły | Hoefer | SE300 miniVE | |
| Spectra Max 5 Czytnik płytek z oprogramowaniem Soft Max Pro 5.2 | Urządzenia molekularne | SpectraMax 5 | |
| Wzmacniacz krosowy | HEKA | EPC-10 | |
| Ściągacz do przygotowania elektrody krosowe | Sutter Instruments | P-97 |
Bibliografia
- Jat, P. S., et al. Direct derivation of conditionally immortall cell lines from an H-2Kb-tsA58 transgenic mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 5096-5100 (1991).
- Kalinec, G. M., Webster, P., Lim, D. J., Kalinec, F. A cochlear cell li....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
