Zakażenie dróg moczowych w modelu małego zwierzęcia: cewnikowanie przezcewkowe samców i samic myszy

Podsumowanie

Ustalony model przezcewkowego cewnikowania myszy pozwala na badanie patologii pęcherza moczowego, w tym infekcji dróg moczowych, ale może być wykonywane tylko u samic. Zaprezentowany tu nowy model wkraplania przezcewkowego u mężczyzn umożliwi prowadzenie badań w obszarze charakteryzującym się silnymi różnicami klinicznymi i epidemiologicznymi między płciami.

Streszczenie

Infekcje dróg moczowych (UTI) są niezwykle powszechne na całym świecie, powodując znaczną zachorowalność i wydatki związane z opieką zdrowotną. Małe modele zwierzęce, które dokładnie odzwierciedlają powstawanie i postęp choroby, pozwalają na analizę interakcji gospodarz-patogen i generowanie odporności na infekcje. U myszy dopęcherzowe wkroplenie uropatogennej E. coli, czynnika wywołującego u ponad 85% zakażeń układu moczowego nabytych w społeczności, podsumowuje wiele etapów infekcji obserwowanych u ludzi. Do niedawna jednak ZUM można było modelować tylko u samic. To ograniczenie utrudniło badanie różnic związanych z płcią w ZUM, a także innych patologii pęcherza moczowego, takich jak rak. W tym miejscu opisujemy metodę wpajania samcom myszy, która umożliwia bezpośrednie porównanie samic i samców zwierząt oraz zapewnia szczegółowy protokół oceny tkanki pęcherza moczowego za pomocą cytometrii przepływowej jako sposób na lepsze zrozumienie reakcji gospodarza na infekcję. Łącznie podejścia te pomogą w identyfikacji czynników gospodarza, które przyczyniają się do uprzedzeń płciowych obserwowanych w ZUM i innych chorobach związanych z pęcherzem moczowym.

Wprowadzenie

Infekcje dróg moczowych (ZUM) są jednymi z najczęstszych infekcji w krajach rozwiniętych¹. Wskaźniki zakażeń są podobne wśród kobiet i mężczyzn wśród noworodków i osób starszych². Dorosłe kobiety przed menopauzą mają jednak znacznie zwiększoną częstość występowania ZUM nabytego przez społeczność w porównaniu z mężczyznami^2,3. Biorąc pod uwagę, że choroba ta dotyka przede wszystkim kobiety, badania podstawowe i kliniczne w przeważającej mierze koncentrują się na ZUM u kobiet. Jednak ZUM u mężczyzn jest poważnym i niedostatecznie zbadanym wyzwaniem w zakresie opieki zdrowotnej⁴. Rzeczywiście, ponieważ ZUM u mężczyzn wiąże się z większą zachorowalnością, infekcje te są rutynowo definiowane jako skomplikowane^4,5.

W miarę rozwoju naszego zrozumienia kluczowej roli uprzedzeń płciowych w fizjologii i patologii, potrzebne są nowe metody do zbadania tego wcześniej zaniedbywanego aspektu choroby. Różnice płci odgrywają zasadniczą rolę w odporności i infekcjach; Kobiety częściej zapadają na choroby autoimmunologiczne, podczas gdy mężczyźni są bardziej podatni na niektóre infekcje, takie jak gruźlica, malaria i HIV^6,7. Rak pęcherza moczowego, inna patologia urologiczna, występuje znacznie częściej u mężczyzn niż u kobiet, a kilka badań wykazało rolę androgenów w rozwoju nowotworu złośliwego8^,9^,10,11,12. Warto jednak zauważyć, że badania nad dopęcherzowymi terapiami raka pęcherza moczowego są prowadzone wyłącznie na samicach zwierząt, ze względu na niemożność wielokrotnego cewnikowania samców myszy¹³.

Badanie patogenezy infekcji dróg moczowych opiera się głównie na modelach infekcji u gryzoni (np. myszy i szczurów). Mysie modele ZUM mogą wykorzystywać uropatogeny pierwotnie wyizolowane z ludzkich infekcji, takie jak uropatogenne E. coli (UPEC), Klebsiella, Enterococcus, Staphylococcus lub Proteus¹⁴. Zazwyczaj bakterie są wprowadzane do pęcherza moczowego poprzez cewnikowanie cewki moczowej. Po zakażeniu pęcherze moczowe i nerki mogą zostać usunięte w celu oceny określonych parametrów infekcji, takich jak kolonizacja bakteryjna, uszkodzenie tkanek lub odpowiedź immunologiczna gospodarza^15,16. Powszechnie jednak do badań nad ZUM wykorzystuje się tylko samice zwierząt. Rzeczywiście, wiele badań wykazało, że z przyczyn anatomicznych cewnikowanie samców myszy nie jest możliwe^13,17,18,19. Niedawno opisano chirurgiczne podejście do wkraplania męskiego, w którym brzuch jest otwierany, pęcherz jest przemieszczany zewnętrznie poprzez delikatny nacisk na otwór w jamie brzusznej, a bakterie są wstrzykiwane do pęcherza²⁰. Takie podejście umożliwia zakażenie u mężczyzn, kosztem interwencji chirurgicznej. Tak więc głównym zastrzeżeniem tego podejścia jest wpływ stanu zapalnego na wynik infekcji, taki jak możliwość wywołania przeciwzapalnej odpowiedzi gojenia się ran po nacięciu²¹. Ponieważ nasze zainteresowania obejmują zrozumienie uprzedzeń płciowych w odpowiedzi na chorobę, opracowaliśmy metodę bakteryjnego wkraplania dopęcherzowego u samców myszy, która bardziej odpowiada długotrwałemu niechirurgicznemu podejściu przezcewkowemu stosowanemu u samic gryzoni²².

Nasz model opiera się na ustalonej metodologii i umożliwia bezpośrednie porównanie odpowiedzi immunologicznej gospodarza na ZUM u samic i samców. Metoda ta pozwoli na analizę różnic w zakażeniu ze względu na płeć i potencjalnie dostarczy molekularnych i komórkowych wskazówek dotyczących wyraźnych różnic w podatności i odpowiedzi na infekcję między płciami. Ponadto model ten ma wartość wykraczającą poza badania ZUM, umożliwiając ustanowienie modeli do badania innych chorób związanych z pęcherzem moczowym, takich jak rak pęcherza moczowego, zapalenie gruczołu krokowego, zespół niedoczynności lub nadczynności pęcherza moczowego oraz śródmiąższowe zapalenie pęcherza

moczowego.

Protokół

Eksperymenty na myszach zostały przeprowadzone zgodnie z zatwierdzeniem protokołu nr 2012-0024 przez Comité d'éthique en expérimentation animale Paris Centre et Sud (komisja etyki ds. doświadczeń na zwierzętach), zgodnie z Dyrektywą Europejską 2010/63 UE.

1. Przygotowanie cewników

1. Przygotuj jedną pediatryczną kaniulę o dostępie dożylnym dla każdej grupy myszy, która ma zostać zakażona. Korzystając z wbudowanego mechanizmu sprężynowego, odłącz każdą kaniulę od igły, zgodnie z instrukcją producenta. Wyrzuć igły, zachowując tylko plastikową kaniulę dożylną.
2. Sterylizuj cewniki w kapturze z przepływem laminarnym przez jeden cykl ultrafioletowy (UV), zwykle 25 - 30 min.
   Uwaga: Cewniki mogą być używane dla więcej niż jednej myszy, jednak nowy cewnik powinien być używany między grupami eksperymentalnymi, płciami lub szczepami bakterii.

2. Przygotowanie uropatogennej E. coli do infekcji

1. Co najmniej dwa dni przed zakażeniem, używając sterylnej pętli do zaszczepiania, rozprowadź UPEC z zamrożonego wywaru bakteryjnego na płytce agarowej Luria Bulion (LB), zawierającej antybiotyki, jeśli to konieczne. Inkubować w temperaturze 37 °C przez noc. Talerze można przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do jednego tygodnia.
2. W sterylnej kolbie Erlenmeyera o pojemności 100 ml zaszczepić 10 ml LB, zawierającej antybiotyki, jeśli to właściwe, pojedynczą kolonią z płytki LB i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc (około 16-18 godzin).
   Uwaga: Stałe kultury pozwalają na ekspresję pilusów typu 1, które są niezbędne do infekcji²³. Kultury wyhodowane w potrząśnięciu będą miały mniej wydajną ekspresję pilusów, a tym samym niespójne wskaźniki infekcji.
3. Zmierzyć gęstość optyczną (OD)₆₀₀ w nocnej hodowli i obliczyć liczbę bakterii na ml, korzystając z wcześniej ustalonej krzywej wzrostu. Na przykład dla szczepu UPEC UTI89, OD₆₀₀ = 0,35 odpowiada 2 x 10⁸ CFU na ml, a zatem hodowla przez noc z OD₆₀₀ = 2,4 byłaby równoważna 13,7 x 10⁸ CFU na ml. Empirycznie określ związek między OD₆₀₀ a żywymi bakteriami z każdym nowym szczepem wykorzystywanym do infekcji.
4. Określ potrzebną ilość bakterii, biorąc pod uwagę liczbę zwierząt, które mają zostać zakażone i że każda mysz powinna otrzymać około 10⁷ jednostek tworzących kolonie (CFU) w 50 μl PBS. Uwzględnij w obliczeniach ~130 μl martwej objętości cewnika i wypustki strzykawki oraz 100 μl potrzebnych do określenia inokulum.
   1. Wirować zawiesinę bakteryjną w mikrowirówce stołowej o sile 17 000 x g przez 1 minutę i ponownie zawiesić powstałą osadkę bakteryjną w ilości 2 x 10⁸ jtk/ml w PBS. Seryjnie rozcieńczyć porcję tej zawiesiny i płytki na agarze LB, w razie potrzeby antybiotykami, w celu określenia dokładnego inokulum dla każdego zakażenia.
5. Narysuj inokulum bakteryjne do strzykawki o pojemności 1 ml i przymocuj cewnik do końca strzykawki. Postukać w strzykawkę, aby usunąć powietrze i wcisnąć tłok, aby wypełnić martwą przestrzeń powietrzną w cewniku przed rozpoczęciem wkraplania.

3. Przygotowanie myszy

1. Znieczulenie myszy poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie 100 mg/kg ketaminy i 5 mg/kg ksylazyny. Można zapewnić dodatkowe ciepło.
2. Upewnij się, że każda mysz jest w pełni uspokojona, ściskając podnóżek ze średnim naciskiem. Myszy są w pełni uspokojone, gdy nie reagują i potrzebują 3 - 5 minut, aby osiągnąć ten stan.
3. Ułóż myszy na wznak i wywieraj średni nacisk na dolną część brzucha, aby opróżnić pęcherz z moczu. Pełne pęcherze są jak ziarnko grochu pod skórą między grzbietami jelita krętego.
   Uwaga: Wziewny izofluran był używany do cewnikowania samic myszy ^15,22, jednak nie przetestowano, czy samce myszy są wystarczająco znieczulone przez wziewny izofluran do tej procedury.

4. Przezcewkowe wkraplanie samicom myszy

1. Używając ręki niedominującej, połóż kciuk na ogonie, a palec tej samej ręki na brzuchu myszy i delikatnie uciskaj w przeciwnych kierunkach, aby mocno utrzymać mysz w miejscu.
2. Umieść końcówkę cewnika prostopadle do myszy przy ujściu cewki moczowej. Delikatnie uciskając wsuń cewnik do cewki moczowej, aż piasta zetknie się z ujściem cewki moczowej, jednocześnie opuszczając strzykawkę tak, aby była równoległa do powierzchni roboczej. Cewnik nie wymaga smarowania. Nie należy wciskać ani wciskać cewnika na siłę do cewki moczowej. Cewnik powinien płynnie i łatwo wsuwać się do cewki moczowej, z niewielkim lub zerowym oporem.
   1. Przed wkropleniem inokulum (krok 4.3), gdy cewnik jest już na miejscu, bardzo delikatnie pociągnij skórę brzucha w kierunku głowy myszy palcem z ręki niedominującej, która znajduje się już na brzuchu myszy (krok 4.1). Jeśli cewnik znajduje się w cewce moczowej, tkanka tworząca ujście cewki moczowej nie będzie się poruszać, natomiast jeśli cewnik zostanie nieprawidłowo umieszczony w pochwie, tkanka przesunie się w górę i odsunie się od cewnika. Ten szybki test należy wykonać na każdej myszy.
3. Gdy piasta cewnika zetknie się z ujściem cewki moczowej, powoli dozuj 50 μl inokulum bakteryjnego. Powolne tempo wkraplania minimalizuje odpływ pęcherzowo-moczowodowy do nerki. Powoli wyjmij cewnik, aby zapobiec wyciekowi, powyżej 5 razy. Umieść myszy w klatkach w pozycji leżącej.

5. Wkraplanie przezcewkowe samcom myszy

1. Przyłóż dwa kleszcze do kciuków czaszkowo i doogonowo do zewnętrznych narządów płciowych myszy. Cofnij napletek, aby w pełni odsłonić żołądź prącia. Gdy penis znajdzie się na zewnątrz, zwolnij kleszcze kciuka.
2. Zmień położenie kleszczy, aby ustabilizować wystającego penisa prostopadle do zwierzęcia, przytrzymując narząd delikatnie, ale mocno. Uwidocznij ujście cewki moczowej i ostrożnie wprowadź cewnik do małego otworu na końcu narządu. Delikatnie wprowadź cewnik do penisa, w kierunku ciała myszy, utrzymując delikatne napięcie kleszczami. Cewnik nie wymaga smarowania. Nie wciskaj cewnika na siłę do penisa; Cewnik powinien płynnie wsunąć się do cewki moczowej, wskazując prawidłowe umieszczenie.
3. Gdy piasta cewnika zetknie się z czubkiem prącia, bardzo powoli dozuj 50 μl inokulum, zachowując pozycję prącia. Jakość wkraplania można w tym czasie odnotować zgodnie z wcześniej ustaloną oceną jakości wkraplania, taką jak pokazana na rysunku 2.
4. Wycofaj cewnik powoli, powyżej liczby 5, aby zapobiec wyciekowi inokulum. Umieść myszy w klatkach w pozycji leżącej. Zwierzęta powinny zacząć wracać do zdrowia po 30 - 45 minutach od podania środka znieczulającego.

6. Oznaczanie CFU w zakażonych narządach

1. W określonych punktach czasowych należy złożyć ofiary myszy przy użyciu zatwierdzonych standardowych procedur operacyjnych (np. zwichnięcie szyjki macicy lub przedawkowanie dwutlenku węgla). Dokładnie zwilż brzuch 70% etanolem, aby zminimalizować zanieczyszczenie sierścią.
2. Wykonaj nacięcie w poprzek dolnej jednej trzeciej brzucha myszy o długości co najmniej 2 cm za pomocą nożyczek i aseptycznie usuń pęcherz moczowy i wszelkie inne pożądane narządy, w tym między innymi nerki, jądra, pęcherzyki nasienne lub gruczoły napletkowe, w 5 ml polipropylenowych probówkach zatrzaskowych zawierających 1 ml sterylnego PBS. Wszystkie próbki należy przechowywać na lodzie.
3. Homogenizuj narządy za pomocą ręcznego homogenizatora, aż prawie nie pozostanie tkanka stała, około 15 - 60 sekund, w zależności od narządu. Tłuszcz nie homogenizuje się dobrze i jest łatwo rozpoznawalny jako błyszcząca, beżowo-biała tkanka. Wyrzucić tłuszcz przed lub po homogenizacji. Przemyć homogenizator w etanolu, a następnie PBS między każdą grupą doświadczalną lub grupą narządów.
   Uwaga: Zazwyczaj należy używać homogenizatorów ręcznych lub homogenizatorów z młynkiem perełkowym. Chociaż wszystkie te systemy dały podobne wyniki, określone przez bezpośrednie porównanie bakteryjnej CFU po 24 godzinach od infekcji, optymalne warunki do homogenizacji tkanki gospodarza przy jednoczesnym zachowaniu żywotności bakterii powinny zostać określone empirycznie przed rutynowym wykonaniem tego protokołu.
4. Wykonać seryjne rozcieńczenia homogenizowanych zawiesin narządów. Rozcieńczenia na płytkach agarowych LB, zawierające antybiotyki, jeśli to właściwe, i inkubować przez noc (~15 godzin) w temperaturze 37 °C. Szczepy UPEC mają bardzo krótki czas podwajania i w związku z tym należy uważać, aby nie inkubować płytek agarowych zbyt długo, ponieważ utrudni to liczenie pojedynczych kolonii.

7. Analiza cytometryczna przepływu tkanki pęcherza moczowego

1. Przygotować bufor do wytrawiania zawierający kolagenazę w stężeniu 34 jednostek/ml i DNazę w stężeniu 100 μg/ml w PBS. Trzymaj na lodzie. Przygotować jedną stożkową probówkę o pojemności 15 ml na zwierzę do analizy i podamy 1 ml buforu do wytrawiania na probówkę.
2. W określonych punktach czasowych należy poświęcić myszy przy użyciu zatwierdzonych standardowych procedur operacyjnych (np. zwichnięcie szyjki macicy lub przedawkowanie dwutlenku węgla). Dokładnie zwilż brzuch 70% etanolem, aby zminimalizować zanieczyszczenie sierścią.
3. Wykonaj nacięcie w poprzek dolnej jednej trzeciej brzucha myszy o długości co najmniej 2 cm za pomocą nożyczek i usuń cały pęcherz. Dobrze zmiel nożyczkami, krojąc pęcherz na 2 - 3 mm kawałki wielkości², zwykle około 8 sztuk.
   1. Dodać jeden zmielony pęcherz do probówki zawierającej bufor wytrawiający. Wstrząśnij, aby przemyć zmieloną tkankę pęcherza moczowego do buforu do wytrawiania. Trzymaj na lodzie, aż wszystkie pęcherze zostaną wycięte i zmielone.
4. Inkubować rozdrobnione pęcherze przez 60 - 75 minut w temperaturze 37 °C, energicznie potrząsając ręką przez 5 s co 15 minut. Kiedy tkanka ma szklisty, przezroczysty wygląd, przypominający mokrą bibułkę, trawienie jest zakończone. Przedłużone trawienie usunie białka powierzchniowe z komórek potrzebnych do identyfikacji i należy tego unikać.
5. Dezaktywować enzymy trawiące przez dodanie 2 - 3 ml lodowatego buforu cytometrii przepływowej (PBS zawierający 2% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 0,2 mM EDTA) i delikatnie wymieszać. Umieść probówki na lodzie.
6. Aby zapewnić zawiesinę pojedynczej komórki i usunąć tkankę łączną, przepuścić zawartość probówki przez filtr 100 μm umieszczony w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Delikatnie przecisnąć pozostałą tkankę przez filtr końcem tłoka strzykawki. Przemyć filtr dodatkowym buforem do cytometrii przepływowej o pojemności 2 ml. Próbki należy przechowywać na lodzie.
7. Przemywać próbki przez odwirowywanie przez 7 minut w temperaturze 200 x g, 4 °C. Zawiesić osady w 100 μl buforze cytometrii przepływowej zawierającym blok Fc, rozcieńczonym do 5 μg/ml i przenieść na 96-dołkową okrągłą płytkę denną. Po 10 - 15 minutach dodaj 100 μl pożądanego koktajlu przeciwciał do każdej próbki. Próbki inkubować przez 30 - 45 minut, na lodzie, chronić przed światłem.
   Uwaga: Blok Fc jest odczynnikiem stosowanym w celu zapobiegania wiązaniu się części Fc przeciwciał z komórkami eksprymującymi receptory Fc. Jego celem jest zminimalizowanie nieswoistego wiązania przeciwciał. Określenie przeciwciał do użycia będzie zależało od hipotezy testowanej w eksperymencie i powinno być wybrane na podstawie danych z literatury. Na rycinie 3, aby zmierzyć ogólny naciekanie komórek odpornościowych, zastosowano przeciwciało anty-CD45, które jest białkiem komórek panimmunologicznych.
8. Przemywać próbki przez odwirowywanie przez 7 minut w temperaturze 200 x g, 4 °C. Ponownie zawiesić granulki komórek w buforze do cytometrii przepływowej o pojemności 200 μl i przepuścić próbki przez sitko o wielkości 40 μm na probówce z polistyrenu o pojemności 5 ml tuż przed pobraniem na cytometr przepływowy.
9. Pobrać całą próbkę na cytometr przepływowy. Dobre trawienie da 200 000 - 400 000 komórek, z 8 000 - 10 000 komórek odpornościowych CD45 ⁺ z naiwnych pęcherzy myszy, podczas gdy zakażone narządy będą zawierały więcej komórek¹⁶ (ryc. 3).
   Uwaga: Próbki przygotowane do analizy metodą cytometrii przepływowej nie mogą być używane do oceny jtk. Nie zaleca się dzielenia pęcherza moczowego na dwie części, ponieważ nie ma dowodów na to, że kolonizacja UPEC lub infiltracja komórek odpornościowych jest jednolita w całej tkance.

Wyniki

Podczas opracowywania niniejszego protokołu przeprowadzono instylację u grup samic i samców myszy C57Bl/6 w wieku od 6 do 8 tygodni, a następnie oceniono obciążenie bakteryjne w pęcherzach moczowych w punktach czasowych od 1 h do 30 dni. Wyniki tych badań zostały szczegółowo opisane w innej publikacji (Zychlinsky Scharff et al., w przygotowaniu). Tutaj przedstawiamy reprezentatywne dane z infekcji trwających 24 h. Co istotne, obciążenie bakteryjne było zbliżone u samców i samic m...

Dyskusja

Wkraplanie przezcewkowe samcom myszy oferuje wiele nowych możliwości badawczych nad wpływem płci na choroby błony śluzowej pęcherza moczowego, ale wiąże się również z kilkoma wyzwaniami. Przede wszystkim jednym z ograniczeń jest to, że wkroplenie może początkowo okazać się trudne technicznie, co skutkuje nadmiernym stanem zapalnym podczas wprowadzania cewnika. Poprawę techniki można osiągnąć poprzez wkroplenie martwych myszy kolorowym roztworem, takim jak niebieski barwnik Evans. Aby potwierdzić, że zakroplenie się powio...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Osłonięte cewniki dożylne BD Insyte Autoguard 24 G, średnica zewnętrzna 0,7 mm, długość 14 mM	BD Medical	381811 lub 381411*	* to zależna od kraju
pętla inokulacyjna	Greiner Bio-One	731171
LB Rosół Miller	Difco	244620
LB Agar Miller	Difco	244520
Kuwety	Bio-rad	223-9955
strzykawki	B Braun	9166017V
Kleszczyki do kciuków (Adson)	Fine Science Tools	11006-12
Probówki 5 ml, polipropylen	Falcon	352063
Tissue Jednorazowe sondy Ruptor	Qiagen	990890
15 ml probówki z klapką	Thermo Scientific	362694
DNAse	Invitrogen	18047019
Liberase TM	Sigma-Aldrich	5401119001	należy podkwotować i przechowywać w temperaturze -20 °; C, aby uniknąć wielokrotnego zamrażania i rozmrażania
100 &mikro; Inteligentne filtry siatkowe M MACS	Miltenyi	130-098-463	kompatybilny z tubkami 15 ml, preferowane
100 i mikro; M Sitka komórkowe	Falcon	352360	kompatybilny z probówkami 50 ml, jeśli MACS Smart Sitka nie są dostępne
96-dołkowa płytka	Falcon	353077
Fc blok	BD Pharmingen	553142	anty-CD16/CD32
anty-mysie przeciwciało CD45	BD Biosciences	561487	wiele różnych opcji koniugacji fluorescencyjnej Probówki
5 ml polistyren z nasadką filtrującą	Falcon
strzykawka insulinowa	Terumo	BS05M2913
ręczny homogenizator	Qiagen	9001272	TissueCytometr przepływowy Ruptor
	BD Biosciences	N/A	Fortessa SORP
Oprogramowanie do cytometrii przepływowej	BD Biosciences	N/A Diva

Numer katalogowy 352235