Wychwytywanie i uwalnianie żywotnych krążących komórek nowotworowych z krwi

Choroba przerzutowa jest odpowiedzialna za większość zgonów z powodu raka. Opracowanie prognostycznego i towarzyszącego biomarkera diagnostycznego przerzutów ma kluczowe znaczenie w leczeniu i leczeniu raka. Krążące komórki nowotworowe (CTC) odgrywają kluczową rolę w rozprzestrzenianiu się guza i przerzutach. Co więcej, CTC w krwi obwodowej pacjentów z rakiem jest łatwo dostępny jako biomarker "płynnej biopsji", stając się "wylęgarnią" badań nad biomarkerami raka. CTC zostały dobrze zwalidowane jako biomarker prognostyczny w różnych stanach nowotworowych, w tym w raku piersi, prostaty i jelita grubego ^1-3. Jednak ostatnie postępy w dziedzinie CTC wskazują, że samo wyliczenie tych rzadkich komórek ma ograniczoną użyteczność kliniczną, jak wykazano w interwencyjnych badaniach klinicznych⁴. W związku z tym pojawia się zapotrzebowanie na technologie, które pozwolą na molekularną i funkcjonalną charakterystykę CTC. Obecnie istnieje tylko kilka technologii, które pozwalają na niestronnicze, realne wychwytywanie i uwalnianie CTC bez uprzedzeń antygenowych, umożliwiając solidną analizę molekularną i funkcjonalną^5,6. Większość tych mikrofabrykowanych urządzeń jest sprzężona z platformami mikroprzepływowymi, a zatem mają czynnik ograniczający ilość krwi, którą można przetworzyć, która waha się od 2-4 ml ^7-10 . CTC są rzadkimi zdarzeniami w pojedynczej probówce pobranej krwi (7,5 ml), dlatego dalsze zmniejszenie ilości krwi, która może być przetworzona, znacznie zmniejsza szanse na uchwycenie i wyizolowanie tych interesujących komórek.

Opracowaliśmy dwa rodzaje urządzeń do mikrofiltrów membranowych Parylene C do wychwytywania CTC, które wykorzystują różnice wielkości między większymi komórkami nowotworowymi a mniejszymi normalnymi komórkami krwi^11,12. Wcześniej informowaliśmy o filtrze do oznaczania liczby porów okrągłych i porównaliśmy go z platformą zatwierdzoną przez FDA, w której wykazano, że mikrofiltr jest lepszy pod względem skuteczności wychwytywania CTC dla próbek krwi pacjentów z rakiem^13,14. Ograniczeniem filtra okrągłego jest jednak konieczność użycia utrwalacza na bazie formaldehydu przed filtracją. Proces ten zachowuje morfologię komórek, jednocześnie pozwalając im wytrzymać naprężenia ścinające i ciśnienie podczas procesu filtracji. Podczas gdy wyliczanie i badania molekularne mogą być wykonywane na chipie¹³, utrwalacz upośledza zdolność do przeprowadzenia charakterystyki funkcjonalnej. Aby rozwiązać ten problem, opracowaliśmy szczelinowy filtr porowy, który eliminuje konieczność naprawiania komórek przed filtracją (rysunek 1). Geometria porów szczelinowych (6 μm szerokości x 40 μm długości) pozwala na uchwycenie komórek nowotworowych, jednocześnie tylko częściowo zamykając pory, a tym samym nadal umożliwiając swobodny przepływ innym komórkom krwi i łagodząc wzrost ciśnienia, który doprowadziłby do uszkodzenia komórek i ostatecznego pęknięcia^15,16 Wkład porów szczelinowych składa się z 2 kawałków akrylu, które umieszczają filtr porów szczelinowych między górą a dołem z polidimetylosiloksanem (PDMS) działającym jako uszczelka zapewniająca szczelne^{uszczelnienie 14,15} (rysunek 1).

Podczas gdy skuteczność wychwytywania filtra porów szczelinowych jest wysoka, (Tabela 1), wychwycone CTC są związane z membraną Parylenu C przez silne niespecyficzne oddziaływania elektrostatyczne, a nie adhezję za pośrednictwem macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM)¹⁵. Metody takie jak przepływ wsteczny lub użycie skrobaków do komórek nie są w stanie skutecznie uwolnić komórek z filtra lub powodują uszkodzenie komórek i śmierć komórek. Zbadaliśmy niekonwencjonalne zastosowanie PIPAAm do sformułowania strategii wydawniczej¹⁵. PIPAAm jest polimerem, który ulega odwracalnej przemianie fazowej roztworu o niższej temperaturze krytycznej (LCST) przy temperaturze roztworu 32 °C¹⁷. Tradycyjnie, ta właściwość PIPAAm była szeroko badana w zastosowaniach inżynierii tkankowej. Zazwyczaj komórki są hodowane na powierzchniach pokrytych PIPAAm w temperaturze 37 °C, gdy PIPAAm jest hydrofobowy. Komórki można następnie odłączyć jako arkusz, gdy temperatura hodowli zostanie przesunięta poniżej 32 °C, gdzie powierzchnia pokryta PIPAAm zostanie uwodniona^17,18. Wykorzystaliśmy tę właściwość termiczną, przeprowadzając proces filtracji w temperaturze pokojowej (poniżej 32 °C), a następnie umożliwiając uwalnianie komórek poprzez umieszczenie filtra w pożywce hodowlanej utrzymywanej w temperaturze 37 °C. W tej temperaturze warstwa polimeru PIPAAm staje się hydrofobowa, uwalniając w ten sposób elektrostatycznie związane ogniwa¹⁵ (ryc. 1).

Chociaż metoda reagująca na temperaturę, jak również inne metody, zostały z powodzeniem wdrożone w celu osiągnięcia realnego wychwytywania i uwalniania CTC^19-21, jedną z kluczowych potencjalnych wad tych zgłoszonych technologii jest to, że wszystkie wykorzystują zasadę zależną od antygenu do wychwytywania CTC. Wychwytywanie CTC na podstawie antygenu, jak wykazano wcześniej, może prowadzić do tendencyjnej analizy CTC^11,14. Na przykład wiele technologii opartych na powinowactwie wykorzystuje przeciwciało, które wiąże EpCAM w celu wychwytywania CTC. Wykazano jednak, że CTC wyraża różne poziomy EpCAM, co prowadzi do pominięcia niskiego poziomu EpCAM i ujemnego EpCAM CTC przez te technologie. Ograniczenia mogą również wystąpić, gdy w grę wchodzi CTC pochodzenia nienabłonkowego, np. CTC w warunkach czerniaka i mięsaka. W związku z tym wysoce pożądana jest technologia, która pozwala na realne wychwytywanie i uwalnianie CTC bez potencjalnego odchylenia wprowadzonego przez wychwytywanie na podstawie antygenu.

Co ważne, urządzenie do wychwytywania mikrofiltrów jest oparte wyłącznie na rozmiarach, a strategia uwalniania jest niezależna od obecności pewnych znaczników powierzchniowych. Wierzymy, że zastosowanie mikrofiltra z powłoką PIPAAm pomoże poszerzyć naszą wiedzę na temat procesu przerzutowego, zapewniając możliwość skutecznego i wydajnego wychwytywania i uwalniania CTC do dalszych analiz. Może to potencjalnie ujawnić nowe cząsteczki, dla których mogą być ukierunkowane nowe celowane terapie ogólnoustrojowe, a także zapewnić biomarker, który można łatwo monitorować i pomóc w leczeniu pacjentów z rakiem.

Oświadczenie etyczne: Aby chronić prawa ludzi, próbki krwi zostały pobrane po uzyskaniu świadomej zgody zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez instytucjonalne komisje rewizyjne Uniwersytetu w Miami na mocy IRB 20150020.
UWAGA: Krew, która ma być przefiltrowana w celu wychwycenia CTC, powinna być zebrana w probówce EDTA, aby zapobiec krzepnięciu.

1. Powlekanie mikrofiltra poli(N-izopropyloakrylamidem) (PIPAAm)

1. Odważyć PIPAAm, aby przygotować 10% w/v roztwór butanolu. Mieszaj za pomocą wiru, aż roztwór będzie klarowny.
2. Pokrój plastikowe szkiełka mikroskopowe na kwadraty o wymiarach około 12 mm x 12 mm za pomocą nożyczek lub ostrego ostrza. Alternatywnie użyj gilotyny.
   UWAGA: Te kwadraty będą służyć jako uchwyt na filtry podczas procesu powlekania wirowego.
3. Za pomocą ostrych nożyczek o prostych krawędziach pokrój wafel mikrofiltra z porami szczelinowymi na kwadraty o wymiarach 8 mm x 8 mm.
4. Za pomocą poliimidowej taśmy filmowej przymocuj przycięte filtry do plastikowych kwadratów wcześniej wyciętych w kroku 1.3. Folię należy nakładać tylko na krawędź i róg filtra, tak aby taśma nie zakrywała co najmniej 7 mm x 7 mm powierzchni filtra.

Rysunek 2: Reprezentatywna ilustracja konfiguracji mikrofiltra do powlekania PIPAAm. Mikrofiltr o wymiarach 8 mm x 8 mm umieszcza się na plastikowym kwadracie o wymiarach 12 mm x 12 mm wyciętym z plastikowego szkiełka mikroskopowego. Taśma poliamidowa służy do mocowania mikrofiltra na miejscu w celu wirowania powłoki PIPAAm.Odtworzone za zgodą z odnośnika¹⁵. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

5. Umieść mikrofiltr, który jest zamocowany na plastikowym kwadracie, na uchwycie próżniowym wirówki.
6. Zaprogramuj wirówkę według następującej receptury: Start, 500 obr./min przez 10 sekund, 6 000 obr./min przez 60 sekund, 500 obr./min przez 10 sekund, Stop.
7. Dozować tyle 10% w/v roztworu PIPAAm (przygotowanego w 1.1), aby całkowicie pokryć powierzchnię mikrofiltra za pomocą standardowej plastikowej pipety transferowej i uruchomić powlekarkę wirową.
8. Po zakończeniu procesu powlekania wyjąć mikrofiltr z powłoką PIPAAm z urządzenia do powlekania. Pozostaw filtr przymocowany do plastikowego kwadratu podczas przechowywania.
   UWAGA: Powlekany filtr może być przechowywany w temperaturze pokojowej do 3 miesięcy.

2. Montaż kasety filtracyjnej z mikrofiltrem pokrytym PIPAAm

1. Mikrofiltr pokryty PIPAAm należy ponownie nawodnić w temperaturze pokojowej, umieszczając mikrofiltr nadal zamocowany na plastikowym kwadracie na szalce Petriego. Dodaj 1x PBS, aż mikrofiltr zostanie całkowicie zanurzony i odstaw na 5 minut.
2. Po etapie hydratacji wyjmij filtr z plastikowego kwadratu, przecinając taśmę z folii poliimidowej za pomocą nożyczek.
   UWAGA: Zwróć uwagę, która strona filtra ma powłokę PIPAAm.
3. Zamontuj mikrofiltr w kasecie filtracyjnej, umieszczając mikrofiltr między górnym i dolnym elementem akrylowym wraz z 2 częściami polidimetylosiloksanu (PDMS) działającymi jako uszczelka/uszczelka. Zaciśnij akrylową kasetę za pomocą klipsów, aby zabezpieczyć filtr i zapewnić szczelne uszczelnienie.
   UWAGA: Powłoka PIPAAm powinna być skierowana do góry, tak aby podczas filtrowania próbki komórki zostały wychwycone na powierzchni filtra pokrytej PIPAAm (rysunek 1).

3. Filtracja próbki krwi z wychwytywaniem i uwalnianiem CTC z mikrofiltra

1. Ponieważ każda marka pompy strzykawkowej ma własny interfejs użytkownika, zapoznaj się z instrukcją obsługi pompy i zaprogramuj pompę strzykawkową tak, aby przepływała z prędkością 75 ml/godz. i ustaw objętość na 20 ml.
2. Ogrzać 3 ml pożywki McCoy's (dostępnej w handlu) pożywki do hodowli komórkowych (przygotowanej przez dodanie 10% płodowej surowicy bydlęcej i 1% penicyliny i streptomycyny) do temperatury 37 °C.
   UWAGA: Wybór pożywki będzie zależał od typu nowotworu pacjenta lub jeśli jest to eksperyment systemowy modelowy, w którym hodowane komórki mają być wzbogacone w zdrową krew dawcy, należy użyć pożywki, w której komórki są normalnie hodowane. Jeśli nie masz pewności, zapoznaj się z przewodnikiem/metodą hodowli dostarczonym przez firmę, od której zakupiono komórki.
3. Dodać 7,5 ml dostępnego w handlu roztworu soli Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) do 7,5 ml próbki krwi i odessać rozcieńczoną krew do strzykawki o pojemności 25 ml.
   UWAGA: Dostosuj objętość HBSS tak, aby próbka krwi była rozcieńczana w równej objętości 1:1 z HBSS. Na przykład, jeśli używa się 10 ml krwi, należy zmieszać z równą objętością 10 ml HBSS do uzyskania rozcieńczenia 1:1.
4. Połączyć kasetę filtracyjną ze strzykawką i umieścić ją na pompie strzykawkowej. Umieść probówkę o pojemności 50 ml na dnie, aby zebrać przepływ i uruchom pompę.
   UWAGA: Filtracja powinna trwać około 10-12 minut. Wszystkie etapy filtracji należy przeprowadzić w normalnej temperaturze pokojowej (20-25 °C), w tym krok 3.8
5. Po zakończeniu filtracji odłącz kasetę filtracyjną, zwracając uwagę, po której stronie znajduje się góra, po której ogniwa zaczepiły się o powierzchnię pokrytą PIPAAm. Odessać 1 ml ciepłej pożywki hodowlanej do nowej strzykawki.
6. Ponownie połączyć kasetę filtracyjną ze strzykawką zawierającą media, ale w tym czasie zaczepić dolny koniec kasety tak, aby powierzchnia filtra pokryta PIPAAm była skierowana w stronę przeciwną do strzykawki.
   UWAGA: Będzie to miało na celu uwolnienie wszelkich komórek, które mogą być osadzone w porach szczeliny, poprzez zastosowanie delikatnego przepływu wstecznego.
7. Umieścić strzykawkę z powrotem na pompie strzykawkowej i przytrzymać małą szalkę Petriego lub płytkę 6-dołkową bezpośrednio pod kasetą filtracyjną. Ustaw natężenie przepływu na 100 ml/h i uruchom pompę.
8. Przepuść wszystkie media przez filtr i zbierz przepływ na szalce Petriego. Poczekaj, aż wszystkie media przejdą, a następnie zatrzymaj pompę i wyjmij strzykawkę i kasetę filtracyjną z pompy.
9. Odłącz kasetę filtracyjną od strzykawki i otwórz ją, aby wyjąć filtr z kasety. Umieść filtr powierzchnią PIPAAm skierowaną w dół na tej samej szalce Petriego, która służy do zbierania przepływu wstecznego podczas uwalniania komórek z porów. Dodać resztę ciepłej pożywki i umieścić szalkę Petriego w inkubatorze do hodowli w temperaturze 37 °C.
10. Po 30 minutach wszystkie komórki zostaną uwolnione z filtra. Pozostaw jednak filtr na szalce Petriego na maksymalnie 24 godziny, aby upewnić się, że wszystkie komórki się odłączą.
    UWAGA: Alternatywnie, uwolnione komórki można zebrać do probówki mikrowirówkowej w celu przeprowadzenia dalszej analizy, takiej jak PCR, ELISA, Western Blot, aby wymienić tylko kilka przykładów.
11. Po 24 godzinach w hodowli ostrożnie wyjmij mikrofiltr za pomocą kleszczy.
    UWAGA: Filtr można w tym momencie wyrzucić, ponieważ komórki zostały z niego uwolnione.
12. Delikatnie odpipetować pożywkę hodowlaną w górę i w dół za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl, aby ponownie zawiesić erytrocyty i komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC), które są wychwycone na filtrze i uwalniane do płytki z CTC. Wykonaj tę czynność ostrożnie i delikatnie, aby uniknąć oderwania luźno przylegających komórek rakowych. Ostrożnie usunąć całą pożywkę zawierającą ponownie zawieszone erytrocyty i PBMC, pozostawiając przyłączone komórki rakowe i zastąpić je świeżą pożywką wstępnie ogrzaną do 37 °C.
    UWAGA: Ten krok można powtórzyć raz, jeśli po jednym praniu występuje nadmierna ilość erytrocytów.

4. Ocena żywotności CTC

1. Oceń żywotność hodowli CTC za pomocą testu żywego/martwego⁸.
   UWAGA: Na rynku dostępnych jest wiele testów na żywe/martwe organizmy. Zdecydowanie zaleca się przestrzeganie protokołu producenta. Proszę zapoznać się z listą materiałów/odczynników, aby uzyskać komercyjny zestaw testowy używany w tym eksperymencie.

Korzystając z krwi zdrowych dawców (uzyskanej zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez IRB Uniwersytetu w Miami 20150020 po świadomej zgodzie) wzbogaconej o hodowane komórki rakowe, termoresponsywna technika uwalniania żywych krążących komórek nowotworowych (CTC) osiągnęła skuteczność wychwytywania, uwalniania i pobierania odpowiednio 94% ± 9%, 82% ± 5% i 77% ± 5% (Tabela 1)15. Dla porównania, skuteczność uwalniania i pobierania filtrów niepowlekanych była znacznie niższa (7% ± 1% skuteczności uwalniania i 6% ± 1% skuteczności pobierania) (tabele 1)15. W celu oceny żywotności CTC uwolnionych z filtra, ~1,000 komórek SK-Br-3 wzbogacono o 7,5 ml krwi zdrowego dawcy, przefiltrowano przez filtr szczelinowy pokryty PIPAAm i uwolniono przy użyciu metody opisanej powyżej. Przeprowadzono test żywych/martwych komórek w celu oceny żywotności komórek przed przeniknięciem do krwi i po uwolnieniu. Żywotność przed kolcem wynosiła 98% (592 z 602 policzonych komórek), a żywotność komórek przechwyconych i uwolnionych z krwi wynosiła 95% (zliczono 540 z 567 komórek)15 (Figura 3A). Równolegle komórki przechwycone i uwolnione po filtracji z próbki krwi hodowano w pożywce 5A McCoya. Zdjęcia zostały wykonane w dniu 3 i dniu 10. Jak pokazano na rysunku 3B, komórki uwolnione z filtra nie tylko pozostały żywotne, ale szybko się rozwijały w hodowli, ustalając w ten sposób ich żywotność po filtracji.

Rycina 1: Filtry szczelinowe z powłoką PIPAAm do wychwytywania i uwalniania krążących komórek nowotworowych z krwi. (Górny panel) (A) Obraz w jasnym polu filtra szczelinowego pokrytego PIPAAm; (B) Filtracja krwi pełnej w celu wychwycenia CTC. (C) Schemat kasety mikrofiltra, w której filtr szczelinowy pokryty PIPAAm jest umieszczony między górną i dolną kasetą. (Dolny panel) (D) Schemat procesu uwalniania wychwyconego CTC z filtrów szczelinowych pokrytych PIPAAm. Przedruk za zgodą z odnośnika15. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 3: Wychwytywanie, uwalnianie i hodowla żywotnych komórek nowotworowych. Komórki raka piersi (SKBr-3) wzbogacone o normalną krew dawcy zostały wychwycone i uwolnione za pomocą mikrofiltra pokrytego PIPAAm. Komórki pozostały żywotne po uwolnieniu i szybko się rozwijały w hodowli. (A) Test żywych ciał przeprowadzony na komórkach uwolnionych z filtra. 95% (540 z 567 policzonych komórek) komórek okazało się żywotnych (kolor zielony) po uwolnieniu. Martwe komórki są oznaczone kolorem czerwonym. (B) Hodowla komórek uwolnionych z filtra szczelinowego pokrytego PIPAAm od dnia 3. do dnia 10. Komórki pozostały żywotne i rozrosły się w hodowli. Podziałka liniowa = 100 μm.Reprodukowana za zgodą z odnośnika15. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Pomiar parametrów porów przed i po nałożeniu powłoki PIPAAm. Obrazy w jasnym polu filtra szczelinowego (A) przed i (B) po powłoce PIPAAm. (C) Długość porów zmniejszyła się o 7,3% ± 2,1% po pokryciu PIPAAm, a szerokość porów zmniejszyła się o 15,3% ± 5,6% po pokryciu PIPAAm. Przedruk za zgodą z odnośnika15. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 5: Zanieczyszczające erytrocyty i leukocyty są usuwane przez delikatne płukanie. Około 1000 komórek SKBr-3 pobrano z krwi za pomocą filtra szczelinowego pokrytego PIPAAm i posiano na 48-dołkowej płytce. (A) Po 16 godzinach w hodowli komórki nowotworowe SKBr-3 przylegały do płytki hodowlanej (zielone strzałki), podczas gdy apoptotyczne erytrocyty i leukocyty również osadzały się na dnie płytki (czerwone strzałki). (B) Po umyciu usunięto nieprzylegające komórki, pozostawiając przylegające komórki nowotworowe na płytce (zielone strzałki). Przedruk za zgodą z odnośnika15. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Skuteczność wychwytywania, uwalniania i pobierania filtrów szczelinowych z powłoką PIPAAm. Skuteczność wychwytywania = liczba komórek przechwycona na filtrze przed uwolnieniem / liczba komórek przeniknięta do krwi. Wydajność uwalniania = liczba komórek zwolnionych z filtra / numery komórek przechwycone na filtrze przed zwolnieniem. Wydajność pobierania = liczba komórek uwolnionych z filtra / liczba komórek wzbogacona do krwi. Przedruk za zgodą z odnośnika15.

Część tej pracy została chroniona na mocy amerykańskiego tymczasowego zgłoszenia patentowego nr 62/219,808. Siddarth Rawal jest udziałowcem firmy Circulogix Inc., która zajmuje się komercyjną produkcją filtrów i kaset/wkładów filtracyjnych używanych w tym artykule.