Wychwytywanie i uwalnianie żywotnych krążących komórek nowotworowych z krwi

Podsumowanie

Przedstawiono protokół wykorzystania mikrofiltra pokrytego poli(N-izopropylolakrylamidem) (PIPAAm) do skutecznego wychwytywania i termoresponsywnego uwalniania żywotnych krążących komórek nowotworowych (CTC). Metoda ta umożliwia wychwycenie CTC z krwi pacjenta, a następnie uwolnienie żywego CTC do dalszej hodowli poza chipem, analiz i charakterystyki.

Streszczenie

Demonstrujemy metodę wychwytywania na podstawie wielkości żywych krążących komórek nowotworowych (CTC) z krwi pełnej, wraz z uwalnianiem tych komórek z chipa do dalszej analizy i/lub hodowli. Strategia wykorzystuje nowatorski mikrofiltr szczelinowy z membraną parylenu C do wychwytywania CTC oraz powłokę z poli(N-izopropylokryloamidu) (PIPAAm) w celu termoresponsywnego, żywotnego uwalniania wychwyconego CTC. Wychwytywanie żywych komórek jest możliwe dzięki wykorzystaniu geometrii porów szczelinowych o określonych wymiarach w celu zmniejszenia naprężeń ścinających zwykle związanych z procesem filtracji. Podczas gdy mikrofiltr wykazuje wysoką skuteczność wychwytywania, uwalnianie tych komórek jest nietrywialne. Zazwyczaj tylko niewielki procent komórek jest uwalniany, gdy stosowane są techniki takie jak przepływ wsteczny lub skrobanie komórek. Silne przyleganie tych nabłonkowych komórek nowotworowych do błony Parylenu C można przypisać niespecyficznemu oddziaływaniu elektrostatycznemu. Aby przeciwdziałać temu efektowi, zastosowaliśmy powłokę PIPAAm i wykorzystaliśmy jej właściwości międzyfazowe reagujące na ciepło, aby uwolnić komórki z filtra. Krew jest najpierw filtrowana w temperaturze pokojowej. Poniżej 32 °C PIPAAm jest hydrofilowy. Następnie filtr umieszcza się w pożywce hodowlanej lub buforze utrzymywanym w temperaturze 37 °C, co powoduje, że PIPAAm staje się hydrofobowy, a następnie uwalnia elektrostatycznie związane komórki.

Wprowadzenie

Choroba przerzutowa jest odpowiedzialna za większość zgonów z powodu raka. Opracowanie prognostycznego i towarzyszącego biomarkera diagnostycznego przerzutów ma kluczowe znaczenie w leczeniu i leczeniu raka. Krążące komórki nowotworowe (CTC) odgrywają kluczową rolę w rozprzestrzenianiu się guza i przerzutach. Co więcej, CTC w krwi obwodowej pacjentów z rakiem jest łatwo dostępny jako biomarker "płynnej biopsji", stając się "wylęgarnią" badań nad biomarkerami raka. CTC zostały dobrze zwalidowane jako biomarker prognostyczny w różnych stanach nowotworowych, w tym w raku piersi, prostaty i jelita grubego ^1-3. Jednak ostatnie postępy w dziedzinie CTC wskazują, że samo wyliczenie tych rzadkich komórek ma ograniczoną użyteczność kliniczną, jak wykazano w interwencyjnych badaniach klinicznych⁴. W związku z tym pojawia się zapotrzebowanie na technologie, które pozwolą na molekularną i funkcjonalną charakterystykę CTC. Obecnie istnieje tylko kilka technologii, które pozwalają na niestronnicze, realne wychwytywanie i uwalnianie CTC bez uprzedzeń antygenowych, umożliwiając solidną analizę molekularną i funkcjonalną^5,6. Większość tych mikrofabrykowanych urządzeń jest sprzężona z platformami mikroprzepływowymi, a zatem mają czynnik ograniczający ilość krwi, którą można przetworzyć, która waha się od 2-4 ml ^7-10 . CTC są rzadkimi zdarzeniami w pojedynczej probówce pobranej krwi (7,5 ml), dlatego dalsze zmniejszenie ilości krwi, która może być przetworzona, znacznie zmniejsza szanse na uchwycenie i wyizolowanie tych interesujących komórek.

Opracowaliśmy dwa rodzaje urządzeń do mikrofiltrów membranowych Parylene C do wychwytywania CTC, które wykorzystują różnice wielkości między większymi komórkami nowotworowymi a mniejszymi normalnymi komórkami krwi^11,12. Wcześniej informowaliśmy o filtrze do oznaczania liczby porów okrągłych i porównaliśmy go z platformą zatwierdzoną przez FDA, w której wykazano, że mikrofiltr jest lepszy pod względem skuteczności wychwytywania CTC dla próbek krwi pacjentów z rakiem^13,14. Ograniczeniem filtra okrągłego jest jednak konieczność użycia utrwalacza na bazie formaldehydu przed filtracją. Proces ten zachowuje morfologię komórek, jednocześnie pozwalając im wytrzymać naprężenia ścinające i ciśnienie podczas procesu filtracji. Podczas gdy wyliczanie i badania molekularne mogą być wykonywane na chipie¹³, utrwalacz upośledza zdolność do przeprowadzenia charakterystyki funkcjonalnej. Aby rozwiązać ten problem, opracowaliśmy szczelinowy filtr porowy, który eliminuje konieczność naprawiania komórek przed filtracją (rysunek 1). Geometria porów szczelinowych (6 μm szerokości x 40 μm długości) pozwala na uchwycenie komórek nowotworowych, jednocześnie tylko częściowo zamykając pory, a tym samym nadal umożliwiając swobodny przepływ innym komórkom krwi i łagodząc wzrost ciśnienia, który doprowadziłby do uszkodzenia komórek i ostatecznego pęknięcia^15,16 Wkład porów szczelinowych składa się z 2 kawałków akrylu, które umieszczają filtr porów szczelinowych między górą a dołem z polidimetylosiloksanem (PDMS) działającym jako uszczelka zapewniająca szczelne^{uszczelnienie 14,15} (rysunek 1).

Podczas gdy skuteczność wychwytywania filtra porów szczelinowych jest wysoka, (Tabela 1), wychwycone CTC są związane z membraną Parylenu C przez silne niespecyficzne oddziaływania elektrostatyczne, a nie adhezję za pośrednictwem macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM)¹⁵. Metody takie jak przepływ wsteczny lub użycie skrobaków do komórek nie są w stanie skutecznie uwolnić komórek z filtra lub powodują uszkodzenie komórek i śmierć komórek. Zbadaliśmy niekonwencjonalne zastosowanie PIPAAm do sformułowania strategii wydawniczej¹⁵. PIPAAm jest polimerem, który ulega odwracalnej przemianie fazowej roztworu o niższej temperaturze krytycznej (LCST) przy temperaturze roztworu 32 °C¹⁷. Tradycyjnie, ta właściwość PIPAAm była szeroko badana w zastosowaniach inżynierii tkankowej. Zazwyczaj komórki są hodowane na powierzchniach pokrytych PIPAAm w temperaturze 37 °C, gdy PIPAAm jest hydrofobowy. Komórki można następnie odłączyć jako arkusz, gdy temperatura hodowli zostanie przesunięta poniżej 32 °C, gdzie powierzchnia pokryta PIPAAm zostanie uwodniona^17,18. Wykorzystaliśmy tę właściwość termiczną, przeprowadzając proces filtracji w temperaturze pokojowej (poniżej 32 °C), a następnie umożliwiając uwalnianie komórek poprzez umieszczenie filtra w pożywce hodowlanej utrzymywanej w temperaturze 37 °C. W tej temperaturze warstwa polimeru PIPAAm staje się hydrofobowa, uwalniając w ten sposób elektrostatycznie związane ogniwa¹⁵ (ryc. 1).

Chociaż metoda reagująca na temperaturę, jak również inne metody, zostały z powodzeniem wdrożone w celu osiągnięcia realnego wychwytywania i uwalniania CTC^19-21, jedną z kluczowych potencjalnych wad tych zgłoszonych technologii jest to, że wszystkie wykorzystują zasadę zależną od antygenu do wychwytywania CTC. Wychwytywanie CTC na podstawie antygenu, jak wykazano wcześniej, może prowadzić do tendencyjnej analizy CTC^11,14. Na przykład wiele technologii opartych na powinowactwie wykorzystuje przeciwciało, które wiąże EpCAM w celu wychwytywania CTC. Wykazano jednak, że CTC wyraża różne poziomy EpCAM, co prowadzi do pominięcia niskiego poziomu EpCAM i ujemnego EpCAM CTC przez te technologie. Ograniczenia mogą również wystąpić, gdy w grę wchodzi CTC pochodzenia nienabłonkowego, np. CTC w warunkach czerniaka i mięsaka. W związku z tym wysoce pożądana jest technologia, która pozwala na realne wychwytywanie i uwalnianie CTC bez potencjalnego odchylenia wprowadzonego przez wychwytywanie na podstawie antygenu.

Co ważne, urządzenie do wychwytywania mikrofiltrów jest oparte wyłącznie na rozmiarach, a strategia uwalniania jest niezależna od obecności pewnych znaczników powierzchniowych. Wierzymy, że zastosowanie mikrofiltra z powłoką PIPAAm pomoże poszerzyć naszą wiedzę na temat procesu przerzutowego, zapewniając możliwość skutecznego i wydajnego wychwytywania i uwalniania CTC do dalszych analiz. Może to potencjalnie ujawnić nowe cząsteczki, dla których mogą być ukierunkowane nowe celowane terapie ogólnoustrojowe, a także zapewnić biomarker, który można łatwo monitorować i pomóc w leczeniu pacjentów z rakiem.

Protokół

Oświadczenie etyczne: W celu ochrony praw uczestników, próbki krwi pobrano po uzyskaniu świadomej zgody zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez rady przeglądowe instytucjonalne University of Miami w ramach IRB 20150020.
UWAGA: Krew przeznaczona do filtracji w celu wychwycenia CTC należy pobrać do probówki z EDTA, aby zapobiec koagulacji.

1. Powlekanie mikrofiltra poli(N-izopropylakryloamidem) (PIPAAm)

1. Odważ PIPAAm w celu przygotowania 10% (w/v) roztworu w butanolu. Mieszaj za pomocą wibratora (vortex) do czasu, aż roztwór stanie się klarowny.
2. Potnij plastikowe szkiełka mikroskopowe na kwadraty o wymiarach około 12 mm x 12 mm, używając nożyczek lub ostrego ostrza. Alternatywnie można użyć gilotyny.
   UWAGA: Kwadraty te będą służyć jako uchwyty dla filtrów podczas procesu powlekania wirowego (spin coating).
3. Używając ostrych nożyczek do cięcia w linii prostej, potnij wafer mikrofiltra z porami szczelinowymi na kwadraty o wymiarach 8 mm x 8 mm.
4. Używając polimidowej taśmy filmowej, przymocuj wycięte filtry do plastikowych kwadratów przygotowanych w kroku 1.3. Naklej taśmę tylko na krawędź i róg filtra, tak aby co najmniej 7 mm X 7 mm powierzchni filtra pozostało niezakryte.

Rysunek 2: Reprezentacyjny schemat układu mikrofiltra do powlekania PIPAAm. Mikrofiltr o wymiarach 8 mm x 8 mm jest umieszczony na plastikowym kwadracie o wymiarach 12 mm x 12 mm wyciętym z plastikowego szkiełka mikroskopowego. Taśma poliamidowa służy do przymocowania mikrofiltra w celu naniesienia powłoki PIPAAm metodą spin coatingu. Reprodukowano za zgodą z odniesienia¹⁵. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

5. Umieść mikrofiltr zamocowany na plastikowym kwadracie na uchwycie próżniowym urządzenia do spin-coatingu.
6. Zaprogramuj spin-coater zgodnie z następującym schematem: Start, 500 rpm przez 10 sec, 6 000 rpm przez 60 sec, 500 rpm przez 10 sec, Stop.
7. Za pomocą standardowej plastikowej pipety transferowej nanieś odpowiednią ilość 10% w/v roztworu PIPAAm (przygotowanego w punkcie 1.1), aby całkowicie pokryć powierzchnię mikrofiltra, a następnie uruchom spin-coater.
8. Po zakończeniu procesu powlekania zdejmij pokryty PIPAAm mikrofiltr ze spin-coatera. Podczas przechowywania pozostaw filtr przymocowany do plastikowego kwadratu.
   UWAGA: Powlekany filtr można przechowywać w temperaturze pokojowej przez maksymalnie 3 miesiące.

2. Montaż kasety filtracyjnej z mikrofiltrem powlekanym PIPAAm

1. Rehydratuj mikrofiltr powlekany PIPAAm w temperaturze pokojowej, umieszczając mikrofiltr wciąż zamocowany do plastikowego kwadratu w czarence Petriego. Dolej 1x PBS, aż mikrofiltr zostanie całkowicie zanurzony, i odstaw na 5 min.
2. Po etapie hydratacji odłącz filtr od plastikowego kwadratu, przecinając taśmę z folii polimidowej nożyczkami.
   UWAGA: Zwróć uwagę, która strona filtra posiada powłokę PIPAAm.
3. Zamontuj mikrofiltr w kasecie filtracyjnej, umieszczając go pomiędzy górnym a dolnym elementem akrylowym wraz z dwoma elementami z polidimetylosiloksanu (PDMS) pełniącymi rolę uszczelki. Zaciśnij kasetę akrylową klipsami, aby zabezpieczyć filtr i zapewnić szczelne domknięcie.
   UWAGA: Powłoka PIPAAm powinna być skierowana do góry, aby podczas filtrowania próbki komórki zostały wychwycone na powlekanej PIPAAm powierzchni filtra (Rysunek 1).

3. Filtracja próbki krwi z wychwytywaniem i uwalnianiem CTC z mikrofiltra

1. Ponieważ każdy producent pomp strzykawkowych posiada własny interfejs użytkownika, należy zapoznać się z instrukcją obsługi pompy i zaprogramować ją na przepływ z szybkością 75ml/hr oraz ustawić objętość na 20 ml.
2. Podgrzać 3 ml komercyjnie dostępnej pożywki do hodowli komórkowej McCoy's (przygotowanej poprzez dodanie 10% Fetal Bovine Serum oraz 1% Penicillin and Streptomycin) do 37 °C.
   UWAGA: Wybór pożywki zależy od typu nowotworu pacjenta; w przypadku eksperymentu w systemie modelowym, w którym hodowane komórki są wprowadzane do krwi zdrowego dawcy, należy użyć pożywki, w której komórki są zazwyczaj hodowane. W razie wątpliwości należy zapoznać się z instrukcją/metodą hodowli dostarczoną przez firmę, od której zakupiono komórki.
3. Dodać 7,5 ml komercyjnie dostępnego roztworu soli Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) do 7,5 ml próbki krwi i odessać tak rozcieńczoną krew do strzykawki o pojemności 25 ml.
   UWAGA: Dostosować objętość HBSS tak, aby próbka krwi została rozcieńczona w stosunku 1:1 z HBSS. Np. jeśli użyto 10 ml krwi, należy zmieszać ją z równą objętością 10 ml HBSS, aby uzyskać rozcieńczenie 1:1.
4. Połączyć kasetę filtracyjną ze strzykawką i umieścić ją w pompie strzykawkowej. Umieścić probówkę 50 ml na dole w celu zbierania filtratu i uruchomić pompę.
   UWAGA: Filtracja powinna trwać około 10- 12 min. Wszystkie etapy filtracji, w tym krok 3.8, należy przeprowadzać w temperaturze pokojowej (20-25 °C).
5. Po zakończeniu filtracji odłączyć kasetę filtracyjną, zwracając uwagę, która strona jest górną, na której powierzchni powlekanej PIPAAm zostały zatrzymane komórki. Odessać 1 ml podgrzanej pożywki hodowlanej do nowej strzykawki.
6. Ponownie połączyć kasetę filtracyjną ze strzykawką zawierającą pożywkę, ale tym razem podłączyć dolny koniec kasety tak, aby powierzchnia filtra powlekana PIPAAm była skierowana w stronę przeciwną do strzykawki.
   UWAGA: Służy to uwolnieniu komórek, które mogły zostać uwięzione w porach szczelinowych, poprzez zastosowanie delikatnego przepływu wstecznego.
7. Umieścić strzykawkę z powrotem w pompie strzykawkowej i przytrzymać małą szalkę Petriego lub płytkę 6-dołkową bezpośrednio pod kasetą filtracyjną. Ustawić szybkość przepływu na 100 ml/hr i uruchomić pompę.
8. Przepuścić całą pożywkę przez filtr i zebrać filtrat do szalki Petriego. Odczekać, aż cała pożywka przepłynie, a następnie zatrzymać pompę i wyjąć strzykawkę oraz kasetę filtracyjną z pompy.
9. Odłączyć kasetę filtracyjną od strzykawki i otworzyć ją, aby wyjąć filtr z kasety. Umieścić filtr powierzchnią PIPAAm skierowaną w dół w tej samej szalce Petriego, której użyto do zbierania przepływu wstecznego podczas uwalniania komórek z porów. Dodać resztę podgrzanej pożywki i umieścić szalkę Petriego w inkubatorze do hodowli ustawionym na 37 °C.
10. Po 30 min wszystkie komórki zostaną uwolnione z filtra. Jednak filtr należy pozostawić w szalce Petriego do 24 godzin, aby upewnić się, że wszystkie komórki się odłączyły.
    UWAGA: Alternatywnie, uwolnione komórki można zebrać do probówki do mikrocentryfugi w celu przeprowadzenia dalszych analiz, takich jak np. PCR, ELISA czy Western Blot.
11. Po 24 h hodowli ostrożnie usunąć mikrofiltr za pomocą pęsety.
    UWAGA: Filtr można w tym momencie wyrzucić, ponieważ komórki zostały z niego uwolnione.
12. Delikatnie pipetować pożywkę hodowlaną w górę i w dół za pomocą pipety 1 000 µl, aby resuspendować erytrocyty i mononuklearne komórki krwi obwodowej (PBMC), które zostały zatrzymane na filtrze i uwolnione do płytki wraz z CTC. Czynność tę należy wykonywać ostrożnie i delikatnie, aby uniknąć odłączenia słabo przytwierdzonych komórek nowotworowych. Ostrożnie usunąć całą pożywkę zawierającą resuspendowane erytrocyty i PBMC, pozostawiając przytwierdzone komórki nowotworowe, i zastąpić ją świeżą pożywką wstępnie podgrzaną do 37 °C.
    UWAGA: Ten krok można powtórzyć raz, jeśli po jednym przemyciu nadal obecne są nadmierne ilości erytrocytów.

4. Ocena żywotności CTC

1. Oceń żywotność hodowlanych CTC za pomocą testu Live/Dead⁸.
   UWAGA: W handlu dostępnych jest wiele testów Live/Dead. Zaleca się ścisłe przestrzeganie protokołu producenta. Szczegóły dotyczące zestawu testowego użytego w tym doświadczeniu znajdują się w liście materiałów/odczynników.

Wyniki

Wykorzystując krew od zdrowych dawców (pozyskaną zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez IRB Uniwersytetu Miami 20150020 po uzyskaniu świadomej zgody) wzbogaconą hodowanymi komórkami nowotworowymi, termoresponsywna technika uwalniania żywych krążących komórek nowotworowych (CTC) pozwoliła na osiągnięcie wydajności wychwytu, uwalniania i odzyskiwania wynoszącej odpowiednio 94% ± 9%, 82% ± 5% oraz 77% ± 5% (Tabela 1)¹⁵. Dla porównania, wydajność uwalniania i odz...

Dyskusja

Proces wychwytywania żywego CTC z krwi pełnej i uwalniania go z mikrofiltra jest stosunkowo prosty; Warto jednak wspomnieć o kilku krytycznych punktach. Podobnie jak w przypadku wszystkich hodowli komórkowych, konieczne jest utrzymanie sterylnego stanu przez cały proces. Początkowy etap powlekania filtra PIPAAm ma kluczowe znaczenie, ponieważ podstawa techniki uwalniania komórek z filtra opiera się na wykorzystaniu właściwości międzyfazowych PIPAAm reagujących na temperaturę. Aby upewnić się, że filtr został skutecznie p...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Filtr szczelinowy	Circulogix Inc.	MSF-01	Dostępne filtry o różnych rozmiarach do filtracji CTC z krwi lub moczu (www.circulogixinc.com)
poli(N-izopropyloakrylamid) (PIPAAm)	Ploysciences Inc.	21458	Bezpieczny Przechowywać w temp. pokojowej.
1-Butanol	Sigma Aldrich	B7906	Stosować w dobrze wentylowanym pomieszczeniu
Plastikowe szkiełka mikroskopowe	Cole-Parmer	48510-30	Można użyć dowolnych szkiełek z tworzywa sztucznego lub alternatywnie dowolnego rodzaju kwadratu (metalowego, akrylowego itp.), jeśli będzie to bela do trzymania kwadratu filtracyjnego 8 mm x 8 mm
Specjalistyczne systemy powlekania	Spin Coater SCS G3 Spin Coater
Instrument Taśma poliimidowa	Uline S-7595		Poliimid to ogólna nazwa taśmy kaptonowej, którą można kupić u wielu dostawców (Amazon, Kaptontape.com)
HBSS- Zbilansowany roztwór soli Hanka	Gibco	14025-092
1x PBS	Gibco	10010-023
Szalki Petriego Falcon 35 x 10 mm	VWR	25373-041
Kaseta z mikrofiltrem	Circulogix Inc.	FC-01	Niestandardowe wkłady są dostępne w oparciu o filtrację CTC z krwi lub moczu
Strzykawka 20 ml	BD Scientific	302830
Pompka strzykawkowa	KD scientific	78-0100V	Można użyć dowolnej pompy strzykawkowej zdolnej pomieścić strzykawkę o pojemności 25 ml
Cellstar 50 ml Probówka wirówkowa	VWR	82050-322
Greiner Bio One 6-dołkowa VWR		89131-688	Można użyć dowolnej marki, o ile powierzchnia jest kompatybilna z komórkami i nie jest odstraszająca
SKBR3 Komórki	ATCC	HTB-30
Test żywych zmarłych	Life Technologies	L3224	Każdy test, który może zapewnić rozsądną analizę w celu oceny żywych komórek, będzie działał
Inkubator do hodowli komórkowych	VWR	98000-368	Wystarczy dowolny inkubator, który może być używany do hodowli komórek