Test odroczonego hamowania wzrostu w celu ilościowego określenia wpływu środków przeciwdrobnoustrojowych pochodzenia bakteryjnego na konkurencję

Podsumowanie

Test odroczonego hamowania wzrostu może być użyty do oceny wpływu konkurencji jednego izolatu bakteryjnego na drugi. Hamowanie określa się ilościowo, mierząc strefę oczyszczania wokół izolatu wytwarzającego inhibitor, lub ocenia się jakościowo, określając widoczny zakres hamowania.

Streszczenie

Konkurencyjne wykluczenie może wystąpić w społecznościach mikroorganizmów, gdy na przykład szczep produkujący inhibitory konkuruje ze swoim konkurentem o niezbędny składnik odżywczy lub wytwarza związki przeciwdrobnoustrojowe, na które jego konkurent nie jest odporny. W tym miejscu opisujemy test odroczonego hamowania wzrostu, metodę oceny zdolności jednej bakterii do hamowania wzrostu innej poprzez produkcję związków przeciwdrobnoustrojowych lub poprzez rywalizację o składniki odżywcze. Technika ta została wykorzystana do zbadania korelacji izolatów donosowych z wykluczeniem poszczególnych gatunków ze zbiorowiska. Technika ta może być również wykorzystywana do badań przesiewowych pod kątem producentów antybiotyków lub potencjalnie nowych środków przeciwdrobnoustrojowych. Test przeprowadza się poprzez najpierw hodowlę szczepu wytwarzającego badany inhibitor przez noc na płytce agarowej, a następnie rozpylenie na testowany szczep konkurenta i ponowną inkubację. Po inkubacji zakres inhibicji można zmierzyć ilościowo, poprzez wielkość strefy oczyszczania wokół szczepu wytwarzającego inhibitor, oraz jakościowo, oceniając przejrzystość strefy inhibicji. W tym miejscu przedstawiamy protokół testu odroczonej inhibicji, opisujemy sposoby minimalizacji różnic między eksperymentami oraz definiujemy skalę przejrzystości, którą można wykorzystać do jakościowej oceny stopnia zahamowania.

Wprowadzenie

Bakterie żyjące w społecznościach konkurują na poziomie międzygatunkowym i wewnątrzgatunkowym o przestrzeń i składniki odżywcze ⁶. Konkurencja między drobnoustrojami może często prowadzić do wykluczenia określonych gatunków lub szczepów w obrębie społeczności. Wykluczenie może wynikać z konkurencji o określony receptor lub składnik odżywczy lub z produkcji związku przeciwdrobnoustrojowego przez członka społeczności ⁶.

Badania badające konkurencyjne wykluczenie często badają obecność i brak gatunków za pomocą sekwencjonowania 16S rRNA ^3,4,13. Jednak zmienność cech wewnątrzgatunkowych, na przykład obecność lub brak produkcji peptydów przeciwdrobnoustrojowych, może mieć ogromny wpływ na zdolność jednego gatunku do hamowania innego ¹. Ponieważ sekwencjonowanie 16S rRNA nie może rozróżnić szczepów tego samego gatunku, nie można ocenić zmienności cech wewnątrzgatunkowych. Opisana tutaj technika może być wykorzystana do oceny potencjału poszczególnych szczepów do wykluczenia innych bakterii. Metoda ta była wcześniej stosowana w celu wykazania dodatniej korelacji między obecnością bakterii hamujących Staphylococcus aureus a brakiem S. aureus w społeczności nosowej ⁷.

Test odroczonego hamowania wzrostu (konkurencji) może zidentyfikować produkcję związków przeciwdrobnoustrojowych lub konkurencję składników odżywczych przez szczep inhibitora. Może również wykrywać pozytywne interakcje, przy czym obecność szczepu inhibitora faktycznie poprawia wzrost szczepu konkurencyjnego. Test ten może być wykorzystany do stworzenia danych ilościowych (strefa wielkości oczyszczania) i danych jakościowych (stopień zahamowania), z których oba można nałożyć na dane dotyczące obecności lub braku gatunku w społeczności w celu znalezienia korelacji między fenotypem (cechą) a wykluczeniem konkurencyjnym ⁷.

Protokół

Poniższa metoda jest dostosowana do ^7,8 do testowania konkurencyjnych szczepów ze szczepami produkującymi inhibitory.

UWAGA: Ten protokół obejmuje wytwarzanie aerozoli z kulturami bakteryjnymi. Można to zrobić tylko w zamkniętej przestrzeni z uwzględnieniem lokalnie zatwierdzonych względów bezpieczeństwa. Rozpylanie kultury na płytki agarowe w komorze bezpieczeństwa poziomu 2 zminimalizuje zanieczyszczenie płytek agarowych i otaczającego środowiska. Będzie to również chronić badacza przed wdychaniem aerozoli rozpylonych bakterii, co jest poważnym problemem, jeśli badacz używa organizmów o poziomie hermetyczności 2. Należy nosić odpowiednie środki ochrony osobistej. Obszar wokół szalki Petriego najlepiej pokryć jednorazową chusteczką chłonną. Zaleca się odkażanie po rozpyleniu za pomocą światła UV.

1. Przygotowanie płytek agarowych

1. Przygotuj agar do infuzji serca (BHI) zgodnie z instrukcjami producenta.
2. Autoklawować agar BHI w temperaturze 121 °C, 15 psi przez 20 minut lub zgodnie z zaleceniami producenta autoklawu, w celu sterylizacji.
3. Wlej 15 ml porcji wysterylizowanego agaru BHI do sterylnych szalek Petriego i pozwól mu zastygnąć.
   UWAGA: Upewnij się, że każda płytka agarowa, która ma być użyta w teście, pochodzi z tego samego zapasu agaru i że na każdej płytce znajduje się taka sama ilość agaru. Ogranicza to zmienność dostępnych składników odżywczych i dyfuzję inhibitorów między płytkami, umożliwiając porównywanie.

2. Przygotowanie sterylnego bulionu

1. Przygotuj bulion BHI zgodnie z instrukcjami producenta.
2. Dodać 10 ml porcji BHI do 28 ml szklanych butelek uniwersalnych.
3. Bulion BHI należy sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C, 15 psi przez 20 minut lub zgodnie z zaleceniami producenta autoklawu w celu sterylizacji.
   UWAGA: Upewnij się, że cały bulion użyty w teście pochodzi z tej samej partii bulionu autoklawowanego w tym samym czasie, aby ograniczyć różnice w składnikach odżywczych, które mogą powodować różnice w wynikach.

3. Przygotowanie sterylnej butelki do waporyzatora

1. Zdemontuj butelkę parownika.
2. Rozpyl 5% powierzchniowo czynny środek czyszczący przez parownik, aby wyeliminować zanieczyszczenia wewnętrzne, namocz butelkę parownika, pokrywkę i parownik w 5% powierzchniowo aktywnym środku czyszczącym przez noc.
   UWAGA: Podczas pracy ze środkiem czyszczącym powierzchniowo czynnym należy używać rękawic i odpowiednich środków ochrony osobistej.
3. Wysuszyć waporyzator, pokrywkę i butelki pod sterylnym kapturem z przepływem powietrza.
4. Napełnij butelkę 70% etanolem, ponownie podłącz parownik i rozpyl trochę etanolu przez parownik.
5. Załóż pokrywkę na waporyzator i przechowuj z etanolem w środku do czasu użycia.
6. Bezpośrednio przed użyciem należy aseptycznie przepłukać butelkę sterylnym bulionem BHI i spryskać bulion przez parownik.
   UWAGA: Zapobiega to wpływowi etanolu na inokulum dodawane do butelki w sekcji 6.3.

4. Przygotowanie hodowli bakteryjnej na noc

1. Szczepy konkurenta i inhibitora należy umieścić na sterylnej płytce z agarem BHI i inkubować w temperaturze 37 °C w warunkach tlenowych przez około 18 godzin (przez noc).
   UWAGA: Ta płytka wytwarza zapas bakterii, który może być użyty do wielu powtórzeń w ciągu tego samego tygodnia, jeśli jest przechowywany w temperaturze 4 °C.
2. Zaszczepić 10 ml sterylnego bulionu BHI pojedynczą kolonią wymaganego konkurencyjnego szczepu bakteryjnego w uniwersalnej butelce o pojemności 28 ml.
3. Inkubować butelkę uniwersalną w temperaturze 37 °C w temperaturze tlenowej przez noc, wytrząsając z prędkością 250 obr./min w wytrząsarce orbitalnej.

5. Posiew punktowy izolatu wytwarzającego inhibitory

1. Przygotować kulturę (kultury) na noc zgodnie z opisem w sekcji 4.
2. Upewnij się, że płytki agarowe są całkowicie suche, bez kondensacji na pokrywce, przed inokulacją (np. przez inkubację płytki przez 60 minut w temperaturze 37 °C); zapobiega to rozprzestrzenianiu się inokulum po płytce z miejsca inokulacji.
3. Odpipetować pipetą 25 μl nocnej kultury na środek płytek agarowych. Unikaj całkowitego wciskania tłoka pipety, aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków powietrza, które rozpylają kulturę na agarze .
4. Pozostaw kulturę do wyschnięcia w temperaturze pokojowej, aby ograniczyć rozprzestrzenianie się kultury. Inkubować płytki agarowe w temperaturze 37 °C w temperaturze tlenowej przez noc.

6. Przygotowanie inokulum w sprayu szczepu (szczepów) uczestnika testu

1. Przygotować posiew przez noc zgodnie z opisem w punkcie 4. Rozcieńczyć kulturę przez noc 10 razy w bulionie BHI, aby uzyskać około 4 x 10⁶ CFU ^ml-1 i zawiesinę OD₆₀₀ 0,3 ±0,05,
   UWAGA: 10-krotne rozcieńczenie nie da 4 x 10⁶ CFU ^ml-1 dla wszystkich gatunków bakterii, oblicz niezbędny współczynnik rozcieńczenia, rozprowadzając seryjne rozcieńczenia posiewu między 1 x ^10-1-1 x ^10-6.
2. Wlej rozcieńczoną kulturę do sterylnej plastikowej butelki na waporyzator perfum.
   UWAGA: Całkowita objętość musi być większa niż jest to konieczne dla liczby opryskiwanych płytek agarowych. Około 250 μl na płytkę wystarcza na szalkę Petriego o średnicy 9 cm.

7. Test odroczonego hamowania wzrostu

1. Rozpyl kulturę przez każdą z butelek parownika, aby upewnić się, że kultura została załadowana do mechanizmu rozpylającego przed rozpyleniem na agar
.
2. Z odległości około 15 cm nad agarem rozpylić około 250 μl rozcieńczonej kultury (3 rozpylenia typowego parownika o pojemności 50 ml) na całą powierzchnię agaru. Inkubować płytki agarowe w temperaturze 37 °C w temperaturze tlenowej przez noc. Powtórz dla innych płytek z taką samą liczbą rozpyleń.

8. Interpretacja wyników testu hamowania odroczonego wzrostu

1. Zmierz strefę zahamowania wzrostu rozpylonego szczepu konkurencyjnego (Rysunek 1A-C, "X" do "X") w milimetrach, odejmując średnicę centralnego miejsca inhibitora-producenta (Rysunek 1A-C, "Y" do "Y").
   UWAGA: Rysunek 1E pokazuje, w jaki sposób można przedstawić te dane
2. Zapisz wynik klarowności dla stref inhibicji.
   UWAGA: Wskazuje to zaobserwowany stopień zahamowania. Przykłady przedstawiono na rysunku 1A-D, szczepy, które można wykorzystać do standaryzacji, sugerowano w sekcji reprezentatywnych wyników. Do oceny klarowności można użyć następującej skali: wynik klarowności równy 0 w celu opisania strefy całkowitego zahamowania wzrostu konkurencyjnego szczepu. Wynik 1 opisujący strefę prawie całkowitego zahamowania wzrostu, w której znajdują się tylko pojedyncze kolonie. Wynik 2 opisujący widoczną strefę zmniejszonego wzrostu, wzrost w tej strefie jest zlewający się lub prawie zlewający, ale gęstość zmniejszona o >50%. Wynik 3 opisujący tylko minimalne zmniejszenie wzrostu, wzrost jest zlewający się i zmniejszony o mniej niż 50%, strefa jest nadal widoczna i mierzalna. Wynik 4 oznacza brak widocznego zahamowania wzrostu. Wynik 5 opisujący, że wzrost konkurencyjnego szczepu był zwiększony w pobliżu szczepu wytwarzającego inhibitor testowy. Przykłady przedstawiono na rysunku 1. Wyniki te są subiektywne dla eksperymentatora.

9. Replikuje

1. Powtórzyć próby co najmniej w trzech biologicznych powtórzeniach w celu określenia odtwarzalności otrzymanych wyników.
   UWAGA: Jeżeli kontrpróby są przeprowadzane w różnych dniach, należy wykonać pomiary i naciąć płytki natychmiast po wyjęciu z inkubacji, a następnie przechowywać płytki w temperaturze 4 °C lub wykonać wysokiej jakości zdjęcia płytek przed ich wyrzuceniem. Przechowywanie lub fotografowanie płytek umożliwia łatwe porównywanie wyników między różnymi dniami, co jest szczególnie ważne dla potwierdzenia powtarzalnej punktacji w różnych dniach/eksperymentach. Należy pamiętać, że przechowywanie płytek może zmienić wyniki.
   UWAGA: Aby uzyskać wyraźne zdjęcia, umieść płyty pionowo bez pokrywy na matowym czarnym tle w obszarze rozproszonego światła, użyj aparatu o wysokiej rozdzielczości (≥8 MP), który może ustawić ostrość na obiektach znajdujących się blisko obiektywu (tryb makro). Alternatywnie, niektóre kamery żelowe z trans-iluminatorem ustawionym na światło białe mogą wytwarzać obrazy o wysokiej jakości, wysoce powtarzalne.

Wyniki

Wyniki testu powinny być widoczne jako różnica w obrębie nałożonego szczepu konkurencyjnego w pobliżu centralnie naniesionego szczepu produkującego inhibitor (Rysunek 1). Różnice te można interpretować jako pełne hamowanie (Rysunek 1A), hamowanie częściowe (Rysunek 1B oraz 1C), brak hamowania (Rysunek 1D) lub pozytywną asocjację. W Rysunkach 1B i 1D odpowiednio wykorzystano powszechnie dostępne szczepy laboratoryjne S. epidermidis Tü3298 i S. epidermidis Rp62A oraz S. epidermidis Rp62A i S. aureus Newman. Sugerujemy, że szczepy te można wykorzystać do przetestowania niniejszego protokołu.

W zależności od badanych gatunków, całkowite oraz częściowe hamowanie są najprawdopodobniej wynikiem działania peptydów przeciwdrobnoustrojowych, antybiotyków lub innych dyfuzyjnych inhibitorów wzrostu produkowanych przez szczep hamujący. Częściowe hamowanie wiązano również ze zmniejszoną dostępnością składników odżywczych dla szczepu konkurującego z powodu pobierania lub sekwestracji nutrientów przez szczep inhibitorowy ⁶.

Porównanie wielkości strefy zahamowania pomiędzy różnymi izolatami produkującymi inhibitor, badanymi przeciwko temu samemu szczepowi konkurenta, wskazuje na różnice w którymkolwiek z następujących aspektów: ilości substancji przeciwdrobnoustrojowej produkowanej przez szczep produkujący inhibitor; zdolności inhibitora do dyfuzji przez podłoże; rodzaju produkowanego inhibitora oraz poziomu oporności szczepu konkurenta na produkowane inhibitory. Porównanie wielkości strefy zahamowania pomiędzy różnymi szczepami konkurentów, badanymi przeciwko temu samemu szczepowi produkującemu inhibitor, pozwala określić poziom oporności szczepów konkurentów na produkowany inhibitor.

Wyniki będą się różnić w zależności od użytego szczepu hamującego oraz szczepu konkurencyjnego. Powtórzenia z użyciem tego samego szczepu hamującego i konkurencyjnego powinny w idealnym przypadku dawać ten sam wynik przejrzystości (opisany w sekcji 8.2), co wskazuje na zastosowanie prawidłowej techniki podczas całego procesu.

W przypadku niejednorodnego naniesienia bakterii płyt nie należy używać. Na przykład, jeśli kultura konkurencyjna użyta w teście jest zbyt rozcieńczona, strefa zahamowania będzie wydawać się większa i będzie miała mniej wyraźnie zdefiniowaną krawędź niż zazwyczaj (Rysunek 2A); wpłynęłoby to na wiarygodność wszelkich porównawczych pomiarów strefy. Jeśli kropla szczepu produkującego inhibitor nie wyschła całkowicie przed inkubacją nocną, szczep inhibitora prawdopodobnie rozprzestrzeni się i nie utworzy wyraźnie zdefiniowanej plamki (Rysunek 2B), co zazwyczaj wpływa na pomiary strefy, ale może również wpłynąć na ocenę klarowności. Jeśli szczep konkurencyjny nie zostanie rozpylony równomiernie, może to doprowadzić do nierównomiernego rozprzestrzenienia się bakterii (Rysunek 2C). Jeśli szczep konkurencyjny jest zbyt skoncentrowany, możliwe jest, że szczep konkurencyjny urośnie na wierzchu szczepu inhibitora (Rysunek 2C); w skrajnych przypadkach może to prowadzić do pewnej inwersji ról szczepu konkurencyjnego i inhibitora.

Rysunek 1: Zakres wyników jakościowych i ilościowych, jakie można uzyskać w teście odroczonego hamowania wzrostu. Wyniki hamowania wzrostu mogą obejmować (A) całkowite hamowanie (wynik 0), (B) częściowe hamowanie (wynik 1), (C) częściowe hamowanie (wynik 2) oraz (D) brak hamowania (wynik 4). Etykiety wskazują krawędzie wzrostu szczepów inhibitorowych (Y) oraz zewnętrzną krawędź stref hamowania (X). Wielkość strefy hamowania wynosi od 0 mm do ponad 10 mm, co przedstawiono w punkcie (E), gdzie ukazano pomiary dla płytek sfotografowanych w A, B, C i D. Wyniki przedstawiono dla niedawnych izolatów gronkowców (A, C) lub powszechnych laboratoryjnych izolatów gronkowców S. epidermidis Tü3298 (inhibitor) i S. epidermidis Rp62A (konkurent) (B), oraz S. epidermidis Rp62A (inhibitor) i S. aureus Newman (konkurent) (D). Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Rycina 2: Przykłady niespójnych wyników wynikających z błędnej techniki. Wyniki mogą odbiegać od oczekiwanych, jeśli (A) szczep konkurencyjny był zbyt rozcieńczony, (B) szczep inhibitora nie był całkowicie suchy przed inkubacją/płytki nie były suche lub (C) szczep konkurencyjny nie został rozpylony równomiernie i był zbyt skoncentrowany. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Krytycznym etapem tego protokołu konkurencji gatunków bakterii, który odróżnia go od innych, jest nocna inkubacja izolatu inhibitora przed dodaniem izolatu konkurencyjnego. Szczep inhibitora wymaga tego okresu wzrostu do produkcji związków hamujących. Ponieważ szczep konkurenta jest nakładany na to samo podłoże, metoda ta pozwala badaczowi zaobserwować pełny potencjał szczepu inhibitora do zakłócania wzrostu szczepu konkurencyjnego. W rezultacie test ten odzwierciedla to, co dzieje się z naturą; Jeden izolat jest w pełni zakorzeniony w niszy, a drugi musi być w stanie przeciwdziałać wszelkim zmiennym hamującym, aby móc skutecznie zaatakować niszę.

Istnieją dwie części tego protokołu, które najprawdopodobniej spowodują błędne wyniki, jeśli zostaną wykonane nieprawidłowo. Po pierwsze, niepełna sterylizacja butelek parownika może wprowadzić do testu bakterie zanieczyszczające. Inkubacja bulionu użytego do przepłukania butelki parownika w kroku 3.6 w sterylnym naczyniu może być wykorzystana do potwierdzenia, że butelki zostały całkowicie wysterylizowane. Jeśli wymagana jest dodatkowa sterylizacja, można zastosować dodatkowe płukanie roztworami dezynfekującymi, takimi jak Virkon, przed myciem w powierzchniowo czynnym środku czyszczącym, opisanym w kroku 3.2.

Drugim krokiem, który może spowodować błędne wyniki, jest rozcieńczenie konkurencyjnego szczepu (krok 6.1). Jeżeli rozcieńczenie nie jest optymalne, jednoznaczne pomiary inhibicji mogą nie być łatwe do określenia. Test ten został zoptymalizowany przy użyciu różnych izolatów donosowych jako szczepów wytwarzających inhibitory w szerokim zakresie gatunków Gram-dodatnich i Gram-ujemnych w porównaniu z S. aureus SH1000 jako konkurencyjnym szczepem ^7,8. Następnie został przetestowany przy użyciu różnych gronkowców koagulazo-ujemnych i koagulazo-dodatnich jako szczepów konkurencyjnych i wytwarzających inhibitory. Podczas badania rodzajów innych niż te opisane powyżej jako szczep konkurencyjny, może być konieczna pewna optymalizacja rozcieńczenia dla inokulum.

Jeśli wyniki klarowności różnią się znacznie między powtórzeniami, może być konieczna standaryzacja inokulum konkurencyjnego szczepu poprzez ustawienie go na określoną gęstość optyczną. Wydłuży to jednak czas potrzebny na przygotowanie testu i prawdopodobnie zmniejszy liczbę szczepów, które można przetworzyć w jednym doświadczeniu. Wizualne dostosowanie kultury do odpowiedniego OD przy użyciu standardu McFarland może stanowić szybką alternatywę.

Jednym z ograniczeń tej techniki jest to, że można ją stosować tylko do bakterii zdolnych do hodowli. Dlatego w wielu badaniach wykorzystuje się sekwencjonowanie 16S rRNA do przewidywania interakcji wykluczających konkurencję ^3,4,13. Jednak techniki genetyczne i metagenomiczne mogą rozróżniać członków społeczności tylko na poziomie gatunku i/lub nie uwzględniają szczególnej zmienności cech wewnątrzgatunkowych. Możliwe jest przeprowadzenie badań przesiewowych pod kątem związku konkretnego genu kodującego cechę z obecnością lub brakiem gatunku bakterii ⁵, jednak wymaga to wstępnej wiedzy na temat genu, który może być związany z wykluczeniem gatunku.

Ze względu na bezpieczeństwo tej techniki polega na tym, że ze względu na wytwarzanie bakterii w aerozolu, może być ona stosowana tylko w laboratoriach z komorą bezpieczeństwa poziomu 2 lub z podobnymi środkami ostrożności. Istnieją alternatywne techniki testowania konkurencji między izolatami, które uwzględniają zmienność cech wewnątrzgatunkowych i nie generują aerozoli bakterii. Jedną z takich metod jest jednoczesny test antagonizmu ². W tej metodzie inokulum jednego izolatu rozprowadza się na płytce agarowej, a drugi inokulum izolatu jest nakrapiany lub dźgany na wierzchu po wyschnięciu pierwszego. W ten sposób powstałoby środowisko, w którym szczepy bezpośrednio konkurują ze sobą (jednoczesny antagonizm), konkurując zarówno o produkcję związków hamujących, jak i o wymiatanie składników odżywczych w pierwszej kolejności. Przewaga testu odroczonego hamowania wzrostu w porównaniu z równoczesnym testem antagonizmu polega na tym, że izolat inhibitora powinien zawsze mieć przewagę konkurencyjną polegającą na tym, że jest w pełni ugruntowany przed inwazją konkurencyjnego izolatu. Jest to bardziej odzwierciedleniem tego, co stałoby się w środowisku, ponieważ w większości nisz jeden izolat zostanie ustanowiony przed dodaniem innego szczepu, a nie dwa izolaty zostaną dodane w tym samym czasie ⁸.

Inną alternatywą, aby uniknąć wytwarzania bakterii w aerozolu, byłoby dodanie konkurencyjnego izolatu do górnego agaru, który można wylać, a nie rozpylać na izolat inhibitora. Jednak objętość dodanego górnego agaru musiałaby wynosić około 3 ml, aby zapewnić równomierne pokrycie płytki. W tej objętości konkurencyjny izolat nie byłby hodowany na tym samym podłożu co izolat inhibitora, więc nie cierpiałby z powodu zmniejszonej ilości składników odżywczych. Konkurent nie miałby również bezpośredniego kontaktu z żadnymi związkami hamującymi, dopóki nie dyfundowałyby one do górnego agaru. Takiego testu nie można określić jako odroczonego hamowania lub jednoczesnego antagonizmu.

Podobną metodę stosowano wcześniej do oceny poziomu oporności na bacytracynę wśród klinicznych izolatów S. aureus ¹⁰. Główna różnica między protokołem opisanym tutaj a tym opisanym przez ¹⁰ polega na tym, że ten drugi klasyfikuje tylko konkurencyjne szczepy jako wrażliwe (całkowita inhibicja - wynik klarowności 0) lub oporne (częściowe lub brak hamowania - wynik klarowności 1-5). Test odroczonego hamowania wzrostu może być zatem również wykorzystywany do badań przesiewowych pod kątem poziomów oporności producentów określonych środków przeciwdrobnoustrojowych, a nawet do poszukiwania nowych środków przeciwdrobnoustrojowych aktywnych przeciwko patogenom wielolekoopornym.

Sugeruje się, że mikroflorą gospodarza można manipulować w celu wyeliminowania niepożądanych członków społeczności bakteryjnej ⁹. Wykazano już, że stosowanie corynebacteria lub Staphylococcus epidermidis eliminuje kolonizację S. aureus w nozdrzach u znacznej części populacji ^11,12. Badania nad konkretnymi szczepami, które mogą konkurencyjnie wykluczać niepożądanych członków flory gospodarza, za pomocą technik takich jak ta opisana tutaj, mogą zatem prowadzić do przyszłych terapii.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Bulion do infuzji serca mózgu	Lab M	lab049	bogate podłoże
agarowe	Merck Milipore	101614
szalki Petriego	Sarstedt	82.1473.001
Plastikowy parownik perfum	nieznany	-	10 cm wysokości z przezroczystą plastikową butelką z rozpylaczem o średnicy 3,5 cm z pokrywką, zakupioną w dziale podróżnym supermarketu
Butelki uniwersalne		już nieprodukowane, alternatywa SLS BOT5006	szklana butelka cylindryczna o pojemności 28 ml (średnica ~280 mm, wysokość 850 mm), z płaskim dnem i plastikową nakrętką
Decon 90	Decon		Powierzchniowo czynny środek czyszczący