Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Skuteczność ochronna i odpowiedź immunologiczna płuc po podaniu podskórnym i donosowym BCG myszom

10K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54440

⸱

19 września 2016

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology, University of Zaragoza

W tym artykule

Podsumowanie

Szczegółowo opisujemy metodologię stosowaną do porównania skuteczności ochronnej i odpowiedzi immunologicznej płuc indukowanej przez donosowe i podskórne szczepienie z BCG w modelu mysim. Nasze wyniki pokazują korzyści płynące ze szczepienia płuc i sugerują rolę odpowiedzi za pośrednictwem IL17 w ochronie indukowanej szczepionką.

Streszczenie

Pomimo globalnego zasięgu śródskórnych szczepień BCG, gruźlica pozostaje jedną z najbardziej rozpowszechnionych chorób zakaźnych na świecie. Dane przedkliniczne wskazują, że szczepionki przeciwko gruźlicy płuc są obiecującą strategią zapobiegania chorobom płuc, które są odpowiedzialne za przenoszenie. W niniejszej pracy opisano metodologię zastosowaną do wykazania w modelu mysim korzyści płynących ze szczepienia donosowego BCG w porównaniu z podskórnym. Nasze dane wykazały większą skuteczność ochronną po donosowym podaniu BCG. Ponadto nasze wyniki wskazują, że szczepienie płucne wywołuje wyższą odpowiedź immunologiczną w płucach, w tym odpowiedzi Th1 i Th17, a także wzrost stężenia immunoglobuliny A (IgA) w drogach oddechowych. Nasze dane wskazują na korelację między skutecznością ochronną a obecnością komórek wytwarzających IL17 w płucach po prowokacji Mycobacterium tuberculosis, co sugeruje rolę tej cytokiny w odpowiedzi ochronnej zapewnianej przez szczepienie płucne. Na koniec szczegółowo opisujemy globalny przepływ pracy, który opracowaliśmy w celu zbadania szczepień układu oddechowego w modelu mysim, które można ekstrapolować na inne szczepionki przeciw gruźlicy, oprócz BCG, ukierunkowane na odpowiedź śluzówkową lub inne drogi podania płucnego, takie jak dotchawicza lub aerozol.

Wprowadzenie

Gruźlica (TB) jest jedną z głównych chorób zakaźnych powodujących więcej zgonów niż HIV na świecie, a w połączeniu z rosnącym wzrostem szczepów wielolekoopornych sprawia, że gruźlica jest alarmującym globalnym problemem zdrowotnym1. Nowe narzędzia diagnostyczne, skuteczniejsze i mniej toksyczne leki oraz nowe bezpieczne i skuteczne szczepionki przeciwko gruźlicy są pilną potrzebą, zwłaszcza w krajach rozwijających się.

Szczepienie płucne, które naśladuje naturalną drogę zakażenia gruźlicą, stanowi atrakcyjne podejście do pobudzania lokalnej odpowiedzi immunologicznej gospodarza. W związku z tym różne prace przedkliniczne na różnych odpowiednich modelach zwierzęcych gruźlicy wykazały większą skuteczność szczepionki po szczepieniu płucnym w porównaniu z drogą podskórną lub śródskórną 3-6. Niemniej jednak mechanizmy ochronne wywoływane przez szczepienie płucne nie są dobrze poznane. W ostatnich latach kilka prac wskazywało na odpowiedź za pośrednictwem IL17 jako ważny czynnik specyficznej dla gruźlicy odpowiedzi immunologicznej błony śluzowej, ponieważ w modelach mysich z niedoborem szczepionki błony śluzowej IL17 skuteczność ochronna wywołana szczepionką jest upośledzona 7,8.

Ostatnio po raz pierwszy wykazaliśmy, że donosowe podawanie BCG chroniło myszy DBA/2, szczep myszy charakteryzujący się brakiem ochrony po podskórnej immunizacji BCG 9. Wyniki te sugerują, że szczepienie przeciwko gruźlicy układu oddechowego może być bardziej skuteczne w zmniejszaniu częstości występowania gruźlicy w krajach endemicznych, w których śródskórne BCG jest uważane za nieskuteczne w walce z gruźlicą płuc.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie myszy były trzymane w kontrolowanych warunkach i obserwowane pod kątem jakichkolwiek oznak choroby. Prace eksperymentalne prowadzono zgodnie z europejskimi i krajowymi dyrektywami dotyczącymi ochrony zwierząt doświadczalnych oraz za zgodą właściwych lokalnych komisji etycznych.

1. Przygotowanie ilościowych zapasów glicerolu BCG Danish i Mycobacterium tuberculosis H37Rv

UWAGA: Wszystkie opisane protokoły zostały wykonane w warunkach BSL3.

  1. Rozmrozić zamrożone zapasy glicerolu szczepów BCG Danish lub H37Rv i zaszczepić 100 μl w 10 ml pożywki 7H910 uzupełnionej Tween-80 0,05% (v/v) i ADC (albumina, dekstroza, katalaza) 10% (v/v).
  2. Inkubować w warunkach statycznych przez tydzień w temperaturze 37 °C, aż kultura znajdzie się w fazie logarytmicznej.
  3. Zwiększ skalę hodowli bakteryjnej, przenosząc 10-mililitrową kulturę do 200 ml świeżej pożywki. Inkubować przez dodatkowe 20 dni w warunkach statycznych.
  4. Przenieść do probówek wirówkowych o pojemności 50 ml i wirować przez 15 minut przy 2500 x g.
  5. Odrzucić supernatanty i ponownie zawiesić osad bakteryjny w pozostałej objętości. Dodaj do każdej probówki sterylne szklane kulki o średnicy 3 mm (10 - 15 na probówkę).
  6. Wiruj energicznie przez 1 minutę w celu dysocjacji grudek bakteryjnych. Zawiesić każdą osadkę w 10 ml PBS za pomocą Tween-80 0,05% (v/v).
  7. Pozostaw probówki na 10 minut, aby osadzały się największe agregaty bakteryjne i szklane kulki.
  8. Odzyskać 9,5 ml supernatantu z każdej z 4 probówek zawierających małe grudki i pojedyncze bakterie i przenieść objętości do jednej świeżej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml (końcowa odzyskana objętość 38 ml). Wirować przez 10 minut przy 400 x g.
  9. Odzyskać 35 ml supernatantu (zawierającego głównie pojedyncze bakterie) w jednej świeżej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml i dodać 15 ml PBS z glicerolem 50% (v/v), uzyskując końcowe stężenie glicerolu 15% (v/v).
  10. Delikatnie wymieszać i rozprowadzić w 1 ml porcji w odpowiednich probówkach do zamrażania. Przechowywać w temperaturze -80 °C (jedna partia zawiera około 50 porcji glicerolu).
  11. Aby określić ilościowo zapasy glicerolu, rozmrozić glicerolu następnego dnia po zamrożeniu i wykonać siedem dziesięciokrotnych seryjnych rozcieńczeń w oddzielnych 1,5-mililitrowych probówkach zawierających 900 μl PBS.
  12. Płytka 100 μl każdego rozcieńczenia w stałym podłożu agarowym7H10 10 uzupełnionym ADC 10% (v/v) przygotowanym na szalkach Petriego o średnicy 55 mm.
  13. Ostrożnie dodaj szklane kulki o średnicy 3 mm (ok. 10 na płytkę) i delikatnie potrząśnij płytką, aby równomiernie rozprowadzić objętość na płytce agarowej. Wyrzuć koraliki i uszczelnij płytkę agarową parafilmem.
  14. Inkubować przez 21 dni w temperaturze 37 °C i oznaczyć stężenie bakterii, licząc jednostki tworzące kolonie (CFU) w rozcieńczeniach, w których można dokładnie rozróżnić pojedyncze kolonie.

2. Szczepienie myszy

  1. Rozmrozić wstępnie oznaczoną ilościowo glicerolę BCG i rozcieńczyć ją w PBS, aby przygotować dwie zawiesiny. Obliczyć objętość końcową, biorąc pod uwagę, że dawka na zwierzę wynosi 100 μl w przypadku podawania podskórnego (10,7 jtk/ml w przypadku szczepienia podskórnego) i 40 μl w przypadku podawania donosowego (2,5 x 10,7 jtk w przypadku szczepienia donosowego).
  2. Użyj specjalistycznej stacji anestezjologicznej dla gryzoni, aby znieczulić myszy mieszaniną izofluranu i tlenu. Użyj izofluranu 5% do wywołania znieczulenia i 2% do utrzymania myszy w komorze anestezjologicznej. (Można zastosować inną akceptowaną metodę znieczulenia).
  3. W celu podania szczepionki podskórnej napełnić strzykawkę o pojemności 1 ml igłą 26 G z 1 ml zawiesiny bakteryjnej (10-7 jtk/ml). Usuń pęcherzyki powietrza.
  4. Umieść znieczuloną mysz na płaskiej powierzchni w pozycji leżącej wewnątrz kaptura z przepływem laminarnym i zaszczepij podskórnie 100 μl (10,6 CFU/dawkę) szczepionki w bok grzbietu myszy. Umieść mysz z powrotem w klatce i monitoruj ją, aby upewnić się, że prawidłowo dochodzi do siebie po znieczuleniu.
  5. Zmieniać igłę strzykawki między kolejnymi podanymi dawkami myszy. Usunięto pęcherzyki powietrza, jak opisano powyżej.
  6. W przypadku podawania donosowego umieść znieczuloną mysz w pozycji leżącej wewnątrz kaptura.
  7. Za pomocą mikropipety pobrać 20 μl zawiesiny o stężeniu 2,5 x 107 jtk/ml. Umieść inokulum kropla po kropli między dwoma nozdrzami, aż cała objętość zostanie zdeponowana, pozostawiając czas między kroplami, aby mysz mogła wdychać objętość. Uwaga: myszy mogą cierpieć na niewydolność oddechową podczas tej procedury, dlatego należy je pozostawić do przyswojenia każdej kropli przed podaniem następnej, aby zapobiec jej w takim samym stopniu jak to możliwe.
  8. Ponownie napełnij mikropipetę kolejnymi 20 μl i powtórz operację. Jeśli mysz zacznie budzić się ze znieczulenia po pierwszym zaszczepieniu, umieść ją w komorze anestezjologicznej przed drugim. Umieść mysz z powrotem w klatce i upewnij się, że prawidłowo dochodzi do siebie po znieczuleniu.

3. Wyzwanie donosowe myszy ze szczepem H37Rv

  1. Rozmrozić wstępnie oznaczoną ilościowo glicerolę H37Rv i rozcieńczyć ją w PBS, aby przygotować zawiesinę bakteryjną o stężeniu 2 500 CFU na ml. Obliczyć końcową objętość, biorąc pod uwagę, że dawka na zwierzę wynosi 40 μl.
  2. H37Rv jest inokulowany donosowo, jak opisano w 2,5 - 2,7. Końcowa dawka prowokacyjna na mysz wynosi 10,2 jtk/40 μl.

4. Analiza indukowanej odpowiedzi immunologicznej w płucach

  1. Zawiesina komórkowa płuc
    UWAGA: Ocena indukowanej szczepionką adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej w płucach wymaga wytworzenia zawiesiny pojedynczej komórki. W tym celu używamy dysocjatora tkankowego, takiego jak GentleMACS.
    1. Poświęć mysz przez zwichnięcie szyjki macicy (lub inną akceptowaną humanitarną metodologię) i upewnij się, że mysz nie dotyka gałki ocznej, aby potwierdzić brak odruchu mrugania.
    2. Wewnątrz okapu z przepływem laminarnym wyciągnij płuca za pomocą sterylnych nożyczek i kleszczy i umieść je na czystej powierzchni. Oczyść płuca, usuwając tchawicę i tkankę łączną, a następnie przenieś płuca do 1,5 ml probówki z PBS (trzymaj na lodzie do czasu przetworzenia).
    3. Aby wytworzyć zawiesinę komórkową, umieść płuca w odpowiedniej probówce do dysocjacji narządów (probówka z dysocjatorem C) zawierającej 5 ml 10 mM HEPES-NaOH pH 7,4, 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2 i 1,8 mM buforu CaCl2.
    4. Dodać 100 μl kolagenazy D 100 mg/ml (stężenie końcowe 2 mg/ml) i 40 μl DNAzy I 20 000 j.m./ml (160 j.m./ml stężenie końcowe.
      UWAGA: Roztwory podstawowe kolagenazy D lub DNazyI przygotowuje się rozpuszczając liofilizowane enzymy odpowiednio w PBS lub glicerolu 50% (v / v), 20 mM Tris-HCl pH 7,5 y MgCl2 1 mM.
    5. Umieść rurkę w dysocjatorze tkankowym i użyj predefiniowanego programu m_lung_01 do fragmentacji płuc. Inkubować probówkę w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej przez 30 minut.
    6. Umieść probówkę w dysocjatorze i użyj predefiniowanego programu m_lung_02 do całkowitej homogenizacji płuc do pojedynczej zawiesiny komórkowej.
    7. Przepuścić zawiesinę komórkową przez nylonowe sitko o średnicy 70 μm zamontowane w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml. Umyj sitko 10 ml pożywki RPMI 1640.
    8. Odwirowywać komórki przez 5 minut przy 400 x g i odrzucić supernatant.
    9. Dodać 1 ml buforu lizującego erytrocyty, wymieszać przez wirowanie i inkubować przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.
    10. Dodać 10 ml pożywki RPMI 1640 i wirować komórki przez 5 minut w sile 400 x g.
    11. Ponownie zawiesić komórki w 0,5 ml kompletnej pożywki RPMI 1640 uzupełnionej 10% inaktywowaną termicznie surowicą cielęcą płodu (FCS), 2 mM L-glutaminy, 100 μg/ml streptomycyny, 100 IU/ml penicyliny i 50 μM 2-merkaptoetanolu.
      UWAGA: FCS inaktywuje się przez inkubację w temperaturze 56°C przez 30 minut.
    12. Policz komórki i dodaj kompletną pożywkę RPMI 1640, aby osiągnąć końcową gęstość komórkową 107 komórek/ml.
      UWAGA: Do zliczania komórek używamy automatycznego licznika komórek.
    13. Rozprowadzić 100 μl zawiesiny komórkowej na sterylnej płytce z dnem U 96 dołków (106 komórek / dołek).
    14. Dodać 50 μl/studzienkę kompletnej pożywki RPMI 1640 z 15 μg/ml komercyjnej pochodnej białka oczyszczonego H37Rv (PPD) (stężenie końcowe 5 μg/ml).
  2. Pobieranie supernatantu do oznaczania cytokin metodą ELISA
    1. Inkubować płytkę z 4.1.14 przez 48 godzin w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
    2. Odwirować płytkę przez 5 minut przy 400 x g i odzyskać 100 μl supernatantu.
    3. Przechowywać w temperaturze -80 °C.
    4. Rozcieńczyć supernatanty 1/10 i 1/2 w buforze do oznaczania odpowiednio IFNγ i IL17A. Oznacz stężenia cytokin za pomocą dostępnych w handlu zestawów ELISA, zgodnie z instrukcjami producenta (zestawy rozwojowe ELISA).
  3. Barwienie wewnątrzkomórkowe w celu oznaczenia komórek CD4 + wytwarzających cytokiny za pomocą cytometrii przepływowej
    1. Inkubować płytkę z 4.1.14 przez 18 godzin w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
    2. Dodać 1,5 μl Brefeldin A 1 mg/ml (bulion rozpuszczony w DMSO) do każdego dołka (10 μg/ml stężenie końcowe) i inkubować przez dodatkowe sześć godzin.
    3. Odwirować płytkę z 4.3.2 przez 1 minutę przy 3200 x g i odrzucić supernatant.
    4. Zawiesić komórki w 50 μl anty-mysiego CD4-FITC rozcieńczonego w RPMI 1640 z 10% FCS (1/500) i inkubować przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    5. Odwirować płytkę z 4.3.4 przez 1 minutę przy 3 200 x g, odrzucić supernatant i dodać 100 μl/basenik roztworu utrwalającego. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 20 minut.
    6. Przemyć komórki dwukrotnie 150 μl/popłuczynę roztworu przepuszczalnego.
      UWAGA: 10x skoncentrowany bulion rozcieńcza się w wodzie dejonizowanej, aby przygotować 1x roztwór roboczy.
    7. Zawieś komórki w 50 μl anty mysiego IFNγ-APC i anty-mysiego IL17A-APC. Cy7 rozcieńczony w roztworze przepuszczalnym (1/250 oba przeciwciała).
    8. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    9. Przemyć komórki dwukrotnie 150 μl/przemycie roztworu permeabilizacyjnego.
    10. Zawieś komórki w 200 μl PBS w celu akwizycji cytometrii przepływowej.

5. Analiza immunoglobulin w płukaniu oskrzelowo-pęcherzykowym (BAL)

  1. Pobieranie próbek BAL
    1. Poświęć mysz przez zwichnięcie szyjki macicy (lub inną akceptowaną humanitarną metodologię) i upewnij się, że mysz nie dotyka gałki ocznej, aby potwierdzić brak odruchu mrugania.
    2. Odsłoń tchawicę za pomocą odpowiednio precyzyjnych sterylnych kleszczy i nożyczek i wykonaj małe nacięcie w tchawicy, uważając, aby nie wyciąć jej całkowicie. Należy uważać, aby nie spowodować krwawienia, które mogłoby zanieczyścić próbkę BAL.
    3. Wprowadzić do tchawicy kaniulę połączoną ze sterylną strzykawką o pojemności 1 ml z 800 μl lodowatego PBS.
    4. Powoli wstrzyknąć PBS do płuc, a następnie odzyskać objętość BAL, bardzo powoli cofając tłok strzykawki, aby uniknąć zapadnięcia się płuc.
      UWAGA: Odzysk od 500 do 600 μl jest zadowalający.
    5. Przenieść objętość BAL do probówki o pojemności 1,5 ml i upewnić się, że BAL pozostaje niezabarwiony, co wskazuje, że nie jest zanieczyszczony krwią (przechowywać na lodzie do czasu przetworzenia).
    6. Odwirować próbki BAL przez 5 minut przy 400 x g i przenieść supernatant do nowej probówki.
    7. Przechowywać supernatanty w temperaturze -80 °C.
  2. Oznaczanie IgA w supernatantach BAL
    UWAGA: Wszystkie użyte odczynniki mają temperaturę RT.
    1. 96-dołkowe płytki z płaskiego dna polistyrenu o wysokim stopniu wiążącego białka pokryć 100 μl PPD rozcieńczonego w PBS (10 μg/ml) do oznaczania IgA swoistego dla M. tuberculosis lub 100 μl supernatantu BAL rozcieńczonego 10 razy w PBS w celu oznaczenia całkowitej IgA.
    2. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
    3. Wyrzuć supernatant i postukaj płytką o ręcznik papierowy, aby wyschł. Przemyć 200 μl/studzienkę PBS.
    4. Blok z 200 μl/basenik albuminy surowicy bydlęcej (BSA) 1% (w/v) w PBS-Tween-80 0,05% (v/v) (bufor blokujący).
    5. Inkubować 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    6. Przemyć raz 200 μl/studzienkę PBS-Tween-80 0,05% (v/v) (bufor do mycia).
    7. Dodać 100 μl nierozcieńczonego supernatantu BAL do studzienek pokrytych PPD. Inkubować dwie godziny w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Jeżeli oznaczanie całkowitej IgA odbywa się równolegle z oznaczaniem IgA specyficznej dla PPD, podczas tej inkubacji należy pozostawić studzienki całkowitej IgA ze 100 μl buforu do przemłukiwania.
    8. Przemyć trzykrotnie 200 μl/studzienkę buforu do mycia.0170004
    9. Dodać 100 μl anty-mysiej IgA sprzężonej z peroksydazą chrzanową (HRP), rozcieńczonej w buforze blokującym (1/10 000).
    10. Inkubować 1 godzinę RT.
    11. Przemyć pięć razy 200 μl/studzienkę buforu do płukania.
    12. Dodać 100 μl/basenik 3,3′,5,5′-tetrametylobenzydyny (TMB). Inkubować 20 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
    13. Dodać 100 μl/basenikH2SO4 0,5N. Odczytać płytkę w spektrofotometrze o długości fali 450 nm.

6. Oznaczanie obciążenia bakteryjnego w płucach

  1. Homogenizacja i posiew płuc
    1. Cztery tygodnie po prowokacji poświęć mysz przez zwichnięcie szyjki macicy (lub inną akceptowaną humanitarną metodologię) i upewnij się, że mysz jest martwa, dotykając gałki ocznej, aby potwierdzić brak odruchu mrugania.
    2. Umieść mysz w pozycji leżącej, zamocowaną na płaskiej i zdezynfekowanej powierzchni wewnątrz okapu z przepływem laminarnym.
    3. Wykonaj nacięcie i usuń skórę z okolicy klatki piersiowej, aby pozostawić widoczny obszar klatki piersiowej.
    4. Wytnij żebra i zbierz płuca i serce za pomocą sterylnych nożyczek i kleszczy. Umieść narządy na czystej powierzchni.
    5. Oczyść płuca, usuwając serce, tchawicę i tkankę łączną, a następnie przenieś płuca do 1,5 ml probówki z 1 ml wody dejonizowanej (trzymaj na lodzie do czasu przetworzenia).
    6. Za pomocą sterylnych kleszczy przenieś płuca każdej myszy do odpowiedniej probówki do homogenizacji narządów (M - probówka dysocjacyjna), zawierającej 1 ml wody dejonizowanej.
    7. Umieścić probówkę w dysocjatorze tkankowym i za pomocą predefiniowanego programu RNA_1 homogenizować płuca.
    8. Wykonać pięć dziesięciokrotnych seryjnych rozcieńczeń w probówkach o pojemności 1,5 ml, zaczynając od 100 μl homogenatu płucnego rozcieńczonego w 900 μl.
    9. Rozcieńczenia płytki zgodnie z opisem w ppkt 1.11-1.14.
  2. Różnicowanie BCG i H37Rv za pomocą PCR
    UWAGA: Na tabliczkach z 6.1.6 odpowiadających grupie szczepionej BCG drogą donosową, przeanalizowaliśmy reprezentatywną liczbę kolonii za pomocą rozróżniającego PCR między BCG i H37Rv, aby upewnić się, że CFU brany pod uwagę do oceny skuteczności ochronnej przyznanej przez szczepionkę odpowiadał jednoznacznie H37Rv. Ten PCR ma na celu amplifikację RD9, regionu genomowego różniącego się u BCG i M. tuberculosis, dając fragment 2618 pz dla H37Rv i 465 pz dla BCG 11.
    1. Przygotować główny materiał mieszankowy dla wszystkich próbek o objętościach na próbkę zgodnie ze wskazaniami, a następnie rozprowadzić w probówkach do PCR (9 μl/próbkę).
      UWAGA: Bufor 5x: 2 μl. Starter do przodu 25 μM (GTGTAGGTCAGCCCCATCC): 0,32 μl, Starter odwrotny 25 μM (GCCCAACAGCTCGACATC): 0,32 μl, polimeraza Taq 5 jednostek/μl: 0,04 μl, Dejonizowany H2O: 6,32 μl.
    2. Dotknij kolonii sterylną wykałaczką i zanurz wykałaczkę z próbką w probówce PCR zawierającej mieszankę wzorcową.
    3. Uruchom PCR z następującym programem: 10 min 95 °C (ten krok ma na celu wywołanie zakłócenia bakteryjnego), 10 min 95 °C (ten krok ma na celu wywołanie zakłócenia bakteryjnego), 35 cykli (30 sekund w 95 °C, 1 min w 58 °C i 4 min w 72 °C).
    4. Załaduj próbki PCR do 1% żelu agarozowego z bromkiem etydyny i uruchom próbki, aby uwidocznić fragmenty.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Niniejsza praca opisuje porównanie dwóch dróg podania BCG: podskórnej oraz donosowej. Droga podskórna jest porównywalna z drogą śródskórną, która jest obecnie stosowaną na całym świecie kliniczną drogą podawania BCG. Donosowa droga szczepienia ma na celu naśladowanie naturalnej drogi zakażenia M. tuberculosis, w celu wywołania odpowiedzi immunologicznej bezpośrednio w płucach, które są głównym narządem docelowym tego patogenu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Chociaż obecna szczepionka przeciwko gruźlicy, BCG, jest najczęściej podawaną szczepionką w historii, gruźlica pozostaje jedną z głównych przyczyn zgonów i zachorowalności z powodu chorób zakaźnych na całym świecie. Ten paradoks tłumaczy się brakiem ochrony tej szczepionki przed gruźlicą płuc, która jest odpowiedzialną formą transmisji. Pilnie potrzebne są nowe metody szczepień skuteczne przeciwko płucnym postaciom choroby, ponieważ miałyby one największy wpływ na przenoszenie choroby na całym świecie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez "Hiszpańskie Ministerstwo Gospodarki i Konkurencyjności" [numer grantu BIO2014-5258P], "Komisję Europejską" przez programy H2020 [numery grantów TBVAC2020 643381].

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Rosół Middlebrook 7H9BD271310
Middlebrook ADC WzbogacanieBD211887
Tween 80ScharlauTW00800250
Koraliki szklane o średnicy 3 mmScharlau038-138003
Middlebrook 7H10 AgarBD262710
Strzykawka 1 ml 26GA 0,45 x 10 mmBD301358
Dysocjator GentleMACSMiltenyi Biotec130-093-235
Rurki CMiltenyi Biotec130-093-237
M RurkiMiltenyi Biotec130-093-236
Kolagenaza DRoche11088882001
DNaseIApplichemA3778,0100
Falcon 70 µ m Sitko komórkoweCorning352350
RPMI 1640SigmaR0883
Bufor lizujący czerwone krwinkiSigmaR7757
Suplement GlutaMAXGibco35050-061100x skoncentrowany
roztwór penicyliny-streptomycynySigmaP4333100x skoncentrowana
surowica cielęca płoduBiologiczna Industries04-001-1A
2-merkaptoetanolSigmaM3148-25ML
Scepter 2.0 Ręczny automatyczny licznik komórekMilliporePHCC20040
Scepter Czujniki licznika komórek, 40 i mikro; mMiliporePHCC40050
Mycobacterium Tuberculosis - Tuberculin PPDStatens Serum Institut (SSI)2390
Mysz IFN-γ Zestaw rozwojowy ELISA MABTECH3321-1H
Mouse IL17A ELISA Mabtech3521-1H
Brefeldin ASigmaB7651
FITC Rat Anti-Mouse CD4BD 553047
BD Cytofix/Cytoperm KitBD555028
APC-Cy7 Rat Anti-Mouse IL-17ABD560821
APC Mouse Anti-Mouse IFNgBD554413
LACHRYMAL OLIVE LUER LOCK 0,60 x 30 mm. 23G x 1 1/4"UNIMED27.134Stosowany jako kaniula tchawicy do
wysokobiałkowych 96-dołkowych płytek polistyrenowych wiążących wysokobiałkowe MAXISORPNUNC430341
Albumina, z surowicy bydlęcejSigmaA4503
Goat Anti-Mouse IgA (&alfa;-łańcuch specyficzny)− Przeciwciało przeciwko peroksydazieSigmaA4789
3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB) SigmaT0440
MyTaq DNA PolimerazaBiolineBIO-21107Zestaw zawiera bufor 5x
Zestaw rozwojowy

Bibliografia

  1. Zumla, A., et al. The WHO 2014 global tuberculosis report--further to go. Lancet Glob Health. 3 (1), e10-e12 (2015).
  2. Mangtani, P., et al. Protection by BCG vaccine against tuberculosis: a systematic review of randomized controlled trials. Clin Infect Dis. 58 (4), 470-480 (2014).
  3. Aguilo, N., et al. Pulmonary Mycobacterium bovis BCG vaccination confers dose-dependent superior protection compared to that of subcutaneous vaccination. Clin Vaccine Immunol. 21 (4), 594-597 (2014).
  4. Chen, L., Wang, J., Zganiacz, A., Xing, Z. Single intranasal mucosal Mycobacterium bovis BCG vaccination confers improved protection compared to subcutaneous vaccination against pulmonary tuberculosis. Infect Immun. 72 (1), 238-246 (2004).
  5. Giri, P. K., Verma, I., Khuller, G. K. Protective efficacy of intranasal vaccination with Mycobacterium bovis BCG against airway Mycobacterium tuberculosis challenge in mice. J Infect. 53 (5), 350-356 (2006).
  6. Lagranderie, M., et al. BCG-induced protection in guinea pigs vaccinated and challenged via the respiratory route. Tuber Lung Dis. 74 (1), 38-46 (1993).
  7. Gopal, R., et al. Interleukin-17-dependent CXCL13 mediates mucosal vaccine-induced immunity against tuberculosis. Mucosal Immunol. 6 (5), 972-984 (2013).
  8. Khader, S. A., et al. IL-23 and IL-17 in the establishment of protective pulmonary CD4+ T cell responses after vaccination and during Mycobacterium tuberculosis challenge. Nat Immunol. 8 (4), 369-377 (2007).
  9. Aguilo, N., et al. Pulmonary but Not Subcutaneous Delivery of BCG Vaccine Confers Protection to Tuberculosis-Susceptible Mice by an Interleukin 17-Dependent Mechanism. J Infect Dis. , (2015).
  10. Middlebrook, G., Cohn, M. L. Bacteriology of tuberculosis: laboratory methods. Am J Public Health Nations Health. 48 (7), 844-853 (1958).
  11. Brosch, R., et al. A new evolutionary scenario for the Mycobacterium tuberculosis complex. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (6), 3684-3689 (2002).
  12. Kaushal, D., et al. Mucosal vaccination with attenuated Mycobacterium tuberculosis induces strong central memory responses and protects against tuberculosis. Nat Commun. 6, 8533(2015).
  13. Lochhead, J. J., Thorne, R. G. Intranasal delivery of biologics to the central nervous system. Adv Drug Deliv Rev. 64 (7), 614-628 (2012).
  14. Lochhead, J. J., Wolak, D. J., Pizzo, M. E., Thorne, R. G. Rapid transport within cerebral perivascular spaces underlies widespread tracer distribution in the brain after intranasal administration. J Cereb Blood Flow Metab. 35 (3), 371-381 (2015).
  15. Griffiths, K. L., et al. Cholera toxin enhances vaccine-induced protection against Mycobacterium tuberculosis challenge in mice. PLoS One. 8 (10), e78312(2013).
  16. Hirota, K., et al. Plasticity of Th17 cells in Peyer's patches is responsible for the induction of T cell-dependent IgA responses. Nat Immunol. 14 (4), 372-379 (2013).
  17. Jaffar, Z., Ferrini, M. E., Herritt, L. A., Roberts, K. Cutting edge: lung mucosal Th17-mediated responses induce polymeric Ig receptor expression by the airway epithelium and elevate secretory IgA levels. J Immunol. 182 (8), 4507-4511 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Szczepienie BCG drog donosowpodsk rne podanie BCGp ukanie oskrzelowo p cherzykowekom rki produkuj ce IL17st enie IgAzaka enie szczepem H37Rvobci enie bakteryjne p uckom rki produkuj ce cytokiny
Skuteczność ochronna i odpowiedź immunologiczna płuc po podaniu podskórnym i donosowym BCG myszom
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.