Artykuł metodologiczny

Przeszczep do poduszeczki tłuszczowej jajnika myszy

11.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54444

⸱

7 września 2016

 ,  , 
1Department of Biomedical Sciences, Cornell University

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy test do przeszczepu jajników, odpowiedni do badań nad normalnym i przekształconym nabłonkiem żeńskiego układu rozrodczego. Mysia poduszka tłuszczowa umożliwia przeszczep dużych fragmentów tkanki, jest łatwo dostępna do zabiegu chirurgicznego i obrazowania oraz zapewnia najkorzystniejsze środowisko natywne dla tkanek pochodzenia Müllerowskiego.

Streszczenie

Testy transplantacji ortotopowej u myszy są nieocenione w badaniach nad regeneracją komórek i transformacją nowotworową. Typowe metody ortotopowego przeszczepu powierzchni jajnika i nabłonka jajowodów obejmują dootrzewnowe i śródkaletkowe podawanie komórek. Do ograniczeń tych metod zalicza się słabo zdefiniowaną lokalizację wstrzykiwanych komórek oraz ograniczoną objętość przestrzeni. Co więcej, słabo nadają się do długotrwałej konserwacji strukturalnej przeszczepionych narządów. Aby sprostać tym wyzwaniom, opracowaliśmy alternatywne podejście, które opiera się na wprowadzeniu komórek i fragmentów tkanek do mysiej poduszki tłuszczowej. Poduszka tłuszczowa jajnika myszy znajduje się w bezpośrednim sąsiedztwie jajnika i jajowodu (inaczej jajowodu, jajowodu) i zapewnia znajome mikrośrodowisko dla komórek i tkanek tych narządów. W naszym podejściu znakowane fluorescencyjnie komórki mysie i ludzkie oraz fragmenty jajowodu są wszczepiane za pomocą minimalnie urazowej operacji nacięcia grzbietowego. Przeszczepione komórki i ich wyrostki łatwo lokalizują się w poduszeczce tłuszczowej jajnika przez ponad 40 dni. Długotrwałe przeszczepienie całej macicy pozwala na prawidłowe zachowanie wszystkich podstawowych składników tkankowych i nie powoduje niepożądanych skutków ubocznych, takich jak zwłóknienie i stan zapalny. Nasze podejście powinno mieć unikalne zastosowanie w udzielaniu odpowiedzi na ważne pytania biologiczne, takie jak różnicowanie, potencjał regeneracyjny i nowotworowy określonych populacji komórek. Ponadto powinien być odpowiedni do badań nad czynnikami mikrośrodowiskowymi w prawidłowym rozwoju i nowotworach.

Wprowadzenie

Testy transplantacyjne, które polegają na wprowadzaniu komórek i tkanek do określonych miejsc ciała u myszy, stanowią niezbędne podejście do badań nad regeneracją tkanek i kancerogenezą. Ortotopowe przeszczepy komórek, czyli ich umieszczenie w środowisku natywnym, są szczególnie ważne dla charakterystyki dorosłych komórek macierzystych. Istnienie komórek macierzystych sutka zostało po raz pierwszy zasugerowane przez przeszczepienie fragmentów nabłonka gruczołu sutkowego do wolnych gruczołów tłuszczowych sutka myszy1. Testy wszczepienia do humanizowanej mysiej poduszeczki tłuszczowej2 wykorzystano w celu podsumowania potencjału regeneracyjnego i prawidłowego rozwoju ludzkich pierwotnych komórek nabłonka piersi. Co więcej, seryjne i ograniczające rozcieńczenia przeszczepy fenotypowo odrębnych typów komórek do oczyszczonej poduszeczki tłuszczowej sutka miały kluczowe znaczenie dla przetestowania zdolności do samoodnawiania się i różnicowania wieloliniowego komórek macierzystych sutka3-5. Testy transplantacyjne w połączeniu ze śledzeniem linii genetycznej dostarczyły dowodów na to, że komórka pochodzenia jest w kancerogenezie sutka5. Przeszczepy torebki nerkowej są powszechnie stosowane do badania właściwości przypuszczalnych komórek macierzystych prostaty6. Ortotopowy przeszczep prawidłowych i nowotworowych organoidów trzustki myszy i człowieka ujawnił geny i szlaki zmienione w progresji raka7. Znaczenie rodzimego środowiska zostało również poparte wykazaniem różnorodnej regeneracji po wszczepieniu gruczołów potowych w różne miejsca, takie jak poduszeczki tłuszczowe sutka, poduszeczki tłuszczowe ramion i skóra pleców8.

Jama otrzewnowa i kaletka jajnika są zwykle używane jako miejsca do ortotopowego przeszczepu komórek nabłonka żeńskiego układu rodnego9-12. Obie te metody mają szereg ograniczeń. Dootrzewnowe wstrzyknięcie komórek prowadzi do ich zagnieżdżenia się w różnych obszarach jamy otrzewnej, komplikując w ten sposób monitorowanie wzrostu komórek. Ponadto różnice w mikrośrodowisku, takie jak stopień unaczynienia, unerwienia i reprezentacji komórek odpornościowych, mogą być dość znaczące w różnych obszarach jamy otrzewnej. Kaletka jajnika ma bardzo ograniczoną objętość, co pozwala na wstrzyknięcie nie więcej niż 10 μl płynu. To znacznie ogranicza ilość komórek, które można podać. Co więcej, wstrzyknięcia do kaletki jajnika mogą być dość trudne technicznie, a procedura wymaga znacznej ilości czasu.

Aby rozwiązać te problemy, wykorzystaliśmy właściwości poduszeczki tłuszczowej jajników. Poduszka tłuszczowa jajnika myszy ma duży rozmiar, przylega do jajnika i jajowodu i jest łatwo dostępna chirurgicznie. Doniesiono, że trofoblast koni może być przeszczepiony do poduszeczki tłuszczowej jajnikamyszy 13. Szczegóły tej metody nie zostały jednak opisane. Nie podano również, czy metoda ta może być stosowana do dorosłych komórek i tkanek. W tym miejscu opisujemy niezawodne podejście do przeszczepiania mysich i ludzkich komórek żeńskiego układu rozrodczego i pokazujemy, że metoda ta ma również zastosowanie do długotrwałych przeszczepów narządów.

Protokół

Wszystkie opisane prace in vivo zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Cornella.

1. Preparaty próbek do testów poduszeczek tłuszczowych jajników

  1. Izolacja i hodowla pierwotnych komórek nabłonka jajowodów (TE)
    1. Poddaj eutanazji myszy dawcy w wieku od 6 do 8 tygodni z pierwotnym białkiem zielonej fluorescencji wzmocnionej β-aktyną (EFGP) lub białkiem czerwonej fluorescencji β-aktyny-Discosoma (DsRed) przez podanie CO2, a następnie zwichnięcie szyjki macicy. Zweryfikuj udaną eutanazję za pomocą uszczypnięcia palca u nogi.
    2. Umieść pojedynczą mysz na chłonnym podkładzie, brzuszną stroną do góry, a następnie przetrzyj brzuch 70% etanolem. Otwórz skórę, wykonując boczne nacięcie na linii środkowej ciała i opuszkami palców pociągnij skórę powyżej i poniżej nacięcia w kierunku głowy i ogona myszy.
    3. Przytrzymaj otrzewną za pomocą kleszczy i wykonaj cięcie cienkimi nożyczkami, aby otworzyć jamę ciała. Delikatnie odepchnij cewkę jelita na bok i zlokalizuj narządy rozrodcze.
    4. Za pomocą cienkich kleszczy podnieś jeden róg macicy i przetnij 0,5 cm powyżej punktu, w którym rogi macicy się rozdzielają. Trzymając róg macicy, wypreparuj tkankę łączną przyczepioną do rogu macicy, jajowodu, jajnika i poduszeczki tłuszczowej jajnika. Wypreparowany układ rozrodczy umieścić w naczyniu z 6 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Kontynuuj z drugim układem rozrodczym.
    5. Przenieś naczynie do szafki bezpieczeństwa biologicznego i umyj chusteczki 3 razy w 6 ml sterylnego PBS. Kontynuuj pracę pod mikroskopem preparacyjnym znajdującym się w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Chwyć róg macicy delikatną pęsetą i odłącz róg macicy od jajowodu, przecinając go na połączeniu macicowo-jajowodowym. Wyciąć kaletkę jajnika otaczającą jajnik za pomocą igły 25 G.
      Uwaga: Po usunięciu kaletki jajnika rozwarstwienie jest zakończone, a pojedynczy jajowód pozostaje w roztworze PBS.
    6. Przenieś pojedynczą rurkę maciczną w kropli PBS o objętości 50 μl do naczynia o średnicy 3,5 cm i zmiel na kawałki o średnicy 0,1 mm za pomocą igieł o rozmiarze 28. Przenieść do 200 μl buforu do wytrawiania 1 (pożywka F12 (szynki) zmodyfikowanej pożywki Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionej 300 jednostkami kolagenazy ml-1 i 100 jednostkami hialuronidazy ml-1) i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 .
    7. Po inkubacji dodać 1 ml 0,25% kwasu trypsyno-etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) i zawiesić roztwór za pomocą końcówki do pipety o pojemności 1 ml (tzw. niebieskiej końcówki) 20 razy przez 3 minuty. Dodać 5 ml + 4 °C pożywki DMEM/F12 (szynki) zawierającej 2% płodowej surowicy bydlęcej.
    8. Zebrać tkanki przez odwirowanie (600 rcf, 5 min, temperatura pokojowa (RT)) i dodać 1 ml buforu wytrawiającego 2 (pożywka DMEM F12 (szynka) uzupełniona 7 mg ml-1 Dispazy II i 10 μg ml-1 Deoksyrybonukleazy I (DNazy I)). Zawiesić osad tkankowy 20 razy za pomocą końcówki do pipety o pojemności 1 ml.
    9. Dodać 5 ml kompletnego nabłonka nabłonka jajowodów myszy bez surowicy (M-TE-GM, tabela 1).
    10. Zebrać komórki przez odwirowanie (600 rcf, 5 min, RT). Dodać 1 ml M-TE-GM, zawiesić i policzyć komórki za pomocą hemocytometru. Wysiać 1 x 105 komórek w 1 ml na studzienkę na 24-dołkowej płytce o niskim mocowaniu i inkubować w M-TE-GM w temperaturze 37°C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 przez 4 dni.
    11. Zmieniaj podłoże codziennie.
    12. Przygotuj zawiesiny pojedynczych komórek hodowanych komórek TE o zawiesinie pierwotnej od myszy β-aktyny-EGFP lub β-aktyny-DsRed.
      1. Zbierz kultury zawiesiny TE z 24-dołkowych płyt o niskim mocowaniu. Odwirować (600 rcf, 5 min, RT) i zawiesić granulki komórkowe z 1 ml 0,25% trypsyny-EDTA. Inkubować przez 10 minut w temperaturze 37°C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 .
      2. Zatrzymaj aktywność trypsyny, dodając 5 ml pożywki DMEM/F12 (szynka) zawierającej 5% płodowej surowicy bydlęcej. Zebrać granulki komórkowe przez odwirowanie (600 rcf, 5 min, RT).
    13. Umyj granulki komórkowe dwukrotnie 4 ml zimnego PBS (4°C), dodaj 1 ml PBS na osad komórkowy i zawiesij. Policz komórki za pomocą hemocytometru i przenieś do probówek wirówkowych o pojemności 1,7 ml. Pracując na lodzie, dodaj 1 x 105 komórek do 10 μl PBS, a następnie dodaj 10 μl macierzy błony podstawnej. Zawieszenie i transport na lodzie do pomieszczenia dla zwierząt.
      Uwaga: Wszystkie prace związane z sekcją i hodowlą tkankową należy wykonywać w komorze bezpieczeństwa biologicznego w sterylnych warunkach.
  2. Przygotowanie unieśmiertelnionej ludzkiej linii komórkowej
    1. Oddzielnie hodować lentiwirusa-EGFP i -mCherry znakowaną ludzką nieśmiertelną linię komórek nabłonka powierzchni jajnika HIO118 do 80 - 90% konfluencji na 10 cm szalkach w temperaturze 37 ° C w inkubatorze 5% CO2 .
    2. Umyć naczynia dwukrotnie 10 ml PBS, dodać 1 ml 0,25% trypsyny-EDTA na naczynie i inkubować przez 10 minut w temperaturze 37°C w inkubatorze o stężeniu 5%CO2. Zatrzymać reakcję, dodając 10 ml pożywki DMEM/F12 (szynki) zawierającej 5% płodowej surowicy bydlęcej. Zebrać granulki komórkowe przez odwirowanie (600 rcf, 5 min, RT).
    3. Umyj granulki komórkowe dwukrotnie 10 ml zimnego PBS (4°C), dodaj 1 ml PBS na osad komórkowy i zawiesij. Policz komórki za pomocą hemocytometru i przenieś do probówek wirówkowych o pojemności 1,7 ml.
    4. Pracując na lodzie, dodaj 1,0 x 106 komórek znakowanych Lenti-mCherry + 1,0 x 106 komórek znakowanych Lenti-EGFP do 10 μl PBS. Dodać 10 μl matrycy błony podstawnej. Zawiesić i przetransportować na lodzie do pomieszczenia dla zwierząt.
  3. Przygotowanie jajowodu macicy
    1. Wypreparuj poszczególne jajowody od 6- do 8-tygodniowych dziewiczych myszy β-aktyny-DsRed w PBS, jak opisano w krokach 1.1.1-1.1.5. Przenieść pojedyncze jajowody maciczne do kropli PBS o objętości 200 μl pod mikroskopem preparacyjnym. Delikatnie rozwiń jajowody maciczne za pomocą pęsety i igieł o rozmiarze 28, usuwając mesosalpinx, część więzadła szerokiego, która podtrzymuje segmenty jajowodu. Umieść pojedyncze rozwinięte jajowody maciczne w kropli 200 μl lodowatego PBS, aż poduszeczka tłuszczowa biorczyni zostanie odsłonięta i przygotowana do przeszczepu.

2. Przeszczep poduszeczki tłuszczowej jajnika

Uwaga: Dezynfekuj narzędzia między każdą operacją na zwierzętach. Przygotuj i rozmieść cały sprzęt z wyprzedzeniem. Przeszczepy grzbietowe do prawej poduszeczki tłuszczowej jajnika są preferowane, ponieważ pozwala to uniknąć śledziony. Jednak biorczyczki mogą mieć przeszczepy w obu poduszeczkach tłuszczowych jajników.

  1. Użyj myszy syngenicznych lub myszy z ciężkim złożonym niedoborem odporności (SCID/NCr) jako biorców komórek pierwotnych. W przypadku komórek ludzkich, takich jak komórki HIO118, użyj myszy Nod / SCID / gamma (NSG) lub myszy SCID.
  2. Znieczulić mysz biorcę pojedynczym wstrzyknięciem dootrzewnowym 2,2,2-tribromoetanolu w dawce 0,15 ml/10 g masy ciała. Umieść zwierzę na poduszce grzewczej, w kapturze dla zwierząt i potwierdź prawidłowe znieczulenie poprzez utratę odruchu pedałowania (szczypanie palców). Nałóż maść weterynaryjną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu, gdy zwierzę jest pod narkozą. Wstrzyknąć zwierzęciu podskórnie środek przeciwbólowy Ketoprofen w dawce 4 mg/g masy ciała w celu leczenia bólu pooperacyjnego.
    Uwaga: Alternatywnie należy użyć izofluranu do znieczulenia. Umieść zwierzę w komorze indukcyjnej i ustaw przepływomierz tlenu na 0,8-1,5 l/min, a parownik izofluranu na 2-3%. Wyjmij znieczulone zwierzę z komory, pozwól mu oddychać izofluranem z maski i ustaw przepływomierz tlenu na 0,4-0,8 l/min, a parownik izofluranu na 1,5%, a następnie rozpocznij operację.
  3. Ogol obszar operacyjny za pomocą maszynki do strzyżenia #40; usuń włosy z obszaru 2 razy większego od obszaru operacyjnego, przygotuj ogoloną skórę trzema antyseptycznymi peelingami jodu powidonu, a następnie 70% etanolem i przykryj sterylnym serwetem.
  4. Przenieś zwierzę pod mikroskop preparacyjny znajdujący się w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Odsłaniać układ rozrodczy przez nacięcie w pozycji grzbietowo-przyśrodkowej bezpośrednio nad poduszeczką tłuszczową jajnika.
    Uwaga: Krytyczny krok: Precyzyjne nacięcie skóry ułatwia gojenie się ran, w kroku 2.4 zaleca się użycie skalpela.
  5. Za pomocą cienkich kleszczy ostrożnie przeciągnij poduszeczkę tłuszczową jajnika przez nacięcie w kierunku linii środkowej, minimalizując uszkodzenia nerwów i głównych naczyń krwionośnych.
    Krok krytyczny: Jeśli wystąpi krwawienie, przerwij operację i rozważ przeszczepienie innemu zwierzęciu gospodarzowi.
  6. Pod kontrolą mikroskopu preparacyjnego za pomocą igły ze skosem o rozmiarze 28 wykonaj nacięcie o głębokości 2-4 mm w poduszce tłuszczowej jajnika, 3-4 mm powyżej jajnika.
    Krytyczny krok: Upewnij się, że nacięcie przechodzi tylko przez połowę poduszeczki tłuszczowej; Przebicie aż do spodu powoduje nieszczelność. Bądź szybki i kontynuuj bez zwłoki po tym kroku.
  7. W przypadku przeszczepów komórek należy napełnić strzykawkę (igła o rozmiarze 30) 10-20 μl mieszaniny macierzy błony komórkowej i podstawnej i wstrzyknąć w nacięcie poduszeczki tłuszczowej. W przypadku przeszczepu jajowodu należy podnieść jajowód za pomocą cienkich kleszczyków i umieścić w 10-20 μl macierzy błony podstawnej trzymanej na lodzie. Za pomocą końcówki filtra stopniowego 0,1-10/20 μl XL (skróconej o 3 mm) pobrać zawiesinę matrycy tkanki i błony podstawnej i uwolnić ją do nacięcia poduszeczki tłuszczowej.
  8. Odczekaj 5 minut, aż macierz błony podstawnej zestali się i umieść układ rozrodczy z powrotem w otrzewnej. Zamknij mięśnie za pomocą 2 szwów szwu chirurgicznego, a skórę za pomocą dwóch małych klipsów do ran lub szwu chirurgicznego.
  9. Powtórzyć kroki 2.4-2.8, aby przesadzić mieszaninę macierzy PBS z błoną podstawną do przeciwległej poduszeczki tłuszczowej zwierzęcia, która będzie służyć jako kontrola.
    Krok krytyczny: Po operacji umieść zwierzę na poduszce grzewczej, ponieważ utrata ciepła jest szybka u znieczulonych myszy.
  10. Pozwól zwierzęciu dojść do siebie na poduszce grzewczej w rodzimej klatce i obserwuj zwierzę, aż całkowicie wybudzi się ze znieczulenia. Nie pozostawiaj zwierzęcia bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą mostka. Nie należy zwracać zwierzęcia, które przeszło operację, do towarzystwa innych zwierząt, dopóki nie wyzdrowieje.
  11. Umieść garść wstępnie zmoczonych granulek karmy w klatce oprócz suchej karmy na klatce po operacji. W razie potrzeby stosuj pooperacyjne leki przeciwbólowe przez kilka następnych dni i codziennie badaj ranę. Zastosuj antybiotyki zgodnie z zatwierdzonym protokołem dla zwierząt, jeśli dojdzie do zakażenia rany. Klipsy do ran należy usunąć 10 dni po zabiegu, gdy rana całkowicie się zamknie.

3. Histologia i akwizycja obrazu

  1. Pobieranie i konserwacja przeszczepów
    1. Przygotować 4% roztwór paraformaldehydu, mieszając 26 ml ddH2O z 4 ml 10 x PBS i 10 ml 16% roztworu paraformaldehydu.
    2. Wypreparuj w jednym bloku wszczepioną poduszeczkę tłuszczową jajnika, jajnik, jajowód macicy, macicę 0,5 cm, jak opisano w krokach 1.1.1-1.1.4. Natychmiast umieścić w 2 ml 4% paraformaldehydu i utrwalić na 2 godziny w temperaturze pokojowej. Od tego samego zwierzęcia należy przeprowadzić sekcję niewszczepionego przeciwległego systemu poduszeczek tłuszczowych jajnika, któremu przeszczepiono mieszaninę PBS i macierzy błony podstawnej jako kontrolę (patrz krok 2.9). Napraw i przetwarzaj w ten sam sposób.
    3. Po utrwaleniu przemyć tkanki trzykrotnie PBS przez 5 minut i inkubować przez noc w PBS w temperaturze 4 °C.
    4. W celu obrazowania całego wierzchowca poduszeczki tłuszczowej przejdź do kroku 3.2.1.
      Uwaga: Po uzyskaniu obrazu tkanki mogą zostać zamrożone (3.3.1) lub przetworzone w celu zatopienia w parafinie (3.3.2). Nocna inkubacja w 30% sacharozie w PBS w temperaturze 4 °C poprawia jakość zamrożonych tkanek.
  2. Akwizycja obrazu
    1. Umieść całe systemy poduszek tłuszczowych jajników w naczyniach wypełnionych PBS i zobrazuj za pomocą mikroskopu odwróconego wyposażonego w nasadkę epi-fluorescencyjną i kolorową kamerę o wysokiej rozdzielczości, z obiektywami 4, 10x oraz mikroskopu stereoskopowego wyposażonego w nasadkę fluorescencyjną, kolorową kamerę i obiektywy Plan Apo 1xWD70, ED Plan 1,5xWD45.
  3. histologia
    1. Po akwizycji obrazu w całości (3.2.1) umieścić kroplę 200-500 μl podłoża do zatapiania zamrożonych próbek tkanek na kawałku folii laboratoryjnej o wymiarach 2 x 1 cm i za pomocą kleszczy przenieść tkankę do kropli. Podnieść folię na jednej krawędzi i przenieść kroplę pożywki tkankowej do fiolki kriogenicznej o pojemności 1,8 ml. Zamknąć fiolkę i zanurzyć w ciekłym azocie. Zamrożone tkanki przechowywać w temperaturze -80 °C.
    2. Alternatywnie można przystąpić do standardowego zatapiania parafiny. Użyj 20-40 objętości objętości tkanki na każdym etapie.
      1. Zanurz chusteczki raz w 65% etanolu na 30 minut, delikatnie wstrząsając w temperaturze pokojowej.
      2. Zanurz chusteczki raz w 70% etanolu na 30 minut, delikatnie wstrząsając w temperaturze pokojowej. Na tym etapie próbki mogą być przechowywane przez wiele miesięcy w RT.
      3. Zanurz chusteczki raz w 90% etanolu na 30 minut, delikatnie wstrząsając w temperaturze pokojowej.
      4. Zanurz chusteczki raz w 95% etanolu na 30 minut, delikatnie wstrząsając w temperaturze pokojowej.
      5. Zanurz tkanki dwukrotnie w absolutnym etanolu (200 proof) na 30 minut, delikatnie wstrząsając w temperaturze pokojowej.
      6. Zanurz tkanki dwukrotnie w chloroformie na 30 minut, delikatnie wstrząsając w temperaturze pokojowej.
      7. Zanurzyć tkanki w parafinie na 30 minut, delikatnie wstrząsając w temperaturze 58 °C.
      8. Zanurzyć tkanki w parafinie na 12 godzin, delikatnie wstrząsając w temperaturze 58 °C.
      9. Zanurzyć tkanki raz w parafinie na 3 godziny w temperaturze 58 °C.
      10. Umieść tkanki w metalowych formach histologicznych i wypełnij formy parafiną o temperaturze 58 °C. Na wierzch parafiny nałożyć plastikową kasetę histologiczną i schłodzić parafinę do temperatury +4 °C. Ekstrahować blok tkanki parafinowej i przechowywać w temperaturze RT.
        Uwaga: Temperatura parafiny nie powinna przekraczać 58 °C dla optymalnego zachowania tkanki nadającej się do barwienia immunohistochemicznego.
    3. Alternatywnie przygotuj się do zatapiania parafiny za pomocą żelu do przetwarzania próbek.
      1. Odessać PBS i przenieść całe tkanki do 70% etanolu. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. W łaźni wodnej podgrzej żel do obróbki próbki do temperatury 60 °C.
      2. Pobrać pipetą 200 μl żelu do przetwarzania próbki na laboratoryjną szalkę Petriego wyłożoną folią. Za pomocą drobnych kleszczy preparacyjnych przenieś cały system tkanek do kropli żelu do przetwarzania próbki.
      3. Pozostawić zatyczkę żelową do przetwarzania próbki do zestalenia się w temperaturze pokojowej lub zestalić zatyczkę na 10 minut w temperaturze 4 °C.
      4. Umieść tkankę zatopioną w żelu do przetwarzania próbek w kasetach z tkankami histologicznymi umieszczonymi między podkładkami piankowymi do biopsji. Zanurzyć w parafinie, jak w krokach 3.3.2-3.3.2.10.
        Uwaga: Osadzanie żelu do przetwarzania próbek zapobiega stratom i umożliwia zachowanie małych delikatnych próbek tkanek.
        Uwaga: Tkanki zakonserwowane przez zamrażanie lub zatapianie w parafinie nadają się do barwienia immunohistochemicznego14,15.

Wyniki

Komórki i tkanki eksperymentalne można precyzyjnie przeszczepić do tkanki tłuszczowej jajnika pod mikroskopem chirurgicznym (Rysunek 1). Przykłady obejmują pierwotne komórki nabłonka jajowodu mysiego pochodzące od myszy wykazujących powszechną ekspresję EGFP (Rysunek 2A) lub DsRed (Rysunek 2B) oraz ludzkie unieśmiertelnione komórki nabłonka powierzchniowego jajnika HIO11816,17 znakowane lentiwirusami mCherry i EGFP (Rysunek 2C-F). Metoda ta znajduje zastosowanie również w długoterminowym przeszczepianiu narządów, takich jak mysi jajowód (Rysunek 3). Zgodnie z barwieniem immunohistochemicznym, w nabłonku jajowodu przeszczepionych tkanek zachowane są zarówno komórki rzęsiste (dodatnie pod kątem FOXJ114), jak i wydzielnicze (dodatnie pod kątem PAX815) (Rysunek 3D i E).

Seria manipulacji w tkance jajnika, w tym widok fluorescencyjny; badania nad biologią rozwoju.
Rysunek 1: Transplantacja do tkanki tłuszczowej jajnika. (A) Odsłonięty obszar transplantacji (strzałka). (B) Nacięcie wykonane igłą 28 G (strzałka). (C) Przeszczepienie mieszaniny UT/macierzy błony podstawnej za pomocą końcówki pipety (strzałka). (D) Przeszczepiony UT (strzałka, jasnoczerwony, UT myszy β-actin-DsRed ). FP, tkanka tłuszczowa; Ov, jajnik; UT, jajowód. Pasek skali = 2 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Mikroskopia fluorescencyjna tkanek; schematy A-F pokazują struktury komórkowe i lokalizację białek.
Rysunek 2: Detekcja przeszczepionych pierwotnych komórek nabłonka jajowodu mysiego oraz unieśmiertelnionych ludzkich komórek nabłonka powierzchni jajnika. (A, B) Wzrosty pierwotnych komórek nabłonka jajowodu mysiego (strzałki) z myszy β-actin-EGFP (A, zielony) i β-actin-DsRed (B, czerwony) 8 dni po przeszczepieniu do myszy syngeneicznej. (C, D) Przeszczepy mieszanych komórek HIO118 (strzałki) znakowanych Lenti-EGFP (zielony) lub Lenti-mCherry (czerwony) 10 dni po przeszczepieniu do myszy NSG. (D) Powiększony obszar z (C, strzałka). (E, F) Przeszczep rozwinięty 43 dni po transplantacji tych samych komórek co w C, D do myszy SCID (strzałki). A-D, F, fluorescencja; E, pole jasne, FP, tkanka tłuszczowa (fat pad); Ov, jajnik; UT, jajowód. (A, B, D-F) Pasek skali = 500 µm; (C) Pasek skali = 1,600 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Analiza tkanek rozrodczych z wykorzystaniem fluorescencji i histologii, z zaznaczeniem markerów PAX8 i FOXJ1.
Rysunek 3: Charakterystyka przeszczepu jajowodu. (A) Cały jajowód (strzałka) myszy β-actin-DsRed 6 dni po przeszczepieniu do tkanki tłuszczowej jajnika (strzałka, jaskrawoczerwony). (B) Fluorescencyjny skrawek mrożony tkanki tłuszczowej z przeszczepem pokazanym na (A). Czerwony: DsRed; Niebieski: przeciwbarwienie jąder 4',6-diamidino-2-fenylindolem (DAPI). (C) Przeszczep jajowodu (strzałka) 40 dni po transplantacji do myszy biorcy NSG (strzałka). Skrawek parafinowy. Zwróć uwagę na prawidłowe zachowanie wszystkich głównych komponentów jajowodu oraz brak włóknienia i stanu zapalnego związanego z transplantacją. Barwienie hematoksyliną i eozyną. (D, E) Wykrywanie markerów nabłonka jajowodu: genu Paired-box 8 (PAX8) oraz Forkhead box J1 (FOXJ1; brązowy kolor jąder, groty strzałek) w komórkach przeszczepu (strzałki) pokazanego na (C). System immunoperoksydazowy. Przeciwbarwienie zielenią metylową. FP, tkanka tłuszczowa; Ov, jajnik; UT, jajowód. (A) Pasek skali = 1,000 µm; (B) Pasek skali = 200 µm; (C-E) Pasek skali = 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Komponentpożywka DMEM F12 (Ham’s) 1x
L-glutamina2 mM
pirowinian sodu1 mM
Epidermalny czynnik wzrostu10 ng/ml-1
Podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów-210 ng/ml-1
Hydrokortyzon500 ng/ml-1
Insulina5 µg ml-1
Transferryna5 µg ml-1
Selenian sodu5 ng/ml-1
Albumina wołowa0.10%
Penicylina/Streptomycyna100 j/ml-1 / 100 µg ml-1
niezbędne aminokwasy do pożywki Minimum Essential Medium Eagle (MEM)0,1 mM
Beta-merkaptoetanol10-4 M

Tabela 1: Pożywka do wzrostu nabłonka jajowodów myszy (M-TE-GM). Składniki wymienione w lewej kolumnie są rozpuszczone w pożywce 1x DMEM F12 (Ham's) w stężeniach podanych w prawej kolumnie. Końcowy skład pożywki jest bezserwokatkowy.

Dyskusja

Opracowaliśmy test przeszczepu poduszeczki tłuszczowej jajników, który pozwala na dokładne dostarczenie i wykrycie komórek i tkanek nabłonka. Procedura przeszczepienia poduszeczki tłuszczowej jajnika jest mniej trudna technicznie niż iniekcja śródoletkowa10-12 i pozwala na bardziej jednolitą i precyzyjną lokalizację przeszczepionych komórek w porównaniu z iniekcją dootrzewnową9. Doskonale nadaje się również do długotrwałego przeszczepu całego narządu, takiego jak jajowód.

Co ważne, poduszeczka tłuszczowa jajnika zapewnia znajome mikrośrodowisko dla nabłonka żeńskiego układu rozrodczego. Powinien być szczególnie przydatny do badań właściwości molekularnych i komórkowych ludzkich i mysich komórek nabłonka jajników i jajowodów podczas regeneracji i transformacji złośliwej. W przeciwieństwie do innych narządów, niewiele badań koncentrowało się na identyfikacji i charakterystyce komórek macierzystych w nabłonku żeńskiego układu rozrodczego18,19. Takie badania mają szczególne znaczenie, ponieważ uważa się, że wiele nowotworów wywodzi się z dorosłych komórek macierzystych20. Jednak komórkowe pochodzenie nabłonkowego raka jajnika pozostaje wysoce wątpliwe18. Nabłonkowy rak jajnika stanowi większość nowotworów jajnika i znajduje się na 5. miejscu wśród wszystkich zgonów kobiet związanych z rakiem w USA21. Tak więc opracowanie testu ortotopowego, który ma kilka zalet w porównaniu z istniejącymi technikami transplantacji9-12 , powinno znacznie ułatwić badania w tej dziedzinie.

Biorąc pod uwagę powierzchowne umiejscowienie poduszeczki tłuszczowej jajnika, systemy obrazowania małych zwierząt mogą być używane do monitorowania wszczepień oznaczonych silnymi reporterami fluorescencyjnymi lub bioluminescencyjnymi. Powinno być również możliwe ustanowienie minimalnie inwazyjnych testów obrazowania na żywo o wysokiej rozdzielczości, takich jak mikroskopia nieliniowa22. Poduszka tłuszczowa jajnika może być również przechowywana w hodowlach narządowych, umożliwiając w ten sposób trójwymiarową hodowlę nabłonka prawidłowego i nowotworowego w warunkach ściśle rekapitulujących organizację komórek i macierzy zewnątrzkomórkowej. Przyszłe badania powinny zająć się tymi obiecującymi możliwościami.

Należy wziąć pod uwagę kilka krytycznych kroków. Zapewnienie poduszki grzewczej i utrzymywanie gryzoni w cieple podczas operacji znacznie poprawia wskaźnik przeżycia. Sterylność narzędzi zajmujących się poduszeczką tłuszczową zapewnia, że wszczepione systemy są utrzymywane w sterylności. Z naszego doświadczenia wynika, że znaczne krwawienie powoduje opóźnienie wzrostu przeszczepów. Co ważne, nacięcie poduszeczki tłuszczowej powinno być wykonane właśnie dlatego, że rozerwanie poduszeczki tłuszczowej lub jej przebicie powoduje krwawienie. W razie potrzeby należy zastosować koagulanty w celu zatamowania krwawienia. Jeśli wszczepienia nie rozwiną się, należy rozważyć większe stężenie wstrzykniętych komórek. Pierwsze udane wyrostki można zaobserwować już po tygodniu od przeszczepu, a większość przeszczepów powinna być widoczna już miesiąc po zabiegu. Do przeszczepu można użyć igieł o większej średnicy (23-25 G), aby zapobiec ścinaniu dużych komórek (o średnicy powyżej 10 μm). Jednak takie igły mogą być bardziej traumatyczne dla poduszeczki tłuszczowej i ich użycie powinno być wcześniej przetestowane. Do naszych eksperymentów wykorzystaliśmy myszy od 6 do 8 tygodniowych dawców i biorców. Do obu celów można wykorzystać młodsze lub starsze myszy. Jednak liczba wstrzykiwanych komórek może wymagać dostosowania. Należy również wziąć pod uwagę mniejszy rozmiar poduszeczek tłuszczowych jajników u młodszych dawczyń.

Podobnie jak w przypadku każdej metody, istnieją pewne ograniczenia testu przeszczepu poduszeczki tłuszczowej jajników myszy. Chociaż syngeniczne myszy immunokompetentne mogą być używane do mysich pierwotnych komórek/tkanek, nasza technika wymaga myszy NSG lub SCID do przeszczepu materiału ludzkiego. Prawdopodobnie możliwe jest uczłowieczenie poduszeczki tłuszczowej w celu wsparcia wzrostu ludzkich komórek nabłonkowych. Jednak nie testowaliśmy jeszcze tego podejścia. Wykorzystanie młodszych samic może prowadzić do obniżenia kosztów hodowli; Jednak dojrzałe dziewicze samice myszy (w wieku od 8 do 10 tygodni) mają większą poduszeczkę tłuszczową, co pozwala na przeszczepianie większych okazów. Wreszcie, personel laboratoryjny powinien zostać przeszkolony w zakresie chirurgii zwierząt, aby zapewnić terminowe i pomyślne wykonanie zabiegu.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Dr. Andrew K. Godwinowi, University of Kansas Medical Center, za dostarczenie ludzkich komórek HIO118. Badania te były wspierane przez granty z New York Stem Cell Program (NYSTEM; T028095) i National Institutes of Health/National Institute of Child Health and Human Development (P50HD076210) na rzecz AFN, a także poprzez dotacje z NYSTEM (C028125, C024174 i T028095), National Institutes of Health/National Cancer Institute (CA182413) i Funduszu Badań nad Rakiem Jajnika (327516) na rzecz AYN.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Igła o rozmiarze 25BD Becton Dickinson305122
Igła o rozmiarze 28 (strzykawka podskórna z dołączoną igłą)Kendall30339Numer części: 8881500014
podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów-2Sigma-AldrichF9786
(Geltrex)InvitrogenA1413202
β-aktyna-DsMyszy czerwoneLaboratorium Jacksona6051B6. Cg-Tg(CAG-DsRed*MST)1Nagy/J
β-aktyna-EGFP myszyThe Jackson Laboratory3291C57BL/6-Tg(CAG-eGFP)1Osb/J
β-merkaptoetanolSigma-AldrichM7522
albumina bydlęcaSigma-AldrichA3311
chloroformVWREM-CX1058-1
kolagenaza/hialuronidazaKomórka macierzysta Technologie7912
fiolki kriogeniczneThermo Scientific Nunc377267
dispase IIWorthingtonNPRO2
DMEM F12 (HAM's)Corning10-092-CV
DNaseI (Deoksyrybonukleaza I)Technologie komórek macierzystych7900
podłoże do zatapiania próbek tkanek mrożonych (OCT)Sakura Finetek 4583
naskórkowy czynnik wzrostuSigma-AldrichE4127
etanol 200 proofKoptecV1001do przygotowania 70% 
płodowa surowica bydlęcaSigmaF4135
końcówka filtra 0,1-10/20 i mikro; l XL USA Scientific1120-3810
Przeciwciało FOXJ1eBioscienceE10109-1632stosowane w stężeniu 1:1,000 (bez demaskowania)
hydrokortyzonSigmaH0135
KetoprofenZoetis4396H
film laboratoryjny (Parafilm M)American National CanPM-999
L-GlutaminaCorning25-005-Cl
selenin insuliny-transferyny soduSigma-AldrichI884
izofluran, 250 mlSanta Cruz Animal Healthsc-363629Rx
niska płytka mocująca 24-dołkoweendogenne Costar3473
MEM Formy histologiczneCorning25-025-Cl
Nauki o mikroskopii elektronowejMikroskop 62527-22
, odwróconyNikonEclipse TS 100
, stereomyszy NikonSMZ800
Nod/SCID/gamma (NSG)The Jackson Laboratory05557NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ
paraformaldehyd 16% roztwórMikroskopia elektronowa Sciences15710
parafina (Paraplast, X-TRA)Fisher Thermo Scientific23-021-401
Przeciwciało PAX8Proteintech10336-1-APstosowane w stężeniu 1:1,000 (bez demaskowania)
PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami)Corning  21-030-CV
penicylina streptomycynaCorning30-002-Cl
myszy z ciężkim złożonym niedoborem odporności (SCID/NCr), tło BALB/C)NCI-Frederick Animal Production Program01S11
pirogronian soduCorning25-000-Cl
żel do przetwarzania próbek (HISTOGEL)Richard-Allan ScientificHG-4000-012
sacharozaSigma-AldrichS0389
Trypsyna-EDTA, 25%Corning25-053-Cl
Macierz błony podstawnej aminokwasy metali mikroskop

Bibliografia

  1. Deome, K. B., Faulkin, L. J., Bern, H. A., Blair, P. B. Development of mammary tumors from hyperplastic alveolar nodules transplanted into gland-free mammary fat pads of female C3H mice. Cancer Res. 19, 515-520 (1959).
  2. Proia, D. A., Kuperwasser, C. Reconstruction of human mammary tissues in a mouse model. Nature protocols. 1, 206-214 (2006).
  3. Shackleton, M., et al. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell. Nature. 439, 84-88 (2006).
  4. Stingl, J., Caldas, C. Molecular heterogeneity of breast carcinomas and the cancer stem cell hypothesis. Nat Rev Cancer. 7, 791-799 (2007).
  5. Koren, S., et al. PIK3CA(H1047R) induces multipotency and multi-lineage mammary tumours. Nature. 525, 114-118 (2015).
  6. Nikitin, A. Y., Nafus, M. G., Zhou, Z., Liao, C. -P., Roy-Burman, P. Prostate stem cells and cancer in animals. Stem Cells and Cancer. Bagley, R. G., Teicher, B. A. , Humana Press. New York, NY. 199-216 (2009).
  7. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160, 324-338 (2015).
  8. Lu, C. P., et al. Identification of stem cell populations in sweat glands and ducts reveals roles in homeostasis and wound repair. Cell. 150, 136-150 (2012).
  9. Flesken-Nikitin, A., et al. Ovarian surface epithelium at the junction area contains a cancer-prone stem cell niche. Nature. 495, 241-245 (2013).
  10. Orsulic, S., et al. Induction of ovarian cancer by defined multiple genetic changes in a mouse model system. Cancer Cell. 1, 53-62 (2002).
  11. Dawes, J., Liu, B., Mars, W., Michalopoulos, G., Khillan, J. S. Multiple ovarian transplants to rescue a transgenic line of mice. Lab Anim (NY). 39, 191-193 (2010).
  12. Cordero, A. B., Kwon, Y., Hua, X., Godwin, A. K. In vivo imaging and therapeutic treatments in an orthotopic mouse model of ovarian cancer. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2010).
  13. Albihn, A., et al. Production of capsular material by equine trophoblast transplanted into immunodeficient mice. Reproduction. 125, 855-863 (2003).
  14. Muthusamy, N., Vijayakumar, A., Cheng, G., Ghashghaei, H. T. A knock-in Foxj1(CreERT2::GFP) mouse for recombination in epithelial cells with motile cilia. Genesis. 52, 350-358 (2014).
  15. Perets, R., et al. Transformation of the fallopian tube secretory epithelium leads to high-grade serous ovarian cancer in Brca;Tp53;Pten models. Cancer Cell. 24, 751-765 (2013).
  16. Capo-Chichi, C. D., et al. Dynamic alterations of the extracellular environment of ovarian surface epithelial cells in premalignant transformation, tumorigenicity, and metastasis. Cancer. 95, 1802-1815 (2002).
  17. Roland, I. H., et al. Loss of surface and cyst epithelial basement membranes and preneoplastic morphologic changes in prophylactic oophorectomies. Cancer. 98, 2607-2623 (2003).
  18. Flesken-Nikitin, A., Odai-Afotey, A. A., Nikitin, A. Y. Role of the stem cell niche in the pathogenesis of epithelial ovarian cancers. Mol Cell Oncol. 1, 963435(2014).
  19. Ng, A., Barker, N. Ovary and fimbrial stem cells: biology, niche and cancer origins. Nat Rev Mol Cell Biol. 16, 625-638 (2015).
  20. Visvader, J. E. Cells of origin in cancer. Nature. 469, 314-322 (2011).
  21. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2015. CA Cancer J Clin. 65, 5-29 (2015).
  22. Williams, R. M., et al. Strategies for high-resolution imaging of epithelial ovarian cancer by laparoscopic nonlinear microscopy. Transl Oncol. 3, 181-194 (2010).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Przeszczep ortotopowyprzeszczep jajowodutransplantacja kom rekobrazowanie fluorescencyjnemacierz b ony podstawnejci cie chirurgicznewszczepienie tkankid ugoterminowe zachowaniee ski uk ad rozrodczy
Przeszczep do poduszeczki tłuszczowej jajnika myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.