Artykuł metodologiczny

Szybkie subtraktywne modelowanie warstw żywych komórek za pomocą sondy mikroprzepływowej

8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54447

⸱

15 września 2016

 ,  ,  , 
1IBM Research - Zurich

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiamy protokół do wykonywania subtraktywnego wzorcowania monowarstw żywych komórek na powierzchni. Osiąga się to poprzez miejscową i selektywną lizę przylegających komórek za pomocą sondy mikroprzepływowej (MFP). Lizat komórkowy pobrany z lokalnych regionów może być wykorzystany do dalszej analizy, umożliwiając badania profilowania molekularnego.

Streszczenie

Sonda mikroprzepływowa (MFP) ułatwia przeprowadzanie lokalnych procesów chemicznych na podłożach biologicznych poprzez ograniczanie nanolitrowych objętości cieczy. Korzystając z jednej konkretnej implementacji urządzenia wielofunkcyjnego, hierarchicznego hydrodynamicznego ograniczenia przepływu (hHFC), wiele cieczy jest jednocześnie stykających się z podłożem. Lokalne działanie chemiczne i kształtowanie cieczy za pomocą hHFC jest wykorzystywane do tworzenia wzorów komórkowych poprzez lokalną lizę i usuwanie komórek. Wykorzystując możliwości skanowania urządzenia wielofunkcyjnego, tworzone są zdefiniowane przez użytkownika wzorce monowarstw komórek. Protokół ten umożliwia szybkie, kontrolowane przestrzennie wzorce komórkowe w czasie rzeczywistym, co może umożliwić selektywne badania interakcji komórka-komórka i komórka-macierz.

Wprowadzenie

W swoim naturalnym środowisku, komórki w tkankach biologicznych odbierają szereg biochemicznych i fizycznych sygnałów kierujących ich wzrostem, organizacją i rozwojem. Zrozumienie tych wskazówek wymaga selektywnego badania interakcji komórka-komórka i komórka-macierz. Wymaga to opracowania metod modelowania monowarstw komórek. Metody geometrycznego oddzielania różnych typów komórek w hodowli (tworzenie wzorów) umożliwiają szerokie badania fizycznych i chemicznych wskazówek w biologii komórki. Większość obecnych podejść do modelowania warstw komórkowych 1-4 opiera się na osadzaniu białek adhezyjnych komórek na powierzchniach lub użyciu mikrofabrykowanych szablonów do selektywnego wzrostu na substratach. Natomiast tutaj przedstawiamy metodę szybkiego modelowania monowarstw komórkowych in situ, tj. komórek w hodowli, poprzez usuwanie komórek w wybranych regionach monowarstwy. Metody, które wykonują takie subtraktywne wzorce 5-9, zwykle wymagają specjalistycznych substratów, obróbki powierzchni, skomplikowanej operacji, kontaktu fizycznego lub ablacji za pomocą lasera, nieumyślnie wpływając na żywe komórki. Używamy tutaj sondy mikroprzepływowej (MFP)10,11, bezkontaktowej skaningowej technologii mikroprzepływowej, która hydrodynamicznie wiąże ciecz na podłożu. Jednym z ważnych elementów urządzenia wielofunkcyjnego jest mikroprefabrykowana głowica zawierająca mikrokanaliki (ilustracja 1). Powiązana platforma składa się z pomp strzykawkowych do kontroli cieczy, stopni do kontroli skanowania oraz mikroskopu odwróconego do wizualizacji i informacji zwrotnej (ilustracja 2). W podstawowej konfiguracji głowica MFP składa się z dwóch mikrokanalików z otworami na wierzchołku, z których jeden służy do wstrzykiwania cieczy procesowej, a drugi do zasysania wstrzykiwanej cieczy procesowej wraz z odrobiną cieczy zanurzeniowej (rysunek 3A). Podczas pracy urządzenia wielofunkcyjnego wierzchołek znajduje się w stałej odległości od podłoża. Gdy natężenie przepływu zasysającego (Qa) jest wystarczająco wyższe niż natężenie przepływu wtrysku (Qi), tj. Qa:Qi≥ 2,5, ciecz procesowa jest zamknięta na podłożu. Powoduje to hydrodynamiczne ograniczenie przepływu (HFC). Obszar, w którym ciecz procesowa ma bezpośredni kontakt z podłożem, nazywany jest śladem węglowym. W typowych warunkach pracy przepływ cieczy procesowej w HFC charakteryzuje się niską liczbą Reynoldsa (Re ≈ 10-2) i wysoką liczbą Pecleta (Pe ≈ 102). Oznacza to, że ciecz przepływa w reżimie laminarnym, przy czym konwekcja jest podstawowym sposobem przenoszenia masy związków chemicznych. Modele numeryczne i analityczne dla ograniczenia przepływu są opisane w innym miejscu12-14.

W tym artykule używamy podejścia polegającego na jednoczesnym ograniczaniu wielu płynów procesowych, co nazywa się hierarchicznym HFC (hHFC)14. Aby wdrożyć hHFC z urządzeniem wielofunkcyjnym, potrzebne są dwa dodatkowe otwory, które zapewniają wtórne źródło wstrzykiwania i aspiracji. Dzięki temu możemy zamknąć jedną ciecz w drugiej cieczy. Ciecz wewnętrzna (procesowa) korzysta z tego, że jest chroniona przed zabłąkanymi zanieczyszczeniami na podłożu przez ciecz zewnętrzną (ekranującą). Ponadto hHFC umożliwia pracę w dwóch trybach: (i) trybie zagnieżdżonym, w którym ciecz procesowa w wewnętrznym HFC styka się z powierzchnią (rysunek 3B), oraz (ii) trybie ściskania, w którym ciecz wewnętrzna traci kontakt i tylko ciecz zewnętrzna styka się z podłożem (rysunek 3C). Przełączanie między tymi dwoma trybami pozwala użytkownikom na zmianę lub zatrzymanie obróbki podłoża i odbywa się poprzez kontrolowanie szczeliny od głowy do powierzchni lub poprzez zmianę stosunku między przepływami iniekcji (Qi2/Qi1). Dla danej geometrii kanału ślad cieczy roboczej na podłożu może być kontrolowany przez modulację warunków przepływu (rysunek 3D). Wodorotlenek sodu (NaOH) jest używany jako wewnętrzna ciecz procesowa do lizy komórek, a lizat jest stale zasysany z powierzchni. Ponieważ efekty chemiczne cieczy procesowej są zlokalizowane w wewnętrznym śladzie HFC, sąsiednie komórki pozostają niezakłócone, co umożliwia czasoprzestrzenne badania interakcji między komórkami. Funkcja skanowania urządzenia wielofunkcyjnego umożliwia tworzenie zdefiniowanych przez użytkownika geometrii wzorów komórek (ilustracja 4). Co więcej, wybór NaOH jako cieczy procesowej umożliwia dalszą analizę DNA (ryc. 7).

Protokół

1. Czyszczenie i przygotowanie głowicy i platformy MFP

UWAGA: Ten protokół wykorzystuje pionowo zorientowane hybrydowe głowice wielofunkcyjne z krzemu i szkła15,16. Krzemowy komponent głowicy zawiera mikrokanaliki, które są wytrawione na głębokość 100 μm. Wytrawiony krzem jest łączony ze szkłem za pomocą wiązania anodowego. Konstrukcja kanału składa się z sześciu kanałów, po dwa do wstrzykiwania i zasysania oraz dwa do wstrzykiwania cieczy zanurzeniowej (rysunek 1). Kanały używane do wstrzykiwania cieczy zanurzeniowej uzupełniają pożywkę otaczającą próbkę biologiczną, unikając w ten sposób strat spowodowanych aspiracją i parowaniem. Kanały wewnętrzne i zewnętrzne wykorzystywane w bieżących pracach to odpowiednio 100 × 100 μm oraz 200 × 100 μm. Po produkcji i obróbce uzyskuje się głowice MFP z przezroczystymi kanałami i polerowanymi wierzchołkami.

  1. Przygotowanie przepompowni i aparatury do transportu płynów
    1. Do wszystkich rurek podłączonych do strzykawek należy używać kapilar o średnicy zewnętrznej 1/16'' (1.59 mm) i średnicy wewnętrznej 0.02'' (0.51 mm). Zmieniaj rozmiar kapilary w zależności od zastosowania i zaopatrz się w odpowiednie złącza i złączki, aby połączyć głowicę MFP ze strzykawkami. Używaj ultraczystej wody wszędzie tam, gdzie konieczne są rozcieńczenia.
    2. Czyste strzykawki (objętość 250 - 500 μl) i tłoki strzykawek przez sonikację w 0,5% roztworze wybielacza w ultraczystej wodzie przed i po eksperymentach z żywymi komórkami. Dokładnie spłucz je wodą. Napełnij je wodą, zanurzając całkowicie ich końcówki w łaźni wodnej i zasysając za pomocą tłoka. Usunąć płyn w łaźni wodnej w taki sposób, aby trzon strzykawki stykał się z uszczelką na wylocie strzykawki. Powtórzyć zasysanie i przedmuchiwanie, aż w kolumnach strzykawki nie będą widoczne pęcherzyki powietrza.
    3. Podłączyć napełnione strzykawki do pomp strzykawkowych za pomocą złączy Luer-lock. Użyj zaworu przełączającego zamontowanego na pompach, aby skierować ciecz ze strzykawki do jednej z dwóch kapilar prowadzących do głowicy MFP lub do zbiorników cieczy (Rysunek 6). (Jeżeli zawór przełączający nie jest dostępny, patrz sekcja 1.4.4). Przepłukać obie kapilary wodą ze strzykawek z prędkością około 10 - 50 μl/min, w zależności od wielkości strzykawki, aż w strzykawkach pozostanie około 10 μl wody.
    4. Wstępnie włóż oczyszczone kapilary do odpowiedniego złącza/adaptera mikroprzepływowego, który łączy się z przelotkami kanałów w głowicy (np. złącze M1 - patrz materiały).
  2. Przygotowanie głowicy MFP
    1. Wyczyść głowicę urządzenia wielofunkcyjnego za pomocą sonikacji przy użyciu detergentu do szkła do standardowego czyszczenia lub 0,5% wybielacza do rygorystycznego czyszczenia, przez 5 minut. Wyczyść kanały wodą, zanurzając wierzchołek w wodzie i stosując podciśnienie do przelotek.
    2. Sprawdź kanały pod mikroskopem stereoskopowym pod kątem potencjalnych przeszkód (zatkania) i powtórz poprzedni krok, jeśli to konieczne.
    3. Zamontuj czystą głowicę na uchwycie głowicy i przykręć złącze z wstępnie włożoną i oczyszczoną rurką do głowicy. Przykręć uchwyt głowicy do stolika Z, który służy do kontroli odległości szczeliny między głowicą a monowarstwą ogniwa.
  3. Kalibracja etapów skanowania platformy MFP
    1. Przed podłączeniem głowicy do platformy należy przeprowadzić kalibrację punktów końcowych stopni X, Y i Z, zgodnie z protokołem producenta z odpowiednim interfejsem oprogramowania. Skalibrowane stoliki zapewniają dokładność w pozycjonowaniu głowicy MFP.
    2. Uzyskać surową odległość zerowej przerwy (zerowanie), przesuwając głowicę urządzenia wielofunkcyjnego nad szkiełkiem komory bez komórek i powoli opuszczać w krokach co 5 μm. Po kontakcie sondy z podłożem należy obserwować pierścienie Newtona. Jest to przybliżone oszacowanie. Dokładne położenie należy uzyskać po dostosowaniu współpłaszczyznowości wierzchołka sondy do podłoża.
    3. Aby zapewnić współpłaszczyznowość wierzchołka sondy, wyreguluj nachylenie głowicy za pomocą goniometru (na styku głowicy i stolika Z). Po uformowaniu upewnij się, że pierścienie Newtona są symetryczne (rysunek 1). Odsuń głowicę MFP o 20 μm od podłoża i wyreguluj nachylenie za pomocą goniometru. Powtarzaj opadanie, zerowanie i regulację nachylenia, aż pierścienie Newtona staną się symetryczne w kontakcie. Przy regulowanym nachyleniu ustaw pozycję z, która tworzy symetryczne pierścienie Newtona, na zero.
      UWAGA: Stolik Z kontroluje odległość od głowicy do podłoża, podczas gdy stolik XY steruje skanowaniem podłoża (ilustracja 2). Szczegółowe wyjaśnienie można znaleźć w naszej wcześniejszej pracy14.
  4. Preparaty chemiczne do miejscowego usuwania warstw komórkowych
    ostrożność: W stosownych przypadkach należy używać sprzętu ochronnego (np. rękawic nitrylowych, okularów ochronnych) do przygotowywanych chemikaliów. W razie potrzeby użyj dygestorium do przygotowania roztworów. Przygotuj wszystkie chemikalia i z ultraczystą wodą jako rozcieńczalnikiem.
    1. Przygotować 50 mM roztwór NaOH jako ciecz procesową dla wewnętrznego kanału iniekcyjnego (i2 z przepływem QI2 na rysunku 1).
    2. Przygotować roztwór buforowy do ekstrakcji wymagany do wstrzyknięcia zewnętrznego (i1 z przepływem QI1 na rysunku 1), składający się z 1 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA), 0,5% Tween 20 i 10 μM rodaminy B w 50 mM tris(hydroksymetylo)aminometanu o pH 8. Do oczyszczania należy używać wody w strzykawkach do aspiracji.
    3. Przefiltruj wszystkie roztwory za pomocą filtra strzykawkowego 0,2 μm. Odgazowuje wszystkie przefiltrowane roztwory za pomocą eksykatora, aż rozpuszczone powietrze przestanie bulgotać na powierzchnię.
    4. Za pomocą przewodu odpływowego podłączonego do pomp strzykawkowych usunąć resztki wody i zassać odgazowane roztwory do strzykawek iniekcyjnych z prędkością 40 μl/min, aż strzykawki będą pełne (250 lub 500 μl). Zapewnia to napełnianie strzykawek, łączników i kapilar bez pęcherzyków powietrza. System strzykawka-przełącznik-zawór-dwukapilarny umożliwia napełnianie strzykawek w trakcie eksperymentu. W przypadku braku takiego zaworu przełączającego należy odłączyć kapilary od głowicy i napełnić kapilary oraz strzykawkę, zasysając odgazowane roztwory przed ponownym podłączeniem ich do głowicy.
    5. Zasysanie cieczy procesowych i osłonowych przez kapilary pozwala na wykorzystanie małych objętości podczas pracy. Jeśli chemikalia można przygotować w dużych ilościach, należy bezpośrednio napełnić strzykawki wymaganymi roztworami. Na przykład strzykawki aspiracyjne, które zawierają wodę, mogą być napełniane przy użyciu tego podejścia.
    6. Przedmuchnąć kapilary głowicy MFP cieczami przydzielonymi dla każdego kanału, jak określono w 1.4.1 i 1.4.2.
      UWAGA: Roztwór buforu ekstrakcyjnego osłania NaOH w wewnętrznym zamknięciu, a składnik rodaminy w buforze ułatwia wizualizację hHFC podczas pracy.
    7. Jeśli komórki nadmiernie się zlewają, a agregaty komórkowe pojawiają się na powierzchni hodowli, uzupełnij bufor ekstrakcyjny 10% proteinazą K. To uzupełnia działanie NaOH na te agregaty poprzez rozpuszczanie zdenaturowanych białek, gdy lizat dostaje się do kanałów aspiracyjnych. Zapobiega to zatykaniu się kanałów podczas pracy.
  5. Przygotowanie monowarstw komórek na szkiełkach komorowych
    ostrożność: Do hodowli komórek należy używać kaptura do hodowli komórek i obchodzić się ze sprzętem zgodnie z przepisami ustalonymi przez inspektora ds. bezpieczeństwa biologicznego laboratorium. Zwróć uwagę na specjalne wymagania określonych linii komórkowych i odpowiednio dostosuj protokół i sprzęt.
    1. Stosować inkubatory do hodowli komórkowych (przy 5% CO2 i w temperaturze 37 ºC) do hodowli i namnażania komórek, które mają być wzorcowane. Przeprowadzić ekspansję przy użyciu standardowych protokołów hodowli komórkowych17,18 w kolbach T. Stosować pożywki hodowlane zgodnie z wymaganiami określonej linii komórkowej (np. DMEM uzupełniony surowicą i antybiotykiem do hodowli MCF7 i MDAMB 231).
    2. Po osiągnięciu zbiegu komórek w kolbach hodowlanych, trypsynizuj i zbieraj komórki oraz nasiona 2×105 komórek/cm2 w każdym z 2-komorowych szkiełek do modelowania i hodowli przez 48 godzin. Użyj komórek w jednej z komór jako kontroli wzrostu i żywotności komórek.
    3. Po osiągnięciu zbiegu komórek na szkiełkach komory, inkubować komórki przez 45 minut z 500 μl roztworu barwnika do śledzenia komórek (np. zielonego - CMFDA lub pomarańczowego - CMRA) o stężeniu 10 μM przygotowanego w podłożu bez surowicy. Odbywa się to w celu wizualizacji komórek podczas tworzenia wzorców. Umyj znakowane komórki PBS, delikatnie przepłukując każdą komorę za pomocą pipety, a następnie hoduj komórki w pożywce uzupełnionej surowicą do eksperymentów z wzorami.
    4. Uzyskać obraz referencyjny powierzchni komórki wybarwionej przez śledzenie komórek w celu zliczania komórek. Ma to na celu zapewnienie zbiegu warstwy komórkowej. Ponadto służy jako pomoc w eksperymentach ilościowych, jeśli celem jest odzyskiwanie próbek i analiza DNA.
      UWAGA: W przypadku, gdy żywotność komórek ma być oceniana podczas modelowania, komórki można wybarwić zestawem do cytotoksyczności żywych/martwych zgodnie z instrukcjami producenta.

2. Tworzenie Hierarchicznego Ograniczenia Przepływu Hydrodynamicznego (hHFC)

  1. Przesuń urządzenie wielofunkcyjne nad monowarstwą ogniwa w odległości 50 μm od szkiełka podstawowego. Ta odległość szczeliny, przy jednoczesnym zapewnieniu kontaktu hHFC, uwzględnia również zmienność powierzchni i grubości jednej warstwy.
  2. Wstrzykiwać NaOH w tempie 6 lub 8 μl/min przez i2. Oceń inne natężenia przepływu (tj. QI1, QA1 i QA2) przy użyciu reguł przepływu na rysunku 3.
  3. Moduluj rozmiar wewnętrznego HFC, zmieniając stosunek QI2/QI1 za pomocą strzykawek iniekcyjnych. Na przykład użyj QI1 w zakresie od 1,3 μl/min do 4 μl/min, przy czym QI2 jest ustalony na 8 μl/min, co daje ślad NaOH wynoszący 150 - 300 komórek (100 - 200 μm2 / komórkę) (rysunek 3D).
  4. Wstrzyknąć kompletne medium z najbardziej zewnętrznych otworów głowicy MFP z natężeniem przepływu 20 μl/min, aby uwzględnić parowanie pożywki i aspirację podczas pracy hHFC.

3. Modelowanie monowarstw komórek za pomocą hHFC

Uwaga: Wzór skanowania określa obszary monowarstwy komórki, z których komórki są wydobywane (wzór subtraktywny), pozostawiając pozostałe komórki do zbadania konkretnych zagadnień biologicznych. Ten wzór może być na przykład liniami prostymi lub tablicą punktów. Skomplikowane wzorce wymagają zaprojektowania odpowiedniej trajektorii skanowania. Na przykład trajektoria skanowania w kratkę zapewnia siatkę obszarów komórek (pokazaną na przykład na rysunku 4A), która umożliwiłaby badanie wpływu różnych bodźców na komórki w różnych kwadratach podczas przebywania w bliskiej odległości. Wzorce te można tworzyć za pomocą sterowania etapami X-Y platformy, w których oprogramowanie sterujące umożliwia skryptowanie trajektorii skanowania dla głowicy MFP nad monowarstwą komórki.

  1. Ustaw oprogramowanie stolika tak, aby skanowało głowicę sondy nad monowarstwą ogniwa w określonych przez użytkownika wzorcach (poprzez ustawienie współrzędnych X, Y i Z) z prędkością skanowania 10 μm/s przy odległości przerwy 50 μm.
  2. Gdy zagnieżdżony hHFC działa i styka się z monowarstwą, zeskanuj urządzenie wielofunkcyjne trajektorią pożądanego wzorca, aby usunąć wzorzyste komórki.
  3. W przypadku kohodowli po usunięciu pierwszego typu komórek, należy wysiać inną linię komórkową w celu wypełnienia luk, stosując metody opisane w sekcji 1.5. Przechodzenie między trybami zagnieżdżonym i ściśniętym (na przykład poprzez zwiększenie odległości między nimi), aby kontrolować usuwanie komórek.
    UWAGA: Może być konieczne zbadanie prędkości skanowania dla innych linii komórkowych. Prędkość skanowania użyta w tej demonstracji powoduje całkowite usunięcie komórek w zeskanowanych regionach dla używanych linii komórkowych.

4. Dalsze przetwarzanie w celu pobierania próbek i amplifikacji DNA

  1. Przygotować stację pobierania próbek do dalszej analizy lizatu. Do stacji pobierania próbek użyj wydrukowanego w 3D 8-paskowego uchwytu probówki do PCR. Alternatywnie można wybrać odpowiedni uchwyt na probówkę, który będzie służył jako adapter, który można zamontować w zasięgu skanowania głowicy poza podłożem. Przetrzyj uchwyt probówki 70% etanolem lub innymi środkami odkażającymi powierzchnię w zależności od wymaganej dla danego zastosowania. Użyj magnetycznego klipsa na uchwycie probówki, aby przymocować go do uchwytu podłoża.
  2. Po przygotowaniu stacji pobierania próbek należy ustawić głowicę MFP w odległości 100 μm od monowarstwy. Rozpocząć pracę hHFC z 50 mM roztworem NaOH jako cieczą procesową dla wewnętrznego kanału wtryskowego o natężeniach przepływu 1, 6, -7 i -17,5 μl/min odpowiednio dla QI1, QI2, QA1 i QA2.
    1. Po ustabilizowaniu się ograniczenia przepływu (w ciągu około 10 sekund) opuść głowicę sondy na odległość szczeliny 50 μm, aby przeprowadzić lokalną lizę wybranej subpopulacji komórek za pomocą hHFC opartej na NaOH. Po zakończeniu lizy subpopulacji (około 30 sekund na ślad), skieruj głowę w stronę probówek w stacji pobierania próbek. Wyrzuć zebrany lizat bezpośrednio do probówek PCR (ryc. 6).
  3. W celu dalszego przetwarzania lizatu należy najpierw zneutralizować pH roztworu, mieszając lizat z buforem Tris (1:1). Po neutralizacji podgrzewać lizat do 95 ºC przez 30 min. Następnie bezpośrednio załaduj lizat do standardowego przepływu pracy qPCR, zgodnie z ustawieniami dostawcy urządzenia.

Wyniki

Opisany protokół szybkiego subtraktywnego wzorowania monowarstw komórkowych został zademonstrowany z wykorzystaniem wieloskładnikowej platformy MFP (Rycina 1 i 2). Protokół wykorzystuje hierarchiczne ograniczanie przepływu hydrodynamicznego (hHFC; Rycina 3) do lokalnego traktowania i usuwania komórek z monowarstw komórkowych, stosując NaOH jako ciecz procesową. Konfiguracja hHFC składa się z wewnętrznego HFC i zewnętrznego HFC. Ograniczony przepływ NaOH w wewnętrznym hHFC wywołuje działanie chemiczne oraz siły ścinania na kontaktujących się komórkach. W obrębie tego obszaru komórki są jednorodnie narażone na działanie chemiczne NaOH dzięki konwekcyjnemu transportowi masy wewnątrz obszaru i pomijalnej dyfuzji do regionu poza ograniczeniem. Z kolei siły ścinania oddziałujące na komórki można zmieniać poprzez modyfikację szybkości przepływu NaOH. Aby uprościć parametry operacyjne, zdecydowano, że mechanizm usuwania komórek będzie zdominowany przez działanie chemiczne w porównaniu z siłami ścinania. W celu oszacowania siły ścinania przyłożonej przez hHFC do powierzchni, zbudowano model elementów skończonych przy użyciu Comsol Multiphysics 5.0. Symulacje przeprowadzono z wykorzystaniem modułu CFD dla przepływów laminarnych. Dla zakresu szybkości przepływu i wymiarów otworów zastosowanych w obecnej demonstracji wprowadzono dwa warunki brzegowe wlotowe dla otworów wtryskowych geometrii oraz dwa warunki brzegowe wylotowe dla otworów ssących (Rycina 5). W uzyskanym modelu reguły przepływu dyktowały profil ścinania, natomiast szybkości przepływu definiowały wielkość ścinania na powierzchni. W praktyce kombinacja obu tych czynników determinuje, czy hHFC styka się z powierzchnią. Mając na uwadze te czynniki, wyznaczono zakres szybkości przepływu dla pracy urządzenia w celu uzyskania chemicznie zdominowanego usuwania komórek. Aby stworzyć hHFC, zastosowano regułę przepływu polegającą na utrzymaniu stosunku całkowitego przepływu ssania do przepływu wtryskowego na poziomie 3,5. Pozostałe reguły przepływu zdefiniowano tak, aby zminimalizować zapychanie kanałów ssących, które może być spowodowane przywieraniem zdenaturowanych białek do powierzchni kanałów. Korzystając z opracowanego modelu, ustalono, że szybkości przepływu od 5 do 10 µl/min przekładają się na naprężenie ścinające między 1 a 3 N/m2. Bez efektu chemicznego NaOH, na przykład w przypadku buforu do ekstrakcji, naprężenie ścinające nie byłoby wystarczająco wysokie, aby usunąć komórki19. W obserwowanym zakresie zauważono, że praca przy wyższych szybkościach przepływu jest bardziej praktyczna ze względu na perturbacje w ścieżce przepływu przy niskich szybkościach przepływu ssania (tj. QI2 < 4 µl/min) spowodowane obecnością szczątków komórkowych w kanałach.

Biorąc pod uwagę zbadany profil ścinania oraz kwestie praktyczne, w eksperymentach nad wzorcowaniem zastosowano przepływy NaOH (QI2) wynoszące 6 i 8 µl/min oraz wartości QI1, QA1 i QA2 zgodnie z zasadami przepływu przedstawionymi na Rysunku 3. Stosunek przepływów wtryskiwania (QI2/QI1) pozwala na dalszą modulację rozmiaru obszaru hHFC (Rysunek 3D i Rysunek 4B), zgodnie z zasadą opisaną przez Auteberta et al.14. Wykorzystując zdolność hHFC do kształtowania cieczy w połączeniu z możliwością skanowania o wysokiej rozdzielczości platformy MFP, demonstrujemy generowanie siatek żywych komórek w wielu skalach, a ponadto pokazujemy zastosowanie opisanego protokołu w tworzeniu kokultur (Rysunek 4C).

Platforma ta pozwala również na odzysk lizatu z próbek do dalszych analiz. Aby wykazać jakość uzyskanego lizatu, pobrano próbki lokalnie lizowanych komórek z jednego oraz pięciu odcisków w dwóch niezależnych eksperymentach, co wykazało zmienność ilości DNA uzyskanego z lizatu (Rysunek 7). W tym celu przeprowadzono amplifikację DNA zawartego w lizacie przy użyciu starterów do β-aktyny (forward: GGATGCAGAAGGAGATCACT oraz reverse: CGATCCACACGGAGTACTTG), wykorzystując 4 µl zneutralizowanego lizatu w każdej reakcji PCR.

Schemat modułów operacyjnych MFP; konfiguracja mikroprzepływów, skanowania i stacji pompowania; analiza komórkowa.
Rycina 1. Moduły platformy MFP oraz głowicy. (AModuły operacyjne platformy obejmują zmotoryzowane strzykawki, zmotoryzowane stoliki oraz sterownik. MFP jest połączony ze zmotoryzowanym stolikiem w osi Z w celu kontrolowania odległości przerwy między głowicą a podłożem, a uchwyt podłoża jest przymocowany do zmotoryzowanych stolików w osiach X i Y, które tworzą system skanowania.BGłowica MFP posiada kanały przepływowe łączące ją ze stacją pompową, otwory montażowe umożliwiające zamocowanie głowicy na stole Z oraz kanały wyprowadzające ciecz przez polerowany wierzchołek. Wierzchołek ustawia się w jednej płaszczyźnie z podłożem hodowli komórkowej. Symetryczne pierścienie Newtona są widoczne, gdy wierzchołek i podłoże znajdują się w jednej płaszczyźnie i stykają się ze sobą. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Schemat i konfiguracja platformy MFP o wysokiej rozdzielczości; mikroskopia do precyzyjnej analizy i manipulacji próbkami.
Rysunek 2. platforma MFP. Platforma skanowania o wysokiej rozdzielczości jest wyposażona w obrobioną mechanicznie głowicę uchwytu zintegrowaną z wysokoprecyzyjną zmotoryzowaną osią Z. Uchwyt podłoża jest połączony ze stołem X-Y w celu przeprowadzenia skanowania. W celu odzyskania lizatu do dalszych analiz, do bocznej części uchwytu podłoża magnetycznie przymocowano wydrukowaną w technologii 3D stację próbkowania (pokazano na wstawce). Wokół platformy znajdują się pompy strzykawkowe, mikroskop odwrócony, kontrolery oraz wyświetlacze. Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Schematy wielofunkcyjnej sondy (MFP) ilustrujące tryby lizy pojedynczych komórek, lizy zagnieżdżonej oraz lizy przez ściskanie. Techniki: modulacja HFC, analiza przepływu; pomiary w μl/min.
Rycina 3. Hierarchiczne ograniczenie przepływu hydrodynamicznego (hHFC) w celu przestrzennej i czasowej kontroli usuwania komórek. (A) Schemat pojedynczego HFC. (B) Zagnieżdżone i (C) tryb ściśnięcia (pinched mode) pracy hHFC. (D) Obraz odcisku dla dwóch różnych stosunków przepływu wstrzykiwania/aspiracji. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Wzorcowanie subtrakcyjne w siatce komórkowej, schemat kontroli decelularyzacji, wyniki mikroskopii kokultur.
Rysunek 4. Wzory monowarstw komórkowych z wykorzystaniem MFP. (A) Generowanie siatki komórkowej poprzez programowane skanowanie MFP na monowarstwie komórek MDA-MB-231. Komórki zabarwiono zielonym barwnikiem CellTracker. (B) Odcisk dla różnych stosunków wtrysku (n) na monowarstwie komórek MCF7. Schemat przedstawia oczekiwaną zmianę kształtu wewnętrznego HFC w zależności od zmiany n. (C) Wzorcowa ko-kultura uzyskana poprzez subtrakcyjne wzorowanie monowarstwy komórek MCF7, a następnie wysianie komórek MDA-MB-231 w obszarach usuniętych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Wykres naprężeń ścinających w funkcji szybkości przepływu wstrzykiwania z konturami; obejmuje analizę wykresu powierzchniowego naprężeń ścinających.
Rysunek 5. Naprężenie ścinające na powierzchni podczas stosowania hHFC. Naprężenie ścinające na powierzchni wzrasta liniowo wraz z prędkością przepływu wtrysku wewnętrznego. Punkt o najwyższym ścinaniu znajduje się pomiędzy dwoma wewnętrznymi otworami (inset w prawym dolnym rogu), gdzie ciecz procesowa jest ograniczona (czerwone linie przepływu, inset w lewym górnym rogu). Wymiary otworów zastosowane w modelu elementów skończonych wynoszą 20, 10, 10 i 200 µm odpowiednio dla i1, i2, a1 i a2. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Tryby wzorowania i próbkowania mikroprzepływowego; schemat przedstawiający pompy strzykawkowe, głowicę MFP oraz monowarstwę komórek.
Rysunek 6. Tryby pracy platformy MFP służące do usuwania i wzorowania komórek. (A) Schemat ścieżki przepływu dla wzorowania subtrakcyjnego poprzez lizę komórek. Dla uproszczenia przedstawiono tylko jedną z każdej ścieżki przepływu wtrysku i aspiracji. Strzykawki są napełniane za pomocą zaworu spustowego w pompach. i1 i2 służą odpowiednio do wtryskiwania buforu ekstrakcyjnego oraz NaOH. (B) Schemat ścieżki przepływu dla odzyskiwania lizatu. Ścieżka przepływu ta jest aktywowana po pobraniu lizatu komórkowego do analizy z wykorzystaniem ścieżki przepływu przedstawionej w (A). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Krzywa amplifikacji i krzywa topnienia β-aktyny w qPCR, przedstawiające natężenie fluorescencji w funkcji cyklu/temperatury.
Rycina 7. Analiza końcowa DNA z lizatu komórkowego przy użyciu qPCR. (A) Wykresy amplifikacji DNA w lizacie wyekstrahowanym z 5 śladów (5 fp) oraz 1 śladu (1 fp). W obu przypadkach kontrole wyekstrahowano po pobraniu lizatu. (B) Krzywe topnienia DNA amplifikowanego z lizatu, wykazujące jakość wyekstrahowanego DNA. Przeprowadzono qPCR (N = 2, n = 3) w celu amplifikacji genu β-aktyny. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat projektu kanału mikroprzepływowego do badań nad dynamiką płynów i zastosowań w systemach lab-on-chip.
Rycina S1. Skalowany obraz projektu kanałów dla 6-kanałowej głowicy MFP wykorzystanej w eksperymentach z wzorcowaniem. Kanały wykonujące hHFC to 200, 10, 10, 200 µm szerokie i 100 µm głębokie. Dwa zewnętrzne kanały, które uzupełniają ciecz immersyjną, są 500 µm szeroki i 100 µm głęboki. Plik GDS dla tego samego projektu został dołączony jako materiał uzupełniający do niniejszego artykułu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej figury.

Dyskusja

Przedstawiamy wszechstronny protokół do subtraktywnego wzorcowania monowarstw komórek, który umożliwia szybkie generowanie przestrzennie zdefiniowanych wzorców komórek. Selektywna liza monowarstw komórkowych jest przeprowadzana przy użyciu NaOH jako cieczy procesowej w hHFC. NaOH natychmiast denaturuje białka zawarte w błonie komórkowej. Zalecamy stosowanie NaOH o stężeniu 50 mM, aby zapewnić dalsze przetwarzanie lizatu. Stężenie to można zwiększyć w celu szybszego usuwania komórek, pod warunkiem, że dalsze przetwarzanie lizatu nie jest celem. hHFC zapewnia, że nieprzetworzone obszary otaczające monowarstwę komórki pozostają nienaruszone i są dostępne do rozszerzania wzoru lub sondowania innych właściwości komórek.

Szybkość usuwania komórek jest funkcją zarówno składu chemicznego, jak i ścinania prezentowanego przez przepływ. Dobieramy zakres roboczy natężeń przepływu, aby usunąć komórki z dominacją chemiczną. Prędkości skanowania 10 - 20 μm/s przy użyciu natężenia przepływu wtrysku NaOH wynoszącego 6 - 8 μl/min są wykorzystywane do ułatwienia "szybkiego" wzorca subtraktywnego. Szybkie tempo usuwania komórek rozwiązuje niektóre wyzwania stojące przed podejściami do modelowania opartego na druku powierzchniowym20,21. Metody te wymagają mechanizmu ograniczającego wzrost komórek w określonych przestrzennie obszarach, na przykład poprzez selektywne osadzanie białek adhezyjnych komórek poprzez drukowanie mikrokontaktowe, a następnie wysiewanie komórek w celu uzyskania wzoru. Są one ograniczone niską przepustowością i wymagają kilku sekwencyjnych kroków do wygenerowania wzoru, a także nowego szablonu/stempla dla każdego wzoru. Opisana metoda nie wymaga selektywnego wzrostu komórek na określonych obszarach i pokonuje kilka ograniczeń poprzez wykonywanie wzorca subtraktywnego w przeciwieństwie do drukowania, nie wymagając przy tym dodatkowej obróbki substratu hodowli komórkowej.

Dzięki protokołowi opisanemu w tym artykule zwiększa się przepustowość monowarstw komórek wzorcowych, przy jednoczesnym uzyskaniu natychmiastowej wizualnej informacji zwrotnej na temat wygenerowanego wzoru. Ułatwia to modyfikację wzorów w czasie rzeczywistym. Taka kontrola może mieć kluczowe znaczenie w scenariuszach, w których żywotność komórek na danej powierzchni nie jest jednorodna. Kolejną zaletą tej metody jest to, że ta sama głowica i chemia mogą być używane do generowania wielu wzorów, zmniejszając w ten sposób liczbę kroków związanych z generowaniem wzorzystej monowarstwy komórek.

Wymiary kanałów w głowicy oraz geometria głowicy mogą być skalowane zgodnie z wymaganiami aplikacji, co pozwala na kontrolę nad rozdzielczością wzoru. Wszystkie eksperymenty w niniejszej pracy przeprowadzono przy użyciu głowicy MFP o stałych wymiarach apertury, w szczególności z wewnętrznymi otworami 100 × 100 μm i zewnętrznymi 200 × 100 μm. Ta konstrukcja z większymi otworami zewnętrznymi została wybrana, aby zapewnić ciągłą pracę hHFC bez zatykania otworów przez szczątki zabłąkanych komórek. Przetestowaliśmy głowice o wymiarach apertury wewnętrznej 50 × 50 μm i odstępach między nimi 50 μm, z udanymi wynikami w usuwaniu komórek. Zastosowanie mniejszych otworów, do 10 × 10 μm w odstępach 10 μm, umożliwiłoby skalowanie do mniejszego rozmiaru podstawy (~ 30 × 30 μm), umożliwiając w ten sposób wyższą rozdzielczość wzoru. Zaobserwowaliśmy problemy operacyjne z otworami o rozmiarach mniejszych niż 10 μm z powodu zatkania cząstkami stałymi. Ze względu na takie trudności eksploatacyjne, 100 μm jest aktualnym limitem rozdzielczości, a tym samym ograniczeniem opisywanej techniki. Możemy jednak rozwiązać ten problem, wykorzystując zdolność hHFC do kształtowania cieczy. Wykazaliśmy, że rozdzielczość usuwania komórek można dostroić do danego zestawu wymiarów apertury, kontrolując QI2 / QI1 (rysunek 4b) i odstęp między wierzchołkiem a podłożem10,14. Stopnie stosowane w obecnej pracy mają minimalny rozmiar kroku 100 nm. Połączenie tych kontrolowanych parametrów może poprawić rozdzielczość przestrzenną usuwania komórek pod względem rozmiaru śladu i odległości skanowania.

Jeśli pożądane są wzorzyste współkultury w celu zbadania określonych interakcji komórka-komórka między różnymi typami komórek, sekwencyjne wysiewanie i modelowanie można przeprowadzić przy użyciu opisanego protokołu. Wreszcie, z lizatu można uzyskać amplifikowalny DNA o wysokiej jakości, o czym świadczy pojedynczy pik na krzywej topnienia DNA (patrz rysunek 7). Oceniliśmy ilość DNA około 1,6 ng z pojedynczego śladu (około 300 komórek) za pomocą qPCR, co jest bliskie teoretycznym oczekiwaniom (6-8 pg / komórkę). Wskazuje to ilość wyekstrahowanego DNA odpowiednią dla kilku dalszych procesów, przy jednoczesnym wyeliminowaniu stosowania jakichkolwiek metod izolacji DNA. Otwiera to drogę do lokalnego sondowania hodowanych komórek w oparciu o analizę DNA. Zdolność hHFC do kształtowania cieczy może być również wykorzystana do osadzania żywych komórek i białek na aktywowanych powierzchniach, co w połączeniu z subtraktywnym wzorcowaniem i sekwencyjną kokulturą przedstawionymi w tym protokole umożliwia tworzenie złożonych wzorów komórek i macierzy komórkowych na podłożach hodowlanych. Wszechstronność i kontrola zapewniana przez subtraktywne wzorcowanie monowarstw komórkowych oparte na hHFC oraz możliwość przeprowadzania analizy DNA na wyekstrahowanych komórkach, zapewnia biologom nowy, potężny zestaw narzędzi do wykonywania badań w rozdzielczości przestrzennej obejmujących interakcje komórkowe.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Europejski Komitet ds. Badań Naukowych (ERC) Starting Grant, w ramach 7 Programu Ramowego (Projekt nr 311122, BioProbe). Dziękujemy dr Julienowi Autebertowi i Marcelowi Buerge za pomoc techniczną i dyskusje podczas opracowywania protokołu i platformy. Prof. Petra Dittrich (ETH Zurich), prof. Bradley Nelson (ETH Zurich), dr Bruno Michel i dr Walter Riess są doceniani za ich nieustanne wsparcie.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Materials
Microfluidic Probe (MFP)Hybrydowa głowica sondy silikonowo-szklanej z kanałami wykonanymi z krzemu. Produkcja wykonana wewnętrznie w IBM Research - Zü bogate
szkiełka komorowe Lab Tek II z 2 komoramiThermoFisher scientific, USA1544612 Szkiełka komorowe do hodowli komórkowych, z których każda komora zapewnia powierzchnię 4 cm2 i może pomieścić do 3 ml objętości
Chemikalia i linie komórkowe
Wodorotlenek sodu, Tris-Cl, kwas etylenodiaminotetraoctowy, rodamina BSigmaAldrich chemicals, USAS5881, 252859,  E9884, R6626Chemikalia używane do przetwarzania i osłaniania cieczy
Proteinaza KQiagen, Niemcy19131proteaza do trawienia denatuirowanych białek
Deconex 16 PlusBohrer Chemie, SzwajcariaUniwersalny środek czyszczący do materiałów eksploatacyjnych labaratorium. Służy do nierygorystycznego czyszczenia.
DNA z dala ThermoFisher scientific, USA7010Dekontaminacja powierzchniowa, która denaturuje DNA i DNAazy.
DMEM, wysoka zawartość glukozy, suplement GLUTAMAXThermoFisher scientific, USA10566-016Pożywka do hodowli komórek nabłonkowych.
CellTracker Zielony barwnik CMFDAThermoFisher scientific, USAC7025Barwnik do znakowania żywych komórek z membraną. Barwnik aktywny przez 72 godziny.
CellTracker Orange CMRA barwnikThermoFisher scientific, USAC34551
β-aktynowe startery genomowe do qPCRZintegrowane technologie DNA, USANiestandardowe oligonukleotydy używane do walidacji jakości DNA i qPCR.
Komórki raka piersi MCF7ATCC, USAATCC HTB-22Linie komórkowe używane do produkcji kokultur.
MDA-MB-231 komórki raka piersiATCC, USAATCC HTB-26
Sprzęt i połączenia płynowe
Zmotoryzowane stopnie o wysokiej precyzjiNiestandardowe elementy obrabiane.  Silniki osi liniowej firmy LANG GmBH, NiemcyDostosowane stopnie osi liniowej z serii LT3 i razy; LT dla 3 osi. Kontroler LSTEP służący do współpracy stopni z komputerem PC poprzez port RS 232.
StrzykawkiHamilton, Szwajcaria Seria1700 TLLXWymienne ze strzykawkami innych producentów z 250-500 µ l zakres.
Niskociśnieniowe pompy strzykawkowe Nemesyscetoni GmbH, NiemcyElement przepompowni.
Złącze okrągłe M1Mikrofluidyka Dolomit, Wielka Brytania 3000051Interfejs między przelotkami w głowicy MFP a rurką
Stopień pochylenia/obrotu GoniometrOptoSigma, USAKKD-25CGoniometr do regulacji współpłaszczyznowości
kolorowej kamery MFP apex DS Fi2 HD (CCD) Nikon, SzwajcariaSterowany za pomocą jednostki sterującej DS-U3
SoftwareWin - Commander LANG GmBH, Niemcy Oprogramowanie do sterowania sceną.
Qmix Elementscetoni GmbH, NiemcyOprogramowanie sterujące pompą.
NIS ElementsNikon, SzwajcariaPodstawowy moduł badawczy do akwizycji i analizy obrazu.
podłoża

Bibliografia

  1. Théry, M. Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions. J. Cell Sci. 123 (Pt 24), 4201-4213 (2010).
  2. Goubko, C. A., Cao, X. Patterning multiple cell types in co-cultures: A review. Mater. Sci. Eng. C. 29 (6), 1855-1868 (2009).
  3. Kaji, H., Camci-Unal, G., Langer, R., Khademhosseini, A. Engineering systems for the generation of patterned co-cultures for controlling cell-cell interactions. Biochim. Biophys. Acta. 1810 (3), 239-250 (2011).
  4. Cho, C. H., Park, J., Tilles, A. W., Berthiaume, F., Toner, M., Yarmush, M. L. Layered patterning of hepatocytes in co-culture systems using microfabricated stencils. Biotechniques. 48 (1), 47-52 (2010).
  5. Schütze, K., Lahr, G. Identification of expressed genes by laser-mediated manipulation of single cells. Nat. Biotechnol. 16 (8), 737-742 (1998).
  6. Salazar, G. T. A., Wang, Y., et al. Micropallet arrays for the separation of single, adherent cells. Anal. Chem. 79 (2), 682-687 (2007).
  7. Guillaume-Gentil, O., Zambelli, T., Vorholt, J. A. Isolation of single mammalian cells from adherent cultures by fluidic force microscopy. Lab Chip. 14 (2), 402-414 (2014).
  8. Iwata, F., Adachi, M., Hashimoto, S. A single-cell scraper based on an atomic force microscope for detaching a living cell from a substrate. J. Appl. Phys. 118 (13), (2015).
  9. Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration. J. Lab. Autom. 17 (1), 59-65 (2012).
  10. Juncker, D., Schmid, H., Delamarche, E. Multipurpose microfluidic probe. Nat. Mater. 4 (8), 622-628 (2005).
  11. Kaigala, G. V., Lovchik, R. D., Delamarche, E. Microfluidics in the "open space" for performing localized chemistry on biological interfaces. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 51 (45), 11224-11240 (2012).
  12. Qasaimeh, M. A., Gervais, T., Juncker, D. Microfluidic quadrupole and floating concentration gradient. Nat. Commun. 2 (May), 464(2011).
  13. Christ, K. V., Turner, K. T. Design of hydrodynamically confined microfluidics: controlling flow envelope and pressure. Lab Chip. 11 (8), 1491-1501 (2011).
  14. Autebert, J., Kashyap, A., Lovchik, R. D., Delamarche, E., Kaigala, G. V. Hierarchical hydrodynamic flow confinement: efficient use and retrieval of chemicals for microscale chemistry on surfaces. Langmuir. 30 (12), 3640-3645 (2014).
  15. Kaigala, G. V., Lovchik, R. D., Drechsler, U., Delamarche, E. A Vertical Microfluidic Probe. Langmuir. 27 (9), 5686-5693 (2011).
  16. Cors, J. F., Lovchik, R. D., Delamarche, E., Kaigala, G. V. A compact and versatile microfluidic probe for local processing of tissue sections and biological specimens. Rev. Sci. Instrum. 85 (3), 034301(2014).
  17. Pollard, J. W., Walker, J. M. Basic Cell Culture Protocols. , Humana Press. (1997).
  18. Mitry, R. R., Hughes, D. R. Human cell culture protocols. Methods Mol. Biol. Springer. 531 (1), (2012).
  19. Sakai, K., Ushida, T., Nagase, T., Nakamigawa, H. Quantitative analysis of cell detachment by shear stress. Mater. Sci. Eng. C. 17 (1-2), 55-58 (2001).
  20. Rodriguez, N. M., Desai, R. A., Trappmann, B., Baker, B. M., Chen, C. S. Micropatterned multicolor dynamically adhesive substrates to control cell adhesion and multicellular organization. Langmuir. 30 (5), 1327-1335 (2014).
  21. Tasoglu, S., Demirci, U. Bioprinting for stem cell research. Trends Biotechnol. 31 (1), 10-19 (2013).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Hierarchiczne ograniczanie przep ywu hydrodynamicznegowzorcowanie kom reklokalna liza kom rekprzetwarzanie wodorotlenkiem sodukontrola odleg o ci szczelinysystem skanowaniamodulacja szybko ci przep ywuwzorcowanie monowarstwy kom rekmanipulacja kom rkami w czasie rzeczywistym
Szybkie subtraktywne modelowanie warstw żywych komórek za pomocą sondy mikroprzepływowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.