Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Mikrowzorowanie i montaż trójwymiarowych mikonaczyń

11.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54457

⸱

9 września 2016

 ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, University of Washington, 2Center for Cardiovascular Biology, Institute for Stem Cell and Regenerative Medicine, University of Washington

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten manuskrypt przedstawia metodę formowania wtryskowego do inżynierii mikronaczyń, które podsumowują fizjologiczne właściwości śródbłonka. Proces oparty na mikroprzepływach tworzy opatentowane sieci naczyniowe 3D z dostosowanymi warunkami, takimi jak przepływ, skład komórkowy, geometria i gradienty biochemiczne. Opisano proces wytwarzania i przykłady potencjalnych zastosowań.

Streszczenie

Platformy in vitro do badania komórek śródbłonka i biologii naczyniowej są w dużej mierze ograniczone do hodowli komórek śródbłonka 2D, komór przepływowych z substratami na bazie polimeru lub szkła oraz testów tworzenia probówek na bazie hydrożelu. Testy te, choć pouczające, nie podsumowują geometrii światła, właściwej macierzy zewnątrzkomórkowej i bliskości wielokomórkowej, które odgrywają kluczową rolę w modulowaniu funkcji naczyń krwionośnych. Manuskrypt ten opisuje metodę formowania wtryskowego w celu wytworzenia naczyń inżynieryjnych o średnicach rzędu 100 μm. Mikronaczynia są wytwarzane przez wysiewanie komórek śródbłonka w kanale mikroprzepływowym osadzonym w natywnym hydrożelu kolagenowym typu I. Poprzez włączenie komórek miąższowych do macierzy kolagenowej przed utworzeniem kanału, można modelować i badać określone mikrośrodowiska tkankowe. Dodatkowe modulacje właściwości hydrodynamicznych i składu pożywki pozwalają na kontrolę złożonej funkcji naczyń krwionośnych w pożądanym mikrośrodowisku. Platforma ta pozwala na badanie rekrutacji komórek okołonaczyniowych, interakcji krew-śródbłonek, odpowiedzi przepływu i interakcji tkankowo-mikronaczyniowych. Zmodyfikowane mikronaczynia oferują możliwość izolowania wpływu od poszczególnych składników niszy naczyniowej i precyzyjnego kontrolowania jej właściwości chemicznych, mechanicznych i biologicznych w celu badania biologii naczyń krwionośnych zarówno w zdrowiu, jak i chorobie.

Wprowadzenie

Mikrokrążenie w każdym narządzie pomaga zdefiniować mikrośrodowisko tkankowe, utrzymać homeostazę tkanek i regulować stan zapalny, przepuszczalność, zakrzepicę i fibrynolizację 1,2. W szczególności śródbłonek mikronaczyniowy jest interfejsem między przepływem krwi a otaczającą tkanką i dlatego odgrywa kluczową rolę w modulowaniu funkcji naczyń krwionośnych i narządów w odpowiedzi na bodźce, takie jak siły hydrodynamiczne oraz krążące cytokiny i hormony 3-5. Zrozumienie szczegółowych interakcji między śródbłonkiem, krwią i otaczającym mikrośrodowiskiem tkanek jest ważne dla badań nad biologią naczyń krwionośnych i progresją choroby. Jednak postęp w badaniu tych interakcji został zahamowany przez ograniczone narzędzia in vitro, które nie podsumowują struktury i funkcji mikronaczyń in vivo 6,7. W rezultacie, postęp w tej dziedzinie i terapii w dużej mierze opierał się na kosztownych i czasochłonnych modelach zwierzęcych, które często nie przekładają się na sukces u ludzi 8-10. Chociaż modele in vivo są nieocenione w badaniu mechanizmów chorobowych i funkcji naczyniowych, są złożone i często brakuje im precyzyjnej kontroli nad indywidualnymi sygnałami komórkowymi, biochemicznymi i biofizycznymi.

Vasculature w całym ciele posiada dojrzałą hierarchiczną strukturę w połączeniu z ekspansywnymi łóżkami kapilarnymi, zapewniając jednocześnie zoptymalizowaną perfuzję i transport składników odżywczych 11. Początkowo układ naczyniowy tworzy się jako prymitywny splot, który we wczesnym okresie rozwoju reorganizuje się w hierarchicznie rozgałęzioną sieć 12,13. Chociaż wiele sygnałów zaangażowanych w te procesy jest dobrze poznanych 14-16, pozostaje nieuchwytne, w jaki sposób taki wzorzec naczyniowy jest determinowany 15. Z kolei rekapitulacja tego procesu in vitro w celu zbudowania zorganizowanych sieci naczyniowych była trudna. Wiele istniejących platform in vitro do modelowania unaczynienia, takich jak dwuwymiarowe hodowle komórek śródbłonka, nie ma ważnych cech, takich jak bliskość wielokomórkowa, trójwymiarowa geometria światła, przepływ i macierz zewnątrzkomórkowa. Testy tworzenia probówek w hydrożelach 3D (kolagen lub fibryna) 17-19 lub testy inwazji 20,21 zostały wykorzystane do badania funkcji śródbłonka w 3D i ich interakcji z innymi typami komórek naczyniowych 17,22 lub tkankowymi 23. Jednak zmontowane lumeny w tych testach nie mają wzajemnych połączeń, przepływu hemodynamicznego i odpowiedniej perfuzji. Co więcej, skłonność do regresji naczyniowej w tych testach tworzenia probówek 24 uniemożliwia długotrwałą hodowlę i dojrzewanie, co ogranicza zakres badań funkcjonalnych, które można przeprowadzić. W związku z tym istnieje rosnąca potrzeba zaprojektowania platform in vitro sieci mikronaczyniowych, które mogą odpowiednio modelować cechy śródbłonka i są zdolne do długotrwałej hodowli.

Na przestrzeni lat pojawiły się różne techniki inżynierii naczyniowej do zastosowań medycznych, które zastępują lub omijają uszkodzone naczynia u pacjentów z chorobami naczyniowymi. Naczynia o dużej średnicy wykonane z materiałów syntetycznych, takich jak politereftalan etylenu (PET) i politetrafluoroetylen (ePTFE), odniosły znaczny sukces terapeutyczny przy długoterminowej drożności (średnio 95% drożność w ciągu 5 lat) 25. Chociaż przeszczepy syntetyczne o małej średnicy (< 6 mm) zazwyczaj napotykają powikłania, takie jak przerost błony wewnętrznej i małopłytkowość 26-28, przeszczepy o małej średnicy wykonane z materiału biologicznego metodą inżynierii tkankowej poczyniły znaczne postępy 29,30. Pomimo tego rodzaju postępów, statki inżynieryjne w mikroskali pozostają wyzwaniem. Aby odpowiednio modelować mikrokrążenie, konieczne jest generowanie złożonych wzorców sieciowych o wystarczającej wytrzymałości mechanicznej do utrzymania drożności i o składzie matrycy, który pozwala zarówno na przenikanie składników odżywczych do komórek miąższowych, jak i na przebudowę komórkową.

Ten protokół przedstawia nowatorską sztuczną sieć naczyń perfuzyjnych, która naśladuje natywne ustawienie in vivo z regulowanym i kontrolowanym mikrośrodowiskiem 31-34. Opisana metoda pozwala na uzyskanie mikronaczyń inżynieryjnych o średnicach rzędu 100 μm. Zmodyfikowane mikronaczynia są wytwarzane przez perfuzję komórek śródbłonka przez kanał mikroprzepływowy, który jest osadzony w miękkim hydrożelu kolagenowym typu I. System ten ma zdolność do generowania wzorzystych sieci o otwartej strukturze świetlnej, replikowania interakcji wielokomórkowych, modulowania składu macierzy zewnątrzkomórkowej i stosowania fizjologicznie istotnych sił hemodynamicznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Mikrowytwarzanie wzorowanego polidimetylosiloksanu (PDMS) o strukturze sieciowej

  1. Wytwarzanie wafla w celu stworzenia negatywowej matrycy projektu sieci
    1. Stworzyć wzór sieci przy użyciu dowolnego oprogramowania do projektowania wspomaganego komputerowo (CAD). Należy upewnić się, że wymiar przekątny między wlotem a wylotem odpowiada odległości między zbiornikami wlotowymi i wylotowymi w urządzeniach obudowach w kolejnych krokach (patrz 2.1.1).
      Uwaga: Projekt samego wzoru jest dostosowany do konkretnych celów badawczych użytkownika (przykładowe wzory przedstawiono na Rysunku 1).
    2. Wygenerować maskę wzoru sieci za pomocą druku o wysokiej rozdzielczości lub zamówić chromową maskę fotolitograficzną od komercyjnego dostawcy. Bardziej szczegółowy protokół procesu fotolitografii jest dostępny w innym opracowaniu 35.
    3. Oczyścić 8-calowy wafel krzemowy przez 5 min przy 100 W za pomocą plazmy tlenowej.
    4. Nalać na wafel odpowiednią ilość negatywowego fotorezystu (dobrze sprawdza się SU-8 2,100), tak aby rezyst utworzył kroplę o średnicy 2,5 cm. Używając wirówki do nakładania warstw, wirować wafel z prędkością 500 rpm przy rampie 100 rpm/sec i utrzymać przez 10 sec. Następnie zwiększyć prędkość do 1,600 rpm z rampą 300 rpm/sec i utrzymać przez 30 sec. Uwaga: Prędkość i rampa muszą zostać zoptymalizowane dla warunków danego laboratorium, aby uzyskać grubość rezystu 150 µm.
    5. Wykonać wstępne wygrzewanie (soft-bake) wafla w temperaturze 65 °C przez 7 min, zwiększyć temperaturę do 95 °C z rampą 360 °C/hr i utrzymać przez 45 min. Powoli schłodzić na płycie grzejnej do temperatury pokojowej. Odcisnąć wzór naczynia na pokrytym rezystem waflu poprzez naświetlanie światłem UV o długości fali 365 nm przez chromową maskę fotolitograficzną, stosując dawkę naświetlania trzykrotnie większą niż zalecana przez producenta (350 mJ/cm2 dla grubości SU-8 około 150 µm).
      Uwaga: Ponieważ SU-8 jest rezystem negatywowym, obszary naświetlone (wszystko poza projektem wzoru) staną się nierozpuszczalne w wywoływaczu w kroku 1.1.7.
    6. Wykonać końcowe wygrzewanie (hard-bake) naświetlonego wafla w temperaturze 65 °C przez 5 min, zwiększyć temperaturę do 95 °C z rampą 360 °C/hr i utrzymać przez 25 min, a następnie pozwolić mu powoli ostygnąć do temperatury pokojowej na płycie grzejnej.
    7. Zanurzyć wafel w wywoływaczu SU-8 na 10–15 min, aby wypłukać nienaświetlony rezyst, a następnie oczyścić alkoholem izopropylowym i osuszyć pod strumieniem sprężonego azotu. Sprawdzić wzór pod mikroskopem świetlnym, aby upewnić się, że rezyst SU-8 jest dobrze związany z waflami (należy sprawdzić, czy nie występują niepożądane odwarstwienia i pęcherzyki).
    8. Zmierzyć grubość elementów wzoru za pomocą profilometru zgodnie z instrukcjami producenta 36. Podczas pomiaru unikać obszarów struktury istotnych dla funkcji sieci (tj. przewodów wlotowych i wylotowych), ponieważ profilometr stykowy mógłby naruszyć integralność strukturalną wzorowanych elementów na waflu. Alternatywnie można zastosować metodę bezstykową (tj. profilometr optyczny), aby całkowicie uniknąć tego problemu.
  2. Tworzenie form wzorowanych i płaskich do odlewania kolagenu
    Uwaga: Silany należy obsługiwać w dygestorium chemicznym.
    1. Umieścić wafel w eksyكاتهrze z 100 µl trichloro(3,3,3-trifluoropropyl)silanu na 2 hr w celu sylanizacji powierzchni.
    2. Przenieść sylanizowany wafel do kwadratowej szalki Petriego o wymiarach 120 x 120 mm. Nalać wymieszany i odgazowany elastomer PDMS oraz czynnik utwardzający (stosunek masowy 10:1) na wafel, aby uzyskać grubość 4–6 mm. Nalać dodatkowy PDMS do oddzielnej kwadratowej szalki Petriego 120 x 120 mm, aby stworzyć formy płaskie bez wzorów. Utwardzać w temperaturze 65 °C przez 2 hr.
    3. Wyjąć z pieca i pozwolić PDMS ostygnąć do temperatury pokojowej. Za pomocą skalpela ostrożnie wyciąć kwadrat wokół SU-8 i powoli odkleić formę z PDMS od wafla. Przyciąć krawędzie do rozmiaru 30 mm x 30 mm. W przypadku form płaskich wyciąć utwardzony PDMS bez odciśniętego wzoru w kwadratowe kawałki o wymiarach około 40 mm x 40 mm.

2. Urządzenia do zakwaterowania

  1. Wykonanie górnej i dolnej części obudowy
    1. Wykonaj obudowę naczynia z polimetakrylanu metylu (PMMA). W celu wykonania części należy zamówić je w standardowym warsztacie obróbki skrawaniem z możliwością frezowania sterowanego numerycznie (CNC). Schemat górnej i dolnej części przedstawiono na rysunku 1.
    2. Zaprojektuj górną część obudowy (rysunek 1D) tak, aby od spodu urządzenia znajdował się otwór o wymiarach 20 mm x 20 mm i głębokości 1 mm, a na górnej części urządzenia, w narożnikach kwadratowego otworu, dwa porty do wstrzykiwania kolagenu (o średnicy 4 mm), dwa zbiorniki wlotowe i wylotowe o średnicach 6 mm oraz cztery otwory na śruby (o średnicy 3 mm) w czterech narożnikach urządzenia.
      Uwaga: Na obwodzie elementu można wywiercić dodatkowe otwory w celu ułatwienia manipulacji.
    3. Zaprojektuj dolną część obudowy (rysunek 1E) tak, aby w środku znajdował się kwadratowy otwór (wymiary 15 mm x 15 mm) z otaczającą go półką o wymiarach 25 mm x 25 mm i głębokości 0,25 mm. Wywierć 4 otwory na śruby z gwintem 4-40. Upewnij się, że otwory na śruby w części dolnej i górnej będą się ze sobą pokrywać podczas późniejszych etapów montażu.

3. Fabrykacja urządzenia do mikronaczyń

  1. Przygotowanie materiałów
    1. Umyć i autoklawować dwa zestawy pęset, szpatułkę ze stali nierdzewnej, mały płaski śrubokręt, śruby ze stali nierdzewnej oraz kilka kołków ustalających ze stali nierdzewnej. Do wykonania naczyń należy również autoklawować formy z PDMS z mikrowzorami, płaskie kwadraty z PDMS, szkiełka nakrywkowe (22 x 22 mm) oraz kawałki waty.
    2. Sterylizować elementy obudowy z PMMA w wybielaczu przez co najmniej 1 h, następnie dwukrotnie wypłukać wodą autoklawowaną w komorze do hodowli tkankowej i pozostawić do wyschnięcia w sterylnych szalkach do hodowli tkankowej (150 mm x 25 mm).
  2. Sterylna powłoka z polietyleniminy i glutaraldehydu (PEI - GA)
    1. Poddać wewnętrzne wgłębienia wysterylizowanych, suchych elementów PMMA działaniu plazmy przez około 1 min. Nanieść 1% polietyleniminę (PEI) na wewnętrzne wgłębienia (kwadratowe wgłębienie 20 mm na górze i kwadratową półkę 25 mm na dole) elementów PMMA na 10 min. Wypłukać sterylną H2O i pozostawić do wyschnięcia w komorze do hodowli tkankowej.
      Uwaga: Czas potrzebny na obróbkę plazmową jest zmienny w zależności od użytego urządzenia – PEI powinna rozprowadzać się łatwo, co wskazuje na powierzchnię hydrofilową. W przeciwnym razie może być konieczna dodatkowa obróbka plazmowa.
    2. Nanieść 0,1% glutaraldehydu (GA) na powierzchnie elementów PMMA potraktowane PEI na 30 min. Wypłukać dwukrotnie sterylną wodą i pozostawić do wyschnięcia.
      Uwaga: W kolejnych etapach kolagen przywrze do powlekanej powierzchni poprzez sieciowanie kolagen-glutaraldehyd. Pomaga to zabezpieczyć żel wewnątrz urządzenia podczas późniejszych etapów montażu oraz w całym okresie hodowli w urządzeniu.
  3. Przygotowanie żelu kolagenowego
    1. Wyprodukować naczynia, używając roztworów kolagenu o stężeniu 0,6% - 1%. Aby przygotować 0,75% kolagenu do wykonania naczyń, zmieszać roztwór stokowy kolagenu typu I (1,5% - izolowany z ogonów szczurów 37) z wodorotlenkiem sodu (NaOH), 10-krotnym suplementem pożywki (M199) oraz pożywką do hodowli komórkowej. Wszystkie roztwory przechowywać w lodzie.
    2. Objętość kolagenu wyznaczyć za pomocą następującego równania, gdzie Vƒinal to końcowa objętość wymaganego żelu (zazwyczaj wystarcza 1 ml kolagenu na urządzenie), Vstock collagen to wymagana objętość kolagenu stokowego, Cstock collagen to stężenie kolagenu stokowego, a Cƒinal collagen to pożądane stężenie kolagenu w naczyniu.
      Równanie rozcieńczania kolagenu, Vstock=Vfinal*(Cfinal/Cstock), wzór na obliczenie stężenia.
    3. Za pomocą strzykawki 1 ml przenieść odpowiednią objętość kolagenu stokowego do nowej probówki stożkowej 30 ml. Objętości neutralizującego NaOH (VNaOH), 10-krotnego suplementu pożywki M199 (V10X) oraz pożywki do hodowli komórkowej (V1X) wyznaczyć w następujący sposób i zmieszać osobno w probówce stożkowej 15 ml:
      Równania rozcieńczania roztworów; V10X=0,1×Vfinal; eksperymentalne obliczenia objętości.
    4. Dodać mieszaninę reagentów neutralizujących (V10X, VNaOH, V1X) do odmierzonego kolagenu i za pomocą małej szpatułki delikatnie mieszać roztwór, aż do uzyskania jednorodnego żelu. Unikać wprowadzania pęcherzyków powietrza, mieszając powoli i delikatnie.
    5. Aby włączyć komórki do macierzy w pożądanym stężeniu (np. 0,5 - 20 milionów komórek/ml), dodać komórki do roztworu kolagenu po jego zmieszaniu z reagentami neutralizującymi i kontynuować mieszanie, aż komórki zostaną homogenicznie rozłożone.
    6. W przypadku dodania komórek, dostosować objętość pożywki do hodowli komórkowej, aby uwzględnić dodatkową objętość, zgodnie z następującym równaniem, gdzie Vcells jest wymaganą objętością zawiesiny komórkowej, Cƒinal cell density jest pożądaną gęstością komórek w naczyniu, a Csuspension cell density jest gęstością komórek w roztworze stokowym.
      Równania obliczania zawiesiny komórkowej dla objętości i gęstości, wzór naukowy, zastosowanie edukacyjne.
  4. Wstrzykiwanie kolagenu - element górny
    1. Umieścić formę z PDMS z mikrowzorami w szalce 100 mm x 20 mm. Oczyścić formę z PDMS plazmą przez 1 min.
    2. Ustawić górny element PMMA na formie z PDMS tak, aby kwadratowe zbiorniki na formie znajdowały się bezpośrednio pod zbiornikami wlotowymi i wylotowymi (patrz Rysunek 1D - linie przerywane). Włożyć stalowe kołki ustalające do otworów zbiorników wlotowego i wylotowego w górnym elemencie PMMA, aby zachować swobodny dostęp ze zbiorników do wzoru.
    3. Za pomocą strzykawki 1 ml pobrać ~ 0,5 - 0,6 ml kolagenu. Upewnić się, że w strzykawce nie pozostały pęcherzyki powietrza.
    4. Lekko docisnąć pęsetą górną obudowę, aby zapewnić szczelny kontakt między górnym elementem a formą z PDMS. Powoli wstrzyknąć kolagen przez port wtryskowy w górnym elemencie PMMA. Sprawdzić, czy kolagen wypełnia obszar 20 mm x 20 mm nad wzorem i czy nie wycieka.
    5. Zamknąć szalkę, nie poruszając kołkami ustalającymi, i pozostawić do żelowania w inkubatorze 37 °C przez 30 min.
  5. Wstrzykiwanie kolagenu - element dolny
    1. Umieścić szkiełko nakrywkowe 22 x 22 mm w centrum dolnego elementu. Za pomocą strzykawki 1 ml równomiernie nanieść ~ 0,25 ml kolagenu na szkiełko. Delikatnie opuścić płaski kwadrat z PDMS na kolagen, upewniając się, że PDMS przylega płasko do PMMA i nie ma uwięzionych pęcherzyków powietrza. Pozostawić do żelowania w 37 °C przez 30 min.
  6. Montaż urządzenia
    1. Po żelowaniu dodać wokół płaskiego elementu PDMS na dolnej części wystarczającą ilość PBS, aby otoczyć PDMS (około 1 ml). Za pomocą pęsety usunąć nadmiar kolagenu z krawędzi i powoli odkleić element PDMS. Dodać więcej PBS na wierzch kolagenu, aby utrzymać nawilżenie.
    2. Aby przygotować element górny, podnieść pęsetą górny element PMMA i obrócić go tak, aby forma z PDMS znajdowała się na górze. Dodać kilka kropli PBS na styk, a następnie szybko i zdecydowanie usunąć formę z PDMS z górnego elementu PMMA.
    3. Delikatnie usunąć stalowe kołki ustalające z drugiej strony obudowy PMMA za pomocą drugiej pęsety. Dodać kilka kolejnych kropli PBS na kolagen z mikrowzorami. Obrócić górny element PMMA tak, aby kolagen był skierowany w dół, i włożyć 4 śruby w narożne otwory.
    4. Delikatnie położyć górny element na dolnym, dopasowując śruby do narożnych otworów w dolnym elemencie. Nie dopuścić do przesunięcia obu części względem siebie. Za pomocą śrubokręta dokręcić śruby z wyczuciem. Nie dokręcać zbyt mocno.
    5. Odssać PBS otaczający powierzchnie PMMA i umieścić mały kawałek waty pod jedną krawędzią urządzenia. Za pomocą pipety usunąć PBS ze zbiorników i zastąpić go pożywką do hodowli komórkowej. Pozostawić urządzenie do wspólnego żelowania w inkubatorze 37°C przez co najmniej 1 h.
  7. Sianie komórek
    1. Hodować ludzkie komórki endotelialne żyły pępowinowej (HUVEC) w pożywce wzrostowej dla komórek endotelialnych w 37 °C (CO2, O2) do osiągnięcia konfluencji 38. W miarę możliwości używać komórek między 4. a 7. pasażem.
    2. Trypsynizować komórki endotelialne, płucząc kolbę z hodowlą 6 ml PBS, a następnie dodając 2 ml 0,05% trypsyny w 37 °C w celu dysocjacji komórek. Pozostawić komórki w trypsynie, aż większość adhezji ogniskowych zostanie przerwana, a komórki przybiorą kształt kulisty (zajmuje to zazwyczaj około 2 - 3 min). Zatrzymać reakcję trypsyny, dodając 4 ml pożywki wzrostowej dla komórek endotelialnych zawierającej płodową surowicę bydlęcą (FBS). Wypłukać kolbę pożywką kilka razy, aby upewnić się, że komórki oddzieliły się od ścianek, i zebrać je do probówki stożkowej.
    3. Policzyć komórki za pomocą hemocytometru i resuspendować je do gęstości 10 milionów komórek na ml. Usunąć całą pożywkę do hodowli komórkowej ze zbiorników wlotowego i wylotowego. Używając końcówki do nakładania żelu 200 µl, dodać 10 µl zawiesiny komórkowej do centrum zbiornika wlotowego. Komórki powinny natychmiast zacząć przepływać do sieci i ją pokrywać.
    4. Dodać po 200 µl pożywki do obu zbiorników i pozostawić komórki do przyczepienia i rozprzestrzenienia się w sieci przez co najmniej 1 h.
  8. Hodowla w urządzeniu
    1. Hodować w urządzeniu z przepływem napędzanym grawitacyjnie przez sieć, dodając 200 µl pożywki do hodowli komórkowej do zbiornika wlotowego i 50 µl do zbiornika wylotowego. Przy tej metodzie hodowli wymieniać pożywkę co 12 h, aby utrzymać żywotność komórek endotelialnych.
      Uwaga: Jeśli pożądane są warunki hodowli z przepływem ciągłym (aby utrzymać stałe naprężenie ścinające, zbierać pożywkę na wylocie, itp.), można zamiast hodowli grawitacyjnej zastosować pompę strzykawkową.
    2. Pozostawić zasiane komórki endotelialne przez co najmniej 24 h w celu przyczepienia i stabilizacji przed zastosowaniem przepływu ciągłego. Przed konfiguracją przepływu ciągłego utrzymywać urządzenia w warunkach przepływu grawitacyjnego.
      UWAGA: Warunki pożywki dla przepływu wymuszonego różnią się od hodowli grawitacyjnej. Dodanie do pożywki ekspandera plazmy, takiego jak dekstran, stabilizuje stworzone mikro naczynia i zapobiega zapadaniu się naczyń podczas długotrwałej perfuzji 39.
    3. Aby przygotować pożywkę do konfiguracji przepływu ciągłego, rozpuścić 3,5% dekstranu (70 kDa) w pożywce wzrostowej dla komórek endotelialnych dla optymalnej hodowli naczyń. Stosując technikę sterylną, napełnić strzykawki 10 ml pożywką wzrostową dla komórek endotelialnych z 3,5% dekstranem.
    4. Przygotować sterylną szalkę do hodowli na potrzeby przepływu, wypalając otwory w ścianie bocznej szalki Petriego za pomocą lutownicy.
    5. Przymocować 12-calową rurkę silikonową (ID 1/32") do złącza Luer lock (żeńskie, ID 1/16") oraz prosty łącznik rurka-rurka 1/16" z 1-calowym odcinkiem rurki na drugim końcu. Włożyć 1/4-calową tępą igłę 20G (oddzieloną od piasty igły) do wolnego końca 1-calowego odcinka. Przygotować również 3-calowy odcinek rurki przymocowany do kolankowego złącza rurka-rurka 90° (do zamontowania we wlocie obudowy). W kolejnych krokach dłuższa rurka zostanie przełożona przez przygotowaną szalkę i połączona z 3-calowym odcinkiem za pomocą igły 20 G. Rurka wylotowa powinna być lustrzanym odbiciem rurki wlotowej, z wolnym końcem zamiast złącza Luer lock. Autoklawować wszystkie segmenty przed użyciem.
    6. Przełożyć autoklawowane rurki wlotowe i wylotowe przez otwory w przygotowanej szalce. Przymocować 3-calowe odcinki do wewnętrznych igieł 20 G. Przymocować złącze Luer lock do strzykawki wypełnionej pożywką i przeprowadzić perfuzję pożywki przez rurkę za pomocą pompy strzykawkowej ustawionej na wysoki przepływ. Upewnić się, że w rurkach lub złączach nie ma pęcherzyków powietrza, ponieważ będą one utrudniać przepływ do naczyń.
    7. Włożyć złącze do wlotu obudowy. Ustawić pompę strzykawkową na pożądany przepływ i rozpocząć perfuzję.
      UWAGA: Można to dostosować w zależności od geometrii naczyń i warunków eksperymentalnych stosowanych naprężeń ścinających. Dla kanału o średnicy 100 µm dobrze sprawdza się przepływ 3 µl/min.
    8. W razie potrzeby zbierać perfuzat za pomocą przygotowanej rurki wylotowej wprowadzonej do sterylnej polistyrenowej probówki o okrągłym dnie 5 ml zawierającej 500 µl pożywki.
      Uwaga: Do probówki zbiorczej dodaje się niewielką ilość pożywki, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków, które mogą zablokować przepływ.
    9. W zależności od prędkości przepływu strzykawkę może być konieczne napełnić ponownie po 24 do 36 h. Odbywa się to poprzez usunięcie złącza z wlotu obudowy, wymianę strzykawki i pozwolenie na perfuzję pożywki przy wysokim przepływie przez kilka minut. Ta sekwencja zapewnia, że do rurki nie zostaną wprowadzone pęcherzyki powietrza. Zresetować pompę do pożądanej prędkości przepływu dla hodowli, włożyć złącze do wlotu obudowy i przenieść z powrotem do inkubatora.

4. Analiza urządzenia

  1. Analiza przepuszczalności
    1. W celu wizualizacji przepuszczalności naczynia in situ należy zastosować FITC-dekstran 40 kDa. Umieść obudowę naczynia na mikroskopie konfokalnym i ustaw ostrość na płaszczyznę naczynia. Do wlotu dodaj 5 µM FITC-dekstranu 40 kDa i wykonaj obrazowanie przy powiększeniu 4X, czasie ekspozycji 25 msec i częstotliwości 1 klatka/s przez 10 min.
    2. Serię obrazów przeanalizuj za pomocą kodu analitycznego, aby oszacować przepuszczalność dekstranu przez ścianę naczynia do kolagenu (µm/sec) w oparciu o model opublikowany przez Zheng et. al. 31.
  2. Immunobarwienie i analiza obrazowania konfokalnego
    1. Aby utrwalić naczynia, przeprowadź perfuzję 3,7% formaldehydem przez wlot przez 20 min, a następnie przemyj, wykonując trzy perfuzje PBS (po 20 min każda). Zablokuj nieswoiste wiązanie przeciwciał, przeprowadzając perfuzję sieci 2% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) i 0,5% Triton X-100 przez 1 hr. Roztwory przeciwciał pierwszorzędowych podawaj w perfuzji przez noc w 4 °C, a następnie przemyj trzy razy PBS. Roztwory przeciwciał wtórnych podawaj w perfuzji przez 1–2 hr i ponownie przemyj PBS w ten sam sposób.
    2. Wykonaj obrazy immunofluorescencyjne mikronaczyń in situ za pomocą mikroskopu konfokalnego z krokiem z wynoszącym 1 µm. Obrazuj mikronaczynia przy powiększeniu 4X, 10X lub 20X.
      Uwaga: Powiększenie 4X dostarczy informacji o globalnej strukturze sieci, natomiast obrazy powiększone 10X i 20X pozwolą na analizę szczegółów komórkowych, takich jak elongacja, tworzenie złączy itp.
    3. Stosy obrazów przeanalizuj w programie ImageJ, stosując projekcje Z (Image/Stacks/Z-project), przekroje poprzeczne (Image/Stacks/Orthogonal view) oraz rekonstrukcje 3D (Image/Stacks/3D Project).
  3. Obrazowanie za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej
    1. W celu analizy mikroskopowej w elektronach utrwal próbkę in situ, przeprowadzając przez noc perfuzję połowitym roztworem Karnovskiego (2% paraformaldehydu/2,5% glutaraldehydu w 0,2 M buforze kakodylanowym). Rozmontuj naczynie i ostrożnie rozdziel obie części. Przytnij krawędzie i całkowicie zanurz w roztworze utrwalającym na kilka dni.
    2. Zanurz grubszą, górną część naczynia w 25% glutaraldehydzie na 20 min i przepłucz trzy razy PBS (po 2 min każde płukanie). Odwodnij w kolejnych kąpielach etanolu o stężeniach 50%, 70%, 85% (po 2 min każda) oraz w dwóch kąpielach 100% etanolu (po 5 min każda).
    3. Przygotuj próbkę do analizy poprzez dalsze odwodnienie metodą suszenia w punkcie krytycznym zgodnie z protokołem producenta 40. Napyl złoto-palladem (7 nm) na naczynie i przeanalizuj pod skaningowym mikroskopem elektronowym przy napięciu przyspieszającym 5 kV i rozmiarze plamki 3.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Inżynieryjna platforma naczyniowa tworzy funkcjonalne mikro naczynia krwionośne osadzone w naturalnej macierzy kolagenu typu I i pozwala na ścisłą kontrolę środowiska komórkowego, biofizycznego i biochemicznego in vitro. Aby wytworzyć inżynieryjne mikronaczynia, ludzkie komórki endotelialne żyły pępowinowej (HUVECs) są przepływane przez osadzony w kolagenie układ mikrofluidyczny, gdzie przywierają, tworząc drożny światło naczynia i zlewne endotelium. Jak pokazano na Rysun...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Zmodyfikowane mikronaczynia są modelem in vitro , w którym cechy fizjologiczne, takie jak geometria światła, siły hydrodynamiczne i interakcje wielokomórkowe, są obecne i można je dostrajać. Ten typ platformy jest potężny, ponieważ oferuje możliwość modelowania i badania zachowania śródbłonka w różnych kontekstach, w których warunki hodowli in vitro można dopasować do warunków danego mikrośrodowiska. Na przykład wiadomo, że mechanizmy kierujące procesami śródbłonka, takie jak angiogeneza, zachodzą w róż...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Lynn and Mike Garvey Imaging Laboratory w Instytucie Komórek Macierzystych i Medycyny Regeneracyjnej oraz Washington Nanofabrication Facility na Uniwersytecie Waszyngtońskim. Doceniają również wsparcie finansowe w postaci grantów Narodowego Instytutu Zdrowia DP2DK102258 (dla YZ) oraz stypendiów szkoleniowych T32EB001650 (dla SSK i MAR) i T32HL007312 (dla MAR).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Produkcja wafli
AutoGlow Plasma SystemAutoGlow
Headway Spin CoaterHeadway Research, Inc Powlekarka wirowa PWM32 
ABM Contact AlignerAB-M
Profilometr krokowy alfaTencorAlpha Step 200
SU-8 DeveloperMicrochemY020100
SU-8 ResistMicrochemSU-8 2000
8-calowy wafel krzemowyWafer World Inc.
Stołowy generator mikrowzorówHeidelberg Instrumentsμ PG 101Do generowania fotomaski
Płyta grzejnaVWR97042-646
Alkohol izpropylowyAvantor Performance Materials9088
Szalki Petriego (120 x 120 mm, kwadratowe)Sigma-AldrichZ617679
Trichloro(3,3,3-trifluoropropylo)silanSigma-AldrichMKBG3805V
Elastomer na bazie polidimetylosiloksanu (PDMS) i utwardzaczDow CorningSylgard 184Mieszany w proporcji 10:1 (w/w)
Eksykator próżniowySigma-AldrichZ119024-1EA
PiekarnikVWR9120976
Produkcja i kultura urządzeń
TreaterProdukty elektrotechniczne, Inc.BD-20Ręczne urządzenie do obróbki plazmowej urządzeń PMMA i form PDMS
LutownicaWeller WTCPS Śruba
maszynowa z kratownicowym ze stali nierdzewnejMcMaster-Carr 91785A096
Kołki ustalające ze stali nierdzewnejMcMaster-Carr 93600A060
Pęseta Miltex24-572Można użyć dowolnej podobnej pęsety
Szpatułka (Micro Spoon)Usługi mikroskopii elektronowej62410-01
ŚrubokrętMożna użyć dowolnego płaskiego śrubokręta, autoklawowanego
Szkiełka nakrywkowe szklane (22 x 22 mm)Fisher Scientific12-542B
WybielaczClorox4460030966
szalki Petriego (150 x 25 mm)Corning430599
szalki Petriego (100 x 20 mm)Corning2909
Bawełna, pokrojona na kawałkiAutoklawowany
polietylenimin (PEI)Sigma-AldrichP3143Rozcieńczony do 1% w wodzie klasy do hodowli komórkowych
Aldehyd glutarowySigma-AldrichG6257Rozcieńczyć do 0,1% w wodzie
klasy hodowli komórkowejSterylny kolagen typu I typu 2OAutoklawizowany DI H2O
typu I, rozpuszczony w 0,1% kwasieWyizolowany z ogonów szczurów, jak opisano w Rajan et. al. 2006 (ref #37)
Strzykawka 1 mlBD309659
Strzykawka 10 mlBD309604
15 ml probówki stożkoweCorning352097
Probówki stożkowe 30 mlCorning352098
M199 10x Media Life Technologies11825-015
1 N NaOH (sterylne)Sigma-Aldrich415413Rozcieńczony do 1 N w wodzie klasy do hodowli komórkowych
HUVEC Lonza
Pożywka wzrostowa śródbłonkaLonzaCC-3124
TrypsynaCorning25-052-CI
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Thermofisher Scientific10082147
Dekstran z Leuconostoc spp. (70  kDa)Sigma-Aldrich31390
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)Corning21-031-CV
HemocytometrHausser Scientific Co.3200
Końcówki do napełniania żelemVWR37001-152
18 G igła do napełnianiaBD 305180
20 G Igła dozująca ze stali nierdzewnejMcMaster-Carr75165A123
Tygon 1/32 " ID, 3/32" OD Rurka silikonowaCole-ParmerEW-95702-00
1/16" Złączka rura-ruraMcMaster-Carr5116K165
90° Złącza kolankowe, rura-rurkaMcMaster-Carr5121K901
Złącze Luer Lock (żeńskie, 1/16" ID)McMaster-Carr51525K211
Kleszcze plastikowe, z uchwytami szczękowymiUsługi mikroskopii elektronowej72971
Podwójna pompa strzykawkowaAparat Harvard70-4505
5 ml Polistyrenowa rurka okrągłodennaFisher Scientific14-959-2A
Analiza urządzenia
FormaldehydeSigma-AldrichF8775
Albumina surowicy bydlęcejSigma-AldrichA8806-5G
Triton X-100Sigma-AldrichT-9284
Królik anty-hCD31Abcamab324571:25 rozcieńczenie robocze
Przeciwciało przeciw czynnikowi von Willebranda sprzężone FITCAbcamab88221:100 rozcieńczenie robocze
Kozioł przeciwciało anty-królicze 568 ThermofisherScientificA-110111:100 rozcieńczenie robocze
HoeschtThermofisher ScientificH1399Ponownie zawieszony w DMSO
Kakodylan sodu Sigma-AldrichC0250Do produkcji 0,2 M buforu kakodylowego
EtanolVWR InternationalBDH1164-4LP
40 kDa Dekstran sprzężony z FITCSigma-AldrichFD40S 
Dodatkowe odczynniki do hodowli 
CHIR-99021Selleck ChemS2924Małocząsteczkowy inhibitor GSK-3
Ludzki rekombinowany VEGFPeprotech100-20
Ludzki rekombinowany bFGFPeprotechAF-100-18B
poli(metakrylan metylu) (PMMA)PlexiPlexiCorona 1 cm x 3 cm octowym

Bibliografia

  1. Rubanyi, G. M. The role of endothelium in cardiovascular homeostasis and diseases. J. Cardiovasc. Pharmacol. 22, Suppl 4 37-44 (1993).
  2. van Hinsbergh, V. W. The endothelium: vascular control of haemostasis. Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 95 (2), 198-201 (2001).
  3. Chiu, J. -J., Chien, S. Effects of Disturbed Flow on Vascular Endothelium: Pathophysiological Basis and Clinical Perspectives. Physiol. Rev. 91, 327-387 (2011).
  4. Qi, Y., Jiang, J., et al. PDGF-BB and TGB-b1 on cross-talk between endothelial and smooth muscle cells in vascular remodeling induced by low shear stress. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 1908-1913 (2011).
  5. Sozzani, S., Del Prete, A., Bonecchi, R., Locati, M. Chemokines as effector and target molecules in vascular biology. Cardiovasc. Res. 107 (3), 364-372 (2015).
  6. Huh, D., Hamilton, G. A., Ingber, D. E. From 3D cell culture to organs-on-chips. Trends Cell Biol. 21 (12), 745-754 (2011).
  7. Staton, C. a, Reed, M. W. R., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. Int. J. Exp. Pathol. 90, 195-221 (2009).
  8. Greek, R., Menache, A. Systematic Reviews of Animal Models: Methodology versus Epistemology. Int. J. Med. Sci. 10, 206-221 (2013).
  9. Can Animal Models of Disease Reliably Inform Human Studies. PLoS Med. van der Worp, H. B., Howells, D. W., et al. 7 (3), e1000245(2010).
  10. Leong, X. -F., Ng, C. -Y., Jaarin, K. Animal Models in Cardiovascular Research: Hypertension and Atherosclerosis. Biomed Res. Int. 2015, 528757(2015).
  11. Pries, A. R., Secomb, T. W. Making Microvascular Networks Work: Angiogenesis, Remodeling, and Pruning. Physiology. 29, 446-455 (2014).
  12. D'Amore, P. Mechanisms Of Angiogenesis. Annu. Rev. Physiol. 49, 453-464 (1987).
  13. Geudens, I., Gerhardt, H. Coordinating cell behaviour during blood vessel formation. Development. 138, 4569-4583 (2011).
  14. Ribatti, D., Nico, B., Crivellato, E. The development of the vascular system: a historical overview. Methods Mol. Biol. 1214, 1-14 (2015).
  15. Ribatti, D., Nico, B., Crivellato, E. Morphological and molecular aspects of physiological vascular morphogenesis. Angiogenesis. 12 (2), 101-111 (2009).
  16. Bautch, V. L. VEGF-directed blood vessel patterning: From cells to organism. Cold Spring Harb. Perspect. Med. 2 (9), 1-12 (2012).
  17. Stratman, A. N., Schwindt, A. E., Malotte, K. M., Davis, G. E. Endothelial-derived PDGF-BB and HB-EGF coordinately regulate pericyte recruitment during vasculogenic tube assembly and stabilization. Blood. 116, 4720-4730 (2010).
  18. Bach, T. L., Barsigian, C., et al. VE-Cadherin mediates endothelial cell capillary tube formation in fibrin and collagen gels. Exp. Cell Res. 238 (238), 324-334 (1998).
  19. Kubow, K. E., Conrad, S. K., Horwitz, aR. Matrix microarchitecture and myosin II determine adhesion in 3D matrices. Curr. Biol. 23 (17), 1607-1619 (2013).
  20. Potapova, I. A., Gaudette, G. R., et al. Mesenchymal Stem Cells Support Migration, Extracellular Matrix Invasion, Proliferation, and Survival of Endothelial Cells In Vitro. Stem Cells. 25 (7), 1761-1768 (2007).
  21. Bayless, K. J., Davis, G. E. Sphingosine-1-phosphate markedly induces matrix metalloproteinase and integrin-dependent human endothelial cell invasion and lumen formation in three-dimensional collagen and fibrin matrices. Biochem. Biophys. Res. Commun. 312 (4), 903-913 (2003).
  22. Hellström, M., Gerhardt, H., et al. Lack of pericytes leads to endothelial hyperplasia and abnormal vascular morphogenesis. J. Cell Biol. 152 (3), 543-553 (2001).
  23. Tulloch, N. L., Muskheli, V., et al. Growth of Engineered Human Myocardium With Mechanical Loading and Vascular Coculture. Circ. Res. 109, 47-59 (2011).
  24. Davis, G. E., Saunders, W. B. Molecular balance of capillary tube formation versus regression in wound repair: role of matrix metalloproteinases and their inhibitors. J. Investig. dermatology Symp. 11 (1), 44-56 (2006).
  25. Kannan, R. Y., Salacinski, H. J., Butler, P. E., Hamilton, G., Seifalian, A. M. Current status of prosthetic bypass grafts: a review. J. Biomed. Mater. Res. B. Appl. Biomater. 74, 570-581 (2005).
  26. Nerem, R. M., Seliktar, D. Vascular Tissue Engineering. Annu. Rev. Biomed. Eng. 3 (1), 225-243 (2001).
  27. Melchiorri, A. J., Hibino, N., Fisher, J. P. Strategies and techniques to enhance the in situ endothelialization of small-diameter biodegradable polymeric vascular grafts. Tissue Eng. Part B. Rev. 19 (4), 292-307 (2013).
  28. Abbott, W. M., Callow, A., Moore, W., Rutherford, R., Veith, F., Weinberg, S. Evaluation and performance standards for arterial prostheses. J. Vasc. Surg. 17 (4), 746-756 (1993).
  29. Niklason, L. E. Functional Arteries Grown in Vitro. Science. 284 (5413), 489-493 (1999).
  30. Niklason, L., Counter, C. Blood vessels engineered from human cells - Authors' reply. Lancet. 366 (9489), 892-893 (2005).
  31. Zheng, Y., Chen, J., et al. In vitro microvessels for the study of angiogenesis and thrombosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 9342-9347 (2012).
  32. Zheng, Y., Chen, J., Lòpez, J. A. Flow-driven assembly of VWF fibres and webs in in vitro microvessels. Nat. Commun. 6, 7858(2015).
  33. Ligresti, G., Nagao, R. J., et al. A Novel Three-Dimensional Human Peritubular Microvascular System. J. Am. Soc. Nephrol. 27, (2015).
  34. Roberts, M. A., Tran, D., et al. Stromal cells in dense collagen promote cardiomyocyte and microvascular patterning in engineered human heart tissue. Tissue Eng. Part A. , (2016).
  35. Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nat. Protoc. 5 (3), 491-502 (2010).
  36. Alpha-Step 200 Manual. Tencor Instruments. , (1989).
  37. Rajan, N., Habermehl, J., Coté, M. -F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nat. Protoc. 1 (6), 2753-2758 (2006).
  38. Baudin, B., Bruneel, A., Bosselut, N., Vaubourdolle, M. A protocol for isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells. Nat. Protoc. 2 (3), 481-485 (2007).
  39. Leung, A. D., Wong, K. H. K., Tien, J. Plasma expanders stabilize human microvessels in microfluidic scaffolds. J. Biomed. Mater. Res. - Part A. 100 (7), 1815-1822 (2012).
  40. Tousimis SAMDRI-780 Critical Point Drying Apparatus. Tousimis Research Corporation. , (1987).
  41. Palpant, N. J., Pabon, L., et al. Inhibition of β-catenin signaling respecifies anterior-like endothelium into beating human cardiomyocytes. Development. 142 (18), 3198-3209 (2015).
  42. Gimbrone, M. a, Topper, J. N., Nagel, T., Anderson, K. R., Garcia-Cardena, G. Endothelial Dysfunction, Hemodynamic Forces, and Atherogenesis. Thromb. Haemost. 82, 722-726 (1999).
  43. Wu, M. H., Ustinova, E., Granger, H. J. Integrin binding to fibronectin and vitronectin maintains the barrier function of isolated porcine coronary venules. J. Physiol. 532 (3), 785-791 (2001).
  44. Ribatti, D., Nico, B., Vacca, A., Roncali, L., Dammacco, F. Endothelial cell heterogeneity and organ specificity. J. Hematother. Stem Cell Res. 11, 81-90 (2002).
  45. Shanks, N., Greek, R., Greek, J. Are animal models predictive for humans. Philos. Ethics. Humanit. Med. 4, 2(2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Sztucznie wytworzone naczynia krwiono newytwarzanie mikronaczyniihydro el kolagenowyzasiew kom rek r db onkaformowanie wtryskowemonta formy z PDMSmodel biologii naczyniowejrekrutacja kom rek oko onaczyniowychinterakcja krew r db onekbadanie odpowiedzi na przep yw
Mikrowzorowanie i montaż trójwymiarowych mikonaczyń
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.