Tworzenie i modelowanie hydrożeli za pośrednictwem światła do zastosowań w hodowlach komórkowych

Podsumowanie

Opisujemy sekwencyjny proces tworzenia za pośrednictwem światła i późniejszego biochemicznego wzorcowania syntetycznych matryc hydrożelowych do zastosowań w trójwymiarowych hodowlach komórkowych. Przedstawiono budowę i modyfikację hydrożeli za pomocą cytokompatybilnej chemii photoclick. Ponadto przedstawiono łatwe techniki ilościowego określania i obserwacji wzorców oraz określania żywotności komórek w tych hydrożelach.

Streszczenie

Kliknij chemia została zbadana pod kątem wykorzystania w licznych zastosowaniach biomateriałów, w tym w dostarczaniu leków, inżynierii tkankowej i hodowli komórek. W szczególności reakcje kliknięcia za pośrednictwem światła, takie jak fotoinicjowane reakcje tiolowo-enowe i tiolowo-ynowe, zapewniają czasoprzestrzenną kontrolę nad właściwościami materiału i umożliwiają projektowanie systemów o wysokim stopniu kontroli właściwości kierowanej przez użytkownika. Wytwarzanie i modyfikacja biomateriałów na bazie hydrożelu z wykorzystaniem precyzji zapewnianej przez światło i wszechstronności oferowanej przez te tiolowo-X chemikalia fotoklikowe cieszą się rosnącym zainteresowaniem, szczególnie w przypadku hodowli komórek w dobrze zdefiniowanych, biomimetycznych mikrośrodowiskach. W tym miejscu opisujemy metody fotoenkapsulacji komórek i późniejszego fotowzorcowania sygnałów biochemicznych w matrycach hydrożelowych przy użyciu wszechstronnych i modułowych bloków budulcowych polimeryzowanych w reakcji fotoklikania tiolowo-enowego. W szczególności przedstawiono podejście do konstruowania hydrożeli z funkcjonalizowanych alliloksykarbonylem (Alloc) wiązań peptydowych i ugrupowań peptydowych wisiorków oraz funkcjonalizowanego tiolem poli(glikolu etylenowego) (PEG), które szybko polimeryzują w obecności fotoinicjatora acylofosfinianu litu i cytokompatybilnych dawek światła ultrafioletowego (UV) o dużej długości fali. Opisano proste techniki wizualizacji fotowzorców i ilościowego określania stężenia dodanych peptydów. Ponadto opracowano metody kapsułkowania komórek, w szczególności ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych, oraz określania ich żywotności i aktywności. Podczas gdy tworzenie i początkowy wzór hydrożeli tiolowo-allokowych jest pokazany tutaj, techniki te mogą być szeroko stosowane do wielu innych systemów materiałowych inicjowanych światłem i rodnikami (np. tiol-norbornen, tiol-akrylan w celu wytworzenia wzorzystych substratów.

Wprowadzenie

Kliknij chemia jest coraz częściej wykorzystywana w projektowaniu materiałów do licznych zastosowań biomedycznych, w tym dostarczania leków, inżynierii tkankowej i kontrolowanych hodowli komórkowych, dzięki ich selektywnym, wydajnym i często cytokompatybilnym reaktywnościom. ^1-3 Chemia Photoclick, która wykorzystuje światło do wywoływania lub inicjowania reakcji (np. azydek-alkin,4 tiol-en,5 i tetrazol-alken⁶) są szczególnie interesujące dla tworzenia lub modyfikacji biomateriałów. Szybkie tempo w łagodnych warunkach i kontrola czasu i miejsca ich zachodzenia za pomocą światła sprawiają, że reakcje te dobrze nadają się do kierowanej przez użytkownika kontroli właściwości biomateriałów w obecności komórek. ^7,8 W szczególności tiolowo-enerowe metody chemiczne typu photoclick wykorzystano do wytworzenia biomateriałów na bazie hydrożelu o solidnych właściwościach mechanicznych^5,9 oraz do enkapsulacji wielu różnych typów komórek, w tym między innymi ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych (hMSC), fibroblastów, chondrocytów i komórek trzustki, które dają nadzieję na hodowlę i dostarczanie komórek. ^10,11 Co więcej, te chemikalia zostały wykorzystane do przestrzennego wzorcowania sygnałów biochemicznych w celu naśladowania kluczowych aspektów natywnych mikrośrodowisk komórkowych i ułatwiania odpowiednich interakcji komórka-macierz, w tym adhezji, różnicowania i inwazji. ^3,12

Do budowy hydrożeli tiolowo-enowych ze światłem, peptydy zawierające cysteiny (tiol) są zwykle reagowane z polimerami funkcjonalizowanymi akrylanami lub norbornenami ("ene") w celu szybkiej, fotoinicjowanej polimeryzacji w warunkach cytokompatybilnych. ¹³ Rozszerzając ten zestaw narzędzi, staraliśmy się ustalić metody tworzenia hydrożelu z nowymi, wszechstronnymi i dostępnymi blokami budulcowymi, które wymagały minimalnego przetwarzania syntetycznego lub były dostępne na rynku w celu ich szerokiego zastosowania jako syntetyczne matryce zewnątrzkomórkowe. ¹⁴ W szczególności peptydy zmodyfikowano lizynami chronionymi alliloksykarbonylem (Alloc): jeden dla wiszących grup wiążących integryny w celu promowania adhezji komórek [K(alloc)GWGRGDS = Pep1Alloc] lub dwa dla niedegradowalnych lub degradowalnych przez komórki usieciowań [K(alloc)RGKGRKGK(alloc)G lub KK(alloc)GGPQGIWGQGK(alloc)K = Pep2Alloc, odpowiednio]. Dzięki tym sekwencjom stworzono warunki do szybkiej reakcji (1-5 min) z czteroramiennym poli(glikolem etylenowo-etylowym) modyfikowanym tiolem (PEG4SH) przy użyciu cytozgodnych dawek światła UV o dużej długości fali (10 mW/^cm2 przy 365 nm) i fotoinicjatora fenylo-2,4,6-trimetylobenzoilofosfinianu litu (LAP). Otrzymane hydrożele były stabilne w warunkach hodowli komórkowej przez wiele tygodni. Aby umożliwić degradację i przebudowę sterowaną komórkami, enzymatycznie rozszczepialny peptyd został włączony do wiązań krzyżowych żelu (tj. GPQGIWGQ),¹⁵ a modelowa komórka pierwotna, ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste (hMSC), pozostały wysoce żywotne po enkapsulacji i podczas hodowli w tych matrycach. Co więcej, peptydy zostały przestrzennie ukształtowane w tych materiałach, a hMSC pozostają żywotne i metabolicznie aktywne w warunkach fotowzorcowania. Alternatywne sekwencje peptydowe wisiorka, nie pokazane tutaj (np. IKVAV, YIGSR, GFOGER itp.), mogą być również włączone do matryc w celu zbadania dodatkowych interakcji komórek z otaczającym mikrośrodowiskiem. Wyniki te są obiecujące dla zastosowania tych materiałów na bazie hydrożelu do trójwymiarowej (3D) hodowli i dostarczania komórek w celu badania i kierowania interakcjami komórka-macierz dla różnych typów komórek.

Tutaj przedstawiono metody fotoenkapsulacji komórek, a następnie fotowzorce biochemiczne w proponowanym systemie hydrożelowym (Rysunek 1). Przedstawiono również techniki obserwacji i ilościowego oznaczania tych fotowzorców: w szczególności i) ilościowe i jakościowe zastosowanie testu Ellmana do określenia modyfikacji wolnych tioli w substratach wzorcowych oraz ii) uzupełniające jakościowe zastosowanie peptydów fluorescencyjnych (AF488Pep1Alloc) do obserwacji tych wzorów w trzech wymiarach. Ponadto przedstawiono testy mające na celu określenie żywotności (barwienie żywe/martwe/cytotoksyczne) i aktywności metabolicznej (MTS; 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ylo)-5-(3-karboksymetoksyfenylo)-2-(4-sulfofenylo)-2H-tetrazolium), aby użytkownicy mogli określić cytokompatybilność warunków fotoenkapsulacji i fotowzorcowania dla różnych linii komórkowych w matrycach hydrożelowych. Podczas gdy protokół został zademonstrowany dla łatwego systemu hydrożelowego photoclick opartego na świetle, techniki te mogą być stosowane do wielu innych radykalnie inicjowanych systemów hydrożelowych do fotoenkapsulacji i fotomodelowania w obecności komórek.

Protokół

1. Przygotowanie materiałów do tworzenia hydrożelu

1. Synteza wisiorka (Pep1Alloc, AF488Pep1Alloc) i peptydów sieciujących (Pep2Alloc) za pomocą standardowych technik syntezy peptydów w fazie stałej (SPPS) i polimeru funkcjonalizowanego tiolem w trzyetapowej procedurze modyfikacji grupy końcowej (PEG4SH). ^14,16 Alternatywnie należy zakupić PEG4SH (M_n ~ 20 kDa), Pep1Alloc i Pep2Alloc na rynku.
2. Zsyntetyzuj fotoinicjator (LAP) w dwuetapowej reakcji opisanej poniżej. ^14,17 Wykonać etapy syntezy (1.2.1-1.2.11) w dygestorium i zachować ostrożność podczas obchodzenia się z chemikaliami (nosić rękawice ochronne, odzież i okulary). LAP można również kupić komercyjnie.
   1. Wysuszyć wszystkie szklane naczynia w piekarniku (>2 godz., 80 °C).
   2. Dodać mieszadło do pustej kolby okrągłodennej z pojedynczą szyjką (100 ml) i przykryć przegrodą.
   3. Zabezpiecz kolbę na magnetycznej płycie grzejnej do mieszania za pomocą pierścieniowego stojaka i zacisku.
   4. Wprowadzić igłę (18 G) przez przegrodę i pozostawić zewnętrzny koniec otwarty na atmosferę. Włóż drugą igłę przymocowaną do przewodu gazu obojętnego. Otworzyć przewód gazu obojętnego (np. argonu lub azotu) i przepłukać kolbę przez 10-15 min.
      UWAGA: System będzie stale przedmuchiwany gazem obojętnym, argonem lub azotem przez cały czas trwania reakcji.
   5. Przenieść 1,5 g (~1,4 ml) dimetylofenylofosfonianu (UWAGA) do kolby, używając strzykawki z igłą do przebicia przegrody. Włączyć płytkę mieszającą (średnia prędkość) i uważać, aby zawartość nie rozprysnęła się na ścianki kolby.
   6. Dodać kroplami 1,6 g (~1,46 ml) chlorku 2,4,6-trimetylobenzoilu (UWAGA) do kolby zawierającej dimetylofenylofosfonit, używając strzykawki z igłą do przekłucia przegrody.
   7. Przykryj naczynie reakcyjne folią w celu ochrony przed światłem i mieszaj przez 18 godzin pod argonem lub azotem.
   8. Następnego dnia należy podnieść wysokość kolby, umieścić kąpiel olejową na mieszadle i ostrożnie opuścić kolbę do łaźni olejowej. Podgrzać łaźnię i kolbę do temperatury 50 °C, utrzymując mieszanie magnetyczne.
   9. Rozpuścić 3,05 g bromku litu w 50 ml 2-butanonu. Wyjąć kolbę z łaźni olejowej i dodać roztwór bromku litu do kolby okrągłodennej, na krótko usuwając przegrodę i wlewając ją do kolby.
      1. Ponownie uszczelnić kolbę z przegrodą (UWAGA: Przegroda nadal będzie miała igłę prowadzącą do przewodów argonowych i igłę do odpowietrzania), opuścić kolbę z powrotem do podgrzanej kąpieli olejowej i pozostawić reakcję do 10 minut. Utworzy się stały osad.
   10. Po 10 minutach wyłączyć argon, zdjąć kolbę z ognia i pozostawić mieszaninę na 4 godziny (przykrytą folią w celu ochrony przed światłem, ponieważ wyprodukowano światłoczuły inicjator. Trzymaj igłę odpowietrzającą w miejscu.
   11. Wlać produkt do lejka do fryty szklanej lub lejka wyłożonego odpowiednią bibułą filtracyjną. Przepłukać filtrat 3 razy 50 ml 2-butanonu w celu usunięcia nieprzereagowanego bromku litu.
   12. Wysuszyć (najpierw na stole, a następnie w eksykatorze próżniowym) i przeanalizować produkt za pomocą ¹H NMR w D₂O. Charakterystyczne piki przy 1,8-1,9 (6 godzin, s), 2,1-2,2 (3 godziny, s), 6,7-6,8 (2 godziny, s), 7,3-7,4 (2 godziny, m), 7,4-7,5 (1 godzina, m) i 7,5-7,7 (2 godziny, m). ^{Pytania z dnia 14,17}
   na dzień
3. Użyj arkusza kalkulacyjnego, aby obliczyć objętość i stężenie każdego roztworu podstawowego (PEG4SH, Pep1Alloc, Pep2Alloc, LAP), który musi być przygotowany do wytworzenia hydrożeli (Tabela 1). Aby wytworzyć żele bez wzoru, upewnij się, że [SH] = [Alloc], aby wszystkie grupy reaktywne zostały zużyte podczas polimeryzacji. Jeśli planowane jest fotowzorcowanie żeli, należy uwzględnić nadmiar tiolowych grup funkcyjnych podczas tworzenia żelu na podstawie stechiometrii (np. 0,2-5 mM, [SH] >[Alloc]) do późniejszej reakcji z Pep1Alloc.
   UWAGA: Żele powinny zawierać więcej niż 5 procent wagowych (wag.) PEG4SH, aby zapewnić szybką polimeryzację (w ciągu 5 minut). Można jednak badać niższe zakresy wag., jeśli zastosowanie wymaga hydrożeli o niższych modułach (>np. <0,5 kPa); Polimeryzacja powinna być sprawdzona i odpowiednio dostosowana do tych kompozycji o niskiej zawartości wagowej. Podobnie, stężenie Pep1Alloc można dostosować do różnych zastosowań (np. 0,2-5 mM), jak podano w literaturze dla peptydów funkcjonalizowanych tiolem. Zaleca się stężenie ^18-21 LAP około 0,067% wag. (2,2 mM) lub mniej, zgodnie z opisem, ponieważ wyższe stężenia mogą zmniejszyć żywotność komórek.
4. Przygotować roztwory podstawowe Pep1Alloc, Pep2Alloc, PEG4SH i LAP w sterylnych warunkach do hodowli komórkowej na podstawie obliczeń w Tabeli 1.
   1. W przypadku Pep1Alloc i Pep2Alloc należy indywidualnie zważyć całkowitą masę Pep1Alloc i Pep2Alloc z syntezy peptydów i rozpuścić w sterylnym roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanem (PBS) zawierającym 1% penicyliny/streptomycyny (PS) i 0,5 μg/ml fungizonu (FZ). Typowe stężenia przygotowanych roztworów podstawowych wahają się od 20-100 mg/ml peptydu. Wymieszaj te materiały, aby uzyskać żele o końcowych modułach odpowiednich do zastosowań w tkankach miękkich (moduł Younga ~ 0,5-5 kPa). ^22,23 Podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu użycia.
   2. W przypadku PEG4SH należy zważyć PEG4SH do sterylnej probówki mikrowirówkowej i rozpuścić w PBS+PS+FZ. Typowe stężenia tego roztworu podstawowego wahają się od 250-430 mg/ml (20-30% wagowo PEG4SH).
   3. W przypadku LAP zważyć LAP do sterylnej probówki mikrowirówkowej i rozpuścić w PBS+PS+FZ do końcowego stężenia 7,5 mg/ml.
      UWAGA: Przygotowanie świeżych roztworów PEG4SH i LAP jest zalecane dla każdego eksperymentu z kapsułkowaniem lub żelem, aby zapewnić stałe czasy polimeryzacji.
5. Przygotuj sterylne formy do końcówek strzykawek do formowania hydrożeli.
   1. Ostrożnie odciąć końcówki strzykawek o pojemności 1 ml za pomocą żyletki, a następnie usunąć tłoki z trzonków strzykawki.
   2. Zanurz trzony strzykawki i tłoki w 70% etanolu na 15 minut i umieść w sterylnym kapturze do hodowli komórkowych do wyschnięcia (30 min). Jeśli nadmiar kropli etanolu pozostanie w trzonie strzykawki, użyj tłoka, aby je wypchnąć.
6. Przygotuj sterylne szklane formy do szkiełek do formowania hydrożeli.
   1. Namocz szkiełka podstawowe (wielokrotność liczby 2) i gumowe uszczelki (o grubości 0,254 mm; 2 małe kawałki używane jako podkładki, prostokąt z wyciętymi krążkami lub kwadratową ramę) w 70% etanolu na 15 minut i umieść w sterylnym kapturze do hodowli komórkowych do wyschnięcia.
   2. Połowę wysterylizowanych szkiełek należy pokryć powłoką antyadhezyjną zgodnie ze wskazówkami producenta, aby zapobiec przywieraniu górnej części żelu do powierzchni szkiełka (np. jeśli są 4 szkiełka, 2 szkiełka zostaną pokryte antyadhezyjnym). Będą one służyć jako górna część formy do szkiełka.
7. Skalibruj lampę do strzykawek lub szklanych form szkiełkowych.
   UWAGA: Do tych eksperymentów użyto rtęciowej lampy łukowej z zewnętrznym zespołem adaptera filtra i zewnętrznym filtrem 365 nm. Inne lampy, które wytwarzają odpowiednie natężenia światła UV o dużej długości fali, mogą być używane zgodnie z raportami innych. ^24-27
   1. Przymocuj soczewkę kolimacyjną do końca światłowodu wypełnionego cieczą, aby zapewnić stosunkowo równomierne natężenie światła we wszystkich próbkach. W razie potrzeby dostosuj odległość światłowodu od próbki (próbek), aby uzyskać rozmiar plamki, który pokryje próbki będące przedmiotem zainteresowania.
   2. Umieść wyciętą formę strzykawki w uchwycie probówki do mikrowirówki (aby utrzymać formę strzykawki w pozycji pionowej). Trzymać radiometr na wysokości końcówki strzykawki, na której będą trzymane próbki, i wyregulować migawkę (% otwarcia), aby uzyskać natężenie światła 10 mW/^cm2 przy długości fali 365 nm. Zapisz dostosowane ustawienia do późniejszego wykorzystania.
   3. Umieść szklaną formę szkiełkową na sterylnej powierzchni (np. na górze pudełka z końcówkami do pipet w komorze bezpieczeństwa biologicznego). Przytrzymaj detektor radiometryczny na wysokości szklanej formy szkiełkowej i wyreguluj migawkę (% otwartą), aby uzyskać natężenie światła 10 mW/^cm2 przy 365 nm. Zapisz dostosowane ustawienia do późniejszego wykorzystania.

2. Tworzenie hydrożelu i fotowzorce

1. Przygotowanie hydrożeli niewzorzystych.
   UWAGA: W tym momencie protokołu, jeśli hydrożele mają być używane w zastosowaniach związanych z hodowlą komórkową, wszystkie kolejne etapy powinny być wykonywane w sterylnych warunkach w sterylnej komorze lub kapturze.
   1. Wymieszaj roztwory podstawowe PEG4SH, Pep2Alloc, Pep1Alloc, LAP i PBS+PS+FZ zgodnie z obliczeniami w arkuszu kalkulacyjnym (patrz przykład w tabeli 1). Energicznie odpipetować otrzymany roztwór prekursora żelu, aby zapewnić równomierne wymieszanie roztworu.
   2. Przygotować gęste hydrożele uformowane w końcówkach strzykawek, pipetując 10-20 μl roztworu prekursora żelu (PEG/Pep/LAP/PBS) do końcówki sterylnej, wyciętej strzykawki. Przygotować pojedynczy żel na strzykawkę o grubości około 0,5-1,5 mm w zależności od objętości i średnicy strzykawki.
      UWAGA: Większe objętości mogą być badane w oparciu o pożądany rozmiar żelu, gdzie mogą istnieć górne granice oparte na ograniczeniach dyfuzyjnych dla Pep1Alloc podczas fotowzorcowania i/lub składników odżywczych/odpadów do/z zamkniętych komórek podczas hodowli komórkowej.
   3. Przygotuj cienkie hydrożele w szklanych formach szkiełkowych, umieszczając gumową uszczelkę (o grubości 0,254 mm) wokół krawędzi niepowlekanego szkiełka podstawowego. Odpipetować 5-10 μl roztworu prekursora żelu (pojedyncze lub wielokrotne żele 5-10 μl można otrzymać przez pipetowanie jednej lub więcej kropek roztworu na jedno szkiełko) na szkiełko podstawowe bez powłoki i umieścić szkiełko pokryte środkiem antyadhezyjnym na wierzchu roztworu żelu (większe żele, do wielkości szkiełka podstawowego, mogą być wykonane w zależności od końcowego zastosowania). Zabezpiecz szkiełka małymi klipsami do segregatorów, aby je ustabilizować.
   4. Umieść formy pod lampą i ustaw intensywność lampy (np. % otwarcia migawki) tak, aby osiągnąć 10 mW/^cm2 na powierzchni żelu w przypadku form z końcówką strzykawki lub szklanych form do szkiełek w oparciu o pomiary odpowiednio w kroku 1.7.2 i 1.7.3.
   5. Stosować światło przez 1 do 5 minut, aby umożliwić całkowitą polimeryzację żeli. Krótszy czas polimeryzacji należy stosować w przypadku żeli o wyższej zawartości PEG4SH (8% wag. lub więcej, 1 min) i dłuższy w przypadku żeli o niższej zawartości PEG4SH (5-8 % wag., 3-5 min) w celu wytworzenia w pełni spolimeryzowanych hydrożeli o modułach w zakresie tkanek miękkich (0,5-5 kPa).
   6. Umieść żele z form do końcówek strzykawek w sterylnej, niepoddanej obróbce 48-dołkowej płytce i umieść szklane szkiełka w sterylnym naczyniu.
   7. Przepłukać 3 x 15 min pożywką do hodowli komórkowych lub odpowiednim buforem (np. PBS+PS+FZ, buforem reakcyjnym Ellmana) w oparciu o zaplanowane eksperymenty, jak opisano poniżej.
2. Przygotowanie wzorzystych hydrożeli.
   1. Wymieszać roztwory podstawowe PEG4SH, Pep2Alloc, LAP i PBS+PS+FZ zgodnie z obliczeniami arkusza kalkulacyjnego, pozostawiając wolne tiole (0,2-5 mM) do późniejszej reakcji z Pep1Alloc. Energicznie odpipetować roztwór prekursora, aby zapewnić równomierne wymieszanie roztworu.
   2. Przygotować grube i cienkie hydrożele zgodnie z krokami od 2.1.2 do 2.1.6.
      UWAGA: Nie umieszczaj żeli w podłożu wzrostowym przed fotomodelowaniem. Wolne tiole mogą być spożywane przez gatunki w pożywce wzrostowej (np. tworzenie dwusiarczków z białkami zawierającymi tiole) i nie pozwolą na modelowanie żelu bez dodatkowych etapów przetwarzania (np. redukcji wiązań dwusiarczkowych).
   3. Przygotować roztwory Pep1Alloc (stężenie końcowe ~3-20 mg/ml) i 2,2 mM LAP.
   4. Przykryć wstępnie uformowane żele roztworem Pep1Alloc/LAP i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
   5. Usunąć nadmiar roztworu Pep1Alloc/LAP. Jeśli żele zostały uformowane w końcówce strzykawki, użyj szpatułki, aby ostrożnie przenieść żele z 48-dołkowej płytki, w której są inkubowane, do sterylnego szkiełka w celu wykonania wzoru.
   6. Umieść fotomaskę z żądanym wzorem bezpośrednio na żelach formowanych strzykawką i szkiełkiem. Upewnij się, że wydrukowana część maski dotyka żelu, aby zapewnić optymalną wierność wzoru (tj. maska powinna być odczytana w prawo i być emulsją skierowaną w dół). Umieścić próbki pod lampą i naświetlać przez 1 minutę ustawieniami lampy stosowanymi dla szkiełek podstawowych (etap 1.7.3).
   7. Po wykonaniu wzoru umieść żele formowane strzykawką na sterylnej, 48-dołkowej płytce niepoddanej hodowli tkankowej, a żele formowane szklanym szkiełkiem, które są przyklejone do szkiełek szkiełkowych, umieść w sterylnym naczyniu.
   8. Przepłukać 3 x 15 min pożywką do hodowli komórkowych lub odpowiednim buforem (np. PBS+PS+FZ, buforem reakcyjnym Ellmana) w oparciu o zaplanowane eksperymenty.

3. Wizualizacja i kwantyfikacja fotowzorców

1. Test Ellmana do wykrywania i ilościowego oznaczania wolnych tioli w hydrożelach fotowzorzystych.
   1. Przygotuj bufor reakcyjny Ellmana, roztwór roboczy cysteiny, wzorce i odczynnik Ellmana, jak opisano poniżej.
      1. W przypadku buforu reakcyjnego Ellmana rozpuścić 2,4 g dwuzasadowego fosforanu sodu (Na₂HPO₄) i 74,4 mg kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) w 200 ml dIH₂O (0,1 M Na₂HPO₄, 1 mM EDTA). Doprowadzić pH do 7,5-8 roztworami wodorotlenku sodu (NaOH) lub kwasu fosforowego (_H3PO4).
      2. Aby uzyskać roztwór roboczy cysteiny, rozpuść 5,27 mg cysteiny w 15 ml buforu reakcyjnego (2 mM cysteiny).
      3. W przypadku wzorców cysteiny rozcieńczyć roztwór roboczy cysteiny w buforze reakcyjnym do końcowego stężenia 2, 1,5, 1,25, 1, 0,75, 0,5, 0,25 i 0 mM cysteiny.
      4. W przypadku odczynnika Ellmana rozpuścić 4 mg odczynnika Ellmana w 1 ml buforu reakcyjnego. Sonicate, aby całkowicie rozpuścić odczynnik Ellmana.
   2. Określić ilościowo stężenie wolnych tioli w żelach za pomocą testu Ellmana (rysunek 2).
      UWAGA: "Cienkie" hydrożele o pojemności 5 μl, formowane między szkiełkami podstawowymi, są opisane w poniższej procedurze i zalecane, aby umożliwić szybką dyfuzję odczynnika Ellmana przez żel (tj. dyfuzja odczynnika przez gęste żele zajmuje więcej czasu).
      1. Określić objętość spęczniejącego żelu w "cienkich" żelach o objętości 5 μl (V_S) na podstawie współczynnika objętościowego pęcznienia, Q.
         1. Przygotuj trzy "gęste" żele o objętości 20 μl za pomocą foremek do strzykawek. Umieść żele w buforze reakcyjnym Ellmana na 24 godziny, a następnie zważ (równowagowa spuchnięta_masa, MS). Liofilizować żele, a następnie zważyć (sucha masa, MD).
         2. Korzystając ze zmierzonych mas dla gęstych żeli, oblicz wolumetryczny współczynnik pęcznienia²⁸ według Q = 1 + ρ_polimer/ρ_{rozpuszczalnik} (M_S/M_D-1), gdzie ρ_polimer = 1,07 g/cm³ dla PEG, ²⁹ ρ_{rozpuszczalnik} = 1,0 g/cm³ dla PBS/H₂O.
         3. Obliczyć teoretyczną suchą masę żelu, który ma być użyty do testu Ellmana (tutaj zwykle stosuje się 5 μl "cienkich" żeli), sumując masy poszczególnych składników PEG4SH, Pep1Alloc i Pep2Alloc (M_D = M_PEG4SH + M_Pep1Alloc + M_Pep2Alloc). Na przykład żel o pojemności 5 μl zawierający 10% wag. PEG4SH zawiera około 0,000535 g PEG w przeliczeniu na wzór M_PEG4SH = 0,005 cm³ x 1,07 g/cm³ x 0,10. Masy Pep1Alloc i Pep2Alloc można obliczyć w podobny sposób na podstawie % wagowych w roztworze (wartości znajdują się w arkuszu kalkulacyjnym), przyjmując ρ ≈ 1,0 g/^cm3 dla tych roztworów wodnych.
            UWAGA: Żele mogą być również suszone i ważone zamiast obliczania teoretycznej suchej masy. Konsekwentny pomiar suchej masy cienkich żeli o pojemności 5 μl może być jednak trudny.
         4. Na podstawie przewidywanej suchej masy i wartości Q wyznaczonej dla "gęstych" żeli należy obliczyć przewidywaną masę spuchniętego_M.S dla "cienkiego" żelu (równanie w kroku 3.1.2.1.1). Załóżmy, że ρ ≈ 1,0 g/cm³, a następnie_{M S} ≈ V_S. Użyj tego_{obliczonego V S}, aby przeprowadzić ilościowy test Ellmana.
            UWAGA: Powyższa metoda jest zalecana do oznaczania V_s dla spuchniętych żeli, ponieważ "cienkie" żele o objętości 5 μl są trudne do przeniesienia w celu ważenia.
      2. Utworzyć cienkie hydrożele do modelowania zgodnie z opisem w sekcji 2.2 (objętość 5 μl). W szczególności należy sporządzić żele z nadmiarem wolnych tioli i "uformować" połowę tych próbek za pomocą Pep1Alloc za pomocą przezroczystego szkiełka nakrywkowego, aby zalać cały żel światłem (np. łącznie 6 żeli z nadmiarem tiolu: 3 niemodyfikowane nie"wzorzyste" i 3 "wzorzyste").
         UWAGA: W tym teście "wzorzyste" żele są wystawiane na działanie światła bez fotomaski. Metodę tę stosuje się w celu określenia całkowitej liczby wolnych tioli zużytych w całej próbce żelu oraz w celu wykazania, jak skutecznie wolne tiole mogą być modyfikowane peptydem. Na podstawie tych informacji można przewidzieć liczbę wolnych tioli zużytych podczas modelowania za pomocą fotomaski na podstawie grubości żelu i obszaru wzoru (obszary wystawione na działanie światła).
      3. Umieścić "wzorzyste" i nie"wzorzyste" żele w studzienkach 48-dołkowej płytki i przepłukać 3 x 15 minut buforem reakcyjnym Ellmana, aby umożliwić dyfuzję nieprzereagowanych gatunków z żelu i wystąpienie pęcznienia równowagowego.
      4. Dodać dodatkowy bufor reakcyjny Ellmana do wypłukanych żeli, tak aby V_s z buforem reakcyjnym było wielokrotnością 20 μl. Na przykład, jeśli przewidywane V_S wynosi 15 μl, dodaj 5 μl buforu reakcyjnego (20 μl), a jeśli przewidywane V_S wynosi 30 μl, dodaj 10 μl buforu reakcyjnego (40 μl).
      5. Odpipetować wzorce cysteiny do indywidualnych studzienek (niezawierających żeli) na 96-dołkowej płytce w wielokrotnościach 20 μl, w zależności od objętości użytej w poprzednim etapie (tj. jeśli w poprzednim etapie było V_S + dodatkowy bufor reakcyjny = 40 μl, dodać 40 μl każdego wzorca do poszczególnych pustych studzienek).
      6. Rozcieńczyć odczynnik Ellmana w buforze reakcyjnym (wielokrotność 180 μl buforu reakcyjnego + 3,6 μl odczynnika Ellmana; Np. 183,6 dla 20 μl lub 367,2 μl dla 40 μl w kroku 3.1.2.5).
      7. Dodać rozcieńczony odczynnik Ellmana do studzienek zawierających wzorce i próbki. W przypadku próbek o objętości 20 μl do każdej studzienki dodać 183,6 μl roztworu. Podwojenie tej ilości rozcieńczonego odczynnika Ellmana dla próbek o objętości 40 μl (lub odpowiednie przeskalowanie w zależności od wielkości próbki).
      8. Inkubować lub umieszczać na wytrząsarce przez 1 godzinę i 30 minut (w temperaturze pokojowej) lub do momentu, gdy kolor roztworu zrówna się z kolorem żeli poprzez oględziny w celu zapewnienia wystarczającej dyfuzji żółtego dianionu 2-nitro-5-tiobenzoesanu (TNB^2-), który powstaje w wyniku reakcji odczynnika Ellmana z wolnymi tiolami, z żelu.
      9. Pobrać 100 μl roztworu z próbek i wzorców i umieścić w studzienkach na 96-dołkowej płytce.
      10. Odczyt absorbancji przy 405 nm na czytniku płytkowym.
      11. Aby przetworzyć dane, należy wykreślić krzywą wzorcową (próbki z kroku 3.1.1.3) (absorbancja w stosunku do stężenia) i dopasować funkcję liniową. Korzystając z funkcji liniowej, stężenie wolnych tioli w roztworze "rozcieńczonego żelu" (żel + bufor reakcyjny) można obliczyć na podstawie odczytów absorbancji. Na koniec, biorąc pod uwagę "rozcieńczenie" buforem reakcyjnym, należy oznaczyć stężenie wolnego tiolu w żelach bez buforu reakcyjnego. (Np. jeśli 15 μl żelu rozcieńczono 5 μl buforu reakcyjnego, pomnożyć przez 20/15).
   3. Wizualizacja fotowzorów za pomocą odczynnika Ellmana (ryc. 3A).
      1. Namocz cienkie hydrożele z wzorem Pep1Alloc w buforze reakcyjnym Ellmana przez 1 godzinę.
      2. Usunąć nadmiar buforu reakcyjnego, delikatnie przecierając krawędzie hydrożelu chusteczką.
      3. Odczynnik Ellmana należy odpipetować bezpośrednio na powierzchnię żelu. Natychmiastowy obraz na mikroskopie świetlnym 10X lub mikroskopie stereoskopowym za pomocą kolorowej kamery.
         Uwaga: Żele muszą być obrazowane natychmiast, ponieważ wzorce wizualizacji znikną w ciągu 5 minut, ponieważ żółty jon^{TNB 2-} wytwarzany przez rozszczepienie odczynnika Ellmana w reakcji z tiolami w obszarze bez wzoru dyfunduje po żelu. Obszary bez wzoru wydają się lekko żółte gołym okiem; Aby uzyskać lepszą rozdzielczość i mniejsze wzory, wymagane jest powiększenie (np. użycie mikroskopu).
2. Wizualizacja fotowzorów za pomocą peptydów fluorescencyjnych (ryc. 3B).
   1. Aby uwidocznić wzory o wyższej rozdzielczości lub w trzech wymiarach, należy wykonać fotowzór zmodyfikowanego przez AF488 Pep1Alloc (lub podobnego peptydu fluorescencyjnego) do żeli w kroku 2.2.
   2. Obraz pod mikroskopem fluorescencyjnym. Mikroskop konfokalny może być tutaj użyty do wykonania obrazów żelu w stosie z, tak aby wzór można było zaobserwować w płaszczyznach x, y i z.
      UWAGA: W przypadku fluorescencji żele muszą być chronione przed światłem, aby zapewnić stabilność fluoroforu AF488 i maksymalną fluorescencję. Żele nie muszą być natychmiast obrazowane, ponieważ peptyd fluorescencyjny jest dość stabilny, jeśli jest chroniony przed światłem (przechowywać w pojemniku owiniętym folią w temperaturze 4 °C).

4. Enkapsulacja komórek w hydrożelach i fotowzorcach

1. Pobieranie i przygotowanie komórek do enkapsulacji.
   1. Postępując zgodnie ze standardowymi sterylnymi procedurami hodowli komórek ssaków, trypsynizuj i zbieraj interesujące komórki z płytek. Zgasić trypsynę pożywką wzrostową po odłączeniu (np. dla kolby T-75, 5 ml trypsyny, zalać 5 ml pożywki, przepłukać płytkę 5 ml pożywki, aby uzyskać łącznie 15 ml).
      UWAGA: Czas trypsynizacji może się różnić w zależności od typu komórek, ale zwykle występuje od 5 do 15 minut. W razie potrzeby do pobierania komórek można użyć alternatywnych środków odłączających komórki (np. Versene).
   2. Policz komórki (co najmniej 100 lub zgodnie z protokołem producenta) z podwielokrotności trypsynizowanej zawiesiny komórek za pomocą hemocytometru lub innego urządzenia do liczenia komórek podczas wirowania zawiesiny komórek masowych (90-110 x g, 5 min). Ponownie zawiesić osad komórkowy po odwirowaniu w minimalnej objętości PBS lub pożywki wzrostowej i ponownie policzyć, jeśli początkowa zawiesina komórek trypsynizowanych jest zbyt rozcieńczona.
   3. Ponownie zawiesić komórki w minimalnej objętości PBS i porcjach podwielokrotnych dla każdego stanu żelu w probówkach mikrowirówek, tak aby po zmieszaniu z roztworem żelu (przed polimeryzacją) pozostało 5 000 komórek/μl.
      UWAGA: Typowe porcje komórek zawierają 300 000-500 000 komórek i wystarczają do wytworzenia 60-100 μl zawiesiny żel/komórka, którą można wykorzystać do żeli 3-5 x 20 μl z 5 000 komórek/μl. Do enkapsulacji można stosować wyższe lub niższe gęstości komórek, w zależności od pożądanej ilości kontaktu komórka-komórka i komórka-matryca, i należy je określić dla każdego zastosowania.
   4. Porcje komory wirówkowej/PBS (90-110 x g, 5 min).
   5. Ostrożnie odessać PBS z osadu komórkowego w probówce do mikrowirówki tuż przed enkapsulacją.
      UWAGA: Jeśli komórki są wrażliwe na siły ścinające, drugi etap wirowania można wyeliminować poprzez zliczenie (np. hemocytometru), a następnie porcjowanie trypsynizowanej zawiesiny komórek (trypsyna + pożywka + komórki) na porcje potrzebne dla każdego stanu żelu. Te podwielokrotności są odwirowywane raz (90-110 x g, 5 min), a trypsyna + pożywka jest odsysana, pozostawiając osad komórkowy do enkapsulacji.
2. Kapsułkowanie komórek w hydrożelach o niewzorze.
   1. Natychmiast po zasysaniu PBS zawiesić granulowane komórki w PEG4SH, Pep2Alloc, Pep1Alloc, LAP i PBS+PS+FZ zgodnie z obliczeniami w arkuszu kalkulacyjnym do końcowego stężenia 5,000 komórek/μl.
   2. Formować i polimeryzować hydrożele zgodnie z opisem w krokach od 2.1.2 do 2.1.6.
      UWAGA: Podczas zamykania komórek w szklanych formach szkiełkowych należy zachować ostrożność podczas usuwania górnej szkiełka po polimeryzacji, aby zapobiec ścinaniu żelu, co może spowodować śmierć komórki. Aby pomóc w usuwaniu żelu z formy, formy szkiełkowe można umieścić w sterylnym PBS lub pożywce wzrostowej po polimeryzacji w celu zwilżenia uszczelki i hydrożelu, co ułatwia usunięcie górnego szkiełka. Metodą całkowitego zapobieżenia temu ścinaniu jest użycie form strzykawkowych.
   3. Płukać żele 3 x 10 min w pożywce wzrostowej, aby usunąć nieprzereagowane gatunki i nadmiar LAP.
   4. Inkubować żele w pożywce wzrostowej w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ do pożądanego punktu czasowego do dalszej analizy. Uzupełniaj pożywkę co 48 godzin lub zgodnie z zaleceniami dla aplikacji (np. typowy odstęp między karmieniem dla określonego typu komórek i pożywki).
3. Kapsułkowanie komórek i fotowzorce w obecności komórek.
   1. Natychmiast po odessaniu PBS zawiesić granulowane komórki w PEG4SH, Pep2Alloc, LAP i PBS+PS+FZ zgodnie z obliczeniami w arkuszu kalkulacyjnym do końcowego stężenia 5 000 komórek/μl. Pozostawić odpowiednie stężenie wolnych tioli (np. 2 mM) do późniejszej reakcji z Pep1Alloc.
   2. Formować, polimeryzować i modelować hydrożele zgodnie z opisem w krokach 2.2.2 do 2.2.8.
   3. Płukać żele 3 x 10 min w pożywce wzrostowej po ułożeniu wzoru, aby usunąć nieprzereagowane gatunki i nadmiar LAP.
   4. Inkubować żele w pożywce wzrostowej w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ do pożądanego punktu czasowego do dalszej analizy. Uzupełniaj podłoże co 48 godzin lub zgodnie z zaleceniami dla aplikacji.

5. Określanie żywotności i aktywności metabolicznej zamkniętych komórek

1. Wykonaj test cytotoksyczności żywej/martwej, aby określić żywotność otorbionych komórek (Figura 4A).
   1. Usunąć pożywkę wzrostową z żeli i płukać 3 x 15 minut PBS, aby umożliwić dyfuzję pożywki z żeli.
   2. Rozmrozić żywe/martwe roztwory do oznaczania cytotoksyczności (homodimer-1 etydyny-1 i kalceina AM).
   3. Dodać 2 μl 2 mM homodimimu etydyny-1 i 0,5 μl 4 mM roztworów kalceiny AM do 1 ml sterylnego PBS. Wiruj, aby zapewnić całkowite wymieszanie.
   4. Dodać 300 μl roztworu barwiącego do każdego żelu do formy strzykawkowej na płytkach 48-dołkowych lub tyle, aby pokryć powierzchnię żelu na szkiełku podstawowym w sterylnym naczyniu i inkubować przez 45 minut.
   5. Usuń nadmiar roztworu barwiącego i spłucz, aby usunąć nadmiar barwnika z żeli (3 x 15 min z PBS).
   6. Obraz na mikroskopie konfokalnym (obrazy ze stosu z) lub na mikroskopie epifluorescencyjnym z możliwością ustawienia stosu z przy 10X i długości fali 488/525 nm Ex/Em. Określ ilościowo liczbę żywotnych komórek, rzutując stosy z i licząc liczbę żywych (zielone w całym ciele komórki) i martwych (czerwone jądra) komórek za pomocą oprogramowania do obrazowania.
2. Wykonaj test aktywności metabolicznej, aby określić aktywność komórki po enkapsulacji (Figura 4B).
   1. 24 godziny przed testem nakarm zamknięte komórki świeżą pożywką wzrostową.
      UWAGA: Dodaj pożywkę do kilku dodatkowych studzienek (niezawierających żeli lub żeli bez komórek) jako kontrolę (odczyty tła).
   2. W miejscu zainteresowania rozmrozić roztwór odczynnika MTS.
      UWAGA: W celu określenia aktywności metabolicznej w czasie, zaleca się początkowy punkt czasowy (12-24 godziny po kapsułkowaniu) jako odniesienie do porównania z późniejszymi punktami czasowymi.
   3. Dodać odczynnik MTS do każdej studzienki (20 μl na 100 μl pożywki wzrostowej).
   4. Próbki inkubować przez 1-4 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO_{2 zgodnie} z instrukcjami producenta.
      UWAGA: Czas inkubacji powinien być wystarczający, aby komórki zredukowały MTS i umożliwiły dyfuzję produktu formazanu z żelu. W związku z tym grubsze żele, takie jak żele z końcówkami strzykawek, mogą wymagać dłuższego czasu inkubacji (~ 4 godziny) w celu wystarczającej redukcji i dyfuzji MTS.
   5. Pipeta 100 μl zredukowała MTS/Medium do czystych studzienek na 96-dołkowej płytce i zapisała absorbancję przy 490 nm na czytniku płytek.
   6. Odejmij absorbancję tła dla studzienek bez komórek od wartości absorbancji próbki, aby uzyskać podstawowe wartości absorbancji.

Wyniki

Konfiguracja i procedura fotoenkapsulacji komórek, a następnie żeli fotowzorcowych zawierających zamknięte komórki jest przedstawiona na rysunku 1, a przykład przygotowania roztworów podstawowych do utworzenia żelu o zawartości 10% wag. jest podany w Tabeli 1. Korzystając z tabeli 1, oblicza się ilość monomerów (PEG4SH, Pep2Alloc, ±Pep1Alloc) i fotoinicjatora (LAP) wymaganych do polimeryzacji hydrożeli. Na podstawie tych obliczeń przygotowuje się roztwory podstawowe PEG4SH, Pep1Alloc, Pep2Alloc i LAP i miesza się je z Pep1Alloc i bez niego, odpowiednio do żeli tworzących i fotomodelujących (Rysunek 1A). Następnie komórki są zbierane z płytek, liczone i odwirowywane w odpowiednich ilościach do enkapsulacji (ryc. 1B). Osad komórkowy jest ponownie zawieszany w roztworze żelowym (peptyd / polimer / LAP w PBS), a mieszaniny komórek / monomerów są przenoszone do form szklanych lub strzykawkowych. Komórki są zamykane w hydrożelu po zastosowaniu światła (1-5 minut 10 mW/^cm2 przy 365 nm) (ryc. 1C). W przypadku fotowzorcowania (ryc. 1D) żele nasącza się Pep1Alloc i LAP przez 30 minut do 1 godziny i 30 minut, umożliwiając dyfuzję peptydu i inicjatora do spolimeryzowanej matrycy. Te żele zawierające peptydy są pokryte fotomaskami z pożądanymi wzorami i wystawione na działanie drugiej dawki światła (1 min) w celu sprzężenia peptydów z wolnymi tiolami w matrycy. Wisiorki są kowalencyjnie połączone z żelem tylko w obszarach wystawionych na działanie światła, ułatwiając odpowiednie interakcje komórka-matryca i naśladując kluczowe właściwości mechaniczne i biochemiczne natywnego mikrośrodowiska komórkowego w kierunku badania funkcji i losu komórki in vitro.

Test Ellmana dostarcza łatwej i niedrogiej metody ilościowego określania modyfikacji żelu i inkorporacji peptydów w podłożach fotowzorzystych. Żele wzorzyste i niewzorzyste (tj. żele z modyfikacją peptydów lub bez) są moczone w buforze reakcyjnym Ellmana po polimeryzacji. Następnie wzorce cysteiny i żele nasączone buforem umieszcza się na 48-dołkowych płytkach i inkubuje z odczynnikiem Ellmana (ryc. 2A, po lewej). Po 1 godzinie 30 minutach podwielokrotności próbek umieszcza się w indywidualnych studzienkach 96-dołkowej płytki, a absorbancję rejestruje się przy 405 nm. Wykreśla się krzywą kalibracyjną (rysunek 2A, po prawej) z wzorców cysteiny (absorbancja w funkcji stężenia, dopasowanie liniowe), a ilość wolnych tioli w żelach można określić na podstawie ich współczynnika rozcieńczenia. Te wolne stężenia tiolu dla różnych warunków polimeryzacji i fotowzorca żelu 10% wag. przedstawiono na rysunku 2B. Żele polimeryzowane przez 1 lub 5 minut bez Pep1Alloc (niebieskie paski, I = 1 min i II = 5 min) mają statystycznie podobne stężenia wolnych tioli, co wskazuje, że zachodzi szybka reakcja i żelowanie jest zakończone w ciągu 1 minuty (dwustronny test t, p >0,05). Tym samym dodatkowa ekspozycja na światło (2-5 minut) nie powoduje dalszej konwersji grup funkcyjnych. Żele polimeryzowane przez 1 min bez Pep1Alloc nasączono Pep1Alloc (3 mg/ml) i LAP (2,2 mM) przez 30 i 90 min (zielone paski, II = 30 min i IV = 90 min) i wystawiono na działanie drugiej dawki światła przez 1 min. Spadek wolnych tioli (60-80% w stosunku do warunku 1 min) wskazuje na efektywną modyfikację żeli z zawieszkami w tych warunkach. Jeżeli pożądana jest wyższa modyfikacja, można zastosować zwiększone stężenia roztworu Pep1Alloc, ponieważ dostępność Pep1Alloc do wolnych tioli w bardziej rozcieńczonych roztworach peptydów może ograniczać konwersję; Na przykład odkryliśmy, że stężenia do 20 mg/ml Pep1Alloc powodują >90% konwersję wolnych tioli.

Unikalnie, wzory peptydów dodanych do hydrożelu można szybko zobrazować za pomocą odczynnika Ellmana (Rysunek 3A, poniżej 5 minut). Jednak wizualizacja wzoru jest tracona z czasem (dłużej niż 5 minut) z powodu dyfuzji żółtego^{TNB 2-dianionu} przez żel. Aby poprawić rozdzielczość obrazowania i obserwować wzorce w trzech wymiarach (płaszczyzny x, y i z) oraz w obecności komórek, można zastosować dodanie peptydów fluorescencyjnych (AF488Pep1Alloc). Na rysunku 3B przedstawiono projekcje x, y i z stosów obrazów wykonanych za pomocą mikroskopu konfokalnego, demonstrując rozdzielczość wzoru (skala μm).

Około (94 ± 2) % i (94 ± 1) % hMSC zamkniętych w żelach ulegających degradacji (Pep2Alloc = GPQG↓WGQ) pozostaje żywotnych (ciała zielonych komórek) odpowiednio 1 i 6 dni po enkapsulacji, z niewielką liczbą martwych komórek (czerwonych jąder) obserwowanych (Rysunek 4A). Co więcej, rozprzestrzenianie się hMSC obserwuje się po 6 dniach od enkapsulacji (Figura 4A, wstawka), co wskazuje, że komórki mogą się przebudować i wchodzić w interakcje z tymi degradowalnymi przez MMP matrycami zmodyfikowanymi za pomocą RGDS wiążących integryny. Testy aktywności metabolicznej przeprowadzone na komórkach zamkniętych w niedegradowalnych żelach (Pep2Alloc = RGKGRK) 1 i 3 dni po enkapsulacji (Figura 4B) zapewniają drugą miarę żywotności komórek i pokazują, że komórki pozostają aktywne w różnych warunkach fotokapsułkowania i fotowzorcowania testowanych za pomocą testu Ellmana (Figura 2B). W szczególności nie ma istotnej różnicy w aktywności metabolicznej między 30-minutową a 90-minutową inkubacją z Pep1Alloc+LAP (warunki III i IV) a początkową enkapsulacją (warunki I i II), co wskazuje, że procedura jest odpowiednia do zastosowań fotowzorcowania w obecności otorbionych komórek (dwustronny test t, p > 0,05).

Rysunek 1: Konfiguracja do kapsułkowania komórek w hydrożelach, a następnie fotomodelowania za pomocą wskazówek biochemicznych. (A) Roztwory podstawowe makromerów i fotoinicjatora są przygotowywane i mieszane (PEG4SH = szkielet, Pep2Alloc = sieciowanie, Pep1Alloc = ugrupowanie adhezyjne (RGDS), LAP = fotoinicjator). (B) Komórki są pobierane w celu enkapsulacji. (C) Komórki miesza się z roztworami makromerów bez peptydów wiążących integryny lub z peptydami wiążącymi integryny (odpowiednio PEG4SH/Pep2Alloc/LAP lub PEG4SH/Pep2Alloc/Pep1Alloc/LAP) i są kapsułkowane po wystawieniu na działanie światła. (D) Żele zawierające nadmiar grup tiolowych podczas tworzenia żelu (tutaj PEG4SH / Pep2Alloc / LAP, utworzony z 2 mM nadmiaru tiolu) mogą być modelowane z sygnałami biochemicznymi przez późniejsze dodanie peptydów funkcjonalizowanych pojedynczą grupą allokową (Pep1Alloc, np. RGDS, IKVAV itp.) w celu promowania adhezji komórek w określonych regionach żelu. Pokazano tu wzór żeli z fluorescencyjnie znakowanym RGDS. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Ilościowy zestaw testów Ellmana i wyniki w celu oceny modyfikacji wzorzystych hydrożeli. (A) Żele i wzorce cysteiny inkubuje się na 48-dołkowych płytkach z odczynnikiem Ellmana. Liniowa krzywa wzorcowa jest wykreślana w celu określenia stężenia cysteiny w próbkach żelu. (B) Nadmiar wolnych tioli jest wprowadzany do hydrożeli podczas tworzenia żelu i zużywany po ułożeniu za pomocą wisiorka allo-peptydu (I = 1 min polimeryzacji; II = 5 min polimeryzacji; III = 30 min inkubacji z Pep1Alloc; IV = 90 min inkubacji z Pep1Alloc; zarówno III, jak i IV polimeryzowane i modelowane światłem przez 1 min). Przedstawione dane ilustrują średnią (n = 3) ze słupkami błędu pokazującymi błąd standardowy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Test Ellmana i obrazy fluorescencyjne do wizualizacji hydrożeli o wzorze fotowzorze. (A) Odczynnik Ellmana może być używany do szybkiego wykrywania wzorów (linii) na płaszczyznach x i y (żółty = obszar bez wzoru, podziałka liniowa = 1 mm). (B) Peptydy fluorescencyjne mogą być używane do obserwacji wzorów w płaszczyznach x, y i z (zielony = obszar wzorzysty; pasek skali 200 μm; 10-krotny obiektyw zanurzający w wodzie; Ex/Em 488/525 nm). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 4: Żywotność i aktywność metaboliczna komórek w niedegradowalnych hydrożelach fotowzorzystych. (A) Przykład konfokalnego stosu z (projekcja z; 10-krotny obiektyw zanurzający się w wodzie) żywotnego (zielony; Ex/Em 488/525 nm) i martwe hMSC (czerwony; Ex/Em 543/580 nm) zamknięte w hydrożelach 24 godziny po enkapsulacji (podziałka = 200 μm). Komórki rozprzestrzeniają się w tych hydrożelach 6 dni po enkapsulacji (obraz wstawkowy, pasek skali = 50 μm). (B) Komórki są metabolicznie aktywne 1 i 3 dni (odpowiednio ciemne i jasne paski) po enkapsulacji dla różnych polimeryzacji (I = 1 minuta polimeryzacji; II = 5 min polimeryzacji) i warunki modelowania (III = 30 min inkubacja z Pep1Alloc; IV = 90 min inkubacji z Pep1Alloc; zarówno spolimeryzowane, jak i wzorzyste światłem przez 1 min). Przedstawione dane ilustrują średnią (n = 3) ze słupkami błędu pokazującymi błąd standardowy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Przykładowa konfiguracja do obliczania objętości roztworów podstawowych do wytwarzania hydrożeli. Komórki w arkuszu kalkulacyjnym, które są podświetlone na niebiesko, wskazują parametry zdefiniowane przez użytkownika; Pozostałe ilości są obliczane na podstawie tych ustawień. Końcowe objętości każdego roztworu podstawowego do wytworzenia żelu są podświetlone na pomarańczowo. Białe komórki zawierają formuły używane do obliczania ostatecznych objętości na podstawie parametrów zdefiniowanych przez użytkownika. Należy pamiętać, że stężenie 2,2 mM LAP odpowiada 0,067% wag.

Dyskusja

Przedstawiona tutaj procedura demonstruje techniki fotoenkapsulacji komórek w hydrożelach utworzonych przez chemię tiolowo-pianową, a następnie fotomodelowania żeli za pomocą wskazówek biochemicznych. Wykorzystanie światła do początkowego formowania hydrożeli pozwala na jednorodne mieszanie i zawieszenie komórek w roztworze polimerowym przed polimeryzacją. Szybka polimeryzacja "blokuje" żel w kształcie zdefiniowanej formy i zamyka zawieszone komórki w sieci hydrożelowej. Żele mogą być również formowane w wiele różnych kształtów (np. szkiełka podstawowe lub końcówki strzykawek) w zależności od pożądanego końcowego zastosowania. Na przykład komórki zamknięte w kapsułkach do hodowli 3D w hydrożelach przymocowanych do szkiełek podstawowych są szczególnie przydatne w zastosowaniach obrazowania, ponieważ tłumienie światła jest ograniczone w cienkiej próbce. Formy strzykawkowe mogą być używane do szybkiej kapsułkowania komórek, co pozwala na przygotowanie większej liczby próbek w krótkim czasie (w porównaniu ze szkiełkami szklanymi), które można wykorzystać do eksperymentów wymagających dużej liczby komórek, takich jak cytometria przepływowa lub qPCR. Następnie żele te mogą być wzorowane na sygnałach biochemicznych, aby wywołać pożądane reakcje komórkowe, takie jak różnicowanie lub inwazja. ^30,31

Testy żywotności i aktywności metabolicznej wskazują na przeżycie komórek w systemie materialnym i przedstawionych warunkach wzorcowania. Należy zauważyć, że aktywność metaboliczną monitorowano do 3 dnia w niedegradowalnych żelach (wiązanie peptydowe RGKGRK) w celu oceny początkowego wpływu polimeryzacji i warunków modelowania na funkcję komórki. Ponadto test integralności błony (barwienie żywy/martwy/cytotoksyczność) hMSC po 1 i 6 dniach od enkapsulacji w żelach zawierających degradowalny peptyd (GPQGIWGQ) potwierdza, że komórki pozostają żywotne i rozprzestrzeniają się po 1 tygodniu w hodowli. Żywotność dodatkowych linii komórkowych została zgłoszona dla warunków fotowzorca³² podobnych do tych stosowanych tutaj i może być oceniona dla opisanego systemu hydrożelowego za pomocą barwienia żywych/martwych i testów aktywności metabolicznej. Chociaż nie zaobserwowaliśmy problemów z żywotnością komórek przy użyciu tego systemu materiałów i powiązanych procedur (4.2 i 4.3), niektóre typy komórek mogą być wrażliwe na ekspozycję na wolne rodniki i/lub światło. W takim przypadku użytkownicy mogą rozważyć użycie systemów materiałów nieinicjowanych fotoinicjowo, takich jak azydkowo-alkinowe,12 FXIII,31 lub chemie tworzenia hydrożelu na bazie Diels Alder. ^{33 Rozdział 33}

Przedstawiono również łatwe techniki wykrywania i ilościowego określania wzorców biochemicznych sygnałów w żelach (3.1 i 3.2). Test Ellmana jest szczególnie interesujący, ponieważ odczynniki są dostępne na rynku i nie są wymagane żadne dodatkowe etapy przetwarzania syntetycznego ani droższe odczynniki (np. peptyd znakowany fluorescencyjnie). Test Ellmana może być wykorzystany do precyzyjnego określenia modyfikacji wolnych tioli za pomocą wskazówek biochemicznych w różnych warunkach fotowzorcowania, a także do szybkiej wizualizacji wzorów. W celu ilościowego określenia inkorporacji peptydów, stężenie tiolowej grupy funkcyjnej przed i po modelowaniu, jako ilościowa miara inkorporacji peptydów, jest bezpośrednio oceniane za pomocą testu Ellmana. Podczas gdy ten rodzaj kwantyfikacji można przeprowadzić za pomocą peptydów znakowanych fluorescencyjnie,34 kwantyfikacja oparta na obrazowaniu wymaga bardziej czasochłonnych etapów obsługi i analizy (np. syntezy peptydu znakowanego fluorescencyjnie i wygenerowania krzywej kalibracyjnej w celu powiązania fluorescencji ze stężeniem peptydu za pomocą analizy obrazu). W celu obrazowania inkorporacji peptydów, odczynnik Ellmana może być bezpośrednio nałożony na próbki i natychmiast zobrazowany. Chociaż technika ta jest ograniczona do płaszczyzn x i y do wizualizacji wzorców, może być stosowana jako prosta, rutynowa metoda określania, czy matryce zawierające wolne grupy tiolowe zostały wzorzyste. Ważne jest, aby pamiętać, że test Ellmana nie jest uważany za cytozgodny, więc chociaż może być używany do obserwacji i ilościowego określania fotowzorców, nie można tego zrobić w obecności komórek. W przypadku obrazowania wzorców w trzech wymiarach i w obecności komórek, koniugacja peptydów fluorescencyjnych w matrycach hydrożelowych pozostaje potężnym i szeroko stosowanym podejściem. Rozdzielczość wzorów można ocenić w płaszczyznach x, y i z za pomocą mikroskopii konfokalnej, a metoda ta jest cytokompatybilna, dzięki czemu można zidentyfikować komórki w regionach wzorzystych lub niewzorzystych. Podsumowując, test Ellmana i techniki oparte na obrazowaniu są uzupełniającymi się narzędziami dla badaczy do oceny zarówno ilościowej, jak i jakościowej fotowzorców sygnałów biochemicznych w systemie materiałowym.

Photoclick, czyli szerzej fotoinicjowane, chemie do tworzenia i modyfikacji hydrożeli w obecności komórek są liczne. Przedstawione tutaj techniki formowania, enkapsulacji i modelowania nie ograniczają się do opisanego systemu materiałów i mogą być stosowane do alternatywnych substancji chemicznych opartych na świetle, takich jak tiol-alkin,35 azydo-alkin,4 i inne chemikalia tiol--enu (np. tiol-norbornen),^10,13, a także z różnymi fotoinicjatorami, takimi jak Irgacure 2959, Eozyna Y i kamforchinon. Należy pamiętać, że użytkownicy mogą być zmuszeni do dostosowania parametrów procedury (np. czasów inkubacji, czasów polimeryzacji, gęstości komórek), aby zapewnić warunki pozostające cytokompatybilne dla tych innych systemów. Ponieważ proces modelowania wymaga dyfuzji peptydu (peptydów) zmodyfikowanego alokiem do hydrożelu (2.2.3-2.2.5), proces ten może okazać się najbardziej przydatny do dodawania ugrupowań wiążących integryny (np. peptydów lub fragmentów białek macierzy zewnątrzkomórkowej) do hydrożelu, gdzie przyłączenie liganda do sieci jest wymagane do wytworzenia sił trakcyjnych przez komórkę i pełnej aktywacji integryny. ³⁶ Należy zauważyć, że w przypadku biomolekuł, które mogą być podobnie aktywne w roztworze lub po unieruchomieniu (np. czynniki wzrostu lub cytokiny), etap inkubacji dyfuzji ugrupowań (~ 1 godzina) do hydrożelu może prowadzić do zdarzeń sygnalizacyjnych, które zawiły wyniki wzorcowania. Ustalono inne metody immobilizacji czynników wzrostu lub miejscowej sekwestracji w celu ich modelowania. ^{37-39 Rozdział 37-39}Dodatkowo rozdzielczość wzoru jest podyktowana kontrolą nad ekspozycją na światło. W tym przypadku fotomaski umożliwiają tworzenie wzorów przez głębokość żelu oraz w płaszczyznach x i y; Jednak większą kontrolę przestrzenną nad wzorcowaniem sygnałów biochemicznych w żelach można osiągnąć za pomocą alternatywnych metod napromieniania, takich jak użycie dwufotonowego mikroskopu konfokalnego do generowania wzorów w płaszczyznach X, Y i Z. ^34,40 Wreszcie, ważne jest, aby zauważyć, że podczas gdy system materiałowy wykorzystywany w tej procedurze jest tylko początkowo modyfikowany za pomocą wskazówek biochemicznych, ortogonalne chemie fotokliknięć mogą być stosowane w celu umożliwienia zmian właściwości matrycy w czasie. ¹² Przedstawione tu procedury i techniki dodają różnorodności do obecnych podejść do tworzenia syntetycznych matryc o dobrze zdefiniowanych i kontrolowanych przestrzennie właściwościach. W szczególności komercyjna dostępność odczynników i materiałów stosowanych w tej procedurze będzie przydatna dla szerokiego grona badaczy zainteresowanych wykorzystaniem biomateriałów na bazie hydrożelu do zastosowań w kontrolowanych hodowlach komórkowych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Niestandardowe peptydy	Różni dostawcy	----	peptydy mogą być również syntetyzowane za pomocą standardowych technik SPPS z materiałami od dostawców, w tym ChemImpex i ChemPep.
4-ramienny PEG Thiol, MW 20k	JenKem USA	4ARM-SH	Wymieniony w kategorii Wieloramienne homofunkcyjne PEG-i. PEG4SH może być również syntetyzowany, jak wspomniano wcześniej.
Fenylo-2,4,6-trimetylobenzoilofosfinian	litu Colorado Roztwory fotopolimerowe	Li-TPO
Dimetylofonylofosfonian	Sigma Aldrich	149470	Uwaga, powoduje poważne oparzenia skóry i uszkodzenie oczu. Nosić rękawice ochronne, odzież i okulary ochronne.
Chlorek 2,4,6-trimetylobenzoilu	Sigma Aldrich	682519	Uwaga, powoduje poważne oparzenia skóry i uszkodzenia oczu. Nosić rękawice ochronne, odzież i okulary ochronne.
Bromek litu	Sigma Aldrich	213225
2-butanon	Sigma Aldrich	360473
Kolba, okrągłodenny, 100  ml	Chemglass	CG-1506-05
80 ml Lejek filtracyjny, Buchner, Medium Frit	Chemglass	CG-1402-L-02	W razie potrzeby można użyć bibuły filtracyjnej wewnątrz zwykłego szklanego lejka.
Mieszadła magnetyczne	Różni dostawcy	----
Mieszadło magnetyczne i płyta grzejna	Różni dostawcy	----
Eksykator próżniowy	Różni dostawcy	----
Tlenek deuteru	Acros Organics	16630
fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco	ThermoFisher Scientific	14190-250
Penicylina Streptomycyna	ThermoFisher Scientific	15070-063
Fungizone	ThermoFisher Scientific	15290-018
Trypsin-EDTA (0,5%), bez czerwieni fenolowej	ThermoFisher Scientific	15400-054	Wybierz odpowiednią pożywkę i trypsynę w zależności od typu komórki.
Probówki do mikrowirówek	Różni dostawcy	----	rozmiary 1,5 lub 2 ml, sterylne.
Strzykawka BD z końcówkami poślizgowymi (Luer) (bez igły)	Fisher Scientific	14-823-16H	Podany tutaj numer produktu dotyczy strzykawki 1 ml (16H), Dostępne są różne rozmiary (14-823-XX).
Szkiełka mikroskopowe Fisherfinest Premium Plain Glass	Fisher Scientific	12-544-1
Kauczuk silikonowy o wysokiej czystości, grubość 0,010 cala, arkusz 6 "x 8", twardość 55A (uszczelka)	McMaster Carr	87315K62
Etanol, 200 Proof	Decon Labs	2701
RainX, oryginalny	Amazon	800002243	Można kupić od innych dostawców.
Sigmacote	Sigma Aldrich	SL2
Photomasks	Advance Reproductions Corporation	----	Photomask Division, różne projekty mogą być drukowane zgodnie z życzeniem.
DTNB; Odczynnik Ellmana; 5,5-dithio-bis(kwas 2-nitrobenzoesowy)	ThermoFisher Scientific	PI-22582
Fosforan sodu dwuzasadowy	Sigma Aldrich	S5136
Kwas etylenodiaminotetraoctowy	Sigma Aldrich	E6758
Wodorotlenek sodu, granulki/Certyfikowany ACS	Fisher Scientific	S318
Kwas ortofosforowy	Alfa Aesar	33266
Monohydrat chlorowodorku cysteiny	Sigma Aldrich	C7880
ŻYWY/MARTWY zestaw żywotności/cytotoksyczności, do komórek ssaków	ThermoFisher Scientific	L-3224
CellTiter 96 Wodny test roztworu	Promega	G3582
Wirówka	dostawcy	----	Zdolna do prędkości 90-110 x g.
Czytnik płytek wielodołkowych	Różni dostawcy	----	Możliwość odczytu absorbancji przy 405 nm w płytce 96-dołkowej.
Mikroskop epifluorescencyjny lub konfokalny	Różni dostawcy	----	Do wizualizacji wzorów peptydowych i komórek w hydrożelach.
Omnicure Exfo Series 2000	Excelitas Technologies	----	Alternatywne systemy świetlne mogą być stosowane do polimeryzacji hydrożeli.
Oprogramowanie Zeiss Zen Lite	Zeiss	----	Dostępne w zeiss.com; kompatybilne z obrazami wykonanymi za pomocą mikroskopów Zeiss
ImageJ	NIH		Dostępne pod adresem imagej.nih.gov; Dotyczy ogólnej analizy obrazu