Wspomagana laserowo mikroiniekcja cytoplazmatyczna u zygot zwierząt gospodarskich

Mikroiniekcja cytoplazmatyczna zarodków 1-komórkowych jest bardzo skuteczną techniką. Może być używany do dostarczania dowolnego roztworu do zarodka, na przykład w celu wytworzenia nokautów genów w celu badania funkcji genów lub do generowania zwierząt z edytowanymi genami. Większość zygot zwierząt gospodarskich o znaczeniu rolniczym ma bardzo wysoki skład kwasów tłuszczowych, który sprawia, że ich cytoplazma jest nieprzezroczysta i ciemna¹. Mają też dość elastyczną błonę plazmatyczną (PM). Te cechy sprawiają, że mikroiniekcja przy użyciu konwencjonalnej iniekcji przedjądrowej/cytoplazmatycznej, stosowanej u gatunków gryzoni, jest trudna i często niedokładna.

Mikroiniekcja cytoplazmatyczna ma przewagę nad mikroiniekcją projądrową, ponieważ jest łatwiejsza do wykonania, a także powoduje mniejsze uszkodzenia wstrzykniętych zarodków, co skutkuje wyższą żywotnością². Ogólnym celem tego protokołu jest zademonstrowanie skutecznej metody dostarczania roztworów do cytoplazmy zygot zwierząt gospodarskich. Aby móc wykonać mikroiniekcję cytoplazmatyczną z wysoką skutecznością na zarodkach zwierząt gospodarskich, do wygenerowania otworu w osłonie przejrzystej (ZP) wykorzystuje się laser, a następnie do mikroiniekcji używa się szklanej igły o końcu. Strategia ta ma na celu zmniejszenie uszkodzeń mechanicznych odciskających się na zarodku podczas iniekcji. Następnie, aspiracja zawartości cytoplazmatycznej do wnętrza igły iniekcyjnej pozwala na skuteczne i pewne złamanie PM, zapewniając, że roztwór zostanie dostarczony do cytoplazmy zarodka.

Ta technika została już z powodzeniem wykorzystana na bydlęcych embrionach do dostarczania siRNA do cytoplazmy zygotycznej^3,4 i generowania mutacji za pomocą zgrupowanych regularnie rozmieszczonych krótkich powtórzeń palindromicznych (CRISPR) / systemu związanego z CRISPR 9 (Cas9)⁵. Nadaje się również (z niewielkimi modyfikacjami) do wstrzykiwania oocytów zamkniętych w kłębikach bydlęcych⁶. W tym miejscu opisujemy nasz protokół iniekcji dostarczający barwnik, który może być stosowany do wstrzykiwania dowolnego pożądanego roztworu do zygoty i pokazujemy, że użycie tej techniki powoduje minimalną lizę i nie wpływa na wczesny rozwój zarodka.

1. Produkcja mikropipet

1. Mikropipeta iniekcyjna
   1. Umieść kapilarnę ze szkła borokrzemianowego (średnica zewnętrzna (OD): 1.0 mm, średnica wewnętrzna (ID): 0.75 mm) w ściągaczu do mikropipet (pośrodku prawego i lewego uchwytu kapilary) i zablokuj ją.
   2. Użyj odpowiedniego programu, aby pociągnąć szklaną kapilę tak, aby uzyskać cienką końcówkę z długim gwintownikiem. (Przykład: Ciepło: 825; Uciąg: 30; Prędkość: 120; Czas: 200; Ciśnienie: 500).
   3. Ostrożnie wyjmij wyciągnięte pipety z urządzenia i umieść je na mikrokuźni w pozycji poziomej.
   4. Ustaw ostrość wyciągniętej pipety i żarnika microforge z kulką szklaną. Za pomocą siatki ocznej zmierz żądaną grubość i przesuwaj pipetę poziomo, aż żarnik grzałki osiągnie docelową średnicę wewnętrzną (5 μm).
   5. Dostosuj temperaturę do około 45% i delikatnie opuść pipetę, aby dotykała filamentu. Włącz na chwilę grzałkę. Spowoduje to lekkie stopienie pipety, dzięki czemu przylega ona do filamentu, a po schłodzeniu pipeta pęknie w miejscu styku, generując proste cięcie.
      Uwaga: Ustawienie odpowiedniej temperatury ma kluczowe znaczenie na tym etapie, ponieważ zbyt wysokie temperatury spowodują, że pipeta będzie się wyginać, a tym samym proste cięcie nie będzie możliwe, a zbyt niskie temperatury nie będą wystarczające do stopienia pipety (Rysunek 1A).
   6. Ustaw przybliżony kąt 30° w pobliżu końcówki pipety, umieszczając ją w odległości około 10 μm od żarnika grzałki. Ustaw temperaturę na 60% i włącz grzałkę.
      Uwaga: Spowoduje to zgięcie pipety nad żarnikiem. Kąt ten jest pożądany, aby końcówka igły była równoległa do powierzchni płytki iniekcyjnej po zamontowaniu we wtryskiwaczu (rysunek 1B).
   7. Z pipetami do mikroiniekcji należy obchodzić się ostrożnie, ponieważ są one niezwykle ostre i delikatne.
2. Trzymanie mikropipety
   1. Umieść kapilarę ze szkła borokrzemianowego (OD: 1.0 mm, ID: 0.75 mm) w ściągaczu do mikropipet (pośrodku prawego i lewego uchwytu kapilary) i zablokuj ją.
   2. Użyj odpowiedniego programu, aby pociągnąć szklaną kapilę tak, aby uzyskać cienką końcówkę o długim, równym zwężaniu się i równoległych ściankach (Przykład: Ciepło: 815; Uciąg: 20; Prędkość: 140; Czas: 175; Ciśnienie: 200).
   3. Ostrożnie wyjmij wyciągniętą pipetę z urządzenia ściągającego i umieść ją na uchwycie mikrokuźni w pozycji poziomej. Ustaw ostrość na żarniku grzałki i pipecie.
   4. Za pomocą siatki okularowej zmierz średnicę pipety i przesuwaj pipetę, aż jej średnica nad włóknem osiągnie 180 μm.
   5. Przy wskazanym rozmiarze zaznacz szklaną kapilarnę pisakiem z diamentową końcówką, a następnie delikatnie naciśnij wyciągniętą końcówkę, aby rozbić szkło. Powinno to skutkować prostym cięciem (Rysunek 1C).
   6. Przesuń pipetę do pozycji pionowej tak, aby jej końcówka znajdowała się blisko filamentu. Ustaw temperaturę mikrokuźni na 60%.
   7. Wypoleruj końcówkę pipety metodą ogniową przy użyciu standardowych technik⁷, aż osiągnie średnicę wewnętrzną 40 μm. Użyj siatki celowniczej okularu, aby sprawdzić średnicę wewnętrzna (Rysunek 1D).
   8. Ustaw kąt na pipecie.
      1. Ustaw pipetę z powrotem w pozycji poziomej w odległości około 10 μm od filamentu i 5 mm od jego końcówki. Ustaw temperaturę na około 60% i włącz grzałkę, aby zgiąć pipetę nad filamentem. Kontynuuj podgrzewanie, aż zostanie osiągnięty żądany kąt (około 30^o). Sprawdź wizualnie kąt (Rysunek 1E).
         Uwaga: Pipeta jest zwykle montowana do mikroiniektora pod przybliżonym kątem 60^o w stosunku do dna naczynia iniekcyjnego. Końcówka pipety jest wygięta tak, aby była równoległa do dna naczynia, co jest niezbędne do prawidłowego wstrzyknięcia zarodka w jego środkowej płaszczyźnie.

2. Konfiguracja mikromanipulatora

1. Sprawdź, czy mikrowtryskiwacze są w pełni załadowane olejem i czy w układzie nie ma pęcherzyków powietrza (pęcherzyki w mikrowtryskiwaczu uniemożliwiają precyzyjną kontrolę wtrysku).
2. Sprawdź, czy mikromanipulatory są w pozycji środkowej. Pozwoli to na szeroki zakres ruchu pipet.
3. Włóż pipetę podtrzymującą do lewego uchwytu mikromanipulatora, a pipetę iniekcyjną do prawego uchwytu do mikromanipulacji.
4. Pozwól, aby olej dostał się do pipet przez kapilarność i sprawdź, czy system działa prawidłowo, przesuwając olej w górę i w dół wewnątrz pipety za pomocą elementów sterujących mikrowtryskiwacza.
   Uwaga: Jeśli nie ma ruchu oleju wewnątrz igieł, może dojść do zatkania. W takim przypadku użyj nowej igły.
5. Użyj elementów sterujących mikromanipulatora, aby ustawić pipety w środku pola widzenia mikroskopu. Korzystając z 4-krotnego powiększenia, sprawdź, czy końcówki mikropipet są ustawione pod odpowiednim kątem (równolegle do dna naczynia).
   Uwaga: Prawidłowe ustawienie igieł ma kluczowe znaczenie dla udanego wstrzyknięcia i spójności wyników.
6. Skalibruj system laserowy zgodnie z instrukcją kalibracji producenta.

3. Przygotowanie naczynia do iniekcji (Rysunek 2)

1. Umieść 50 μl kropli podgrzanego (37 °C) SOF-HEPES (skład szczegółowo opisany w sekcji materiały) uzupełnionej 20% płodową surowicą bydlęcą (FBS) na środku pokrywy płytki Petriego o średnicy 100 mm. Umieścić 1-2 μl kropli roztworu do wstrzyknięcia w pobliżu kropli do wstrzykiwania. Upewnij się, że zarodki nie schładzają się poniżej RT.
   Uwaga: W tym protokole dodamy barwnik Dextran-Red do roztworu do wstrzykiwań, aby móc uwidocznić miejsce wstrzyknięcia i śledzić je później.
2. Przykryć krople w płytce iniekcyjnej około 10 ml oleju mineralnego.
3. Umieścić naczynie iniekcyjne na stoliku mikroskopu odwróconego i umieścić pipety w kropli iniekcyjnej. Sprawdź, czy igły są ostre wewnątrz kropli. Dostosuj ich wysokość w razie potrzeby za pomocą elementów sterujących mikromanipulatora.
4. Za pomocą mikrodozownika załadować około 20 - 30 zygot (17 - 20 godzin po zapłodnieniu (hpf)) w górną stronę kropli iniekcyjnej. Wstrzyknięcie należy wykonać w temperaturze pokojowej, tak aby liczba zarodków w kropli do wstrzykiwania była określona na podstawie szybkości, z jaką dana osoba może je wstrzyknąć. Nie należy ładować więcej zarodków niż te, które można wstrzyknąć w ciągu 30 minut.
   1. Aby załadować zarodki do mikrodozownika, należy całkowicie wcisnąć tłok i zanurzyć końcówkę w roztworze zawierającym zarodki. Dotknij zarodków, które mają zostać podniesione, końcówką szklanej kapilary (pojedynczo) i powoli zwolnij tłok, aby każdy zarodek wszedł do naczynia włosowatego. Powtarzaj tę czynność, aż wszystkie zarodki zostaną zebrane lub pojemność mikrodozownika będzie pełna.
   2. Aby uwolnić załadowane zarodki, należy delikatnie wcisnąć tłok, aż cała objętość zawierająca zarodki zostanie uwolniona z naczynia włosowatego.

4. Mikroiniekcja

1. Używając obiektywu 4X, załaduj roztwór do wstrzyknięcia do pipety iniekcyjnej, stosując podciśnienie (zasysanie). Załadować roztwór wystarczający do wstrzyknięcia 2-3 zygot. Następnie przejdź do kropli do wstrzykiwań.
2. W obrębie kropli iniekcyjnej przesunąć pipetę przytrzymującą tak, aby końcówka zbliżyła się do zygoty. Zastosuj podciśnienie (aspirat) za pomocą mikroiniektora przytrzymującego, aby zygota została przymocowana do pipety podtrzymującej i zmień obiektyw na 20X.
3. Po przymocowaniu zygoty do pipety podtrzymującej sprawdź jej jakość za pomocą pipety do wstrzykiwań, aby delikatnie przesunąć zarodek bez jego odłączania. Dobrej jakości zygota powinna mieć dwa ciała biegunowe (chociaż czasami widać tylko jedno) i jednorodną cytoplazmę. Nie należy wstrzykiwać nieprawidłowych zygot (ryc. 3A).
4. W razie potrzeby należy zmienić położenie zarodka w celu uzyskania właściwego miejsca wstrzyknięcia. Dobrym pozycjonowaniem byłoby takie, w którym jest pewna przestrzeń między ZP a PM, aby PM nie został uszkodzony przez laser.
5. Sprawdzić, czy pipeta do wstrzykiwań jest umieszczona na środkowej płaszczyźnie zarodka, delikatnie dotykając zygoty w miejscu wstrzyknięcia. Jeśli nie znajduje się na płaszczyźnie środkowej, igła będzie miała tendencję do obracania zarodka zamiast do nakłucia. W razie potrzeby wyreguluj wysokość pipety iniekcyjnej.
6. Wykonaj otwór w ZP za pomocą lasera (rysunek 3B).
   1. Za pomocą oprogramowania lasera umieść siatkę laserową w ZP, w miejscu, w którym zostanie wykonany otwór (po przeciwnej stronie niż miejsce, w którym zarodek jest przymocowany do pipety trzymającej). Korzystając z okna sterowania laserem, kliknij przycisk ognia. Upewnij się, że rozmiar otworu jest wystarczająco duży, aby utworzyć otwór w ZP, przez który igła może przejść bez uszkodzenia PM (przykład: szerokość impulsu 0,662 ms / rozmiar otworu 6,9 μm).
7. Przełóż igłę do wstrzykiwań przez otwór w ZP i zetknij się z PM. Kontynuuj popychanie pipety do przodu, aż igła znajdzie się w 3/4 drogi do zarodka (ryc. 3C).
8. Obserwuj położenie menisku na interfazie roztwór-olej, ponieważ będzie to wykorzystywane do konsekwentnej kontroli objętości wtrysku.
9. Zastosować podciśnienie (aspirat) na pipetę iniekcyjną, co spowoduje zassanie PM i cytoplazmy do igły iniekcyjnej. Kontynuuj, aż ruch cytoplazmy do igły przyspieszy lub gdy będzie można zauważyć mieszanie się cytoplazmy z roztworem do wstrzykiwań. Będą one wskazywać na pęknięcie PM (rysunek 3D).
10. Wstrzyknąć z powrotem zawartość cytoplazmatyczną, a następnie roztwór do cytoplazmy zygoty, stosując nadciśnienie (wstrzyknięcie), aż menisk na interfazie roztwór-olej przesunie się o jeden odpowiednik średnicy zygoty poza punkt początkowy.
    Uwaga: W naszych warunkach odpowiada to około 7 pl wstrzykniętego roztworu (ryc. 3E).
11. Zmień obiektyw na 4X i przesuń wstrzyknięty zarodek/zarodki na dolną stronę kropli do wstrzykiwania. Uwolnić zarodek, wywierając dodatni nacisk na mikrowstrzykiwacz podtrzymujący. Trzymaj zarodki, którym nie wstrzyknięto, należy trzymać na górnej stronie, a zarodki, którym wstrzyknięto, na dolnej stronie kropli, aby śledzić zarodki, w które wstrzyknięto/nie wstrzyknięto zarodków i pracować wydajnie.

5. Wyniki odzyskiwania zarodków i iniekcji

1. Przygotuj 3 krople po około 200 μl w nowym naczyniu z podgrzanym SOF-HEPES. Pobrać wstrzyknięte zarodki za pomocą mikrodozownika (jak opisano powyżej). Umyj wstrzyknięte zarodki, przesuwając je przez 3 krople SOF-HEPES.
2. Policz zarodki poddane lizie podczas mikroiniekcji i wyrzuć je.
   Uwaga: Lizowaną zygotę można łatwo odróżnić od nienaruszonej, ponieważ pierwsza z nich wydaje się półprzezroczysta, wypełnia cały ZP i zwykle ma zawartość cytoplazmatyczną wyciekającą na zewnątrz zarodka.
3. Opcjonalnie należy sprawdzić skuteczność mikroiniekcji za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Należy pamiętać, że ekspozycja na światło UV może wywołać uszkodzenie zarodka, które może wpłynąć na późniejszy rozwój.
4. Grupy hodowlane składające się z 25 wstrzykniętych zarodków w 50 μl kropli pożywki optymalizacyjnej potasu pospolitego (KSOM) uzupełnionej 4 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w oleju mineralnym w temperaturze 38,5 °C, 5% CO₂ w powietrzu i wilgotności do nasycenia.
5. Uzupełnij pożywkę hodowlaną 5% FBS dwa dni po wstrzyknięciu.
6. Sprawdź częstość występowania blastocysty (BL) 7 dni po wstrzyknięciu. Obliczyć wskaźniki BL jako całkowitą liczbę zarodków blastocysty/całkowitą liczbę zarodków wyhodowanych w tym kropli.

Wspomagana laserowo mikroiniekcja cytoplazmatyczna to potężny i niezawodny protokół dostarczania roztworów do cytoplazmy zygot zwierząt gospodarskich. Rycina 3 przedstawia ogólny zarys zygot przed i po wstrzyknięciu, a także ogólny zarys techniki. Dekstran-czerwony jest stosowany jako roztwór do wstrzykiwań, aby umożliwić śledzenie miejsca wstrzyknięcia oraz skuteczność i dokładność wstrzyknięcia. Pomyślne dostarczenie roztworu zilustrowano na rycinie 4 przedstawiającym niedawno wstrzyknięty zarodek, w którym barwnik jest jednorodnie rozprowadzony w cytoplazmie. Za pomocą tej techniki 100% zarodków jest wstrzykiwanych do ich cytoplazmy.

Ten protokół wykazał minimalne wskaźniki lizy u zygot bydlęcych i owczych. Tylko 15,6 ± 5 i 5,8 ± 3,9% wstrzykniętych zarodków poddano lizie odpowiednio u bydła i owiec w wyniku mikroiniekcji (ryc. 5). Ponadto, jak pokazano na rycinie 6, nie ma statystycznie istotnych różnic w tempie rozwoju blastocyst w grupach kontrolnych i w grupach, którym wstrzyknięto zastrzyki, zarówno dla zarodków bydła (32,8 ± 6,6% kontrolnych, 31,4 ± 5,9%, jak i owiec (40,3 ± 7,8 kontrolnych, 30,3 ± 6,0% wstrzykniętych).

Te wyniki wskazują, że wspomagane laserem wstrzyknięcie docytoplazmatyczne powoduje minimalne uszkodzenia podczas iniekcji i skutkuje normalnym tempem rozwoju blastocysty.

Rysunek 1: Ogólny schemat przedstawiający sposób wytwarzania pipet przytrzymujących i iniekcyjnych. A-B) Pipeta iniekcyjna, C-E) Pipeta trzymająca. A) Delikatnie dotknąć filamentu wyciągniętą pipetą o żądanej średnicy (5 μm). Włącz na krótko grzałkę (pokazaną na pomarańczowo). Spowoduje to lekkie stopienie pipety, dzięki czemu przylgnie ona do filamentu, a po schłodzeniu pipeta pęknie w miejscu styku, powodując proste cięcie. B) Ustawić pipetę pod kątem około 0.5 cm od jej końcówki, umieszczając pipetę w odległości około 10 μm od żarnika grzałki. Kontynuuj ogrzewanie, aż do uzyskania żądanego kąta. C) Za pomocą pisaka z diamentową końcówką oznacz i przytnij pipetę trzymającą o żądanej średnicy (180 μm). D) W pozycji pionowej wypolerować ogniowo końcówkę pipety podtrzymującej, aż osiągnie żądaną średnicę wewnętrzną (40 μm). E) Ustaw pipetę pod kątem, ustawiając ją z powrotem w pozycji poziomej w odległości kilku μm od filamentu i około 0.5 cm od jej końcówki. Aktywuj grzałkę, aby zgiąć pipetę nad filamentem. Kontynuuj ogrzewanie, aż do uzyskania żądanego kąta. Zobacz 8,9,10, aby uzyskać więcej informacji na temat robienia igieł. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Ogólna konfiguracja naczynia iniekcyjnego. Rozmieszczenie pipet, kropli i zarodków jest pokazane na tym rysunku. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 3: Protokół wstrzyknięcia docytoplazmatycznego wspomaganego laserem. A) Ogólny schemat zygoty przymocowanej do pipety podtrzymującej przed wstrzyknięciem. PB: Ciała polarne, ZP: zona pellucida, Cyt: Cytoplazma, PN: przedjądrza, PM: błona plazmatyczna, HP: pipeta trzymająca, IP: pipeta iniekcyjna. B-E) Etapy mikroiniekcji: B) Wykonać otwór w ZP zygoty przymocowanej do pipety trzymającej za pomocą lasera. C) Wprowadzić pipetę do wstrzykiwań w kierunku przeciwnej strony zarodka. Sprawdź położenie łąkotki (a). D) Przeciąć błonę plazmatyczną, odsysając zawartość cytoplazmatyczną do pipety iniekcyjnej. E) Wstrzyknąć z powrotem zawartość cytoplazmatyczną i roztwór do cytoplazmy jarzmowej, aż menisk osiągnie jedną średnicę zygoty (b) poza punktem początkowym. Odległość a-b odpowiada ~ 7 pl wstrzykniętego roztworu. F) Ogólny schemat zygoty po wstrzyknięciu. Należy zauważyć, że wstrzyknięty roztwór jednorodnie rozprzestrzenia się do cytoplazmy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 4: Reprezentatywny rysunek wstrzykniętej zygoty z dekstranem-czerwonym. A) Obraz w jasnym polu wstrzykniętej zygoty B) Fluorescencyjny obraz wstrzykniętej zygoty. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 5: Odsetek zlizowanych zarodków po mikroiniekcji zygoty u dwóch różnych gatunków. Dane dotyczą 4 powtórzeń dla zarodków bydlęcych (łącznie 103 wstrzyknięte zygoty) i 3 powtórzeń dla zarodków owczych (łącznie 173 zygoty, którym wstrzyknięto). Słupki błędów reprezentują s.e.m. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 6: Częstość występowania blastocyst w zarodkach bydlęcych i owczych. Dane dotyczą 4 powtórzeń w przypadku bydła z łączną liczbą 102 zarodków kontrolnych i 156 zarodków kontrolnych oraz 3 powtórzeń w przypadku owiec, w których łącznie 163 zarodki zostały wstrzyknięte i 239 zarodków kontrolnych. Słupki błędów reprezentują s.e.m. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.