Wspomagana laserowo mikroiniekcja cytoplazmatyczna u zygot zwierząt gospodarskich

Podsumowanie

Ten protokół pokazuje, jak wykonać mikroiniekcję cytoplazmatyczną u zygot zwierząt hodowlanych. Technika ta może być wykorzystana do dostarczenia dowolnego roztworu do zarodka jednokomórkowego, takiego jak narzędzia do edycji genomu w celu wygenerowania zwierząt z nokautem.

Streszczenie

Mikroiniekcja cytoplazmatyczna do jednokomórkowych embrionów jest bardzo potężną techniką. Na przykład umożliwia dostarczenie narzędzi do edycji genomu, które mogą tworzyć modyfikacje genetyczne, które będą obecne w każdej komórce dorosłego organizmu. Może być również stosowany do dostarczania siRNA, mRNA lub przeciwciał blokujących w celu badania funkcji genów w zarodkach preimplantacyjnych. Konwencjonalna technika mikroiniekcji zarodków stosowana u gryzoni polega na bardzo cienkiej mikropipecie, która bezpośrednio przenika przez błonę plazmatyczną po wprowadzeniu do zarodka. Gdy ta technika jest stosowana u zwierząt gospodarskich, zwykle skutkuje niską wydajnością. Dzieje się tak głównie dlatego, że w przeciwieństwie do myszy i szczurów, zygoty bydlęce, owcze i świńskie mają bardzo ciemną cytoplazmę i wysoce elastyczną błonę plazmatyczną, co utrudnia wizualizację podczas wstrzykiwania i penetracji błony plazmatycznej. W tym protokole opisujemy odpowiednią metodę mikroiniekcji do dostarczania roztworów do cytoplazmy zygot bydlęcych, która okazała się skuteczna również w przypadku zarodków owiec i świń. Najpierw laser służy do tworzenia w osłonie przejrzystej. Następnie przez otwór wprowadza się szklaną mikropipetę o końcu i przesuwa się do momentu, gdy końcówka igły dotrze około 3/4 do zarodka. Następnie błona plazmatyczna zostaje przerwana przez aspirację zawartości cytoplazmatycznej wewnątrz igły. Na koniec zasysana zawartość cytoplazmatyczna, a następnie roztwór będący przedmiotem zainteresowania, jest wstrzykiwana z powrotem do cytoplazmy embrionalnej. Protokół ten został z powodzeniem wykorzystany do dostarczania różnych roztworów do zygot bydlęcych i owczych ze 100% wydajnością, minimalną lizą i normalnym tempem rozwoju blastocyst.

Wprowadzenie

Mikroiniekcja cytoplazmatyczna zarodków 1-komórkowych jest bardzo skuteczną techniką. Może być używany do dostarczania dowolnego roztworu do zarodka, na przykład w celu wytworzenia nokautów genów w celu badania funkcji genów lub do generowania zwierząt z edytowanymi genami. Większość zygot zwierząt gospodarskich o znaczeniu rolniczym ma bardzo wysoki skład kwasów tłuszczowych, który sprawia, że ich cytoplazma jest nieprzezroczysta i ciemna¹. Mają też dość elastyczną błonę plazmatyczną (PM). Te cechy sprawiają, że mikroiniekcja przy użyciu konwencjonalnej iniekcji przedjądrowej/cytoplazmatycznej, stosowanej u gatunków gryzoni, jest trudna i często niedokładn....

Protokół

1. Produkcja mikropipet

1. Mikropipeta iniekcyjna
   1. Umieść kapilarnę ze szkła borokrzemianowego (średnica zewnętrzna (OD): 1.0 mm, średnica wewnętrzna (ID): 0.75 mm) w ściągaczu do mikropipet (pośrodku prawego i lewego uchwytu kapilary) i zablokuj ją.
   2. Użyj odpowiedniego programu, aby pociągnąć szklaną kapilę tak, aby uzyskać cienką końcówkę z długim gwintownikiem. (Przykład: Ciepło: 825; Uciąg: 30; Prędkość: 120; Czas: 200; Ciśnienie: 500).
   3. Ostrożnie wyjmij wyciągnięte pipety z urządzenia i umieść je na mikrokuźni w pozycji poziomej.
   4. Ustaw ostrość wyciągniętej pipety i żarnika microforge z kulką szklaną. Za pomocą si....

Wyniki

Mikroiniekcja cytoplazmatyczna wspomagana laserem to skuteczny i niezawodny protokół wprowadzania roztworów do cytoplazmy zygot zwierząt hodowlanych. Rysunek 3 przedstawia ogólny zarys zygot przed i po iniekcji, a także ogólny schemat techniki. W celu monitorowania miejsca iniekcji oraz oceny jej wydajności i precyzji jako roztworu wstrzykiwanego zastosowano dekstran-red. Skuteczne wprowadzenie roztworu zilustrowano na Rysunku 4, przedstawiającym niedawno.......

Dyskusja

Mikroiniekcja zygot jest dobrze znaną metodą wprowadzania roztworów do zarodków ssaków. Z pewnymi różnicami w zależności od gatunku i celu eksperymentu, technika ta może być szeroko stosowana. Pokazujemy, jak wykonać mikroiniekcję docytoplazmatyczną za pomocą lasera, aby wspomóc wejście mikropipety z końcem. Zygoty niektórych gatunków zwierząt gospodarskich (takich jak bydło, owce i świnie) mają ciemną cytoplazmę, co utrudnia wizualizację pipety do wstrzykiwań wewnątrz zarodka. Ponadto ich błony plazmatyczne są bardzo el.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Ściągacz do mikropipet	Sutter Instrument	P-97
Kapilara szklana	Instrumenty Sutter	B100-75-10	Te kapilary służą do wykonywania pipet do przytrzymywania i wstrzykiwania. Można użyć dowolnych grubych/standardowych rur borokrzemianowych bez żarnika.
Microforge	Narishige	MF-9	Wyposażony w soczewkę o powiększeniu 10X.
Mikromanipulator	Nikon/ Narishige	NT88-V3
Mikroskop odwrócony	Nikon	TE2000-U	Wyposażony w obiektywy 4X, 20X oraz w system laserowy.
Laserowe	instrumenty badawcze	7-47-500	Saturn 5 Aktywny laser.
Mikrodozownik	Drummond	3-000-105	Mikrodozownik służy do przenoszenia zarodków. Można również użyć pipety p10, ale ładującej jak najmniejszą objętość.
Naczynie hodowlane 100 x 15 mm	Falcon	351029	Użyj pokrywki naczynia, aby wykonać płytkę iniekcyjną, ponieważ mają one dolne ścianki i ułatwiają pozycjonowanie i przesuwanie mikromanipulatora. Można również użyć pokrywki naczynia hodowlanego o średnicy 60 mm.
Naczynie hodowlane 35 mm	Corning	430165	Te naczynia są używane do hodowli zarodków w 50 μ l krople pokryte olejem mineralnym. Alternatywnie można również użyć naczynia 4-dołkowego. Niezależnie od wybranej dawki do hodowli zarodków, zawsze muszą one być zrównoważone w inkubatorze przez co najmniej 4 godziny przed przeniesieniem zarodków do nich.
Inkubator	Sanyo	MCO-19AIC	Dowolny inkubator, który można ustawić na 38,5 ° C, można zastosować warunki 5% CO2.
Mikroskop stereoskopowy	Nikon	SMZ800	Służy do wizualizacji zarodków w kroplach hodowlanych i podczas mycia. Można użyć dowolnego mikroskopu stereoskopowego o powiększeniu 10x.
Jednostka sterująca HT	Minitube	12055/0400	System grzewczy podłączony do stereomikroskopu.
Podgrzewany stolik mikroskopowy	Minitube	12055/0003	System grzewczy dołączony do mikroskopu stereoskopowego.
Dextran-Red	Thermo Scientific	D1828	Do wstrzykiwań stosuje się sterylny roztwór o stężeniu 10 mg/ml.
Olej mineralny	sigma	M8410	Olej mineralny należy przechowywać w temperaturze pokojowej i  chronić przed światłem za pomocą papieru foliowego.
KSOMaa Evolve Bovine	Zenit	ZEBV-100	Uzupełniony o 4 mg/ml BSA. Płytki KSOM do hodowli zarodków należy przechowywać w inkubatorze przez co najmniej 4 godziny przed użyciem.
FBS	Gemini-Bio	100-525	Użyj FBS z kwalifikacją komórek macierzystych.
Zygoty			Zygoty wstrzykuje się 17 - 20 hpf i mogą pochodzić in vitro lub in vivo.
NaCl	Sigma	S5886	Stężenie końcowe: 107,7 mM. Składnik podłoża SOF-HEPES.
KCl	Sigma	P5405	Stężenie końcowe: 7,16 mM. Składnik podłoża SOF-HEPES.
KH2PO4	Sigma	P5655	Stężenie końcowe: 1,19 mM. Składnik podłoża SOF-HEPES.
MgCl2 6H2O	Sigma	M2393	Stężenie końcowe: 0,49 mM. Składnik podłoża SOF-HEPES.
DL-mleczan sodu	Sigma	L4263	Stężenie końcowe: 5,3 mM. Składnik podłoża SOF-HEPES.
CaCl2-2H2O	Sigma	C7902	Stężenie końcowe: 1,71 mM. Składnik podłoża SOF-HEPES.
D-(−)-Fruktoza	Sigma	F3510	Stężenie końcowe: 0,5 mM. Składnik podłoża SOF-HEPES.
HEPES	Sigma	H4034	Stężenie końcowe: 21 mM. Składnik podłoża SOF-HEPES.
MEM-NEAA	Sigma	M7145	Stężenie końcowe: 1x. Składnik podłoża SOF-HEPES.
BME-EAA	Sigma	B6766	Stężenie końcowe: 1x. Składnik pożywki SOF-HEPES.
NaHCO3	Sigma	S5761	Stężenie końcowe: 4 mM. Składnik podłoża SOF-HEPES.
Pirogronian sodu	Sigma	P4562	Stężenie końcowe: 0,33 mM. Składnik podłoża SOF-HEPES.
Glutamax	Gibco	35050	Stężenie końcowe: 1 mM. Składnik podłoża SOF-HEPES.
BSA	Sigma	A-3311	Stężenie końcowe: 1 mg/ml. Składnik pożywki SOF-HEPES.
Gentamycyna	Sigma	G-1397	Stężenie końcowe: 5 μ g/ml. Składnik podłoża SOF-HEPES.
Woda do transferu zarodków	Sigma	W1503	Składnik pożywki SOF-HEPES.
Podłoże SOF-HEPES	Wyprodukowano w laboratorium		pH 7,3 - 7,4, 280 ± 10 mOs. Filtr sterylizowany przez 22 μ m filtr można przechowywać w lodówce w temperaturze 4 stopni C przez 1 miesiąc. Ciepło w 37 stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem.