Wspomagana laserowo mikroiniekcja cytoplazmatyczna u zygot zwierząt gospodarskich

Podsumowanie

Ten protokół pokazuje, jak wykonać mikroiniekcję cytoplazmatyczną u zygot zwierząt hodowlanych. Technika ta może być wykorzystana do dostarczenia dowolnego roztworu do zarodka jednokomórkowego, takiego jak narzędzia do edycji genomu w celu wygenerowania zwierząt z nokautem.

Streszczenie

Mikroiniekcja cytoplazmatyczna do jednokomórkowych embrionów jest bardzo potężną techniką. Na przykład umożliwia dostarczenie narzędzi do edycji genomu, które mogą tworzyć modyfikacje genetyczne, które będą obecne w każdej komórce dorosłego organizmu. Może być również stosowany do dostarczania siRNA, mRNA lub przeciwciał blokujących w celu badania funkcji genów w zarodkach preimplantacyjnych. Konwencjonalna technika mikroiniekcji zarodków stosowana u gryzoni polega na bardzo cienkiej mikropipecie, która bezpośrednio przenika przez błonę plazmatyczną po wprowadzeniu do zarodka. Gdy ta technika jest stosowana u zwierząt gospodarskich, zwykle skutkuje niską wydajnością. Dzieje się tak głównie dlatego, że w przeciwieństwie do myszy i szczurów, zygoty bydlęce, owcze i świńskie mają bardzo ciemną cytoplazmę i wysoce elastyczną błonę plazmatyczną, co utrudnia wizualizację podczas wstrzykiwania i penetracji błony plazmatycznej. W tym protokole opisujemy odpowiednią metodę mikroiniekcji do dostarczania roztworów do cytoplazmy zygot bydlęcych, która okazała się skuteczna również w przypadku zarodków owiec i świń. Najpierw laser służy do tworzenia w osłonie przejrzystej. Następnie przez otwór wprowadza się szklaną mikropipetę o końcu i przesuwa się do momentu, gdy końcówka igły dotrze około 3/4 do zarodka. Następnie błona plazmatyczna zostaje przerwana przez aspirację zawartości cytoplazmatycznej wewnątrz igły. Na koniec zasysana zawartość cytoplazmatyczna, a następnie roztwór będący przedmiotem zainteresowania, jest wstrzykiwana z powrotem do cytoplazmy embrionalnej. Protokół ten został z powodzeniem wykorzystany do dostarczania różnych roztworów do zygot bydlęcych i owczych ze 100% wydajnością, minimalną lizą i normalnym tempem rozwoju blastocyst.

Wprowadzenie

Mikroiniekcja cytoplazmatyczna zarodków 1-komórkowych jest bardzo skuteczną techniką. Może być używany do dostarczania dowolnego roztworu do zarodka, na przykład w celu wytworzenia nokautów genów w celu badania funkcji genów lub do generowania zwierząt z edytowanymi genami. Większość zygot zwierząt gospodarskich o znaczeniu rolniczym ma bardzo wysoki skład kwasów tłuszczowych, który sprawia, że ich cytoplazma jest nieprzezroczysta i ciemna¹. Mają też dość elastyczną błonę plazmatyczną (PM). Te cechy sprawiają, że mikroiniekcja przy użyciu konwencjonalnej iniekcji przedjądrowej/cytoplazmatycznej, stosowanej u gatunków gryzoni, jest trudna i często niedokładna.

Mikroiniekcja cytoplazmatyczna ma przewagę nad mikroiniekcją projądrową, ponieważ jest łatwiejsza do wykonania, a także powoduje mniejsze uszkodzenia wstrzykniętych zarodków, co skutkuje wyższą żywotnością². Ogólnym celem tego protokołu jest zademonstrowanie skutecznej metody dostarczania roztworów do cytoplazmy zygot zwierząt gospodarskich. Aby móc wykonać mikroiniekcję cytoplazmatyczną z wysoką skutecznością na zarodkach zwierząt gospodarskich, do wygenerowania otworu w osłonie przejrzystej (ZP) wykorzystuje się laser, a następnie do mikroiniekcji używa się szklanej igły o końcu. Strategia ta ma na celu zmniejszenie uszkodzeń mechanicznych odciskających się na zarodku podczas iniekcji. Następnie, aspiracja zawartości cytoplazmatycznej do wnętrza igły iniekcyjnej pozwala na skuteczne i pewne złamanie PM, zapewniając, że roztwór zostanie dostarczony do cytoplazmy zarodka.

Ta technika została już z powodzeniem wykorzystana na bydlęcych embrionach do dostarczania siRNA do cytoplazmy zygotycznej^3,4 i generowania mutacji za pomocą zgrupowanych regularnie rozmieszczonych krótkich powtórzeń palindromicznych (CRISPR) / systemu związanego z CRISPR 9 (Cas9)⁵. Nadaje się również (z niewielkimi modyfikacjami) do wstrzykiwania oocytów zamkniętych w kłębikach bydlęcych⁶. W tym miejscu opisujemy nasz protokół iniekcji dostarczający barwnik, który może być stosowany do wstrzykiwania dowolnego pożądanego roztworu do zygoty i pokazujemy, że użycie tej techniki powoduje minimalną lizę i nie wpływa na wczesny rozwój zarodka.

Protokół

1. Produkcja mikropipet

1. Mikropipeta iniekcyjna
   1. Umieść kapilarnę ze szkła borokrzemianowego (średnica zewnętrzna (OD): 1.0 mm, średnica wewnętrzna (ID): 0.75 mm) w ściągaczu do mikropipet (pośrodku prawego i lewego uchwytu kapilary) i zablokuj ją.
   2. Użyj odpowiedniego programu, aby pociągnąć szklaną kapilę tak, aby uzyskać cienką końcówkę z długim gwintownikiem. (Przykład: Ciepło: 825; Uciąg: 30; Prędkość: 120; Czas: 200; Ciśnienie: 500).
   3. Ostrożnie wyjmij wyciągnięte pipety z urządzenia i umieść je na mikrokuźni w pozycji poziomej.
   4. Ustaw ostrość wyciągniętej pipety i żarnika microforge z kulką szklaną. Za pomocą siatki ocznej zmierz żądaną grubość i przesuwaj pipetę poziomo, aż żarnik grzałki osiągnie docelową średnicę wewnętrzną (5 μm).
   5. Dostosuj temperaturę do około 45% i delikatnie opuść pipetę, aby dotykała filamentu. Włącz na chwilę grzałkę. Spowoduje to lekkie stopienie pipety, dzięki czemu przylega ona do filamentu, a po schłodzeniu pipeta pęknie w miejscu styku, generując proste cięcie.
      Uwaga: Ustawienie odpowiedniej temperatury ma kluczowe znaczenie na tym etapie, ponieważ zbyt wysokie temperatury spowodują, że pipeta będzie się wyginać, a tym samym proste cięcie nie będzie możliwe, a zbyt niskie temperatury nie będą wystarczające do stopienia pipety (Rysunek 1A).
   6. Ustaw przybliżony kąt 30° w pobliżu końcówki pipety, umieszczając ją w odległości około 10 μm od żarnika grzałki. Ustaw temperaturę na 60% i włącz grzałkę.
      Uwaga: Spowoduje to zgięcie pipety nad żarnikiem. Kąt ten jest pożądany, aby końcówka igły była równoległa do powierzchni płytki iniekcyjnej po zamontowaniu we wtryskiwaczu (rysunek 1B).
   7. Z pipetami do mikroiniekcji należy obchodzić się ostrożnie, ponieważ są one niezwykle ostre i delikatne.
2. Trzymanie mikropipety
   1. Umieść kapilarę ze szkła borokrzemianowego (OD: 1.0 mm, ID: 0.75 mm) w ściągaczu do mikropipet (pośrodku prawego i lewego uchwytu kapilary) i zablokuj ją.
   2. Użyj odpowiedniego programu, aby pociągnąć szklaną kapilę tak, aby uzyskać cienką końcówkę o długim, równym zwężaniu się i równoległych ściankach (Przykład: Ciepło: 815; Uciąg: 20; Prędkość: 140; Czas: 175; Ciśnienie: 200).
   3. Ostrożnie wyjmij wyciągniętą pipetę z urządzenia ściągającego i umieść ją na uchwycie mikrokuźni w pozycji poziomej. Ustaw ostrość na żarniku grzałki i pipecie.
   4. Za pomocą siatki okularowej zmierz średnicę pipety i przesuwaj pipetę, aż jej średnica nad włóknem osiągnie 180 μm.
   5. Przy wskazanym rozmiarze zaznacz szklaną kapilarnę pisakiem z diamentową końcówką, a następnie delikatnie naciśnij wyciągniętą końcówkę, aby rozbić szkło. Powinno to skutkować prostym cięciem (Rysunek 1C).
   6. Przesuń pipetę do pozycji pionowej tak, aby jej końcówka znajdowała się blisko filamentu. Ustaw temperaturę mikrokuźni na 60%.
   7. Wypoleruj końcówkę pipety metodą ogniową przy użyciu standardowych technik⁷, aż osiągnie średnicę wewnętrzną 40 μm. Użyj siatki celowniczej okularu, aby sprawdzić średnicę wewnętrzna (Rysunek 1D).
   8. Ustaw kąt na pipecie.
      1. Ustaw pipetę z powrotem w pozycji poziomej w odległości około 10 μm od filamentu i 5 mm od jego końcówki. Ustaw temperaturę na około 60% i włącz grzałkę, aby zgiąć pipetę nad filamentem. Kontynuuj podgrzewanie, aż zostanie osiągnięty żądany kąt (około 30^o). Sprawdź wizualnie kąt (Rysunek 1E).
         Uwaga: Pipeta jest zwykle montowana do mikroiniektora pod przybliżonym kątem 60^o w stosunku do dna naczynia iniekcyjnego. Końcówka pipety jest wygięta tak, aby była równoległa do dna naczynia, co jest niezbędne do prawidłowego wstrzyknięcia zarodka w jego środkowej płaszczyźnie.

2. Konfiguracja mikromanipulatora

1. Sprawdź, czy mikrowtryskiwacze są w pełni załadowane olejem i czy w układzie nie ma pęcherzyków powietrza (pęcherzyki w mikrowtryskiwaczu uniemożliwiają precyzyjną kontrolę wtrysku).
2. Sprawdź, czy mikromanipulatory są w pozycji środkowej. Pozwoli to na szeroki zakres ruchu pipet.
3. Włóż pipetę podtrzymującą do lewego uchwytu mikromanipulatora, a pipetę iniekcyjną do prawego uchwytu do mikromanipulacji.
4. Pozwól, aby olej dostał się do pipet przez kapilarność i sprawdź, czy system działa prawidłowo, przesuwając olej w górę i w dół wewnątrz pipety za pomocą elementów sterujących mikrowtryskiwacza.
   Uwaga: Jeśli nie ma ruchu oleju wewnątrz igieł, może dojść do zatkania. W takim przypadku użyj nowej igły.
5. Użyj elementów sterujących mikromanipulatora, aby ustawić pipety w środku pola widzenia mikroskopu. Korzystając z 4-krotnego powiększenia, sprawdź, czy końcówki mikropipet są ustawione pod odpowiednim kątem (równolegle do dna naczynia).
   Uwaga: Prawidłowe ustawienie igieł ma kluczowe znaczenie dla udanego wstrzyknięcia i spójności wyników.
6. Skalibruj system laserowy zgodnie z instrukcją kalibracji producenta.

3. Przygotowanie naczynia do iniekcji (Rysunek 2)

1. Umieść 50 μl kropli podgrzanego (37 °C) SOF-HEPES (skład szczegółowo opisany w sekcji materiały) uzupełnionej 20% płodową surowicą bydlęcą (FBS) na środku pokrywy płytki Petriego o średnicy 100 mm. Umieścić 1-2 μl kropli roztworu do wstrzyknięcia w pobliżu kropli do wstrzykiwania. Upewnij się, że zarodki nie schładzają się poniżej RT.
   Uwaga: W tym protokole dodamy barwnik Dextran-Red do roztworu do wstrzykiwań, aby móc uwidocznić miejsce wstrzyknięcia i śledzić je później.
2. Przykryć krople w płytce iniekcyjnej około 10 ml oleju mineralnego.
3. Umieścić naczynie iniekcyjne na stoliku mikroskopu odwróconego i umieścić pipety w kropli iniekcyjnej. Sprawdź, czy igły są ostre wewnątrz kropli. Dostosuj ich wysokość w razie potrzeby za pomocą elementów sterujących mikromanipulatora.
4. Za pomocą mikrodozownika załadować około 20 - 30 zygot (17 - 20 godzin po zapłodnieniu (hpf)) w górną stronę kropli iniekcyjnej. Wstrzyknięcie należy wykonać w temperaturze pokojowej, tak aby liczba zarodków w kropli do wstrzykiwania była określona na podstawie szybkości, z jaką dana osoba może je wstrzyknąć. Nie należy ładować więcej zarodków niż te, które można wstrzyknąć w ciągu 30 minut.
   1. Aby załadować zarodki do mikrodozownika, należy całkowicie wcisnąć tłok i zanurzyć końcówkę w roztworze zawierającym zarodki. Dotknij zarodków, które mają zostać podniesione, końcówką szklanej kapilary (pojedynczo) i powoli zwolnij tłok, aby każdy zarodek wszedł do naczynia włosowatego. Powtarzaj tę czynność, aż wszystkie zarodki zostaną zebrane lub pojemność mikrodozownika będzie pełna.
   2. Aby uwolnić załadowane zarodki, należy delikatnie wcisnąć tłok, aż cała objętość zawierająca zarodki zostanie uwolniona z naczynia włosowatego.

4. Mikroiniekcja

1. Używając obiektywu 4X, załaduj roztwór do wstrzyknięcia do pipety iniekcyjnej, stosując podciśnienie (zasysanie). Załadować roztwór wystarczający do wstrzyknięcia 2-3 zygot. Następnie przejdź do kropli do wstrzykiwań.
2. W obrębie kropli iniekcyjnej przesunąć pipetę przytrzymującą tak, aby końcówka zbliżyła się do zygoty. Zastosuj podciśnienie (aspirat) za pomocą mikroiniektora przytrzymującego, aby zygota została przymocowana do pipety podtrzymującej i zmień obiektyw na 20X.
3. Po przymocowaniu zygoty do pipety podtrzymującej sprawdź jej jakość za pomocą pipety do wstrzykiwań, aby delikatnie przesunąć zarodek bez jego odłączania. Dobrej jakości zygota powinna mieć dwa ciała biegunowe (chociaż czasami widać tylko jedno) i jednorodną cytoplazmę. Nie należy wstrzykiwać nieprawidłowych zygot (ryc. 3A).
4. W razie potrzeby należy zmienić położenie zarodka w celu uzyskania właściwego miejsca wstrzyknięcia. Dobrym pozycjonowaniem byłoby takie, w którym jest pewna przestrzeń między ZP a PM, aby PM nie został uszkodzony przez laser.
5. Sprawdzić, czy pipeta do wstrzykiwań jest umieszczona na środkowej płaszczyźnie zarodka, delikatnie dotykając zygoty w miejscu wstrzyknięcia. Jeśli nie znajduje się na płaszczyźnie środkowej, igła będzie miała tendencję do obracania zarodka zamiast do nakłucia. W razie potrzeby wyreguluj wysokość pipety iniekcyjnej.
6. Wykonaj otwór w ZP za pomocą lasera (rysunek 3B).
   1. Za pomocą oprogramowania lasera umieść siatkę laserową w ZP, w miejscu, w którym zostanie wykonany otwór (po przeciwnej stronie niż miejsce, w którym zarodek jest przymocowany do pipety trzymającej). Korzystając z okna sterowania laserem, kliknij przycisk ognia. Upewnij się, że rozmiar otworu jest wystarczająco duży, aby utworzyć otwór w ZP, przez który igła może przejść bez uszkodzenia PM (przykład: szerokość impulsu 0,662 ms / rozmiar otworu 6,9 μm).
7. Przełóż igłę do wstrzykiwań przez otwór w ZP i zetknij się z PM. Kontynuuj popychanie pipety do przodu, aż igła znajdzie się w 3/4 drogi do zarodka (ryc. 3C).
8. Obserwuj położenie menisku na interfazie roztwór-olej, ponieważ będzie to wykorzystywane do konsekwentnej kontroli objętości wtrysku.
9. Zastosować podciśnienie (aspirat) na pipetę iniekcyjną, co spowoduje zassanie PM i cytoplazmy do igły iniekcyjnej. Kontynuuj, aż ruch cytoplazmy do igły przyspieszy lub gdy będzie można zauważyć mieszanie się cytoplazmy z roztworem do wstrzykiwań. Będą one wskazywać na pęknięcie PM (rysunek 3D).
10. Wstrzyknąć z powrotem zawartość cytoplazmatyczną, a następnie roztwór do cytoplazmy zygoty, stosując nadciśnienie (wstrzyknięcie), aż menisk na interfazie roztwór-olej przesunie się o jeden odpowiednik średnicy zygoty poza punkt początkowy.
    Uwaga: W naszych warunkach odpowiada to około 7 pl wstrzykniętego roztworu (ryc. 3E).
11. Zmień obiektyw na 4X i przesuń wstrzyknięty zarodek/zarodki na dolną stronę kropli do wstrzykiwania. Uwolnić zarodek, wywierając dodatni nacisk na mikrowstrzykiwacz podtrzymujący. Trzymaj zarodki, którym nie wstrzyknięto, należy trzymać na górnej stronie, a zarodki, którym wstrzyknięto, na dolnej stronie kropli, aby śledzić zarodki, w które wstrzyknięto/nie wstrzyknięto zarodków i pracować wydajnie.

5. Wyniki odzyskiwania zarodków i iniekcji

1. Przygotuj 3 krople po około 200 μl w nowym naczyniu z podgrzanym SOF-HEPES. Pobrać wstrzyknięte zarodki za pomocą mikrodozownika (jak opisano powyżej). Umyj wstrzyknięte zarodki, przesuwając je przez 3 krople SOF-HEPES.
2. Policz zarodki poddane lizie podczas mikroiniekcji i wyrzuć je.
   Uwaga: Lizowaną zygotę można łatwo odróżnić od nienaruszonej, ponieważ pierwsza z nich wydaje się półprzezroczysta, wypełnia cały ZP i zwykle ma zawartość cytoplazmatyczną wyciekającą na zewnątrz zarodka.
3. Opcjonalnie należy sprawdzić skuteczność mikroiniekcji za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Należy pamiętać, że ekspozycja na światło UV może wywołać uszkodzenie zarodka, które może wpłynąć na późniejszy rozwój.
4. Grupy hodowlane składające się z 25 wstrzykniętych zarodków w 50 μl kropli pożywki optymalizacyjnej potasu pospolitego (KSOM) uzupełnionej 4 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w oleju mineralnym w temperaturze 38,5 °C, 5% CO₂ w powietrzu i wilgotności do nasycenia.
5. Uzupełnij pożywkę hodowlaną 5% FBS dwa dni po wstrzyknięciu.
6. Sprawdź częstość występowania blastocysty (BL) 7 dni po wstrzyknięciu. Obliczyć wskaźniki BL jako całkowitą liczbę zarodków blastocysty/całkowitą liczbę zarodków wyhodowanych w tym kropli.

Wyniki

Mikroiniekcja cytoplazmatyczna wspomagana laserem to skuteczny i niezawodny protokół wprowadzania roztworów do cytoplazmy zygot zwierząt hodowlanych. Rysunek 3 przedstawia ogólny zarys zygot przed i po iniekcji, a także ogólny schemat techniki. W celu monitorowania miejsca iniekcji oraz oceny jej wydajności i precyzji jako roztworu wstrzykiwanego zastosowano dekstran-red. Skuteczne wprowadzenie roztworu zilustrowano na Rysunku 4, przedstawiającym niedawno...

Dyskusja

Mikroiniekcja zygot jest dobrze znaną metodą wprowadzania roztworów do zarodków ssaków. Z pewnymi różnicami w zależności od gatunku i celu eksperymentu, technika ta może być szeroko stosowana. Pokazujemy, jak wykonać mikroiniekcję docytoplazmatyczną za pomocą lasera, aby wspomóc wejście mikropipety z końcem. Zygoty niektórych gatunków zwierząt gospodarskich (takich jak bydło, owce i świnie) mają ciemną cytoplazmę, co utrudnia wizualizację pipety do wstrzykiwań wewnątrz zarodka. Ponadto ich błony plazmatyczne są bardzo el...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Ściągacz do mikropipet	Sutter Instrument	P-97
Kapilara szklana	Instrumenty Sutter	B100-75-10	Te kapilary służą do wykonywania pipet do przytrzymywania i wstrzykiwania. Można użyć dowolnych grubych/standardowych rur borokrzemianowych bez żarnika.
Microforge	Narishige	MF-9	Wyposażony w soczewkę o powiększeniu 10X.
Mikromanipulator	Nikon/ Narishige	NT88-V3
Mikroskop odwrócony	Nikon	TE2000-U	Wyposażony w obiektywy 4X, 20X oraz w system laserowy.
Laserowe	instrumenty badawcze	7-47-500	Saturn 5 Aktywny laser.
Mikrodozownik	Drummond	3-000-105	Mikrodozownik służy do przenoszenia zarodków. Można również użyć pipety p10, ale ładującej jak najmniejszą objętość.
Naczynie hodowlane 100 x 15 mm	Falcon	351029	Użyj pokrywki naczynia, aby wykonać płytkę iniekcyjną, ponieważ mają one dolne ścianki i ułatwiają pozycjonowanie i przesuwanie mikromanipulatora. Można również użyć pokrywki naczynia hodowlanego o średnicy 60 mm.
Naczynie hodowlane 35 mm	Corning	430165	Te naczynia są używane do hodowli zarodków w 50 μ l krople pokryte olejem mineralnym. Alternatywnie można również użyć naczynia 4-dołkowego. Niezależnie od wybranej dawki do hodowli zarodków, zawsze muszą one być zrównoważone w inkubatorze przez co najmniej 4 godziny przed przeniesieniem zarodków do nich.
Inkubator	Sanyo	MCO-19AIC	Dowolny inkubator, który można ustawić na 38,5 ° C, można zastosować warunki 5% CO2.
Mikroskop stereoskopowy	Nikon	SMZ800	Służy do wizualizacji zarodków w kroplach hodowlanych i podczas mycia. Można użyć dowolnego mikroskopu stereoskopowego o powiększeniu 10x.
Jednostka sterująca HT	Minitube	12055/0400	System grzewczy podłączony do stereomikroskopu.
Podgrzewany stolik mikroskopowy	Minitube	12055/0003	System grzewczy dołączony do mikroskopu stereoskopowego.
Dextran-Red	Thermo Scientific	D1828	Do wstrzykiwań stosuje się sterylny roztwór o stężeniu 10 mg/ml.
Olej mineralny	sigma	M8410	Olej mineralny należy przechowywać w temperaturze pokojowej i  chronić przed światłem za pomocą papieru foliowego.
KSOMaa Evolve Bovine	Zenit	ZEBV-100	Uzupełniony o 4 mg/ml BSA. Płytki KSOM do hodowli zarodków należy przechowywać w inkubatorze przez co najmniej 4 godziny przed użyciem.
FBS	Gemini-Bio	100-525	Użyj FBS z kwalifikacją komórek macierzystych.
Zygoty			Zygoty wstrzykuje się 17 - 20 hpf i mogą pochodzić in vitro lub in vivo.
NaCl	Sigma	S5886	Stężenie końcowe: 107,7 mM. Składnik podłoża SOF-HEPES.
KCl	Sigma	P5405	Stężenie końcowe: 7,16 mM. Składnik podłoża SOF-HEPES.
KH2PO4	Sigma	P5655	Stężenie końcowe: 1,19 mM. Składnik podłoża SOF-HEPES.
MgCl2 6H2O	Sigma	M2393	Stężenie końcowe: 0,49 mM. Składnik podłoża SOF-HEPES.
DL-mleczan sodu	Sigma	L4263	Stężenie końcowe: 5,3 mM. Składnik podłoża SOF-HEPES.
CaCl2-2H2O	Sigma	C7902	Stężenie końcowe: 1,71 mM. Składnik podłoża SOF-HEPES.
D-(−)-Fruktoza	Sigma	F3510	Stężenie końcowe: 0,5 mM. Składnik podłoża SOF-HEPES.
HEPES	Sigma	H4034	Stężenie końcowe: 21 mM. Składnik podłoża SOF-HEPES.
MEM-NEAA	Sigma	M7145	Stężenie końcowe: 1x. Składnik podłoża SOF-HEPES.
BME-EAA	Sigma	B6766	Stężenie końcowe: 1x. Składnik pożywki SOF-HEPES.
NaHCO3	Sigma	S5761	Stężenie końcowe: 4 mM. Składnik podłoża SOF-HEPES.
Pirogronian sodu	Sigma	P4562	Stężenie końcowe: 0,33 mM. Składnik podłoża SOF-HEPES.
Glutamax	Gibco	35050	Stężenie końcowe: 1 mM. Składnik podłoża SOF-HEPES.
BSA	Sigma	A-3311	Stężenie końcowe: 1 mg/ml. Składnik pożywki SOF-HEPES.
Gentamycyna	Sigma	G-1397	Stężenie końcowe: 5 μ g/ml. Składnik podłoża SOF-HEPES.
Woda do transferu zarodków	Sigma	W1503	Składnik pożywki SOF-HEPES.
Podłoże SOF-HEPES	Wyprodukowano w laboratorium		pH 7,3 - 7,4, 280 ± 10 mOs. Filtr sterylizowany przez 22 μ m filtr można przechowywać w lodówce w temperaturze 4 stopni C przez 1 miesiąc. Ciepło w 37 stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem.