Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wysokoprzepustowa, wieloobrazowa kriohistologia zmineralizowanych tkanek

16K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54468

⸱

14 września 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Reconstructive Sciences, University of Connecticut Health Center, 2Department of Computer Science and Engineering, University of Connecticut, 3Department of Orthopaedic Surgery, University of Connecticut Health Center, 4Department of Orthopaedics, University of Rochester

W tym artykule

Podsumowanie

W tym manuskrypcie prezentujemy wysokoprzepustową, półautomatyczną platformę kriohistologiczną do tworzenia wyrównanych obrazów kompozytowych pomiarów wielokrotnej odpowiedzi z kilku rund obrazowania fluorescencyjnego na zamrożonych odcinkach zmineralizowanych tkanek.

Streszczenie

Istnieje rosnące zapotrzebowanie na efektywne fenotypowanie i histopatologię różnych tkanek. Ta potrzeba fenotypowania jest widoczna w ambitnych projektach mających na celu zakłócenie każdego genu w genomie myszy. Społeczność naukowa potrzebuje szybkich i niedrogich środków do fenotypowania tkanek za pomocą histologii. Analizy histologiczne tkanek szkieletowych są często czasochłonne i w najlepszym razie półilościowe, regularnie wymagają subiektywnej interpretacji preparatów od przeszkolonych osób. W tym miejscu przedstawiamy kriohistologiczny paradygmat skutecznego i niedrogiego fenotypowania zmineralizowanych tkanek. W pierwszej kolejności przedstawiamy nowatorską metodę kriosekcji stabilizowanej taśmą, która zachowuje morfologię zmineralizowanych tkanek. Sekcje te są następnie sztywno przylegane do szkiełek szklanych i wielokrotnie obrazowane w kilku rundach barwienia. Powstałe obrazy są następnie wyrównywane ręcznie lub za pomocą oprogramowania komputerowego w celu uzyskania kompozytowych stosów kilku warstwowych obrazów. Protokół pozwala na kolokalizację wielu sygnałów molekularnych do określonych komórek w obrębie danego odcinka. Ponadto te sygnały fluorescencyjne można obiektywnie określić ilościowo za pomocą oprogramowania komputerowego. Protokół ten przezwycięża wiele niedociągnięć związanych z histologią zmineralizowanych tkanek i może służyć jako platforma do wysokoprzepustowego, wysokowartościowego fenotypowania tkanek mięśniowo-szkieletowych.

Wprowadzenie

Badania biologiczne często wymagają efektywnego fenotypowania, co często wiąże się z pewnego rodzaju analizą histologiczną1-3. Potrzeba ta jest jeszcze bardziej widoczna w przypadku ambitnych projektów mających na celu zakłócenie każdego genu w genomie myszy4. Te analizy histologiczne mogą obejmować zarówno ocenę morfologii komórek i/lub cech anatomicznych, jak i mapowanie ekspresji określonych genów lub białek w poszczególnych komórkach. W rzeczywistości jednym z podstawowych wkładów histologii w dziedzinę genomiki jest zdolność do powiązania określonego sygnału molekularnego z określonym regionem lub typem komórki.

Tradycyjne metody histologii, szczególnie dla tkanek mięśniowo-szkieletowych, są często czasochłonne i pracochłonne, czasami wymagają tygodni na utrwalenie, odwapnienie, przecięcie, zabarwienie i zobrazowanie próbki, a następnie analizę obrazów poprzez ludzką interpretację. Analiza wielu sygnałów molekularnych, czy to za pomocą immunohistochemii, hybrydyzacji in situ, czy specjalnych barwień, wymaga wielu sekcji, a nawet wielu próbek, aby działały prawidłowo. Ponadto te wielokrotne odpowiedzi nie mogą być kolokowane w tej samej komórce, a czasami nie mogą być kolokalizowane w określonym regionie w danej próbce. W miarę jak dziedzina genomiki i epigenomiki wkracza w erę cyfrową, dziedzina histologiczna również musi podążać za nimi, aby zapewnić wydajną, wysokowydajną i zautomatyzowaną analizę różnych sygnałów molekularnych w ramach jednego odcinka histologicznego.

Rzeczywiście, istnieje zapotrzebowanie na ulepszone techniki histologiczne, które mogą kojarzyć wiele sygnałów molekularnych z konkretnymi komórkami w danym próbce. Niedawno opublikowaliśmy nową, wysokoprzepustową metodę kriohistologiczną do oceny kilku miar odpowiedzi w danym odcinku ze zmineralizowanej tkanki5-14. Proces polega na ustabilizowaniu kriosekcji za pomocą zamrożonej kriotaśmy, sztywnym przyklejeniu zaklejonej taśmy do szkiełka mikroskopowego oraz przeprowadzeniu kilku rund barwienia i obrazowania na każdej sekcji. Te rundy obrazów są następnie wyrównywane ręcznie lub za pomocą automatyzacji komputerowej przed analizą obrazu (rysunek 1). W tym miejscu przedstawiamy szczegółowe protokoły tego procesu i podajemy przykłady, w których techniki te poprawiły nasze zrozumienie różnych procesów biologicznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Komitet ds. opieki nad zwierzętami i użytkowania zwierząt w Centrum Zdrowia Uniwersytetu Connecticut zatwierdził wszystkie procedury dla zwierząt.

1. Utrwalanie i osadzanie

  1. Poddać zwierzę eutanazji poprzez uduszenie CO2 lub inne zatwierdzone metody.
  2. Pobrać tkankę będącą przedmiotem zainteresowania (np. kończynę, kręgi itp.) i umieścić w 10% neutralnej buforowanej formalinie w temperaturze 4 °C, aż do prawidłowego utrwalenia. Zachowaj szczególną ostrożność, aby utrzymać stałe położenie anatomiczne przed mocowaniem. Na przykład umocuj kończyny ze stawami przy stałym zgięciu, rotacji wewnętrznej i kątach rotacji zewnętrznej11. Zazwyczaj naprawiaj całe kończyny myszy przez 1 - 3 dni.
    Uwaga: Formalina jest toksyczna i należy obchodzić się z nią pod wyciągiem wyciągowym, nosząc odpowiednie środki ochrony osobistej.
    Uwaga: Ramy czasowe mocowania zależą od wielkości próbki. Jeśli eksperyment na to pozwoli, rozcięcie kości poprawi utrwalenie komory szpikowej. Niektóre próbki mogą wymagać utrwalenia perfuzyjnego15 w celu zminimalizowania tła fluorescencyjnego (np. słabe sygnały fluorescencyjne w szpiku kostnym).
  3. Przenieść próbki z formaliny do 30% sacharozy wykonanej w 1x PBS i inkubować przez 12 - 24 godziny w temperaturze 4 °C.
    Uwaga: Po inkubacji przez 12 - 24 godzin, próbki można następnie umieścić w temperaturze -80 °C w celu długotrwałego przechowywania. Ta metoda przechowywania jest zalecana w przypadku eksperymentów, w których badacze zamierzają osadzić wiele próbek w tym samym bloku, ale nie mogą zebrać wszystkich tych próbek w tym samym czasie (np. eksperymenty z wieloma punktami czasowymi).
  4. Usunąć próbki z sacharozy i wyciąć nadmiar tkanki.
  5. Napełnij kriomold (wielkość formy zależy od wielkości próbki) częściowo roztworem do zatapiania kriogenicznego. Umieść próbkę w formie w taki sposób, aby płaszczyzna cięcia dla obszaru zainteresowania była równoległa do dna formy.
    Uwaga: Przykład specyficznego rozmieszczenia i orientacji tkanki można znaleźć na rysunku 2A - B.
  6. Umieść kriomold na kawałku suchego lodu, aż cienka warstwa podłoża do zatapiania w kriogenicznym roztworze zamarznie, a następnie utrwali próbkę na miejscu. Wypełnij pozostałą objętość kriomoldu pożywką do zatapiania kriogenicznego, utrzymując kriomold na granulkach suchego lodu.
  7. Umieść kriomold w pojemniku zawierającym 2-metylo-butan wstępnie schłodzony suchym lodem. Po całkowitym zamrożeniu próbek usuń krioformy i strząśnij nadmiar 2-metylobutanu. Zawiń krioformy w celofan i umieść w zamrażarce o temperaturze -20 °C lub -80 °C do przechowywania.
    Uwaga: Próbki mogą z czasem wyschnąć, gdy są przechowywane w podłożu do zatapiania krio, zwłaszcza w temperaturze -20 °C. Zalecamy przechowywanie próbek przez okres dłuższy niż 1-2 miesiące w podłożu do zatapiania kriogenicznego w temperaturze -80 °C lub w 30% sacharozie w temperaturze -80 °C (patrz krok 1.3).

2. Stabilizowany taśmą podział tkanek

  1. Wyjąć bloki próbki z zamrażarki i umieścić w kriostacie w temperaturze ustawionej między -20 a -25 °C.
  2. Wyjmij blok z kriofordu i odetnij nadmiar podłoża do zatapiania kriogenicznego za pomocą żyletki.
  3. Umieść trochę podłoża do osadzania kriogenicznego na krążku próbki, a następnie wyrównaj blok tak, aby powierzchnia krążka próbki była równoległa do dolnej powierzchni bloku, ustalając w ten sposób odpowiednią płaszczyznę cięcia dla obszaru zainteresowania.
  4. Umieścić krążek z próbką w kriostacie i pozostawić do zamrożenia podłoża do zatapiania kriogenicznego.
  5. Umieść krążek próbki na głowicy próbki i wyreguluj głowicę tak, aby ostrze cięło równolegle do powierzchni bloku próbki.
  6. Przytnij blok do poziomu w obszarze zainteresowania i zetrzyj wszelkie wióry z powierzchni bloku.
  7. Wytnij kawałek kriotaśmy wystarczająco duży, aby pokryć obszar zainteresowania i wstępnie schłodzić w kriostacie.
    Uwaga: Wiele kawałków można ciąć o stałych rozmiarach i przechowywać w kriostacie podczas cięcia.
  8. Usuń nieprzylegający podkład z kriotaśmy, chwytając taśmę za nieklejące się srebrne/złote zakładki za pomocą kleszczy, a następnie umieść taśmę na bloku lepką stroną do dołu.
  9. Dociśnij kriotaśmę za pomocą wałka (Rysunek 2C).
  10. Wykonać przekrój (5 - 8 μm) za pomocą silnika automatycznego lub ręcznego koła tnącego kriostatu.
    Uwaga: Dobrą praktyką jest trzymanie krawędzi kriotaśmy podczas jej wchodzenia na stolik, tak aby sekcja nie spadła ze stołu montażowego podczas cięcia (Rysunek 2D).
  11. Umieść wycinek tkanką do góry na plastikowym szkiełku mikroskopowym w kriostacie.
  12. Zdjąć plastikowe szkiełko z kriostatu i pozwolić, aby podłoże do zatapiania kriogenicznego stopiło się tak, aby sekcja przylegała do powierzchni szkiełka.
  13. Powtórz sekcje dla sekcji szeregowych lub innych obszarów zainteresowania.
  14. Po zakończeniu przechowywać sekcje w pojemniku na szkiełka w temperaturze 4, -20 lub -80 °C, w zależności od wymaganej długości przechowywania i dalszych środków reagowania. Na przykład, jeśli są przechowywane w temperaturze 4 °C, należy użyć szkiełek, które mają być zabarwione pod kątem aktywności enzymatycznej (patrz 5.2-5.3).

3. Przyczepność przekrojów do szkiełek mikroskopowych

  1. Metoda klejenia utwardzana promieniami UV.
    1. Oznacz szkiełko mikroskopu.
      Uwaga: W celu zwiększenia automatyzacji próbki i preparaty można oznaczać kodami kreskowymi.
    2. Nałóż kroplę kleju optycznego aktywowanego promieniami UV na dwa szkiełka podstawowe i użyj krawędzi plastikowego szkiełka, aby rozprowadzić cienką warstwę kleju na powierzchni szkiełek.
    3. Odetnij srebrno-złotą zakładkę i połóż zaklejoną taśmą część chusteczki do góry na kleju pierwszego szkiełka. Nakładaj sekcję ruchem tocznym od jednej krawędzi do drugiej, aby zminimalizować tworzenie się pęcherzyków uwięzionych pod taśmą.
      UWAGA: Pierwsze szkiełko służy do wstępnego zwilżenia spodu taśmy przed umieszczeniem jej na drugim (stałym) suwaku (krok 3.1.4).
    4. Usuń zaklejoną taśmę część z pierwszego szkiełka i umieść ją na warstwie kleju drugiego szkiełka (Rysunek 3A). Ponownie uważaj, aby uniknąć uwięzienia bąbelków.
      UWAGA: Ten krok wymaga praktyki, aby go opanować.
    5. Po umieszczeniu na każdym szkiełku odpowiedniej liczby sekcji dla danego eksperymentu, zetrzyj nadmiar kleju z otaczających obszarów.
    6. Sprawdź dokładnie, czy pod taśmą nie ma pęcherzyków lub włókien. Wykonaj tę kontrolę pod mikroskopem lub szkłem powiększającym. Jeśli są przeszkody, usuń pojedynczą sekcję, usuń przeszkody, a następnie ponownie nałóż ją na szkiełko.
    7. Po ustaleniu, że pod zaklejonymi odcinkami nie ma żadnych przeszkód, umieść szkiełka mikroskopowe pod czarnym światłem UV na 5 - 10 minut, aby usieciować klej.
  2. Metoda klejenia chitozanu.
    1. Przygotuj 1% klej chitozanowy. Przygotować roztwór kwasu octowego, rozpuszczając 0,25 ml stężonego kwasu octowego w 100 ml wody demineralizowanej (0,25% v/v). Rozpuścić 1 g proszku chitozanu w 100 ml roztworu kwasu octowego i mieszać roztwór O/N lub do momentu, aż cały proszek chitozanu się rozpuści.
      UWAGA: Roztwór jest stabilny w temperaturze pokojowej.
    2. Umieść kroplę roztworu chitozanu na każdą sekcję, która zostanie umieszczona na szkiełku.
    3. Odetnij srebrno-złotą zakładkę taśmy i umieść każdy zaklejony fragment chusteczką do góry na kleju (Rysunek 3A). Zachowaj szczególną ostrożność, aby uniknąć uwięzienia pęcherzyków.
    4. Po umieszczeniu wszystkich sekcji na zjeżdżalni przechyl zjeżdżalnię do góry na jednej z jej dłuższych krawędzi i przeciągnij nadmiar chitozanu do dolnej krawędzi za pomocą kleszczy.
    5. Umieść szkiełka w tej orientacji na ręczniku papierowym w pudełku na slajdy. Grawitacja spowoduje, że nadmiar chitozanu spadnie na ręcznik, tworząc płaską i jednolitą warstwę chitozanu.
    6. Umieść pudełko na suwak z otwartą pokrywką w lodówce O/N, aby chitozan wyschł.
      UWAGA: Patrz Tabela 1, aby zapoznać się z porównaniem między dwiema metodami klejenia.

4. Zastosowanie znaczników referencyjnych do slajdów

  1. Przygotować referencyjny roztwór znacznikowy, rozpuszczając 50 μl zielonych i 50 μl czerwonych mikrosfer w 100 μl wody. Przechowywać roztwór w ciemności w temperaturze 4 °C.
  2. Umieścić końcówkę pipety o pojemności 10 μl lub 20 μl w roztworze mikrosfery. Dodaj małą kroplę roztworu mikrosfery do każdej sekcji przylegającej do obszaru zainteresowania (rysunek 3C). Uważaj, aby mikrosfery nie znalazły się w obszarze zainteresowania.
  3. Suszyć szkiełka w temperaturze pokojowej (chronionej przed światłem) przez 30 minut, jeśli szkiełka są przetwarzane w tym dniu. Jeśli nie, umieść szkiełka w pudełku na szkiełka w temperaturze 4 °C.
    Uwaga: Tak długo, jak roztwór mikrosfery wyschnie przed nawodnieniem szkiełek, mikrosfery pozostaną przyklejone do szkiełek podczas wielu rund barwienia/obrazowania.

5. Wiele rund barwienia

UWAGA: Wybierając kompatybilną sekwencję etapów obrazowania, barwienia i ponownego obrazowania, możliwe jest wykrycie i kolokalizacja wielu sygnałów biologicznych na tym samym odcinku tkanki. Każda runda obrazowania/barwienia/ponownego obrazowania musi być opracowana dla konkretnego pytania histologicznego. Sekwencja obrazowania/barwienia/ponownego obrazowania zazwyczaj obejmuje uzyskanie endogennych sygnałów fluorescencyjnych (np. komórkowego GFP, barwników mineralizacyjnych, sond do obrazowania in vivo) w pierwszej rundzie obrazowania, a następnie fluorescencyjnego multipleksowanego barwienia immunologicznego i wielu rund barwienia aktywności enzymatycznej. Na koniec przekrój można wybarwić przy użyciu barwników chromogennych (np. H&E, błękitu toluidynowego, safraniny O itp.), aby podkreślić architekturę tkanki. W tej sekcji przedstawiono niestandardowe metody zaadaptowane z dostępnych na rynku protokołów.

  1. Barwienie niebieskim kalceiną dla nagromadzonego minerału
    UWAGA: Barwienie niebieskim kalceinem daje spójną powierzchnię mineralną, która jest podatna na automatyczną analizę obrazu, w przeciwieństwie do obrazowania w ciemnym polu lub różnicowego kontrastu interferencyjnego (DIC). Problem z barwieniem błękitem kalceinowym polega na tym, że widmo fluorescencyjne pokrywa się z znakowaniem tetracykliną i demeklocykliną. Dlatego, jeśli próbka zawiera te etykiety mineralne, należy je zobrazować w pierwszej rundzie obrazowania przed barwieniem błękitem kalceinowym.
    1. Jeśli endogenne sygnały w tkance zostaną zobrazowane przed tym etapem barwienia, zanurz szkiełka z poprzedniej rundy obrazowania w słoiku z kopiną wypełnionym 1xPBS, aż pokrywa zsunie się z szkiełek. Usuń i wysusz szkiełka nakrywkowe.
    2. Przygotować 30 mg/ml roztworu błękitu kalceinowego w 2%NaHCO3 (przygotowanym przez rozpuszczenie 2 gNaHCO3 w 100 mlH2Oi dostosowanie HCl do pH 7,4). Porcję roztworu należy podzielić na porcje i przechowywać w temperaturze -20°C.
    3. Zanurz szkiełka w słoiku z kopiną zawierającym 1x PBS na 15 minut, aby nawodnić sekcje, jeśli nie zostały jeszcze nawodnione z poprzedniej rundy.
    4. Zdejmij szkiełka i osusz tył i krawędzie ręcznikiem papierowym.
    5. Nałożyć 100 - 500 μl roztworu błękitu kalceinowego na szkiełko i inkubować przez 10 minut w komorze wilgotnościowej w temperaturze pokojowej.
    6. Płukać szkiełka w 1x PBS przez 10 minut z 3 zmianami.
    7. Nałóż ~ 200 μl 50% glicerolu w 1x PBS na każde szkiełko podstawowe i zamontuj szkiełko nakrywkowe.
    8. Usuń nadmiar glicerolu i osusz spód szkiełek.
  2. Barwienie enzymatyczne fosfatazą kwasową odporną na winian (TRAP) <br /> UWAGA: TRAP ulega ekspresji przez wiele typów komórek w linii krwiotwórczej, w tym osteoklasty. Prezentowane tutaj barwienie TRAP wykorzystuje żółty substrat fluorescencyjnej fosfatazy kwasowej. Niektóre sygnały fluorescencyjne będą nakładać się na niestandardowy zestaw żółtych filtrów, w tym etykiety mineralizacji tetracykliny/demeklocykliny, niebieskie barwienie kalceiną i przeciwbarwienie DAPI.
    1. Zanurz szkiełka z poprzedniej rundy obrazowania w słoiku z kopiną wypełnionym 1x PBS, aż okładka zsunie się ze szkiełek. Usuń i wysusz szkiełka nakrywkowe.
    2. Przygotować bufor 1, rozpuszczając 9,2 g bezwodnego octanu sodu i 11,4 g dwuwodnego dwuwodnego winianu sodu w wodzie i doprowadzając końcową objętość do 1 000 ml. Dostosować pH do 4,2 za pomocą stężonego lodowatego kwasu octowego (~ 1,5 - 2 ml). Przechowywać roztwór w temperaturze 4 °C przez okres do 12 miesięcy.
    3. Przygotować bufor 2, rozpuszczając 40 mg azotynu sodu w wodzie i doprowadzając końcową objętość do 1 ml. Przechowywać roztwór w temperaturze 4 °C przez okres do 1 tygodnia.
    4. W dniu barwienia przygotować bufor reakcyjny, mieszając 7,5 ml buforu 1 i 150 μl buforu 2.
    5. Nałożyć bufor reakcyjny bez substratu na szkiełka na 10 - 15 minut, aby zrównoważyć tkankę przy niższym pH.
      UWAGA: Typowa objętość to ~ 200 μl, ale musi być wystarczająco duża, aby pokryć wszystkie sekcje.
    6. Rozcieńczyć żółty substrat kwaśnej fosfatazy fluorescencyjnej w stosunku 1:50 do 1:100 w buforze reakcyjnym.
      UWAGA: Rozcieńczenie będzie podyktowane aktywnością TRAP w próbce.
    7. Wylać bufor reakcyjny ze szkiełek i nałożyć na szkiełka bufor reakcyjny z żółtym substratem fluorescencyjnym.
    8. Umieść szkiełka pod czarnym światłem UV na ~ 5 minut, aby aktywować podłoże.
      UWAGA: Czas inkubacji może się różnić w zależności od aktywności TRAP w próbce.
    9. Płukać szkiełka w 1x PBS przez 10 minut z 3 zmianami.
    10. Nałóż ~ 200 μl 50% glicerolu w 1x PBS na każde szkiełko podstawowe i zamontuj szkiełko nakrywkowe.
    11. Usuń nadmiar glicerolu i osusz spód szkiełek.
      UWAGA: Kwaśny bufor TRAP odwapni sekcje. Dodatkową zaletą odwapnienia jest to, że niektóre kolory będą ponownie dostępne do dalszego barwienia (np. etykiety mineralizacji). Na przykład niebieskie zabarwienie kalceiną zostanie usunięte podczas barwienia TRAP. W związku z tym przeciwplama DAPI może być obrazowana w tym kanale podczas kolejnej rundy.
  3. Barwienie aktywnością enzymatyczną fosfatazy alkalicznej (AP)
    UWAGA: Wiele typów komórek biorących udział w mineralizacji, w tym osteoblasty i chondrocyty mineralizujące, wyraża AP. Substrat Fast Red używany w tym protokole wywołuje zarówno fluorescencyjny sygnał czerwony, jak i chromogeniczny czerwony. Z tego powodu podłoże chromogenne będzie tłumić sygnały fluorescencyjne w regionach, w których substrat się wytrąca. Dlatego najlepiej jest wykonać to barwienie po zobrazowaniu sygnałów fluorescencyjnych, które mogą być wygaszane przez podłoże AP.
    1. Zanurz szkiełka z poprzedniej rundy obrazowania w słoiku z kopiną wypełnionym 1x PBS, aż okładka zsunie się ze szkiełek. Usuń i wysusz szkiełka nakrywkowe.
    2. Przygotować 1 M Tris, rozpuszczając 12,1 g Tris w 100 ml wody. Doprowadzić pH do 9,5 za pomocą 1 M NaOH.
    3. Przygotować 1 M MgCl2 sześciowodny przez rozpuszczenie 20,33 g MgCl2 w 100 ml wody dejonizowanej.
    4. Przygotować 2 M NaCl, rozpuszczając 11,68 g NaCl w 100 ml wody dejonizowanej.
    5. Przygotować 100 razy (20 mg/ml) roztwór podstawowy soli Fast Red TR Salt, rozpuszczając 1 g proszku w 50 ml wody dejonizowanej. Przygotować 100 μl porcji i przechowywać w temperaturze -20°C.
    6. Przygotować 100 razy (10 mg/ml) roztwór podstawowy fosforanu naftolu AS-MX, rozpuszczając 500 mg proszku w 50 ml dimetyloformamidu N,N. Przygotować 100 μl porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C.
    7. W dniu barwienia przygotować bufor AP, dodając 1 ml 1 M Tris, 0,5 ml 1 M MgCl2, 0,5 ml 2 M NaCl i doprowadzić końcową objętość do 10 ml za pomocą wody dejonizowanej (końcowe stężenia: 100 mM Tris, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl).
    8. Umieścić bufor AP na każdym szkiełku i inkubować w komorze wilgotnościowej przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    9. Przygotuj bufor substratu AP, rozcieńczając 100x zapasy soli Fast Red TR i naftolu AS-MX do 1x w buforze AP.
    10. Wylej bufor AP ze szkiełek i zastąp go buforem substratu AP. Inkubować szkiełka podstawowe przez 5 - 10 minut w komorze wilgotnościowej o temperaturze RT.
      UWAGA: Czas inkubacji będzie podyktowany aktywnością AP próbki.
    11. Myj szkiełka 3x w 1x PBS przez 5 min każda.
    12. Zamontuj szkiełka nakrywkowe za pomocą roztworu przeciwbarwiącego DAPI (rozcieńczenie DAPI 1:1,000 w 50% glicerolu w 1x PBS).
  4. Barwienie chromogenne błękitu toluidynowego O (TB)
    UWAGA: Ponieważ wszystkie poprzednie etapy są obrazowane pod tymczasowym montażem wodnym w 50% roztworze glicerolu/PBS, etap chromogenny jest również obrazowany w warunkach wodnych. Jednak roztwór barwiący może z czasem mieć tendencję do wypłukiwania. Dlatego sugeruje się zobrazowanie błękitu toluidynowego tak szybko, jak to możliwe po barwieniu.
    1. Zanurz szkiełka z poprzedniej rundy obrazowania w słoiku coplin wypełnionym wodą dejonizowaną, aż pokrywa zsunie się z szkiełek. Usuń i wysusz szkiełka nakrywkowe.
    2. Po usunięciu szkiełek nakrywkowych należy je zastąpić świeżą wodą i inkubować szkiełka przez co najmniej 10 minut, tak aby sole z PBS zostały wystarczająco usunięte z tkanki.
    3. Przygotować 0,025% roztwór TB w wodzie dejonizowanej.
    4. Umieść szkiełka w roztworze TB na 1 - 5 min.
      UWAGA: Czas inkubacji zależy od preferencji użytkownika, ale powinien być spójny dla wszystkich próbek.
    5. Umieść szkiełka w słoiku z wodą dejonizowaną i myj szkiełka 3x po 5 minut każda.
    6. Zamontuj szkiełko nakrywkowe z 30% glicerolem rozpuszczonym w wodzie dejonizowanej (NIE 1x PBS, ponieważ spowoduje to wypłukiwanie plamy z tkanki). UWAGA: Pożywkę montażową glicerolu można zastąpić syropem fruktozowym, który pomaga zapobiegać dyfuzji plamy z tkanki. Aby przygotować syrop fruktozowy, należy rozpuścić 30 g fruktozy w 10 ml wody dejonizowanej i podgrzać do temperatury 60 °C aż do rozpuszczenia.

6. Wiele rund obrazowania

  1. Załaduj szkiełka do tacek mikroskopu (Rysunek 3D).
    Uwaga: Tace są sprężynowe.
  2. Włóż tace do stosu tacek mikroskopu skanującego do szkiełek (Rysunek 3E).
  3. Kliknij listę profili, aby załadować profil dla każdego preparatu z odpowiednimi czasami naświetlania dla każdego fluoroforu. Kliknij nazwę slajdu, aby ręcznie nazwać każdy slajd lub poproś oprogramowanie o odczytanie kodu kreskowego znajdującego się na etykiecie slajdu. Kliknij przycisk Rozpocznij skanowanie podglądu, aby zrobić podgląd obrazu slajdu.
  4. Ustaw obszary zainteresowania w kreatorze wykrywania tkanek i zapisz je dla kolejnych rund obrazowania. Po skonfigurowaniu każdego slajdu rozpocznij proces skanowania, klikając przycisk rozpocznij skanowanie.
    Uwaga: System może pomieścić do 100 slajdów jednocześnie.
  5. Po zakończeniu obrazowania wyeksportuj obrazy z każdego kanału i rundy obrazowania z osobna jako pliki .tif lub .jpg w celu złożenia i analizy obrazu.

7. Montaż obrazu

  1. Metoda ręczna przy użyciu Photoshopa (lub podobnego oprogramowania do edycji obrazów, które może tworzyć obrazy warstwowe).
    1. Otwórz obraz każdego kanału z każdej rundy obrazowania.
    2. Zbierz poszczególne obrazy jako warstwy w jednym obrazie kompozytowym. Aby to zrobić, kliknij warstwę w palecie warstw z jednego obrazu. Następnie przeciągnij warstwę na inny obraz. Ta operacja przeciągnij i upuść utworzy nową warstwę na obrazie. Zrób to dla wszystkich innych obrazów. Alternatywnie użyj skryptu (File>Scripts>Load Files into Stack...), aby zautomatyzować ten proces, ładując wiele plików graficznych jako warstwy w stosie obrazów.
    3. Gdy każdy obraz zostanie wymieniony jako osobna warstwa w obrazie kompozytowym, kliknij dwukrotnie nazwę warstwy, aby zmienić nazwy warstw zgodnie z potrzebami, aby rozróżnić różne kanały.
    4. Aby przejrzeć każdą warstwę i stworzyć prawdziwie złożony obraz, zmień tryb mieszania dla każdej warstwy z "Normalny" na "Ekran" w palecie warstw.
      Uwaga: Aby przyspieszyć ten krok, zmień pojedynczą warstwę na ekran, a następnie kliknij warstwę prawym przyciskiem myszy, wybierz "kopiuj styl warstwy", a następnie zaznacz wszystkie inne warstwy i wybierz "wklej styl warstwy", aby zastosować styl ekranu do innych warstw.
    5. W razie potrzeby zmniejsz krycie (zmień wartość na 10 - 40%) warstwy chromogenicznej (tj. błękitu toluidynowego), aby lepiej uwidocznić sygnały fluorescencyjne przez warstwę chromogenną.
      Uwaga: Kafelkowy mikroskop skaningowy używany w tym protokole utrzymuje szkiełka na 3 krawędziach, minimalizując w ten sposób ilość obrotu, który może wystąpić na szkiełku podczas każdej rundy obrazowania. Dzięki temu użytkownikowi znacznie łatwiej jest ręcznie wyrównać obrazy bez konieczności obracania obrazów pochodzących z różnych rund obrazowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Ogólny schemat postępowania dla wysokoprzepustowej krio-histologii z obrazowaniem wielokrotnym

Rysunek 1 przedstawia ogólny schemat pracy stosowany w tej technice. Obejmuje on kilka etapów, od utrwalania, poprzez kilka rund obrazowania, aż po końcowe wyrównanie i analizę obrazów. Proces przejścia od utrwalenia próbki do przeprowadzenia 4 rund obrazowania może zająć zaledwie tydzień, co jest czas...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Tutaj przedstawiliśmy szczegółowy protokół kriohistologiczny do kolokalizacji i ilościowego określenia kilku miar biologicznych poprzez wyrównanie obrazów z wielu rund barwienia/obrazowania na jednym odcinku. Opisana metoda z użyciem kriotaśmy jest szczególnie przydatna, ponieważ zachowuje morfologię trudnych do przekroju tkanek (np. zmineralizowanych kości i chrząstek). Ponadto wycięta tkanka jest mocno przylegająca do szkiełka podstawowego, co pozwala na wielokrotne rundy barwienia/obrazowania tego samego odci...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Autorzy pragną podziękować następującym źródłom finansowania: NIH R01-AR063702, R21-AR064941, K99-AR067283 i T90-DE021989.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
10% neutralna buforowana formalinaSigma AldrichHT501128-4LDostępnych jest wielu dostawców. Toksyczny. Może być zastąpiony 4% paraformaldehydem.
SacharozaSigmaAldrich S9378Dostępnych jest wielu dostawców.
PBSSigma AldrichP5368Dostępnych jest wielu dostawców.
CryomoldsFisher ScientificFisherbrand #22-363-554W zależności od tkanki można stosować różne rozmiary
CryomatrixThermo Scientific6769006Można zastąpić innymi kriomatrycami. Jednak w naszych rękach najlepiej sprawdziły się żywice na bazie PVA/PEG.
2-metylo-butanSigma AldrichM32631Dostępnych jest wielu dostawców.
CryostatLeica Biosystems3050sMożna zastąpić innymi markami/modelami.
Dysk z próbkamiLeica Biosystems14037008587Może być zastąpiony innymi markami/modelami.
Ostrza kriostatuThermo Scientific3051835Można zastąpić innymi markami/modelami.
Sekcja kriotaśmyLabCryofilm 2C
Rolkowamikroskopia elektronowa Sciences62800-46Można zastąpić innymi markami/modelami.
Plastikowe szkiełka mikroskopoweMikroskopia elektronowa Sciences71890-01Można zastąpić innymi markami/modelami.
Szkiełka mikroskopowe szklaneThermo Scientific3051Można zastąpić innymi markami/modelami.
Klej optyczny Norland, 61Klej optycznyNorland Optical
UV Czarne światłoGeneral ElectricF15T8-BLB
Lodowaty kwas octowySigma AldrichARK2183Dostępnych jest wielu dostawców.
ChitozanSigma AldrichC3646Dostępnych jest wielu dostawców.
Czerwone mikroskopyInSpeck ThermoFisher ScientificI-14787
Zielone mikrosfery InSpeckThermoFisher ScientificI-14785
Calcein BlueSigma AldrichM1255Dostępnych jest wielu dostawców.
CalceinSigma AldrichC0875 Dostępnych jest wielu dostawców.
Alizarin complexoneSigma AldrichA3882 Dostępnych jest wielu dostawców.
DemeklocyklinaSigma AldrichD6140 Dostępnych jest wielu dostawców.
NaHCO3Sigma AldrichS5761Dostępnych jest wielu dostawców.
GlicerolSigma AldrichG5516Dostępnych jest wielu dostawców.
ELF 97 żółty fluorescencyjny substrat fosfatazy kwasowejThermoFisher ScientificE-6588
DAPIThermoFisher Scientific62247Dostępnych jest wielu dostawców. Może być zastąpiony Hoechst 33342 lub innymi barwnikami jądrowymi.
TO-PRO-3 (Cy5 jądrowe przeciwbarwienie)ThermoFisher ScientificT3605
Jodek propidiumThermoFisher ScientificR37108Dostępnych jest wielu dostawców.
Octan sodu bezwodnySigma AldrichS2889Dostępnych jest wielu dostawców.
Winian sodu dwuzasadowy dwuwodny Sigma AldrichT6521Dostępnych jest wielu dostawców.
Azotyn soduSigma AldrichS2252Dostępnych jest wielu dostawców.
TrisSigma Aldrich15504Dostępnych jest wielu dostawców.
MgCl2 sześciowodnySigma AldrichM9272Dostępnych jest wielu dostawców.
NaClSigma AldrichS7653Dostępnych jest wielu dostawców.
Fast Red TR SaltSigma AldrichF8764Dostępnych jest wielu dostawców. Może być również zastąpiony innymi zestawami substratów, takimi jak Vector Blue (Vector Laboratories, Cat# SK-5300)
Naphthol AS-MX Sigma AldrichN4875Dostępnych jest wielu dostawców.
N,N dimetyloformamidSigma AldrichD158550Dostępnych jest wielu dostawców.
Błękit toluidynowy OSigma AldrichT3260Dostępnych jest wielu dostawców.
Axio Scan.Z1Carl Zeiss AGAxio Scan.Z1Można również stosować inne skanery liniowe lub kafelkowe.
Zestaw filtrów DAPIChroma Technology Corp.49000
Zestaw filtrów CFPChroma Technology Corp.49001
Zestaw filtrów GFPChroma Technology Corp.49020
Zestaw filtrów YFPChroma Technology Corp.49003
Niestandardowy żółty (ELF 97) zestaw filtrówChroma Technology Corp.zwyczaj; HQ409sp, HQ555/30m, 425dxcr
Zestaw filtrów TRITCChroma Technology Corp.49004
Zestaw filtrów Cy5Chroma Technology Corp.49009
System transferu taśm CryoJaneMikroskopia elektronowa Nauki62800-10Dostępnych jest wielu dostawców.
CryoJane Tape WindowsMikroskopia elektronowa Sciences62800-72Dostępnych jest wielu dostawców.
CryoJane Szkiełka samoprzylepneMikroskopia elektronowa Sciences62800-4XDostępnych jest wielu dostawców.
, 61

Bibliografia

  1. Schofield, P. N., Vogel, P., Gkoutos, G. V., Sundberg, J. P. Exploring the elephant: histopathology in high-throughput phenotyping of mutant mice. Dis Model Mech. 5 (1), 19-25 (2012).
  2. Adissu, H. A., et al. Histopathology reveals correlative and unique phenotypes in a high-throughput mouse phenotyping screen. Disease Models and Mechanisms. 7 (5), 515-524 (2014).
  3. Johnson, J. T., et al. Virtual histology of transgenic mouse embryos for high-throughput phenotyping. PLoS Genet. 2 (4), e61(2006).
  4. Ayadi, A., et al. Mouse large-scale phenotyping initiatives: overview of the European Mouse Disease Clinic (EUMODIC) and of the Wellcome Trust Sanger Institute Mouse Genetics Project. Mamm.Genome. 23 (9-10), 600-610 (2012).
  5. Utreja, A., et al. Cell and matrix response of temporomandibular cartilage to mechanical loading. Osteoarthr Cartil. 24 (2), 335-344 (2016).
  6. Dyment, N. A., et al. Gdf5 progenitors give rise to fibrocartilage cells that mineralize via hedgehog signaling to form the zonal enthesis. Dev.Biol. 405 (1), 96-107 (2015).
  7. Lalley, A. L., et al. Improved biomechanical and biological outcomes in the MRL/MpJ murine strain following a full-length patellar tendon injury. J.Orthop.Res. 33 (11), 1693-1703 (2015).
  8. Breidenbach, A. P., et al. Ablating hedgehog signaling in tenocytes during development impairs biomechanics and matrix organization of the adult murine patellar tendon enthesis. J.Orthop.Res. 33 (8), 1142-1151 (2015).
  9. Ushiku, C., Adams, D., Jiang, X., Wang, L., Rowe, D. Long Bone Fracture Repair in Mice Harboring GFP Reporters for Cells within the Osteoblastic Lineage. J.Orthop.Res. 28 (10), 1338-1347 (2010).
  10. Matthews, B. G., et al. Analysis of asMA-labeled progenitor cell commitment identifies notch signaling as an important pathway in fracture healing. J.Bone Miner.Res. 29 (5), 1283-1294 (2014).
  11. Dyment, N. A., Hagiwara, Y., Jiang, X., Huang, J., Adams, D. J., Rowe, D. W. Response of knee fibrocartilage to joint destabilization. Osteoarthritis Cartilage. 23 (6), 996-1006 (2015).
  12. Grcevic, D., et al. In vivo fate mapping identifies mesenchymal progenitor cells. Stem Cells. 30 (2), 187-196 (2012).
  13. Hong, S. H., Jiang, X., Chen, L., Josh, P., Shin, D. G., Rowe, D. Computer-Automated Static, Dynamic and Cellular Bone Histomorphometry. J Tissue Sci Eng. Suppl 1, 004(2012).
  14. Matthews, B. G., Torreggiani, E., Roeder, E., Matic, I., Grcevic, D., Kalajzic, I. Osteogenic potential of alpha smooth muscle actin expressing muscle resident progenitor cells. Bone. 84, 69-77 (2016).
  15. Hagiwara, Y., et al. Fixation stability dictates the differentiation pathway of periosteal progenitor cells in fracture repair. J.Orthop.Res. 33 (7), 948-956 (2015).
  16. Jiang, X., et al. Histological analysis of GFP expression in murine bone. J.Histochem.Cytochem. 53 (5), 593-602 (2005).
  17. Nissanov, J., Bertrand, L., Tretiak, O. Cryosectioning distortion reduction using tape support. Microsc.Res.Tech. 53 (3), 239-240 (2001).
  18. Kawamoto, T. Use of a new adhesive film for the preparation of multi-purpose fresh-frozen sections from hard tissues, whole-animals, insects and plants. Arch.Histol.Cytol. 66 (2), 123-143 (2003).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Kriosekcjonowanie stabilizowane taśmąklej utwardzany promieniami UVobrazowanie sekcji seryjnychilościowe oznaczanie sygnału fluorescencyjnegoskaningowy mikroskop do preparatówwyrównywanie markerów referencyjnychwysokoprzepustowe fenotypowanieanaliza tkanek mięśniowo-szkieletowych
Wysokoprzepustowa, wieloobrazowa kriohistologia zmineralizowanych tkanek
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.