Method Article

Łączenie bezwzględnych i względnych ilościowych danych PCR w celu ilościowego określenia transkryptów wariantu splicingu STAT3

DOI:

10.3791/54473

⸱

October 9th, 2016

 ,  ,  , 
1Department of Biomolecular Chemistry, University of Wisconsin-Madison, 2Department of Medicine, University of Wisconsin-Madison

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zdarzenia splicingu tandemowego występują w miejscach oddalonych od siebie o mniej niż 12 nukleotydów. Kwantyfikacja proporcji takich wariantów splicingu jest możliwa przy użyciu bezwzględnego ilościowego podejścia PCR. Niniejszy manuskrypt opisuje, w jaki sposób można określić ilościowo warianty splicingu genu STAT3, w których dwa zdarzenia splicingu skutkują włączeniem/wykluczeniem Serine-701 i α/β C-końcami.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ludzki przetwornik sygnału i aktywator transkrypcji 3 (STAT3) jest jednym z wielu genów zawierających tandemowe miejsce splicingu. Alternatywne miejsca splicingu donorów oddalone od siebie o 3 nukleotydy powodują włączenie (S) lub wykluczenie (ΔS) pojedynczej reszty, Serine-701. Dalej, splicing w parze alternatywnych miejsc splicingu akceptora powoduje powstanie transkryptów kodujących albo 55 końcowych reszt domeny transaktywacyjnej (α), albo skróconą domenę transaktywacyjną z 7 unikalnymi resztami (β). Jak opisano w tym manuskrypcie, pomiar proporcji czterech splicingowanych transkryptów STAT3 (Sα, Sβ, ΔSα i ΔSβ) był możliwy przy użyciu bezwzględnej qPCR (ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy). W związku z tym protokół rozróżnia i mierzy bardzo podobne warianty spawów. Absolute qPCR wykorzystuje plazmidy kalibracyjne, dzięki czemu swoistość detekcji nie jest zagrożona ze względu na wydajność. Protokół wymaga walidacji starterów i optymalizacji parametrów cyklicznych. Połączenie bezwzględnego qPCR i zależnego od wydajności względnego qPCR całkowitych transkryptów STAT3 pozwoliło na opisanie wahań poziomów wariantów splicingu STAT3 w eozynofilach traktowanych cytokinami. Protokół dostarczył również dowodów na współzależność splicingu między dwoma zdarzeniami splicingu STAT3. Strategia oparta na połączeniu dwóch technik qPCR powinna być łatwa do zaadaptowania do badania współsplicingu w innych miejscach splicingu tandemowego.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alternatywne łączenie krótkiego zasięgu (tandem), gdzie alternatywne miejsca akceptora lub dawcy znajdują się blisko siebie, jest powszechne u ssaków1, bezkręgowców2 i roślin3. Szacuje się, że 20% genów ssaków zawiera alternatywne miejsca splicingu oddalone od siebie o 2-12 nukleotydów4. Wiele z tych miejsc jest oddalonych od siebie o 3 nukleotydy i powoduje włączenie lub wykluczenie pojedynczego kodonu. Toczy się debata na temat natury regulacji splicingu w tych miejscach5,6, przy czym niektórzy twierdzą, że różnice w motywie splicingu są tak subtelne, że selekcja jest stochastyczna7, podczas gdy inni wnioskują regulację na podstawie specyficzności tkankowej8.

Wybór miejsca łączenia tandemowego został przeanalizowany półilościowo przy użyciu zmodyfikowanej elektroforezy kapilarnej7 i elektroforezy żelowej o wysokiej rozdzielczości8. Odczyty RNA-Seq (sekwencjonowanie RNA) mogą być wykorzystywane do ilościowego określania współczynników splicingu w każdym miejscu splicingu. W ten sposób dane RNA-Seq dostarczyły informacji na temat regulacji miejsc splicingutandemowego 9. Umożliwiło to również przewidywanie oczekiwanych proporcji wariantów splicingu na podstawie motywu nukleotydowego10. Większość nacisku na splicing, który obejmuje lub wyklucza pojedynczy kodon, został położony na częściej występujące miejsca splicingu akceptorowego tandemu, znane jako NAGNAG (gdzie N = dowolny nukleotyd).

Alternatywne miejsca splicingu dawcy tandemu, włączając lub wykluczając pojedynczy kodon (motyw rozpoznania GYNGYN, gdzie Y = pirymidyna) są mniej powszechne niż akceptory tandemowe. Przetwornik sygnału i aktywator transkrypcji 3 (STAT3) jest kluczowym genem poddawanym alternatywnemu splicingowi dawcy tandemowego1,11. Miejsca splicingu dawcy tandemowego łączą się z eksonami 21 i 22 i powodują włączenie lub wyłączenie kodonu dla seryny-701 (odpowiednio S lub ΔS)1,11. Dalsze alternatywne miejsca akceptorowe (40 nukleotydów oddalonych od siebie) łączące eksony 22 i 23a/b powodują włączenie 55 reszt końcowych domeny transaktywacyjnej (α) lub skróconej domeny transaktywacyjnej z 7 unikalnymi resztami C-końcowymi (β)11. W związku z tym możliwe są cztery warianty spawów.

Białko STAT3 jest czynnikiem transkrypcyjnym i głównym integratorem sygnału w wielu typachkomórek12, a gdy ulega mutacji, jego konstytutywna aktywacja przyczynia się do kilku fenotypów raka (omówione w odnośniku13). Zespół Hioba, zaburzenie niedoboru odporności charakteryzujące się wysokim poziomem IgE, jest również spowodowane mutacjami w STAT3 (omówione w odnośniku14). Odrębne role białek wariantu splicingu STAT3 α i β zostały wcześniej opisane15. Początkowo uważano, że STAT3 β działa w sposób dominująco-negatywny16, antagonizując aktywność transkrypcyjną STAT3 α, ale późniejsze prace sugerowały, że ma niezależne geny docelowe17. Pomimo subtelności łączenia tandemowego, istnieją powody, by sądzić, że brak lub obecność Serine-701 (Ser701) wpływa na działanie. Ser701 znajduje się nie tylko w bliskim sąsiedztwie tyrozyny-705 (reszta fosforylowana w aktywacji STAT318), ale ostatnie badania sugerują, że warianty splicingu STAT3 S i ΔS są niezbędne do żywotności uzależnionych od STAT3 komórek chłoniaka rozlanego z dużych komórek B (DLBLCL)19. Znaczenie biologiczne pozostaje do zbadania. Biorąc pod uwagę, że skład wariantu splicingu może wpływać na funkcję, staraliśmy się ustalić, czy stosunek ten był zaburzony przez stymulację cytokin w eozynofilach.

Początkowo próbowaliśmy zbadać związek między dwoma zdarzeniami splicingu, używając PCR specyficznego dla wariantów α STAT3 i β, a następnie podziału produktów z enzymem restrykcyjnym specyficznym dla wariantów splicingu S, AfeI. Densytometria produktów wykazała, że włączenie Ser701 było około dziesięć razy częstsze niż jego pominięcie (ΔS) zarówno w STAT3 α, jak i β (dane nie pokazane). Jednak to półilościowe podejście nie było wystarczająco powtarzalne i nie mogło być skutecznie wykorzystane do jednoczesnego pomiaru wszystkich czterech wariantów splicingu. Aby przeanalizować proporcje każdego z czterech wariantów splicingu, konieczne było ustalenie ilościowego protokołu PCR (qPCR), który pozwolił na uzyskanie ścisłych powtórzeń technicznych (kilka testów danej próbki).

Względny qPCR opiera się na porównaniu interesującego genu z genem standardowym lub genem porządkowym, o którym wiadomo, że ulega ekspresji na określonym poziomie20 i jest odpowiedni, gdy gen będący przedmiotem zainteresowania i gen porządkowy są amplifikowane z podobną wydajnością. Dwuniciowy (ds) barwnik fluorescencyjny (cyjaninowy) wiążący DNA wiąże się z amplikonami PCR21, a po określonej liczbie cykli nastąpiła wystarczająca amplifikacja, aby fluorescencja była wykrywalna. Im wyższy początkowy poziom transkryptu, tym niższa wartość progowa cyklu (Ct). Ponieważ stężenie preparatów cDNA jest różne, należy porównać stężenie transkryptu ze stężeniem transkryptu, o którym wiadomo, że ulega ekspresji na stałym poziomie we wszystkich próbkach, takich jak glukuronidaza-β (GUSB) w eozynofilach22.

Względny qPCR nie jest możliwy do wykonania dla bardzo podobnych sekwencji, co widać w wariantach splicingu wynikających z łączenia tandemowego. Rygorystyczne warunki wymagane do specyficznego wzmocnienia wariantów spawów skutkują zmniejszoną wydajnością. Zamiast tego należy zastosować bezwzględną kwantyfikację23. Wiąże się to z przygotowaniem krzywej wzorcowej ze znanymi stężeniami interesującego nas transkryptu splicingu i zapewnieniem, że warunki PCR optymalizują swoistość24. Jak opisano, bezwzględne i względne dane qPCR dla konkretnego genu można połączyć, aby uzyskać informacje na temat ekspresji genu w określonym typie komórki, w tym przypadku STAT3 w różnie stymulowanych eozynofilach25.

Tutaj, opisano kwantyfikację wariantu splicingu STAT3 z oczekiwaniem, że metoda może być dostosowana do ukierunkowanych badań innych zdarzeń splicingu tandemowego. Optymalizacja była długotrwałym procesem, w ramach którego w ciągu kilku miesięcy przetestowano kilka par starterów o różnych stężeniach i liczne iteracje parametrów cyklicznych. Kluczowymi cechami protokołu są walidacja swoistości startera i kwantyfikacja w oparciu o krzywe standardowe ze znanymi stężeniami wariantów splicingu. Względny qPCR w połączeniu okazał się pomocny dla naszej aplikacji, ale nie jest konieczny.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Eozynofile krwi obwodowej zostały pobrane bez informacji identyfikującej, zgodnie z protokołem zatwierdzonym (#2013-1570) przez Instytucjonalną Komisję Rewizyjną Centrum Nauk o Zdrowiu Uniwersytetu Wisconsin-Madison. Uzyskano podpisaną świadomą zgodę dawcy na wykorzystanie każdej próbki w badaniach.

1. Tworzenie plazmidów jako wzorców szablonów

  1. Utwórz startery dla amplikonu obejmującego oba miejsca łączenia STAT3, z miejscami ograniczeń 5'- KpnI i NheI (oraz przedłużeniami 5') zgodnie z tabelą 1a.
    UWAGA: Miejsca KpnI i NheI zostały wybrane tak, aby umożliwić ligację insertów do zmodyfikowanego wektora pET-28a o oporności na kanamycynę25,26. Witryna KpnI została dodana do witryny klonowania wielokrotnego.
  2. Używając świeżo pobranych eozynofili, przygotuj duplikaty próbek o wymiarach 2,5 x 106 komórek/ml w pożywce do hodowli komórkowych (pożywka Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640). Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 i wilgotności 10%.
    1. Przygotować komplementarne (c)DNA z próbek (co najmniej 1 x 106 komórek na preparat) zgodnie z instrukcjami producenta, korzystając z zestawów do ekstrakcji RNA i syntezy cDNA.
  3. Z matrycy cDNA przygotowanej w kroku 1.2.1 amplifikować warianty splicingu STAT3 za pomocą amplifikacji PCR zgodnie z tabelą 2a.
  4. Rozpuścić amplikony w 2% żelu agarozowym Tris-acetate-etylenodiaminotetraoctan (TAE)27. Usuń banderole z żelu i oczyść zgodnie z instrukcją zestawu do wycinania żelu.
  5. Pociąć amplikony i plazmid odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi (przegląd restrykcji w pozycji27), stosując objętości, czasy inkubacji i temperatury zalecane przez dostawcę enzymu; i oczyścić jak w kroku 1.4. Zwiąż ograniczone amplikony do plazmidu w warunkach zalecanych przez dostawcę.
  6. Przygotować kontrolę ujemną (ograniczony plazmidowy DNA bez insercji, ale z ligazą) i kontrolę pozytywną (nieograniczony plazmid z opornością na kanamycynę). Przeprowadzić standardowe transformacje plazmidowe kompetentnej E. coli DH5α28 przy użyciu mieszanin ligacyjnych27.
  7. Inkubować przekształcone E. coli w 1 ml pożywki Luria-Bulion (LB) (przygotowanej zgodnie z instrukcją27), wytrząsając przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Rozprowadzić transformanty na płytkach LB zawierających 50 μg/ml kanamycyny i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.
  8. Wybierz kilka kolonii z płytek α STAT3 i STAT3 β za pomocą sterylnych wykałaczek27. Przenieść każdy z nich do 2 ml LB. Hodować kultury przez noc w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wytrząsaniem.
  9. Oczyść plazmidy z kultur bakteryjnych, postępując zgodnie z instrukcjami dostarczonymi w zestawie do oczyszczania DNA. Przechowywać plazmidy w temperaturze -20 lub -80 °C.
  10. Sekwencjonuj plazmidy z kilku kolonii, przygotowując reakcje sekwencjonowania 20 μl. Pipeta 3 μl buforu reakcyjnego do sekwencjonowania, 2 μl mieszaniny reakcyjnej sekwencjonowania, 12 μl wody ultraczystej, 1 μl plazmidu jako matrycy i 2 μl startera do sekwencjonowania.
    UWAGA: Jeśli używasz wektora pET-28a, użyj startera sekwencjonowania 5'-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGG-3'.
    1. Oceń elektroforetogramy plazmidów kodujących każdy wariant: Sα, Sβ, ΔSα i ΔSβ25.
  11. Zmierz stężenie czystego plazmidowego DNA w ng / μl. W przypadku odczytu absorbancji przy długości fali 260 nm za pomocą spektrofotometru, należy obliczyć stężenie DNA zgodnie z prawem Beera-Lamberta29:
    figure-protocol-1
    Gdzie c = stężenie, A = absorbancja, ε (współczynnik ekstynkcji) = 0,02 (μg/ml)-1 cm-1 dla dwuniciowego DNA, a L = długość drogi światła (zwykle 1 cm).
  12. Korzystając z mas cząsteczkowych amplikonów cDNA wariantu splicingu STAT3 i wektora, oblicz liczbę kopii na μl.
    UWAGA: Masę cząsteczkową na parę zasad (bp) szacuje się na 650 Da.
    figure-protocol-2

2. Analiza swoistości startera dla bezwzględnego qPCR

  1. Przygotować serię rozcieńczeń 1 na 10 plazmidów STAT3, z ~108 do 103 kopii na μl (20 μl) przy użyciu ultraczystej wody. Zmierz stężenie najbardziej stężonego (~108 kopii na μl, patrz krok 1.11).
  2. Użyć rozcieńczonych plazmidów do przygotowania czterech mieszanin "niebędących przedmiotem zwalczania" (tj. kontroli negatywnej STAT3ΔSβ zawierających równe stężenia STAT3 Sα, ΔSα, Sβ, ale bez ΔSβ) w ilości 106 kopii na μl każda. Przygotować "docelową" mieszaninę o równych stężeniach wszystkich czterech matryc w ilości10-6 kopii na μl.
  3. Przygotować roztwory par starterów dla każdego wariantu splicingu (patrz Tabela 1b i Rysunek 1), wykonując ~60 μl starterów każdy o stężeniu 7 μM (końcowe stężenie w próbce wyniesie 560 nM).
  4. Rozcieńczyć polimerazę DNA/barwnik wiążący dsDNA w proporcji 7:5 z czystymH2O.
  5. Ustawić test 1 na 96-dołkowej płytce PCR, jak pokazano w szablonie (Tabela 3).
    1. Dodać 21 μl rozcieńczonej mieszaniny polimerazy DNA i barwnika wiążącego dsDNA, następnie 2 μl mieszaniny starterów i 2 μl matrycy (zgodnie z tabelą 2b). Zamiast szablonu dodaj 2 μl przefiltrowanego H2O do studzienki kontrolnej bez szablonu (NTC). Ustaw reakcje w dwóch egzemplarzach, aby ocenić powtarzalność30.
  6. Uszczelnić płytkę qPCR z samoprzylepną osłoną i odwirować przez 5 minut w temperaturze 1 200 x g w temperaturze 12 °C.
  7. Jeśli korzystasz z oprogramowania wymienionego w sekcji Materiały, skonfiguruj eksperyment zgodnie z opisem.
    1. Włącz maszynę qPCR i włóż zapieczętowaną płytkę qPCR. Kliknij Plik > Nowy > Dalej > Wybierz "Nowy detektor", wybierz reportera, wygaszacz i podaj nazwę. Skonfiguruj "nowy detektor" dla każdego wariantu spawu.
    2. Wybierz opcję Dalej i skonfiguruj standardy zgodnie z monitem na stronie Konfiguracja płytki próbkowania, upewniając się, że ilości zostały wprowadzone do tabeli i wybrano odpowiednie detektory. Kliknij przycisk Zakończ.
    3. Ustaw jazdę na rowerze zgodnie z tabelą 2b. Upewnij się, że odczyt fluorescencji (w celu określenia Ct) występuje podczas kroku 72 °C każdego cyklu. Wybierz pozycję Uruchom.
    4. Po zakończeniu uruchamiania kliknij kartę Wyniki > kartę Wykres wzmocnienia. Oceń wykres wzmocnienia wyjściowego, aby ocenić jakość danych (poszukaj wykresu wykładniczego, jak na rysunku 2).
      UWAGA: Upewnij się, że wykresy wzmocnienia są w większości wykładnicze i że próg cyklu można ustawić na wykładniczą część wykresu. Upewnij się, że NTC nie są wzmocnione, a inne standardowe punkty wykazują niską wartość Ct przy wysokim ΔRn.
    5. Aby wyeksportować wyniki do arkusza kalkulacyjnego, kliknij Plik > Eksportuj > wyniki.

3. Ocena swoistości i powtarzalności bezwzględnego testu qPCR

  1. Powtarzalność
    1. Użyj danych z kroku 2.7.5, aby obliczyć odchylenie standardowe wartości Ct (cykl progowy dla fluorescencji).
      figure-protocol-3
      Gdzie N = liczba próbek (2, jeśli są wykonywane w dwóch egzemplarzach), figure-protocol-4 = Ct próbki i figure-protocol-5 = średnia Ct próbki. Sprawdzić, czy odchylenie standardowe wartości Ct duplikatów wynosi ≤0,2. Sprawdź, czy wartości Ct we wszystkich studzienkach z wyjątkiem NTC są mniejsze niż 38.
    2. Jeśli powtarzalność jest niska, zoptymalizuj parametry cyklu, wydłużając lub skracając czas wyżarzania.
  2. Wykreśl numer kopii logarytmu (określony w kroku 1.12 i przygotowany w kroku 2.1) w funkcji wartości Ct, aby utworzyć krzywą standardową, co daje następujące równanie:
    figure-protocol-6
    Gdzie y to Ct, m to gradient, x to log(liczba kopii), a b to wartość punktu przecięcia.
    UWAGA: Wartość R2 regresji liniowej będzie wynosić ≥0,95 dla prawidłowych danych.
  3. Oblicz wydajność wzmocnienia za pomocą krzywej standardowej i równania:
    figure-protocol-7
    UWAGA: Celuj w wydajność ≥75%.
  4. Oblicz swoistość na podstawie testu qPCR 1 przy użyciu wzoru Also:
    figure-protocol-8
    Gdzie ΔCtToo = Ctcel - Ctniedocelowy , opisujący różnicę w progowej liczbie cyklu dla amplifikacji specyficznej i niespecyficznej
    UWAGA: Swoistość powinna przekraczać cztery rzędy wielkości (tj. współczynnik swoistości ≥4).
    1. Jeśli swoistość jest słaba, zoptymalizuj, obniżając stężenie podkładu. Przygotuj testy (zgodnie z opisem w krokach 2.5-2.7) z końcowymi stężeniami startera w zakresie od 100 nM do 500 nM.

4. Wykonywanie względnych testów qPCR

  1. Traktuj komórki cytokinami, aby promować transkrypcję.
    1. W przypadku świeżo pobranych eozynofili należy przygotować duplikaty próbek o wymiarach 2,5 x 106 komórek/ml w pożywce do hodowli komórkowej (pożywka RPMI 1640) i potraktować 50 ng/ml interleukiny-3 (IL3) i/lub 50 ng/ml czynnika martwicy nowotworu α (TNFα) przez okresy 3, 6, 9 i 20 godzin w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 i wilgotności 10%.
  2. Przygotuj cDNA z próbek eozynofili (co najmniej 1 x 106 komórek na preparat) zgodnie z instrukcjami producenta, korzystając z zestawów do ekstrakcji RNA i syntezy cDNA.
  3. Przygotować seryjne rozcieńczenia dwóch podwielokrotności cDNA próbki (próbki kontrolne lub spoczynkowe) w zakresie rozcieńczenia od "1" do "1:1024".
    1. Aby uzyskać rozcieńczenie 1 do 4, odpipetuj 1 μl cDNA i 3 μl ultraczystej wody.
    2. W przypadku rozcieńczenia 1:16 należy odpipetować 1 μl rozcieńczenia 1:4 i 3 μl ultraczystej wody itd.
  4. Ustawić PCR na 96-dołkowej płytce z reakcjami 25 μl, jak opisano w krokach 2.3-2.5, ale z kilkoma stężeniami startera dla pan-STAT3 i GUSB (patrz matryca w tabeli 4).
  5. Dodaj "nowy detektor" dla GUSB i postępuj zgodnie z krokami 2.6-2.7, używając parametrów cyklicznych opisanych w tabeli 2c.
  6. Wygeneruj krzywe standardowe (patrz kroki 3.2 i 3.3), aby określić, które stężenia starterów skutkują 95-100% wydajnością amplifikacji.
  7. Ustaw płytkę z przygotowanymi próbkami cDNA (z kroku 4.2) i zoptymalizowanymi stężeniami startera (patrz tabela 2c dla parametrów cyklicznych, odczynników i tabeli 5 szablonu płytki 96-dołkowej).
  8. Wykonaj kroki 2.6-2.7. Powtórz test co najmniej raz i sprawdź jakość danych.
  9. Oblicz średnią wartość Ct zduplikowanych próbek Ct zarówno dla STAT3, jak i genu porządkowego GUSB.
  10. Uzyskać wartości ΔCt dla każdej próbki.
    figure-protocol-9
  11. Oznaczyć próbkę spoczynkową (zwykle o najniższym stężeniu interesującego nas transkryptu) jako próbkę 0. Obliczyć ΔΔCt31 dla każdej próbki (tutaj oznaczonej jako próbka X):
    figure-protocol-10
  12. Oblicz zwiększenie krotności dla każdej próbki:
    figure-protocol-11
  13. Odtwarzalności
    1. Obliczanie współczynnika zmienności (CV) liczby kopii dla pan-STAT3 i GUSB.
      figure-protocol-12
      Gdzie N = liczba próbek, = obliczona liczba kopii próbki i = średnia próbki. Sprawdź, czy CV każdej próbki (testy wielokrotne) wynosi ≤10%.

5. Analiza bezwzględnych danych qPCR dla nieznanych próbek

  1. Porównaj wartości Ct uzyskane w względnym qPCR (jak opisano w kroku 4.9) dla genu GUSB, aby upewnić się, że stężenia cDNA w próbkach mieszczą się w granicach jednego rzędu wielkości.
    1. Rozcieńczyć odpowiednio cDNA (np. jeśli próbka 1 ma wartość Ct ~17,5, a wartości Ct innych próbek wynoszą ~21, próbka 1 jest około 2(21-17,5) = 11 razy bardziej skoncentrowana. Wykonać rozcieńczenie 1:1 ultraczystą wodą w tym samym zakresie, nie rozcieńczając więcej niż to konieczne).
      UWAGA: Bardzo różne stężenia początkowe będą miały wpływ na analizę regresji liniowej (krok 4.12).
  2. Skonfiguruj bezwzględny test qPCR próbek. Przygotować płytkę wzorcową do oznaczania 2a dla Sα i Sβ zgodnie z tabelą 6; i przygotować oznaczenie 2b dla ΔSα i ΔSβ zgodnie z tabelą 7. Przeprowadzić testy zgodnie z opisem w krokach 2.6-2.7.3 (i w tabeli 2b). Powtórz testy co najmniej raz.
  3. Sprawdź jakość danych i wyeksportuj je zgodnie z opisem w krokach 2.7.4-2.7.5.
  4. Ustawić bezwzględną płytkę qPCR 96 dołkową z reakcjami 25 μl przy użyciu starterów pan-STAT3 (startery w tabeli 1c, matryca w tabeli 8) w 400 μM i mieszaninie wszystkich czterech plazmidów lub pojedynczego plazmidu w podanych całkowitych stężeniach.
    UWAGA: Wydajność nie ma znaczenia dla bezwzględnego qPCR, ale optymalizacja wydajności tych starterów jest ważna dla względnego qPCR (Krok 4).
  5. Uszczelnić płytkę qPCR z samoprzylepną osłoną i odwirować przez 5 minut w temperaturze 1 200 x g w temperaturze 12 °C.
  6. Zainstaluj "nowy detektor" dla pan-STAT3 jak w krokach 2.7.1-2.7.3.
  7. Ustaw cykliczne ustawienia dla pan-STAT3 zgodnie z tabelą 2c (te same warunki, co względny qPCR). Upewnij się, że odczyt fluorescencji (w celu określenia Ct) występuje podczas kroku 72 °C każdego cyklu. Powtórzyć test co najmniej raz, aby zapewnić odtwarzalność.
  8. Sprawdź jakość danych i wyeksportuj je (patrz kroki 2.7.4-2.7.5).
    1. Jeśli wykresy amplifikacji nie są wykładnicze (patrz rysunek 2), rozcieńczyć próbkę cDNA (1:10) i powtórzyć test zgodnie z opisem (krok 5.7).
  9. Korzystając z równania krzywej standardowej (patrz 3.2, rysunek 3) i wartości Ct próbek, obliczyć liczbę kopii każdego wariantu spawu i pan-STAT3 w każdej próbce.
    figure-protocol-13
  10. Log wykresu (bezwzględne wartości liczby kopii qPCR uzyskane dla pan-STAT3) vs log (skumulowane bezwzględne wartości liczby kopii qPCR dla wariantów spawów STAT3).
    UWAGA: Idealne wartości regresji liniowej i nachylenia wynoszą ~1.
  11. Oblicz powtarzalność (krok 3.1) i odtwarzalność (krok 4.13).

6. Łączenie bezwzględnych i względnych danych qPCR

  1. Pomnóż proporcję wariantu przez całkowity wzrost krotności STAT3, aby obliczyć krotność każdego wariantu połączenia.
  2. Obliczyć odchylenia standardowe (patrz krok 3.1.1) wartości bezwzględnych i względnych w celu uwzględnienia rozchodzenia się błędu. Określ standardowy błąd pomiaru (SEM), jak pokazano:
    figure-protocol-14

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dobrej jakości dane qPCR wygenerują wykres amplifikacji sigmoidalnej (Rysunek 2a), co oznacza wykładniczy wzrost transkryptów w trakcie cyklu cyklowego. Obecność zbyt dużej ilości matrycy może skutkować wysokim tłem fluorescencyjnym, co oznacza, że w pierwszych kilku cyklach ustalana jest niewłaściwa linia bazowa. Jeśli dane nie dostarczają krzywej wykładniczej (rysunek 2b), konieczna jest dalsza optymalizacja (opisana w krokach 3.1 i 3.4). Aby uzyskać więcej informacji na temat rozwiązywania problemów z wynikami qPCR, patrz odniesienie32. Krzywe standardowe wygenerowane dla plazmidów kalibratora matrycowego wskażą wydajność amplifikacji (krzywa dla STAT3 Sα pokazana na rysunku 3). W opisanych warunkach zaobserwowano sprawność od 83 do 95%. Równanie specyficzności (krok 3.4) zakłada równą wydajność, co jest mało prawdopodobne25, więc swoistość prawdopodobnie będzie większa, niż sugeruje współczynnik swoistości.

Aby ocenić zgodność poziomów STAT3, zmierzono wartości bezwzględne każdego z czterech wariantów splicingu, jak również poziom całkowitego STAT3, przy czym ten ostatni używał starterów wzmacniających obszar wspólny dla wszystkich czterech wariantów splicingu (Rysunek 4). Idealnie byłoby, gdyby regresja liniowa (wskazanie korelacji) i nachylenie (stosunek pan-STAT3 do zsumowanych wariantów spawu) były bliskie 1.

Bezwzględne dane qPCR są przedstawione jako wykresy kołowe, aby pokazać proporcje czterech wariantów splicingu w czasie po stymulacji cytokinami (Rysunek 5a). Spoczynkowe eozynofile (0 godz.) miały najmniejszy udział STAT3 Sα, chociaż ten wariant był zawsze najliczniejszy. Pomnożenie frakcji wariantów splicingu STAT3 β (Sβ+ΔSβ) przez ułamek wariantów splicingu STAT3 ΔS (ΔSα+ΔSβ) konsekwentnie dało wartość niższą niż wartość zarejestrowana doświadczalnie dla ΔSβ. Gdyby zdarzenia splicingu były niezależne, można by się spodziewać, że pomnożenie ułamka wariantów ΔS przez ułamek β wariantów dałoby wartość zgodną z wartością wyznaczoną doświadczalnie. Wyższe poziomy ΔSβ niż oczekiwano w przypadku niezależnych zdarzeń splicingu sugerują, że istnieje odchylenie współsplicingu.

Połączenie bezwzględnych i względnych danych qPCR wykazało, że poziomy wszystkich wariantów splicingu STAT3 wzrosły po stymulacji cytokinami IL3 i TNFα, osiągając szczyt 6 godzin po stymulacji (Rysunek 5b-e). W przypadku trzech z czterech wariantów splicingu poziomy transkryptu były około 3 razy wyższe w eozynofilach traktowanych IL3 + TNFα (6 godzin) w porównaniu z eozynofilami w pożywce w tym samym punkcie czasowym. STATYSTYKA 3 Poziomy Sα były 3,5 razy wyższe w eozynofilach traktowanych IL3 + TNFα w porównaniu z eozynofilami w pożywkach w tym punkcie czasowym. Największą niepewność (największy błąd standardowy pomiaru) zaobserwowano w ΔSβ (rysunek 5e), który stanowi najmniejszy ułamek całkowitego STAT3 we wszystkich próbkach. Nie było to zaskakujące, ponieważ niższe poziomy wiążą się z wyższymi wartościami Ct. Wymaganie większej liczby cykli do osiągnięcia cyklu progowego zwiększy niepewność ze względu na różnice w wydajności wzmocnienia z cyklu na cykl

.

figure-results-1
Rysunek 1: Schemat par starterów używanych do wykonywania qPCR wariantów splicingu STAT3 i pan-STAT3. Pokazano startery używane do specyficznego wzmacniania każdego z wariantów splicingu STAT3 (odpowiednio Sα, Sβ, ΔSα i ΔSβ). Startery do przodu (STAT3 "S" i "ΔS") obejmują połączenie między eksonami 21 i 22. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Wykresy amplifikacji danych qPCR. (a) Wykresy amplifikacji sigmoidalnej oznaczają niezawodne wzmocnienie. Dane te uzyskano z qPCR dwóch seryjnych rozcieńczeń plazmidu zawierającego STAT3 Sα, przy czym każda para kolorowych linii reprezentuje poziomy fluorescencji zduplikowanych rozcieńczonych próbek w ciągu 40 cykli (oś x). Najbardziej skoncentrowana próbka (zielono-szara) została wystarczająco amplifikowana w cyklu 17 (z barwnikiem wiążącym dsDNA proporcjonalnym do fluorescencji, pokazanym na osi y), aby przekroczyć progową wartość fluorescencji (linia bazowa pokazana jako zielona strzałka). Jego wartość Ct wynosiłaby 17. (b) Wykresy niewykładnicze sugerują, że próg fluorescencji tła nie został prawidłowo ustalony w pierwszych kilku cyklach. Może to być spowodowane obecnością inhibitora lub wysoce skoncentrowanej matrycy lub starterów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Krzywa standardowa logarytmu (liczba kopii STAT3 Sα) w funkcji Ct. Istnieje liniowa zależność między logarytmem liczby kopii każdego wariantu spawu STAT3 a cyklem progowym (Ct). Tworzenie krzywej wzorcowej z plazmidowego DNA imituje cDNA próbek, a tym samym zapewnia lepszy pomiar niż krzywa utworzona z rozcieńczonych amplikonów PCR. Przedstawione dane są wartościami Ct uzyskanymi z qPCR dwóch seryjnych rozcieńczeń plazmidu zawierającego STAT3 Sα. Na podstawie tej krzywej można interpolować liczbę kopii obecną w każdej próbce i obliczyć skuteczność amplifikacji (83,9%). Chociaż przecięcia z osią y są mniej powtarzalne niż nachylenie, przecięcie sugeruje, że konieczne byłyby cykle 42,2, aby mieć pewność, że nie ma docelowego DNA. Słupki błędów wskazują SEM, n = 3. Porównywalne krzywe zostały skonstruowane dla STAT3 Sβ, ΔSα i ΔSβ (nie pokazano). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Porównanie ilościowych wariantów splicingu pan-STAT3 i skumulowanych wariantów spawów STAT3.Regresja dodanych wariantów spawu STAT3 w stosunku do całkowitego STAT3 powinna mieć nachylenie (stosunek pan- do skumulowanego) i wartość R2 (korelacja) bliskie 1. Uwzględniono wartości z 17 próbek (eozynofile i DLBCL). Słupki błędów wskazują SEM oznaczeń od x do y, n ≥ 2 dla każdego z nich. Rysunek zaczerpnięty z odnośnika20. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rycina 5: Poziomy wariantu splicingu STAT3 ulegały wahaniom w trakcie leczenia cytokinami. (a) Wykresy kołowe przedstawiające procentową zawartość procentową każdego wariantu splicingu STAT3 w eozynofilach podczas leczenia IL3 i TNFα. lit. b-e) Zmiany w wariantach splicingu STAT3 w eozynofilach traktowanych różnymi kombinacjami cytokin, mierzone przez połączenie względnych i bezwzględnych danych qPCR. STATYSTYKA 3 Poziomy Sα (b), Sβ (c), ΔSα (d) i ΔSβ (e) ulegały wahaniom w czasie po stymulacji. Poziomy początkowo wzrosły, osiągając szczyt 6 godzin po stymulacji. Kombinacja IL3 + TNFα wywołała wyższą ekspresję wszystkich czterech wariantów splicingu STAT3 niż sama IL3. SEM obliczony dla każdego punktu danych z uwzględnieniem propagacji błędu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Tabela 1: Startery stosowane do amplifikacji (a), bezwzględnej (b) i względnej (c) ilościowej reakcji PCR. Podkłady do klonowania mają sekwencje ograniczające i przedłużenia 5' dla wydajnego cięcia. Miejsca ograniczeń KpnI i NheI są zaznaczone pogrubioną czcionką. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej tabeli.

figure-results-7
Tabela 2. Parametry cykliczne PCR (po lewej) i objętości odczynnika (po prawej) dla amplifikacji (a), względne (b), bezwzględne (c) ilościowe PCR. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej tabeli.

figure-results-8
Tabela 3: Matryca do bezwzględnego testu kalibracji plazmidu qPCR. Test ten jest niezbędny do oceny odtwarzalności i wydajności, a także do generowania krzywych wzorcowych, z których można interpolować dane. Mieszanki "niedocelowe" dadzą oszacowanie specyficzności. Optymalizacja może być konieczna do osiągnięcia spójności. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej tabeli.

figure-results-9
Tabela 4: Szablon do względnego testu kalibracji qPCR (pan-STAT3 i genu porządkowego GUSB). W przeciwieństwie do bezwzględnego qPCR, celem tego testu jest określenie warunków, w których skuteczność amplifikacji wynosi ~100%. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej tabeli.

figure-results-10
Tabela 5: Szablon do względnego testu próbki qPCR do pomiaru pan-STAT3 i genu porządkowego GUSB. Krzywe wzorcowe powtarza się razem z próbkami, aby zapewnić porównywalną skuteczność testów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej tabeli.

figure-results-11
Tabela 6: Szablon do bezwzględnego testu próbki qPCR do pomiaru wariantów S. Krzywe wzorcowe powtarza się razem z próbkami, aby zapewnić porównywalną skuteczność testów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej tabeli.

figure-results-12
Tabela 7: Szablon do bezwzględnego testu próbki qPCR do pomiaru wariantów ΔS. Krzywe wzorcowe powtarza się razem z próbkami, aby zapewnić porównywalną skuteczność testów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej tabeli.

figure-results-13
Tabela 8: Szablon do bezwzględnego testu próbki qPCR do pomiaru pan-STAT3. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej tabeli.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opracowaliśmy ten protokół, aby ocenić poziomy i proporcje transkryptów wariantu splicingu STAT3 w eozynofilach i komórkach chłoniaka oraz dowiedzieć się, czy stymulacja cytokin wpłynęła na poziomy i proporcje. STAT3 jest szczególnie interesujący ze względu na jego plejotropową i niepewną funkcjonalność, ze sprzecznymi doniesieniami na temat tego, czy działa jako onkoproteina czy supresor guza w raku (przegląd w odnośniku33). Różnice w funkcji wariantu splicingu STAT3 α i β zostały scharakteryzowane wcześniej34,35, a nasz protokół ułatwił analizę knock-down/re-expression, która sugeruje potrzebę optymalnego stosunku transkryptów S i ΔS19.

Dokładna kwantyfikacja różnych wariantów splicingu ułatwi dalsze badania nad powiązaniem heterogenicznej funkcji STAT3 ze składem wariantu splicingu. Protokół integruje bezwzględne i względne dane qPCR, łącząc zdolność bezwzględnego qPCR do obliczania proporcji wariantu splicingu oraz względnego qPCR do pomiaru zmian w ogólnej ekspresji STAT3. Takie podejście pozwala na rozróżnienie subtelnych różnic w sekwencji i jednoczesny pomiar współczynników splicingu w dwóch alternatywnych miejscach splicingu oddalonych od siebie o ponad 50 nukleotydów. Indywidualne określenie proporcji zdarzeń splicingu nie przyniosłoby niezwykłego odkrycia, że istnieje błąd systematyczny współsplicingu, tak że poziomy ΔSβ są wyższe niż przewidywano, jeśli zastosowania dwóch miejsc są losowo łączone25.

Co istotne, bezwzględny qPCR z wykorzystaniem krzywych kalibracyjnych plazmidu umożliwia kwantyfikację (z nieoptymalną wydajnością) zmian splicingu, które skutkują bardzo podobnymi sekwencjami. Przewidujemy, że nowatorski test qPCR z subtelnym splicingiem powinien zająć około dwóch miesięcy, aby go zoptymalizować. Kluczowymi etapami w rozwoju testu są stworzenie plazmidów STAT3 wykorzystywanych do generowania krzywych wzorcowych dla bezwzględnego qPCR; eksperymentalne określanie optymalnych sekwencji starterów i parametrów cyklicznych w celu zapewnienia swoistości i odtwarzalności; oraz całkowanie względnych danych qPCR pochodzących z ilościowego określania ekspresji pan-STAT3 w stosunku do ekspresji GAPDH. Korelacja liczby kopii określonej ilościowo za pomocą pan-STAT3 w porównaniu z kwantyfikacją skumulowaną (Sα+ΔSα+Sβ+ΔSβ) pokazuje, że protokół daje wiarygodne wyniki.

Zastrzeżeniem tej techniki jest obszerny proces walidacji. Konieczna jest ocena zmienności wewnątrz testu (powtarzalność), zmienności między testami (odtwarzalności) i swoistości. Protokół określa sposoby uzyskiwania liczbowych danych wyjściowych dla tych parametrów. Za odpowiednie progi uznaliśmy wydajność ≥75%, współczynnik swoistości ≥4, współczynnik zmienności (odtwarzalność) ≤10% i odchylenie standardowe Ct (powtarzalność) ≤0,2 za odpowiednie progi30. Mutacje lub delecje w aminokwasach sekwencji STAT3 1-690 nie zostaną wykryte przez ten protokół, chociaż mogą wpływać na proporcje splicingu. Proporcje transkryptu mogą nie być proporcjonalne do proporcji proteoformu36.

Ponieważ próbki mają różne początkowe ilości całkowitego cDNA, bezwzględny qPCR jest odpowiedni do porównywania liczby kopii wariantów splicingu w próbce, ale nie do porównania między próbkami, chyba że jest sprzężony z względnym qPCR przy użyciu ustalonego genu porządkowego. Opisana metoda jest zgodna z wytycznymi MIQE qPCR dotyczącymi odtwarzalności30. Parametry cykliczne PCR i stężenia starterów mogą wymagać modyfikacji w celu uzyskania powtarzalnych danych, jeśli używany jest inny sprzęt. Idealna specyficzność nie jest możliwa bez drastycznego pogorszenia wydajności, ale cel został wzmocniony bardziej efektywnie o ponad cztery rzędy wielkości.

Liniowe DNA jest łatwiejsze do amplifikacji niż kołowe. Jeśli alternatywny plazmid nie zapewnia zadowalających krzywych standardowych (R2 < 0,95), rozważ linearyzację plazmidu przez ograniczenie pojedynczego miejsca przed kwantyfikacją. Optymalizacja qPCR ma kluczowe znaczenie dla uzyskania dobrej jakości danych (ryc. 1). Większość protokołów qPCR opiera się na dwuetapowym cyklu cyklowym, a maszyny są odpowiednio optymalizowane. Nierównomierne nagrzewanie bloku grzewczego może się nasilić w trzystopniowym cyklu, przyczyniając się do słabej powtarzalności. Testy muszą być wykonywane w sterylnych warunkach z końcówkami pipet filtrujących i ultraczystą wodą, najlepiej w dedykowanym okapie z przepływem laminarnym. Ponieważ zanieczyszczenia mogą prowadzić do niespójnych wyników, testy powinny być wykonywane w sterylnych warunkach z końcówkami pipet filtrujących i ultraczystą wodą, najlepiej w specjalnym okapie z przepływem laminarnym. Aby uzyskać więcej informacji na temat optymalizacji qPCR, zapoznaj się z Bustin i wsp.Rozdział 32

Kwantyfikacja STAT3 może prowadzić do lepszego wglądu w wiele kontekstów. STAT3 automatycznie reguluje swoją własną ekspresję37, a opisany powyżej protokół może pomóc w wyjaśnieniu, czy proporcje wariantów splicingu STAT3 przyczyniają się do regulacji tej pętli dodatniego sprzężenia zwrotnego. Protokół może być wykorzystany do badania zmian w proporcjach wariantów splicingu, obserwowanych w komórkach o różnej gęstości38 lub w trakcie rozwoju: wiadomo, że stosunek STAT3 α/β zmienia się na poziomie białka podczas hematopoezy16. Sundin i wsp. stwierdzono, że polimorfizm mononowego nukleotydu obciążył splicing eksonu 12 w STAT3 pacjenta z zespołem Joba39. Można sobie wyobrazić, że jeden z wielu SNP obecnych w intronach między eksonem 21 i 22 lub eksonem 22 i 23 może przyczyniać się do współczynników splicingu odpowiednio ΔS/S i α/β. Test można wykorzystać do ilościowego określenia transkryptów STAT3 w komórkach nowotworowych, w których mutacje lub zmiany w regulacji splicingu mogą wprowadzać stronniczość do procesu splicingu40. Mutacje w czynnikach splicingowych (takich jak SF3B1), obserwowane w zespołach mielodysplastycznych41 , mogą również prowadzić do zmian, które można zmierzyć za pomocą tego protokołu.

W szerszym ujęciu, podejście to wykrywa w szczególności koasocjację w splicingu, co nie jest wykonalne w przypadku konwencjonalnego sekwencjonowania RNA ani standardowego qPCR. Podczas gdy zjawisko wzajemnie wykluczającego się splicingu eksonów świadczy o koordynacji decyzji dotyczących splicingu, współpowiązanie innych zdarzeń splicingu nie zostało dobrze zbadane. Niedawno opisana alternatywna metoda, w której sekwencja RNA została zmodyfikowana tak, aby badać cDNA o pełnej długości, sugeruje, że odległe zdarzenia splicingu są bardziej współzależne niżwcześniej sądzono.

STAT3 zawiera miejsce łączenia tandemowego dawcy. Akceptorowe miejsca splicingu tandemowego są częstsze43 , a zasady przedstawionego protokołu mogą służyć jako punkt wyjścia do opracowania testów do wykrywania koincydencji splicingu NAGNAG i innych zdarzeń splicingu w obrębie 200 nukleotydów. Inne potencjalne zastosowania obejmują kwantyfikację koincydencji innych subtelnych różnic w sekwencji, takich jak indele lub polimorfizmy podwójnych/potrójnych nukleotydów44.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować National Institutes of Health-NHLBI za grant na projekt programu Rola eozynofili w zapaleniu i przebudowie dróg oddechowych: P01HL088584 (PI: N. Jarjour), oraz University of Wisconsin Carbone Cancer Center and Department of Medicine za finansowanie studiów stacjonarnych. Dziękujemy Douglasowi Annisowi za sklonowanie czterech wariantów STAT3.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
MJ Research PTC-200 Thermal CyclerGMIN/AUżywany do standardowego
systemu PCR 7500 Real-Time PCRApplied BiosystemsN/AqPCR Maszyna
GS-6RBeckman CoulterN/Ado płytek 96-dołkowych
Spretrofotometr Nanodrop 2000ThermoFisher ScientificN/A
RPMI-1640 mediumSigma AldrichR8758Pożywka do hodowli komórkowych
PfuTurbo DNA PolimerazaAgilent Technologies600410Polimeraza DNA do standardowego PCR
KpnINew England BiosciencesR0142S
NheINew England BiosciencesR0131S
SYBR Green PCR Master MixQiagen330523qPCR, mieszanka barwników wiążących DNA / dsDNA
Rneasy Mini KitQiagen74204Zestaw do ekstrakcji RNA
SuperScript III System syntezy pierwszej niciInvitrogen (ThermoFisher Scientific)18080-044Zestaw do syntezy cDNA
StarteryZintegrowana technologia DNAN/A
NEBuffer 1.1New England BiosciencesB7201S
GenePure LE AgarozaISC BioExpressE-3120-500składnik żelu TAE
PipetyGłówni dostawcy laboratoryjni (MLS)Nie dotyczy
Końcówki do pipet z filtremNeptune ScientificBT10XL, BT20, BT200
EU Jednoczęściowa cienkościenna płytaMidSciABI7501
Folia uszczelniająca ThermalSeal AMidSciTSA-10096-dołkowa uszczelka
pET-Elmer (wariant pET-28a)Novagen; zmodyfikowana w laboratorium MosherN/ASzczegóły w PMID: System
oczyszczania DNA 20947497 Wizard Plus SV MiniprepsOczyszczanie plazmiduPromegaA1460
Zestaw do sekwencjonowania cykli BigDye Terminator v3.1 Zestaw do sekwencjonowaniaThermoFisher Scientific4337455Zestaw do sekwencjonowania
QIAEX II Zestaw do ekstrakcji żeluQiagen20021Oczyszczanie amplikonu Kompetentne
komórki DH5&alphaThermoFisher Scientific18265-017dostępny u kilku dostawców, patrz PMID: 2162051
kanamycinResearch Products International Corp.K22000-5.0
Tris baseThermoFisher ScientificBP152-5składnik buforu TAE
Kwas octowy, lodowatyThermoFisherScientific A38C-212składnik buforu TAE
EDTA (kwas etylenodiaminotetraoctowy)Sigma Chemical Company (Sigma Aldrich)E-5134składnik buforu TAE
Bacto TryptoneBD Biosciences211705składnik Luria Bulion
Bacto Ekstrakt drożdżowy, technicznyBD Biosciences288620składnik Luria
Bulion Chlorek soduThermoFisher ScientificS271-10składnik Luria Broth
Wodorotlenek soduThermoFisher ScientificSS255-1składnik Luria Bulion
Bacto AgarBD Biosciences214010składnik Luria Płytka bulionowa
Lasergene SeqBuilderDNASTARRysunek 1 wygenerowana przy użyciu oprogramowania Lasergene SeqBuilder w wersji 12.2.0 (DNASTAR)

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hiller, M., et al. Phylogenetically widespread alternative splicing at unusual GYNGYN donors. Genome Biol. 7 (7), R65(2006).
  2. Treacy, M. N., et al. Twin of I-POU: a two amino acid difference in the I-POU homeodomain distinguishes an activator from an inhibitor of transcription. Cell. 68 (3), 491-505 (1992).
  3. Schindler, S., et al. Alternative splicing at NAGNAG acceptors in Arabidopsis thaliana SR and SR-related protein-coding genes. BMC Genomics. 9, 159(2008).
  4. Szafranski, K., Kramer, M. It's a bit over, is that ok? The subtle surplus from tandem alternative splicing. RNA Biol. 12 (2), 115-122 (2015).
  5. Wang, M., et al. Alternative splicing at GYNNGY 5' splice sites: more noise, less regulation. Nucleic Acids Res. 42 (22), 13969-13980 (2014).
  6. Hiller, M., Platzer, M. Widespread and subtle: alternative splicing at short-distance tandem sites. Trends Genet. 24 (5), 246-255 (2008).
  7. Tsai, K. W., Lin, W. C. Quantitative analysis of wobble splicing indicates that it is not tissue specific. Genomics. 88 (6), 855-864 (2006).
  8. Tadokoro, K., et al. Frequent occurrence of protein isoforms with or without a single amino acid residue by subtle alternative splicing: the case of Gln in DRPLA affects subcellular localization of the products. J Hum Genet. 50 (8), 382-394 (2005).
  9. Bradley, R. K., Merkin, J., Lambert, N. J., Burge, C. B. Alternative splicing of RNA triplets is often regulated and accelerates proteome evolution. PLoS Biol. 10 (1), e1001229(2012).
  10. Zheng, C. L., Fu, X. D., Gribskov, M. Characteristics and regulatory elements defining constitutive splicing and different modes of alternative splicing in human and mouse. RNA. 11 (12), 1777-1787 (2005).
  11. Schaefer, T. S., Sanders, L. K., Nathans, D. Cooperative transcriptional activity of Jun and Stat3 beta, a short form of Stat3. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (20), 9097-9101 (1995).
  12. Waitkus, M. S., et al. Signal integration and gene induction by a functionally distinct STAT3 phosphoform. Mol Cell Biol. 34 (10), 1800-1811 (2014).
  13. Srivastava, J., DiGiovanni, J. Non-canonical Stat3 signaling in cancer. Mol Carcinog. , (2015).
  14. Holland, S. M., et al. STAT3 mutations in the hyper-IgE syndrome. N Engl J Med. 357 (16), 1608-1619 (2007).
  15. Maritano, D., et al. The STAT3 isoforms alpha and beta have unique and specific functions. Nat Immunol. 5 (4), 401-409 (2004).
  16. Hevehan, D. L., Miller, W. M., Papoutsakis, E. T. Differential expression and phosphorylation of distinct STAT3 proteins during granulocytic differentiation. Blood. 99 (5), 1627-1637 (2002).
  17. Yoo, J. Y., Huso, D. L., Nathans, D., Desiderio, S. Specific ablation of Stat3beta distorts the pattern of Stat3-responsive gene expression and impairs recovery from endotoxic shock. Cell. 108 (3), 331-344 (2002).
  18. Stahl, N., et al. Choice of STATs and other substrates specified by modular tyrosine-based motifs in cytokine receptors. Science. 267 (5202), 1349-1353 (1995).
  19. Zheng, M., et al. A mix of S and DeltaS variants of STAT3 enable survival of activated B-cell-like diffuse large B-cell lymphoma cells in culture. Oncogenesis. 4, 184(2016).
  20. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  21. Zipper, H., Brunner, H., Bernhagen, J., Vitzthum, F. Investigations on DNA intercalation and surface binding by SYBR Green I, its structure determination and methodological implications. Nucleic Acids Res. 32 (12), e103(2004).
  22. Kelly, E. A., Liu, L. Y., Esnault, S., Quinchia Johnson, B. H., Jarjour, N. N. Potent synergistic effect of IL-3 and TNF on matrix metalloproteinase 9 generation by human eosinophils. Cytokine. 58 (2), 199-206 (2012).
  23. Whelan, J. A., Russell, N. B., Whelan, M. A. A method for the absolute quantification of cDNA using real-time PCR. J Immunol Methods. 278 (1-2), 261-269 (2003).
  24. Too, H. P. Real time PCR quantification of GFRalpha-2 alternatively spliced isoforms in murine brain and peripheral tissues. Brain Res Mol Brain Res. 114 (2), 146-153 (2003).
  25. Turton, K. B., Annis, D. S., Rui, L., Esnault, S., Mosher, D. F. Ratios of Four STAT3 Splice Variants in Human Eosinophils and Diffuse Large B Cell Lymphoma Cells. PloS One. 10 (5), e0127243(2015).
  26. Maurer, L. M., et al. Extended binding site on fibronectin for the functional upstream domain of protein F1 of Streptococcus pyogenes. J Biol Chem. 285 (52), 41087-41099 (2010).
  27. Current protocols in molecular biology. Ausubel, F. M., et al. , Greene Pub. Associates; J. Wiley. (1987).
  28. Grant, S. G., Jessee, J., Bloom, F. R., Hanahan, D. Differential plasmid rescue from transgenic mouse DNAs into Escherichia coli methylation-restriction mutants. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (12), 4645-4649 (1990).
  29. Kocsis, L., Herman, P., Eke, A. The modified Beer-Lambert law revisited. Phys Med Biol. 51 (5), N91-N98 (2006).
  30. Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 55 (4), 611-622 (2009).
  31. Pfaffl, M. W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res. 29 (9), e45(2001).
  32. A-Z of quantitative PCR. Bustin, S. A. , International University Line. (2004).
  33. Zhang, H. F., Lai, R. STAT3 in cancer-friend or foe. Cancers (Basel). 6 (3), 1408-1440 (2014).
  34. Caldenhoven, E., et al. STAT3beta, a splice variant of transcription factor STAT3, is a dominant negative regulator of transcription. J Biol Chem. 271 (22), 13221-13227 (1996).
  35. Zammarchi, F., et al. Antitumorigenic potential of STAT3 alternative splicing modulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (43), 17779-17784 (2011).
  36. Liu, Y., Beyer, A., Aebersold, R. On the Dependency of Cellular Protein Levels on mRNA Abundance. Cell. 165 (3), 535-550 (2016).
  37. Narimatsu, M., et al. Tissue-specific autoregulation of the stat3 gene and its role in interleukin-6-induced survival signals in T cells. Mol Cell Biol. 21 (19), 6615-6625 (2001).
  38. Szafranski, K., et al. Physiological state co-regulates thousands of mammalian mRNA splicing events at tandem splice sites and alternative exons. Nucleic Acids Res. 42 (14), 8895-8904 (2014).
  39. Sundin, M., et al. Novel STAT3 mutation causing hyper-IgE syndrome: studies of the clinical course and immunopathology. J Clin Immunol. 34 (4), 469-477 (2014).
  40. Oltean, S., Bates, D. O. Hallmarks of alternative splicing in cancer. Oncogene. 33 (46), 5311-5318 (2014).
  41. Boultwood, J., Dolatshad, H., Varanasi, S. S., Yip, B. H., Pellagatti, A. The role of splicing factor mutations in the pathogenesis of the myelodysplastic syndromes. Adv Biol Regul. 54, 153-161 (2014).
  42. Tilgner, H., et al. Comprehensive transcriptome analysis using synthetic long-read sequencing reveals molecular co-association of distant splicing events. Nat Biotechnol. 33 (7), 736-742 (2015).
  43. Hiller, M., et al. Widespread occurrence of alternative splicing at NAGNAG acceptors contributes to proteome plasticity. Nat Genet. 36 (12), 1255-1257 (2004).
  44. Rosenfeld, J. A., Malhotra, A. K., Lencz, T. Novel multi-nucleotide polymorphisms in the human genome characterized by whole genome and exome sequencing. Nucleic Acids Res. 38 (18), 6102-6111 (2010).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

STAT3 Splice VariantsAbsolute qPCRRelative qPCRSplice Variant QuantificationPlasmid StandardsPrimer ValidationCycling ParametersCytokine TreatmentEosinophil STAT3Co splicing Analysis

Related Articles