Artykuł metodologiczny

Łączenie bezwzględnych i względnych ilościowych danych PCR w celu ilościowego określenia transkryptów wariantu splicingu STAT3

16.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54473

⸱

9 października 2016

 ,  ,  , 
1Department of Biomolecular Chemistry, University of Wisconsin-Madison, 2Department of Medicine, University of Wisconsin-Madison

W tym artykule

Podsumowanie

Zdarzenia splicingu tandemowego występują w miejscach oddalonych od siebie o mniej niż 12 nukleotydów. Kwantyfikacja proporcji takich wariantów splicingu jest możliwa przy użyciu bezwzględnego ilościowego podejścia PCR. Niniejszy manuskrypt opisuje, w jaki sposób można określić ilościowo warianty splicingu genu STAT3, w których dwa zdarzenia splicingu skutkują włączeniem/wykluczeniem Serine-701 i α/β C-końcami.

Streszczenie

Ludzki przetwornik sygnału i aktywator transkrypcji 3 (STAT3) jest jednym z wielu genów zawierających tandemowe miejsce splicingu. Alternatywne miejsca splicingu donorów oddalone od siebie o 3 nukleotydy powodują włączenie (S) lub wykluczenie (ΔS) pojedynczej reszty, Serine-701. Dalej, splicing w parze alternatywnych miejsc splicingu akceptora powoduje powstanie transkryptów kodujących albo 55 końcowych reszt domeny transaktywacyjnej (α), albo skróconą domenę transaktywacyjną z 7 unikalnymi resztami (β). Jak opisano w tym manuskrypcie, pomiar proporcji czterech splicingowanych transkryptów STAT3 (Sα, Sβ, ΔSα i ΔSβ) był możliwy przy użyciu bezwzględnej qPCR (ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy). W związku z tym protokół rozróżnia i mierzy bardzo podobne warianty spawów. Absolute qPCR wykorzystuje plazmidy kalibracyjne, dzięki czemu swoistość detekcji nie jest zagrożona ze względu na wydajność. Protokół wymaga walidacji starterów i optymalizacji parametrów cyklicznych. Połączenie bezwzględnego qPCR i zależnego od wydajności względnego qPCR całkowitych transkryptów STAT3 pozwoliło na opisanie wahań poziomów wariantów splicingu STAT3 w eozynofilach traktowanych cytokinami. Protokół dostarczył również dowodów na współzależność splicingu między dwoma zdarzeniami splicingu STAT3. Strategia oparta na połączeniu dwóch technik qPCR powinna być łatwa do zaadaptowania do badania współsplicingu w innych miejscach splicingu tandemowego.

Wprowadzenie

Alternatywne łączenie krótkiego zasięgu (tandem), gdzie alternatywne miejsca akceptora lub dawcy znajdują się blisko siebie, jest powszechne u ssaków1, bezkręgowców2 i roślin3. Szacuje się, że 20% genów ssaków zawiera alternatywne miejsca splicingu oddalone od siebie o 2-12 nukleotydów4. Wiele z tych miejsc jest oddalonych od siebie o 3 nukleotydy i powoduje włączenie lub wykluczenie pojedynczego kodonu. Toczy się debata na temat natury regulacji splicingu w tych miejscach5,6, przy czym niektórzy twierdzą, że różnice w motywie splicingu są tak subtelne, że selekcja jest stochastyczna7, podczas gdy inni wnioskują regulację na podstawie specyficzności tkankowej8.

Wybór miejsca łączenia tandemowego został przeanalizowany półilościowo przy użyciu zmodyfikowanej elektroforezy kapilarnej7 i elektroforezy żelowej o wysokiej rozdzielczości8. Odczyty RNA-Seq (sekwencjonowanie RNA) mogą być wykorzystywane do ilościowego określania współczynników splicingu w każdym miejscu splicingu. W ten sposób dane RNA-Seq dostarczyły informacji na temat regulacji miejsc splicingutandemowego 9. Umożliwiło to również przewidywanie oczekiwanych proporcji wariantów splicingu na podstawie motywu nukleotydowego10. Większość nacisku na splicing, który obejmuje lub wyklucza pojedynczy kodon, został położony na częściej występujące miejsca splicingu akceptorowego tandemu, znane jako NAGNAG (gdzie N = dowolny nukleotyd).

Alternatywne miejsca splicingu dawcy tandemu, włączając lub wykluczając pojedynczy kodon (motyw rozpoznania GYNGYN, gdzie Y = pirymidyna) są mniej powszechne niż akceptory tandemowe. Przetwornik sygnału i aktywator transkrypcji 3 (STAT3) jest kluczowym genem poddawanym alternatywnemu splicingowi dawcy tandemowego1,11. Miejsca splicingu dawcy tandemowego łączą się z eksonami 21 i 22 i powodują włączenie lub wyłączenie kodonu dla seryny-701 (odpowiednio S lub ΔS)1,11. Dalsze alternatywne miejsca akceptorowe (40 nukleotydów oddalonych od siebie) łączące eksony 22 i 23a/b powodują włączenie 55 reszt końcowych domeny transaktywacyjnej (α) lub skróconej domeny transaktywacyjnej z 7 unikalnymi resztami C-końcowymi (β)11. W związku z tym możliwe są cztery warianty spawów.

Białko STAT3 jest czynnikiem transkrypcyjnym i głównym integratorem sygnału w wielu typachkomórek12, a gdy ulega mutacji, jego konstytutywna aktywacja przyczynia się do kilku fenotypów raka (omówione w odnośniku13). Zespół Hioba, zaburzenie niedoboru odporności charakteryzujące się wysokim poziomem IgE, jest również spowodowane mutacjami w STAT3 (omówione w odnośniku14). Odrębne role białek wariantu splicingu STAT3 α i β zostały wcześniej opisane15. Początkowo uważano, że STAT3 β działa w sposób dominująco-negatywny16, antagonizując aktywność transkrypcyjną STAT3 α, ale późniejsze prace sugerowały, że ma niezależne geny docelowe17. Pomimo subtelności łączenia tandemowego, istnieją powody, by sądzić, że brak lub obecność Serine-701 (Ser701) wpływa na działanie. Ser701 znajduje się nie tylko w bliskim sąsiedztwie tyrozyny-705 (reszta fosforylowana w aktywacji STAT318), ale ostatnie badania sugerują, że warianty splicingu STAT3 S i ΔS są niezbędne do żywotności uzależnionych od STAT3 komórek chłoniaka rozlanego z dużych komórek B (DLBLCL)19. Znaczenie biologiczne pozostaje do zbadania. Biorąc pod uwagę, że skład wariantu splicingu może wpływać na funkcję, staraliśmy się ustalić, czy stosunek ten był zaburzony przez stymulację cytokin w eozynofilach.

Początkowo próbowaliśmy zbadać związek między dwoma zdarzeniami splicingu, używając PCR specyficznego dla wariantów α STAT3 i β, a następnie podziału produktów z enzymem restrykcyjnym specyficznym dla wariantów splicingu S, AfeI. Densytometria produktów wykazała, że włączenie Ser701 było około dziesięć razy częstsze niż jego pominięcie (ΔS) zarówno w STAT3 α, jak i β (dane nie pokazane). Jednak to półilościowe podejście nie było wystarczająco powtarzalne i nie mogło być skutecznie wykorzystane do jednoczesnego pomiaru wszystkich czterech wariantów splicingu. Aby przeanalizować proporcje każdego z czterech wariantów splicingu, konieczne było ustalenie ilościowego protokołu PCR (qPCR), który pozwolił na uzyskanie ścisłych powtórzeń technicznych (kilka testów danej próbki).

Względny qPCR opiera się na porównaniu interesującego genu z genem standardowym lub genem porządkowym, o którym wiadomo, że ulega ekspresji na określonym poziomie20 i jest odpowiedni, gdy gen będący przedmiotem zainteresowania i gen porządkowy są amplifikowane z podobną wydajnością. Dwuniciowy (ds) barwnik fluorescencyjny (cyjaninowy) wiążący DNA wiąże się z amplikonami PCR21, a po określonej liczbie cykli nastąpiła wystarczająca amplifikacja, aby fluorescencja była wykrywalna. Im wyższy początkowy poziom transkryptu, tym niższa wartość progowa cyklu (Ct). Ponieważ stężenie preparatów cDNA jest różne, należy porównać stężenie transkryptu ze stężeniem transkryptu, o którym wiadomo, że ulega ekspresji na stałym poziomie we wszystkich próbkach, takich jak glukuronidaza-β (GUSB) w eozynofilach22.

Względny qPCR nie jest możliwy do wykonania dla bardzo podobnych sekwencji, co widać w wariantach splicingu wynikających z łączenia tandemowego. Rygorystyczne warunki wymagane do specyficznego wzmocnienia wariantów spawów skutkują zmniejszoną wydajnością. Zamiast tego należy zastosować bezwzględną kwantyfikację23. Wiąże się to z przygotowaniem krzywej wzorcowej ze znanymi stężeniami interesującego nas transkryptu splicingu i zapewnieniem, że warunki PCR optymalizują swoistość24. Jak opisano, bezwzględne i względne dane qPCR dla konkretnego genu można połączyć, aby uzyskać informacje na temat ekspresji genu w określonym typie komórki, w tym przypadku STAT3 w różnie stymulowanych eozynofilach25.

Tutaj, opisano kwantyfikację wariantu splicingu STAT3 z oczekiwaniem, że metoda może być dostosowana do ukierunkowanych badań innych zdarzeń splicingu tandemowego. Optymalizacja była długotrwałym procesem, w ramach którego w ciągu kilku miesięcy przetestowano kilka par starterów o różnych stężeniach i liczne iteracje parametrów cyklicznych. Kluczowymi cechami protokołu są walidacja swoistości startera i kwantyfikacja w oparciu o krzywe standardowe ze znanymi stężeniami wariantów splicingu. Względny qPCR w połączeniu okazał się pomocny dla naszej aplikacji, ale nie jest konieczny.

Protokół

UWAGA: Eozynofile z krwi obwodowej zostały przekazane bez informacji identyfikacyjnych, zgodnie z protokołem zatwierdzonym (#2013-1570) przez Instytucjonalną Radę Rewizyjną Center for Health Sciences Uniwersytetu w Wisconsin-Madison. Od każdego dawcy uzyskano podpisaną świadomą zgodę na wykorzystanie próbki w badaniach.

1. Tworzenie plazmidów jako standardów matrycowych

  1. Zaprojektuj startery dla amplikonu obejmującego oba STAT3 miejsca splicingu, z 5'- KpnI i NheI miejsca restrykcyjne (oraz przedłużenia 5') zgodnie z Tabela 1a.
    UWAGA: KpnI i NheI wybrano miejsca umożliwiające ligację insertów do zmodyfikowanego wektora pET-28a z opornością na kanamycynę25,26. KpnI miejsce to zostało wprowadzone do wielokrotnej witryny klonowania.
  2. Przy użyciu świeżo pobranych eozynofilów przygotować próbki dubletowe w ilości 2,5 x 106 komórek/ml w pożywce do hodowli komórkowych (pożywka Roswell Park Memorial Institute (RPMI)1640). Inkubować przez 1 h w temperaturze 37 °C poniżej 5% CO2 oraz 10% wilgotności.
    1. Przygotuj komplementarne (c)DNA z próbek (co najmniej 1 x 106 komórek na preparat) zgodnie z instrukcjami producenta, wykorzystując zestawy do ekstrakcji RNA i syntezy cDNA.
  3. Z cDNA matrycowego przygotowanego w kroku 1.2.1, przeprowadzić amplifikację STAT3 warianty splicingu za pomocą PCR amplifikacyjnego zgodnie z Tabela 2a.
  4. Rozdziel amplikony w 2% żelu agarozowym w buforze Tris-octan-EDTA (TAE)27Wytnij prążki z żelu i oczyść zgodnie z instrukcją dołączoną do zestawu do oczyszczania produktów po elektroforezie.
  5. Przetraw amplikony i plazmid odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi (przegląd restrykcji w odniesieniu)27), stosując objętości, czasy inkubacji i temperatury zalecane przez dostawcę enzymu; a następnie oczyścić zgodnie z krokiem 1.4. Ligować pocięte amplikony do plazmidu w warunkach zalecanych przez dostawcę.
  6. Przygotować kontrolę negatywną (ograniczony DNA plazmidowy bez wstawki, ale z ligazą) oraz kontrolę pozytywną (nieograniczony plazmid z opornością na kanamycynę). Przeprowadzić standardowe transformacje plazmidowe kompetentnych E. coli DH5α28 wykorzystanie mieszanin do ligacji27.
  7. Inkubować przetransformowane E. coli w 1 ml pożywki Luria-Broth (LB) (przygotowanej zgodnie z instrukcją27) wstrząsanie przez 1 h przy 37 °CWysiać transformanty na płytki LB zawierające 50 µg/ml kanamycyną i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.
  8. Wybierz kilka kolonii z STAT3 α oraz STAT3 płytki $\beta$ przy użyciu sterylnych wykałaczek27Przenieść każdą z nich do 2 ml pożywki LB. Hodować kultury przez noc w temperaturze 37 °C w inkubatorze wytrząsowym.
  9. Oczyść plazmidy z kultur bakteryjnych, postępując zgodnie z instrukcjami zamieszczonymi w zestawie do oczyszczania DNA. Przechowuj plazmidy w temperaturze -20°C lub -80 °C.
  10. Sekwencjonuj plazmidy z kilku kolonii poprzez przygotowanie 20 µl reakcje sekwencjonowania. Pipetować 3 µl bufor do reakcji sekwencjonowania, 2 µl mieszanina reakcyjna do sekwencjonowania, 12 µl woda ultra czysta, 1 µl plazmid jako matryca i 2 µl starter do sekwencjonowania
    UWAGA: W przypadku użycia wektora pET-28a należy zastosować starter do sekwencjonowania 5'-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGG-3'.
    1. Oceń elektroforetogramy plazmidów kodujących każdy wariant: Sα, Sβ, ΔSα i ΔSβ25.
  11. Pomiar stężenia czystego plazmidowego DNA w ng/µlµlW przypadku pomiaru absorbancji przy 260 nm za pomocą spektrofotometru, stężenie DNA należy obliczyć zgodnie z prawem Lamberta-Beera.29:
    Wzór na prawo Beer-Lamberta, c=A/εL, obliczenia w spektroskopii absorpcyjnej.
    Gdzie Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia. = stężenie, A = absorbancja, ε (współczynnik ekstynkcji) = 0,02 (µg/ml)-1 cm-1 dla dwuniciowego DNA oraz L = droga optyczna światła (zazwyczaj 1 cm).
  12. Wykorzystując masy cząsteczkowe STAT3 amplikony cDNA wariantów splicingowych oraz wektor, oblicz liczbę kopii na µl.
    UWAGA: Masę cząsteczkową na jedną parę zasad (bp) szacuje się na 650 Da.
    Równanie ilościowego oznaczania DNA; obliczanie liczby kopii z wykorzystaniem liczby Avogadra; wzór naukowy.

2. Analiza specyficzności starterów dla bezwzględnego qPCR

  1. Przygotować szereg rozcieńczeń 1:10 plazmidów STAT3, od ~108 do 103 kopii na µl (20 µl), używając wody ultrapure. Zmierzyć stężenie najsilniej skoncentrowanego roztworu (~108 kopii na µl, patrz krok 1.1).
  2. Wykorzystując rozcieńczone plazmidy, przygotować cztery mieszaniny „nietargetowe” (t.j. ujemną kontrolę STAT3ΔSβ zawierającą równe stężenia STAT3 Sα, ΔSα, Sβ, ale bez ΔSβ) o stężeniu 106 kopii na µl dla każdej z nich. Przygotować mieszaninę „targetową” z równymi stężeniami wszystkich czterech matryc, każda w stężeniu 106 kopii na µl.
  3. Przygotować roztwory par starterów dla każdego wariantu splicingowego (patrz Tabela 1b i Rysunek 1), sporządzając ~60 µl każdego startera o stężeniu 7 µM (stężenie końcowe w próbce wyniesie 560 nM).
  4. Rozcieńczyć mieszaninę polimerazy DNA/barwnika wiążącego dsDNA w stosunku 7:5 czystą wodą H2O.
  5. Przygotować Assay 1 w 96-dołkowej płytce PCR zgodnie z szablonem (Tabela 3).
    1. Dodać 21 µl rozcieńczonej mieszaniny polimerazy DNA/barwnika wiążącego dsDNA, następnie 2 µl mieszaniny starterów i 2 µl matrycy (zgodnie z Tabelą 2b). Zamiast matrycy, dodać 2 µl filtrowanej wody H2O dołka kontroli bez matrycy (NTC). Reakcje przeprowadzić w dubletach, aby ocenić powtarzalność30.
  6. Uszczelnić płytkę qPCR pokrywą przylepną i wirować przez 5 min przy 1 20 x g w temperaturze 12 °C.
  7. W przypadku korzystania z oprogramowania wymienionego w sekcji Materiały, skonfigurować eksperyment zgodnie z opisem.
    1. Włączyć urządzenie do qPCR i włożyć uszczelnioną płytkę qPCR. Kliknąć Plik > Nowy > Dalej > Wybrać „Nowy detektor”, wybrać reporter, quencher i podać nazwę. Skonfigurować „nowy detektor” dla każdego wariantu splicingowego.
    2. Wybrać Dalej i ustawić standardy zgodnie z instrukcjami na stronie Konfiguracji Płytki z Próbkami, upewniając się, że ilości zostały wpisane do tabeli i wybrano odpowiednie detektory. Kliknąć Zakończ.
    3. Ustawić cykle zgodnie z Tabelą 2b. Upewnić się, że odczyt fluorescencji (w celu wyznaczenia Ct) następuje podczas kroku 72 °C każdego cyklu. Wybrać Uruchom.
    4. Po zakończeniu procesu kliknąć kartę Wyniki > karta Wykres amplifikacji. Przeanalizować uzyskany wykres amplifikacji w celu oceny jakości danych (szukać wykresu wykładniczego, jak na Rysunku 2).
      UWAGA: Upewnić się, że wykresy amplifikacji mają w przeważającej mierze charakter wykładniczy i że próg cyklu można ustawić w wykładniczej części wykresu. Upewnić się, że próbki NTC nie uległy amplifikacji, a pozostałe punkty standardowe wykazują niską wartość Ct przy wysokim ΔRn.
    5. Aby wyeksportować wyniki do programu arkusza kalkulacyjnego, kliknąć Plik > Eksportuj > Wyniki.

3. Ocena specyficzności i powtarzalności absolutnego testu qPCR

  1. Powtarzalność
    1. Wykorzystaj dane z kroku 2.7.5, aby obliczyć odchylenie standardowe dla Ct (wartości cyklu progowego dla fluorescencji).
      Równanie odchylenia standardowego, formuła analizy statystycznej, pojęcie matematyczne, narzędzie edukacyjne.
      Gdzie N = liczba próbek (2 w przypadku wykonania w dubletach), schemat równowagi statycznej, ΣFx=0, bilans sił, ilustracja wektorowa, analiza układu mechanicznego próbki Ct i Termodynamika, wykres PV=nRT, diagram, prawo gazów doskonałych, zależność objętość-ciśnienie, fizyka edukacyjna. próbka Ct średnią. Sprawdzić, czy odchylenie standardowe Ct wartości powtórek są ≤0,2. Należy sprawdzić, czy Ct wartości we wszystkich dołkach z wyjątkiem NTC są mniejsze niż 38.
    2. Jeśli powtarzalność jest niska, należy zoptymalizować parametry cykli poprzez zwiększenie lub zmniejszenie czasu annealingu.
  2. Wykreślij logarytm liczby kopii (wyznaczony w kroku 1.12 i przygotowany w kroku 2.1) w funkcji Ct wartość do stworzenia krzywej wzorcowej, co pozwoliło uzyskać następujące równanie:
    Równanie liniowe y=mx+b, wzór, ilustrujący koncepcje postaci równania prostej z wykorzystaniem współczynnika kierunkowego i wyrazu wolnego.
    Gdzie y jest Ct, m jest gradientem, Wprowadź tekst źródłowy, który chcesz przetłumaczyć. czy log(liczby kopii) i b jest wartością wycinka.
    UWAGA: R2 wartość regresji liniowej dla dobrych danych będzie wynosić ≥0,95.
  3. Oblicz wydajność amplifikacji, korzystając z krzywej standardowej i równania:
    Równanie wydajności procentowej, wzór; edukacyjny; zwięzłe wyjaśnienie pojęcia z zakresu chemii/fizyki.
    UWAGA: Dążyć do uzyskania wydajności ≥75%.
  4. Oblicz swoistość z testu qPCR 1, korzystając z wzoru Too:
    Wzór na współczynnik specyficzności, równanie służące do wyznaczania specyficzności molekularnej w procesach chemicznych.
    Gdzie ΔCtZbyt = CtProszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia. - Ctnietargetowy opisujący różnicę w liczbie cykli progowych dla amplifikacji specyficznej i niespecyficznej
    UWAGA: Specyficzność powinna przekraczać cztery rzędy wielkości (t. j.., współczynnik swoistości ≥4).
    1. W przypadku niskiej specyficzności należy przeprowadzić optymalizację poprzez obniżenie stężenia starterów. Należy przygotować testy (zgodnie z opisem w krokach 2.5–2.7), stosując końcowe stężenia starterów w zakresie od 10 nM do 50 nM.

4. Wykonywanie analizy względnej qPCR

  1. Inkubacja komórek z cytokinami w celu stymulacji transkrypcji.
    1. W przypadku świeżo pobranych eozynofilów należy przygotować próbki powielone w ilości 2,5 x 106 komórek/ml w pożywce do hodowli komórkowej (pożywka RPMI 1640) i poddać działaniu 50 ng/ml interleukiny-3 (IL3) i/lub 50 ng/ml czynnika martwicy nowotworów α (TNFα) przez okresy 3, 6, 9 i 20 h w temperaturze 37 °C poniżej 5% CO2 oraz 10% wilgotności.
  2. Przygotowanie cDNA z próbek eozynofili (co najmniej 1 x 106 komórek na preparat) zgodnie z instrukcjami producenta, przy użyciu zestawów do ekstrakcji RNA i syntezy cDNA.
  3. Przygotować rozcieńczenia seryjne dwóch alikwotów cDNA z próbek (prób kontrolnych lub spoczynkowych), w zakresie rozcieńczeń od „1” do „1:1024”.
    1. Do rozcieńczenia 1:4 odpipetować 1 µl cDNA oraz 3 µl woda ultrazczysta.
    2. W celu przygotowania rozcieńczenia 1:16, odpipetować 1 µl z rozcieńczenia 1:4 i 3 µl woda ultrapure, itp.
  4. Przygotuj reakcję PCR w płytce 96-dołkowej z 25 µl reakcje zgodnie z opisem w krokach 2.3-2.5, ale z zastosowaniem kilku stężeń starterów dla pan-STAT3 i GUSB (patrz szablon w Tabela 4).
  5. Dodaj „nowy detektor” dla GUSB i należy postępować zgodnie z krokami 2.6-2.7, stosując parametry cykli opisane w Tabela 2c.
  6. Wygeneruj krzywe standardowe (patrz kroki 3.2 i 3.3), aby określić, które stężenia starterów zapewniają wydajność amplifikacji na poziomie 95–10%.
  7. Przygotować płytkę z przygotowanymi próbkami cDNA (z kroku 4.2) i zoptymalizowanymi stężeniami starterów (patrz Tabela 2c dla parametrów cykli, odczynników i Tabela 5 szablon płytki 96-dołkowej).
  8. Wykonać kroki 2.6–2.7. Powtórzyć analizę co najmniej raz i sprawdzić jakość danych.
  9. Oblicz średnią Ct wartość próbki powtórzonej Cts dla obu STAT3 or gen referencyjny GUSB.
  10. Wyznaczyć ΔCt wartości dla każdej próbki.
    Wzór analizy qPCR, równanie obliczania ΔCt dla kwantyfikacji ekspresji genów.
  11. Próbkę spoczynkową (zazwyczaj o najniższym stężeniu interesującego transkryptu) wyznacz jako próbkę 0. Oblicz ΔΔCt31 dla każdej próbki (oznaczonej tutaj jako próbka X):
    Wzór ilościowania względnego w qPCR ΔΔCt=ΔCt_próbkaX−ΔCt_próbka0, równanie dla ekspresji genów.
  12. Oblicz krotność wzrostu dla każdej próbki:
    Równanie wyników qPCR: wzrost krotności = 2^(-ΔCt Próbki X).
  13. Powtarzalność
    1. Oblicz współczynnik zmienności (CV) liczby kopii dla pan-STAT3 i GUSB.
      Współczynnik zmienności, CV, wzór; analiza statystyczna; równanie obrazujące rozproszenie danych.
      Gdzie N = liczba próbek, = obliczona liczba kopii w próbce oraz = średnia dla próbki. Należy sprawdzić, czy współczynnik zmienności (CV) dla każdej próbki (wielokrotne analizy) wynosi ≤10%.

5. Analiza danych ilościowego PCR (qPCR) dla próbek o nieznanym stężeniu

  1. Porównaj wartości Ct uzyskane w relatywnej qPCR (zgodnie z opisem w kroku 4.9) dla genu referencyjnego GUSB aby zapewnić, że stężenia cDNA w próbkach mieszczą się w zakresie jednego rzędu wielkości.
    1. Odpowiednio rozcieńczyć cDNA (np. jeśli próbka 1 wykazuje Ct wartość wynosząca ok. 17,5, a innych próbek Ct wartości wynoszą ~21, próbka 1 wynosi w przybliżeniu 2(21-17.5) = 1-krotnie bardziej skoncentrowany. Przeprowadzić rozcieńczenie 1:1 wodą ultrapurystyczną w tym samym zakresie, nie rozcieńczając bardziej niż jest to konieczne).
      UWAGA: Znaczące różnice w stężeniach początkowych będą obciążać analizę regresji liniowej (krok 4.12).
  2. Przygotowanie bezwzględnego testu qPCR dla próbek. Przygotowanie płytki matrycy 2a do testu dla Sα i Sβ zgodnie z Tabela 6; oraz przygotować test 2b dla ΔSα i ΔSβ zgodnie z Tabela 7Przeprowadzić analizy zgodnie z opisem w krokach 2.6–2.7.3 (oraz Tabela 2b). Powtórzyć analizy co najmniej raz.
  3. Sprawdzić jakość danych i wyeksportować je zgodnie z opisem w krokach 2.7.4-2.7.5.
  4. Przygotuj płytkę 96-dołkową do bezwzględnej reakcji qPCR z 25 µl reakcje z użyciem przeciwciał pan-STAT3 startery (startery w Tabela 1c, szablon w Tabela 8) w 400 µM oraz mieszanka wszystkich czterech plazmidów lub pojedynczy plazmid w wymienionych stężeniach całkowitych.
    UWAGA: Wydajność nie ma znaczenia w przypadku absolutnej qPCR, jednak optymalizacja wydajności tych starterów jest istotna dla względnej qPCR (Krok 4).
  5. Uszczelnij płytkę qPCR pokrywą adhezyjną i wiruj przez 5 min przy 1 20 x g przy 12 °C.
  6. Konfiguracja „nowego detektora” dla pan-STAT3 zgodnie z krokami 2.7.1–2.7.3.
  7. Skonfiguruj cykle dla pan-STAT3 zgodnie z Tabela 2c (te same warunki, co w przypadku względnego qPCR). Należy upewnić się, że odczyt fluorescencji (w celu wyznaczenia Ct) występuje podczas 72 °C etap każdego cyklu. Powtórzyć analizę co najmniej raz, aby zapewnić powtarzalność wyników.
  8. Sprawdź jakość danych i wyeksportuj je (patrz kroki 2.7.4-2.7.5).
    1. Jeśli wykresy amplifikacji nie mają charakteru wykładniczego (patrz Rycina 2), rozcieńczyć cDNA próbki (1:10) i powtórzyć analizę zgodnie z opisem (krok 5.7).
  9. Korzystając z równania krzywej wzorcowej (patrz pkt 3.2, Rycina 3) oraz Ct wartości próbek, obliczyć liczbę kopii każdego wariantu splicingowego oraz pan-STAT3 w każdej próbce.
    Równanie numeru krzywej odpływu, CN=10[(Ct-b)/m], schemat formuły, narzędzie analizy hydrologicznej.
  10. Wykreśl logarytm (bezwzględne wartości liczby kopii qPCR uzyskane dla pan-STAT3) vs log (skumulowane wartości bezwzględne liczby kopii w qPCR dla STAT3 warianty skielone).
    UWAGA: Idealne wartości regresji liniowej i nachylenia powinny wynosić odpowiednio około 1.
  11. Oblicz powtarzalność (Krok 3.1) oraz odtwarzalność (Krok 4.13).

6. Łączenie danych z bezwzględnej i względnej qPCR

  1. Pomnóż proporcję wariantu przez wartość całkowitą STAT3 krotność wzrostu w celu obliczenia krotności wzrostu dla każdego wariantu splicingowego.
  2. Oblicz odchylenia standardowe (patrz krok 3.1.1) wartości bezwzględnych i względnych, aby uwzględnić propagację błędu. Wyznacz standardowy błąd pomiaru (SEM) zgodnie z poniższym wzorem:
    Wzór na błąd standardowy średniej, obliczanie SEM, statystyczna analiza danych, równanie matematyczne.

Wyniki

Dane qPCR o dobrej jakości wygenerują krzywą wzrostu w kształcie litery S (Rycina 2a), co oznacza wykładniczy wzrost liczby transkryptów w trakcie cykli amplifikacji. Zbyt duża ilość matrycy może prowadzić do wysokiego tła fluorescencji, co oznacza nieprawidłowe ustalenie linii bazowej w pierwszych kilku cyklach. Jeśli dane nie tworzą krzywej wykładniczej (Rycina 2b), konieczna jest dalsza optymalizacja (opisana w krokach 3.1 i 3.4). Aby uzyskać więcej informacji na temat rozwiązywania problemów z wynikami qPCR, należy zapoznać się z odniesieniem32. Krzywe standardowe uzyskane dla plazmidów kalibratorowych matrycy wskazują wydajność amplifikacji (przykład krzywej dla STAT3 Sα pokazano na Rycina 3). W opisanych warunkach zaobserwowano wydajność w zakresie od 83 do 95%. Równanie określające specyficzność (krok 3.4) zakłada równą wydajność, co jest mało prawdopodobne25, zatem rzeczywista specyficzność jest prawdopodobnie wyższa niż sugeruje to współczynnik specyficzności.

W celu oceny zgodności poziomów STAT3, zmierzono wartości absolutne każdej z czterech wariantów łączenia alternatywnego oraz poziom całkowitego STAT3, przy czym ten ostatni wyznaczono za pomocą starterów amplifikujących region wspólny dla wszystkich czterech wariantów łączenia alternatywnego (Rycina 4). W idealnym przypadku zarówno regresja liniowa (wskazująca korelację), jak i nachylenie prostej (stosunek poziomu ogólnego STAT3 do sumy wariantów łączenia alternatywnego) powinny być zbliżone do 1.

Bezwzględne dane qPCR przedstawiono na wykresach kołowych, aby pokazać proporcje czterech wariantów skrótu w czasie po stymulacji cytokinami (Rycina 5a). Eozynofile w stanie spoczynku (0 godz.) wykazywały najmniejszy udział wariantu STAT3 Sα, choć ten wariant był zawsze najliczniejszy. Pomnożenie ułamka wariantów skrótu STAT3 β (Sβ+ΔSβ) przez ułamek wariantów STAT3 ΔS (ΔSα+ΔSβ) systematycznie dawało wartość niższą niż wartość eksperymentalnie zarejestrowana dla ΔSβ. Gdyby zdarzenia skrętu były niezależne, oczekiwalibyśmy, że pomnożenie ułamka wariantów ΔS przez ułamek wariantów β da wartość zgodną z eksperymentalnie ustaloną. Wyższe poziomy ΔSβ niż przewidywane przy niezależnych zdarzeniach skrętu sugerują istnienie obustronnego biasu skrętu.

Połączenie danych qPCR opartych na wartościach bezwzględnych i względnych wykazało wzrost poziomów wszystkich wariantów wycięcia genu STAT3 po stymulacji cytokinami IL3 i TNFα, przy czym poziomy osiągnęły maksimum 6 godzin po stymulacji (Ryc. 5b–e). W przypadku trzech spośród czterech wariantów wycięcia poziomy transkryptów były około trzykrotnie wyższe w eozynofilach leczonych IL3+TNFα (6 godz.) w porównaniu do eozynofili utrzymywanych w pożywce w tym samym punkcie czasowym. Poziom transkryptu STAT3 Sα był 3,5-krotnie wyższy w eozynofilach leczonych IL3+TNFα w porównaniu do komórek utrzymywanych w pożywce w tym czasie. Największą niepewność (największy błąd standardowy pomiaru) zaobserwowano dla ΔSβ (Ryc. 5e), który stanowi najmniejszą frakcję całkowitego STAT3 we wszystkich próbkach. Nie jest to zaskakujące, ponieważ niższe poziomy wiążą się z wyższymi wartościami Ct. Większa liczba cykli potrzebna do osiągnięcia progu wykrywalności nasila niepewność związaną z cyklem do cyklu występującą zmiennością wydajności amplifikacji.

Schematy splicingu genów; porównania struktury egzonów i intronów do analizy sekwencji kodujących białka.
Rycina 1: Schemat par starterów wykorzystanych do przeprowadzenia qPCR wariantów splicingu STAT3 oraz pan-STAT3. Pokazano startery używane do specyficznego namnażania poszczególnych wariantów splicingu STAT3 (odpowiednio Sα, Sβ, ΔSα i ΔSβ). Startery w kierunku sensu (STAT3 „S” i „ΔS”) obejmują połączenie między egzonami 21 i 22. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Krzywe amplifikacji PCR; wykres Delta Rn względem liczby cykli; analiza ilościowa; dane graficzne.
Rycina 2: Wykresy amplifikacji danych qPCR. (a) Sigmoidalne krzywe amplifikacji wskazują na wiarygodną amplifikację. Dane te uzyskano w wyniku qPCR dwóch szeregowych rozcieńczeń plazmidu zawierającego STAT3 Sα, przy czym każda para kolorowych linii przedstawia poziomy fluorescencji próbek rozcieńczonych w duplikatach w ciągu 40 cykli (oś x). Najbardziej stężona próbka (zielono-szara) została wystarczająco amplifikowana do cyklu 17 (z barwnikiem wiążącym dsDNA proporcjonalnym do fluorescencji, pokazanym na osi y), aby przekroczyć wartość progową fluorescencji (linia bazowa oznaczona zieloną strzałką). Jej wartość Ct wynosiłaby 17. (b) Wykresy niemiesistne sugerują, że próg fluorescencji tła nie został poprawnie ustalony w pierwszych kilku cyklach. Może to wynikać z obecności inhibitora lub bardzo stężonego matrycy lub starterów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Wykres krzywej standardowej Ct w funkcji log liczby kopii plazmidu; regresja liniowa pokazuje silną korelację (R²=0,994).
Rycina 3: Krzywa standardowa log (liczby kopii STAT3 Sα) w funkcji Ct. Istnieje zależność liniowa między logarytmem liczby kopii każdej wariantu splajsu genu STAT3 a cyklem progowym (Ct). Utworzenie krzywej standardowej na podstawie DNA plazmidowego naśladuje cDNA próbek i pozwala na dokładniejsze pomiary niż krzywa uzyskana z rozcieńczonych produktów PCR. Dane przedstawione na rycinie to wartości Ct uzyskane z qPCR dwóch serii rozcieńczeń plazmidu zawierającego STAT3 Sα. Na podstawie tej krzywej można oszacować liczbę kopii obecnych w każdej próbce oraz obliczyć sprawność amplifikacji (83,9%). Chociaż punkty przecięcia z osią y są mniej odtwarzalne niż nachylenie, to sugerują, że potrzeba 42,2 cykli, aby mieć pewność, że nie ma obecnego DNA docelowego. Słupki błędów oznaczają SEM, n = 3. Porównywalne krzywe skonstruowano dla STAT3 Sβ, ΔSα i ΔSβ (nie pokazano). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Korelacja logarytmiczna, warianty łączenia alternatywnego STAT3, wykres regresji liniowej, wynik analizy danych.
Rycina 4: Porównanie ilościowego całkowitego STAT3 z sumarycznymi wariantami łączenia alternatywnego STAT3. Regresja dodanych wariantów łączenia alternatywnego STAT3 w stosunku do całkowitego STAT3 powinna wykazywać nachylenie (stosunek całkowitego do sumarycznego) oraz wartość R2 (korelacja) bliską 1. Uwzględniono dane z 17 próbek (eozynofili i DLBCL). Słupki błędów wskazują błąd standardowy średniej (SEM) pomiarów x do y, n ≥ 2 dla każdej próbki. Rycina zmodyfikowana na podstawie źródła20. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Odpowiedź komórek w czasie; wykresy kołowe, wykresy liniowe; ekspresja białek, analiza stymulacji.
Rycina 5: STAT3 poziomy wariantów łączenia zmieniały się w trakcie leczenia cytokinami. (a) Wykresy kołowe wskazujące procentową zawartość każdego wariantu łączenia STAT3 w eozynofilach podczas leczenia IL3 i TNFα. (b–e) Zmiany wariantów łączenia STAT3 w eozynofilach leczonych różnymi kombinacjami cytokin, mierzone poprzez połączenie danych qPCR względnego i bezwzględnego. Poziomy STAT3 Sα (b), Sβ (c), ΔSα (d) oraz ΔSβ (e) zmieniały się w czasie po stymulacji. Poziomy początkowo wzrastały, osiągając szczyt 6 godzin po stymulacji. Kombinacja IL3+TNFα wywołała wyższą ekspresję wszystkich czterech wariantów łączenia STAT3 niż IL3 samodzielnie. Błąd SEM obliczono dla każdego punktu danych z uwzględnieniem propagacji błędu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Tabela starterów PCR dla transkryptów STAT3, pokazująca sekwencje w kierunku wstępnym/odwrotnym oraz rozmiary produktów amplifikacji w bp.
Tabela 1: Startery używane do amplifikacji (a), absolutnego (b) i względnego (c) ilościowego PCR. Startery do klonowania zawierają sekwencje restrykcyjne i rozszerzenia na końcu 5' umożliwiające skuteczne cięcie. Miejsca restrykcyjne KpnI i NheI zostały oznaczone pogrubieniem. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej tabeli.

Protokoły cyklingu termicznego PCR i przygotowanie odczynników; schemat zawiera temperatury, czasy i objętości dla amplifikacji DNA.
Tabela 2. Parametry cyklingu PCR (po lewej) i objętości odczynników (po prawej) dla amplifikacji (a), ilościowego PCR względnego (b) i absolutnego (c). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej tabeli.

Wyniki PCR w czasie rzeczywistym w formie mapy cieplnej; ilustracja danych wzmacniania i kontroli bez szablonu.
Tabela 3: Schemat kalibracji absolutnej qPCR z użyciem plazmidu. Ten test jest konieczny do oceny powtarzalności i sprawności oraz do tworzenia krzywych wzorcowych, na podstawie których interpolowane są dane. Mieszanki „nielowiące” pozwolą oszacować swoistość. Może być konieczna optymalizacja w celu osiągnięcia spójności. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej tabeli.

Układ płytki PCR z rozcieńczeniami kDNA, kontrolą bez szablonu, parami oligonukleotydów; analiza molekularna.
Tabela 4: Schemat kalibracji dla względnego qPCR (gen pan-STAT3 oraz gen referencyjny GUSB). W przeciwieństwie do qPCR absolutnego, celem tego testu jest określenie warunków, w których wydajność amplifikacji wynosi około 100%. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej tabeli.

Układ płytki mikrotiterowej do analizy qPCR, przedstawiający rozmieszczenie próbek i kontrole bez szablonu.
Tabela 5: Schemat próbek do względnego oznaczania qPCR dla pomiaru ogólnego STAT3 i genu utrzymującego gospodarstwo GUSB. Krzywe wzorcowe są powtarzane razem z próbkami, aby zapewnić porównywalną wydajność oznaczeń. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej tabeli.

Schemat układu płytki mikrotiterowej do kwantyfikacji DNA metodą rozcieńczeń szeregowych; zawiera dane krzywej standardowej.
Tabela 6: Szablon dla testu qPCR z użyciem standardu absolutnego służącego do pomiaru wariantów S. Krzywe standardowe są powtarzane razem z próbkami, aby zapewnić porównywalną skuteczność testów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej tabeli.

Szablon płytki do rozcieńczeń szeregowych dla testu PCR, pokazujący gradienty stężeń i układ próbek.
Tabela 7: Szablon testu absolutnego qPCR dla pomiaru wariantów ΔS. Krzywe standardowe są powtarzane razem z próbkami, aby zapewnić porównywalną skuteczność testów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej tabeli.

Układ płytki mikrotiterowej do analizy ilościowej PCR, w tym krzywej wzorcowej, próbek i kontroli.
Tabela 8: Szablon dla badania absolutnego qPCR z użyciem matrycy pan-STAT3. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej tabeli.

Dyskusja

Opracowaliśmy ten protokół, aby ocenić poziomy i proporcje transkryptów wariantu splicingu STAT3 w eozynofilach i komórkach chłoniaka oraz dowiedzieć się, czy stymulacja cytokin wpłynęła na poziomy i proporcje. STAT3 jest szczególnie interesujący ze względu na jego plejotropową i niepewną funkcjonalność, ze sprzecznymi doniesieniami na temat tego, czy działa jako onkoproteina czy supresor guza w raku (przegląd w odnośniku33). Różnice w funkcji wariantu splicingu STAT3 α i β zostały scharakteryzowane wcześniej34,35, a nasz protokół ułatwił analizę knock-down/re-expression, która sugeruje potrzebę optymalnego stosunku transkryptów S i ΔS19.

Dokładna kwantyfikacja różnych wariantów splicingu ułatwi dalsze badania nad powiązaniem heterogenicznej funkcji STAT3 ze składem wariantu splicingu. Protokół integruje bezwzględne i względne dane qPCR, łącząc zdolność bezwzględnego qPCR do obliczania proporcji wariantu splicingu oraz względnego qPCR do pomiaru zmian w ogólnej ekspresji STAT3. Takie podejście pozwala na rozróżnienie subtelnych różnic w sekwencji i jednoczesny pomiar współczynników splicingu w dwóch alternatywnych miejscach splicingu oddalonych od siebie o ponad 50 nukleotydów. Indywidualne określenie proporcji zdarzeń splicingu nie przyniosłoby niezwykłego odkrycia, że istnieje błąd systematyczny współsplicingu, tak że poziomy ΔSβ są wyższe niż przewidywano, jeśli zastosowania dwóch miejsc są losowo łączone25.

Co istotne, bezwzględny qPCR z wykorzystaniem krzywych kalibracyjnych plazmidu umożliwia kwantyfikację (z nieoptymalną wydajnością) zmian splicingu, które skutkują bardzo podobnymi sekwencjami. Przewidujemy, że nowatorski test qPCR z subtelnym splicingiem powinien zająć około dwóch miesięcy, aby go zoptymalizować. Kluczowymi etapami w rozwoju testu są stworzenie plazmidów STAT3 wykorzystywanych do generowania krzywych wzorcowych dla bezwzględnego qPCR; eksperymentalne określanie optymalnych sekwencji starterów i parametrów cyklicznych w celu zapewnienia swoistości i odtwarzalności; oraz całkowanie względnych danych qPCR pochodzących z ilościowego określania ekspresji pan-STAT3 w stosunku do ekspresji GAPDH. Korelacja liczby kopii określonej ilościowo za pomocą pan-STAT3 w porównaniu z kwantyfikacją skumulowaną (Sα+ΔSα+Sβ+ΔSβ) pokazuje, że protokół daje wiarygodne wyniki.

Zastrzeżeniem tej techniki jest obszerny proces walidacji. Konieczna jest ocena zmienności wewnątrz testu (powtarzalność), zmienności między testami (odtwarzalności) i swoistości. Protokół określa sposoby uzyskiwania liczbowych danych wyjściowych dla tych parametrów. Za odpowiednie progi uznaliśmy wydajność ≥75%, współczynnik swoistości ≥4, współczynnik zmienności (odtwarzalność) ≤10% i odchylenie standardowe Ct (powtarzalność) ≤0,2 za odpowiednie progi30. Mutacje lub delecje w aminokwasach sekwencji STAT3 1-690 nie zostaną wykryte przez ten protokół, chociaż mogą wpływać na proporcje splicingu. Proporcje transkryptu mogą nie być proporcjonalne do proporcji proteoformu36.

Ponieważ próbki mają różne początkowe ilości całkowitego cDNA, bezwzględny qPCR jest odpowiedni do porównywania liczby kopii wariantów splicingu w próbce, ale nie do porównania między próbkami, chyba że jest sprzężony z względnym qPCR przy użyciu ustalonego genu porządkowego. Opisana metoda jest zgodna z wytycznymi MIQE qPCR dotyczącymi odtwarzalności30. Parametry cykliczne PCR i stężenia starterów mogą wymagać modyfikacji w celu uzyskania powtarzalnych danych, jeśli używany jest inny sprzęt. Idealna specyficzność nie jest możliwa bez drastycznego pogorszenia wydajności, ale cel został wzmocniony bardziej efektywnie o ponad cztery rzędy wielkości.

Liniowe DNA jest łatwiejsze do amplifikacji niż kołowe. Jeśli alternatywny plazmid nie zapewnia zadowalających krzywych standardowych (R2 < 0,95), rozważ linearyzację plazmidu przez ograniczenie pojedynczego miejsca przed kwantyfikacją. Optymalizacja qPCR ma kluczowe znaczenie dla uzyskania dobrej jakości danych (ryc. 1). Większość protokołów qPCR opiera się na dwuetapowym cyklu cyklowym, a maszyny są odpowiednio optymalizowane. Nierównomierne nagrzewanie bloku grzewczego może się nasilić w trzystopniowym cyklu, przyczyniając się do słabej powtarzalności. Testy muszą być wykonywane w sterylnych warunkach z końcówkami pipet filtrujących i ultraczystą wodą, najlepiej w dedykowanym okapie z przepływem laminarnym. Ponieważ zanieczyszczenia mogą prowadzić do niespójnych wyników, testy powinny być wykonywane w sterylnych warunkach z końcówkami pipet filtrujących i ultraczystą wodą, najlepiej w specjalnym okapie z przepływem laminarnym. Aby uzyskać więcej informacji na temat optymalizacji qPCR, zapoznaj się z Bustin i wsp.Rozdział 32

Kwantyfikacja STAT3 może prowadzić do lepszego wglądu w wiele kontekstów. STAT3 automatycznie reguluje swoją własną ekspresję37, a opisany powyżej protokół może pomóc w wyjaśnieniu, czy proporcje wariantów splicingu STAT3 przyczyniają się do regulacji tej pętli dodatniego sprzężenia zwrotnego. Protokół może być wykorzystany do badania zmian w proporcjach wariantów splicingu, obserwowanych w komórkach o różnej gęstości38 lub w trakcie rozwoju: wiadomo, że stosunek STAT3 α/β zmienia się na poziomie białka podczas hematopoezy16. Sundin i wsp. stwierdzono, że polimorfizm mononowego nukleotydu obciążył splicing eksonu 12 w STAT3 pacjenta z zespołem Joba39. Można sobie wyobrazić, że jeden z wielu SNP obecnych w intronach między eksonem 21 i 22 lub eksonem 22 i 23 może przyczyniać się do współczynników splicingu odpowiednio ΔS/S i α/β. Test można wykorzystać do ilościowego określenia transkryptów STAT3 w komórkach nowotworowych, w których mutacje lub zmiany w regulacji splicingu mogą wprowadzać stronniczość do procesu splicingu40. Mutacje w czynnikach splicingowych (takich jak SF3B1), obserwowane w zespołach mielodysplastycznych41 , mogą również prowadzić do zmian, które można zmierzyć za pomocą tego protokołu.

W szerszym ujęciu, podejście to wykrywa w szczególności koasocjację w splicingu, co nie jest wykonalne w przypadku konwencjonalnego sekwencjonowania RNA ani standardowego qPCR. Podczas gdy zjawisko wzajemnie wykluczającego się splicingu eksonów świadczy o koordynacji decyzji dotyczących splicingu, współpowiązanie innych zdarzeń splicingu nie zostało dobrze zbadane. Niedawno opisana alternatywna metoda, w której sekwencja RNA została zmodyfikowana tak, aby badać cDNA o pełnej długości, sugeruje, że odległe zdarzenia splicingu są bardziej współzależne niżwcześniej sądzono.

STAT3 zawiera miejsce łączenia tandemowego dawcy. Akceptorowe miejsca splicingu tandemowego są częstsze43 , a zasady przedstawionego protokołu mogą służyć jako punkt wyjścia do opracowania testów do wykrywania koincydencji splicingu NAGNAG i innych zdarzeń splicingu w obrębie 200 nukleotydów. Inne potencjalne zastosowania obejmują kwantyfikację koincydencji innych subtelnych różnic w sekwencji, takich jak indele lub polimorfizmy podwójnych/potrójnych nukleotydów44.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować National Institutes of Health-NHLBI za grant na projekt programu Rola eozynofili w zapaleniu i przebudowie dróg oddechowych: P01HL088584 (PI: N. Jarjour), oraz University of Wisconsin Carbone Cancer Center and Department of Medicine za finansowanie studiów stacjonarnych. Dziękujemy Douglasowi Annisowi za sklonowanie czterech wariantów STAT3.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
MJ Research PTC-200 Thermal CyclerGMIN/AUżywany do standardowego
systemu PCR 7500 Real-Time PCRApplied BiosystemsN/AqPCR Maszyna
GS-6RBeckman CoulterN/Ado płytek 96-dołkowych
Spretrofotometr Nanodrop 2000ThermoFisher ScientificN/A
RPMI-1640 mediumSigma AldrichR8758Pożywka do hodowli komórkowych
PfuTurbo DNA PolimerazaAgilent Technologies600410Polimeraza DNA do standardowego PCR
KpnINew England BiosciencesR0142S
NheINew England BiosciencesR0131S
SYBR Green PCR Master MixQiagen330523qPCR, mieszanka barwników wiążących DNA / dsDNA
Rneasy Mini KitQiagen74204Zestaw do ekstrakcji RNA
SuperScript III System syntezy pierwszej niciInvitrogen (ThermoFisher Scientific)18080-044Zestaw do syntezy cDNA
StarteryZintegrowana technologia DNAN/A
NEBuffer 1.1New England BiosciencesB7201S
GenePure LE AgarozaISC BioExpressE-3120-500składnik żelu TAE
PipetyGłówni dostawcy laboratoryjni (MLS)Nie dotyczy
Końcówki do pipet z filtremNeptune ScientificBT10XL, BT20, BT200
EU Jednoczęściowa cienkościenna płytaMidSciABI7501
Folia uszczelniająca ThermalSeal AMidSciTSA-10096-dołkowa uszczelka
pET-Elmer (wariant pET-28a)Novagen; zmodyfikowana w laboratorium MosherN/ASzczegóły w PMID: System
oczyszczania DNA 20947497 Wizard Plus SV MiniprepsOczyszczanie plazmiduPromegaA1460
Zestaw do sekwencjonowania cykli BigDye Terminator v3.1 Zestaw do sekwencjonowaniaThermoFisher Scientific4337455Zestaw do sekwencjonowania
QIAEX II Zestaw do ekstrakcji żeluQiagen20021Oczyszczanie amplikonu Kompetentne
komórki DH5&alphaThermoFisher Scientific18265-017dostępny u kilku dostawców, patrz PMID: 2162051
kanamycinResearch Products International Corp.K22000-5.0
Tris baseThermoFisher ScientificBP152-5składnik buforu TAE
Kwas octowy, lodowatyThermoFisherScientific A38C-212składnik buforu TAE
EDTA (kwas etylenodiaminotetraoctowy)Sigma Chemical Company (Sigma Aldrich)E-5134składnik buforu TAE
Bacto TryptoneBD Biosciences211705składnik Luria Bulion
Bacto Ekstrakt drożdżowy, technicznyBD Biosciences288620składnik Luria
Bulion Chlorek soduThermoFisher ScientificS271-10składnik Luria Broth
Wodorotlenek soduThermoFisher ScientificSS255-1składnik Luria Bulion
Bacto AgarBD Biosciences214010składnik Luria Płytka bulionowa
Lasergene SeqBuilderDNASTARRysunek 1 wygenerowana przy użyciu oprogramowania Lasergene SeqBuilder w wersji 12.2.0 (DNASTAR)

Bibliografia

  1. Hiller, M., et al. Phylogenetically widespread alternative splicing at unusual GYNGYN donors. Genome Biol. 7 (7), R65(2006).
  2. Treacy, M. N., et al. Twin of I-POU: a two amino acid difference in the I-POU homeodomain distinguishes an activator from an inhibitor of transcription. Cell. 68 (3), 491-505 (1992).
  3. Schindler, S., et al. Alternative splicing at NAGNAG acceptors in Arabidopsis thaliana SR and SR-related protein-coding genes. BMC Genomics. 9, 159(2008).
  4. Szafranski, K., Kramer, M. It's a bit over, is that ok? The subtle surplus from tandem alternative splicing. RNA Biol. 12 (2), 115-122 (2015).
  5. Wang, M., et al. Alternative splicing at GYNNGY 5' splice sites: more noise, less regulation. Nucleic Acids Res. 42 (22), 13969-13980 (2014).
  6. Hiller, M., Platzer, M. Widespread and subtle: alternative splicing at short-distance tandem sites. Trends Genet. 24 (5), 246-255 (2008).
  7. Tsai, K. W., Lin, W. C. Quantitative analysis of wobble splicing indicates that it is not tissue specific. Genomics. 88 (6), 855-864 (2006).
  8. Tadokoro, K., et al. Frequent occurrence of protein isoforms with or without a single amino acid residue by subtle alternative splicing: the case of Gln in DRPLA affects subcellular localization of the products. J Hum Genet. 50 (8), 382-394 (2005).
  9. Bradley, R. K., Merkin, J., Lambert, N. J., Burge, C. B. Alternative splicing of RNA triplets is often regulated and accelerates proteome evolution. PLoS Biol. 10 (1), e1001229(2012).
  10. Zheng, C. L., Fu, X. D., Gribskov, M. Characteristics and regulatory elements defining constitutive splicing and different modes of alternative splicing in human and mouse. RNA. 11 (12), 1777-1787 (2005).
  11. Schaefer, T. S., Sanders, L. K., Nathans, D. Cooperative transcriptional activity of Jun and Stat3 beta, a short form of Stat3. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (20), 9097-9101 (1995).
  12. Waitkus, M. S., et al. Signal integration and gene induction by a functionally distinct STAT3 phosphoform. Mol Cell Biol. 34 (10), 1800-1811 (2014).
  13. Srivastava, J., DiGiovanni, J. Non-canonical Stat3 signaling in cancer. Mol Carcinog. , (2015).
  14. Holland, S. M., et al. STAT3 mutations in the hyper-IgE syndrome. N Engl J Med. 357 (16), 1608-1619 (2007).
  15. Maritano, D., et al. The STAT3 isoforms alpha and beta have unique and specific functions. Nat Immunol. 5 (4), 401-409 (2004).
  16. Hevehan, D. L., Miller, W. M., Papoutsakis, E. T. Differential expression and phosphorylation of distinct STAT3 proteins during granulocytic differentiation. Blood. 99 (5), 1627-1637 (2002).
  17. Yoo, J. Y., Huso, D. L., Nathans, D., Desiderio, S. Specific ablation of Stat3beta distorts the pattern of Stat3-responsive gene expression and impairs recovery from endotoxic shock. Cell. 108 (3), 331-344 (2002).
  18. Stahl, N., et al. Choice of STATs and other substrates specified by modular tyrosine-based motifs in cytokine receptors. Science. 267 (5202), 1349-1353 (1995).
  19. Zheng, M., et al. A mix of S and DeltaS variants of STAT3 enable survival of activated B-cell-like diffuse large B-cell lymphoma cells in culture. Oncogenesis. 4, 184(2016).
  20. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  21. Zipper, H., Brunner, H., Bernhagen, J., Vitzthum, F. Investigations on DNA intercalation and surface binding by SYBR Green I, its structure determination and methodological implications. Nucleic Acids Res. 32 (12), e103(2004).
  22. Kelly, E. A., Liu, L. Y., Esnault, S., Quinchia Johnson, B. H., Jarjour, N. N. Potent synergistic effect of IL-3 and TNF on matrix metalloproteinase 9 generation by human eosinophils. Cytokine. 58 (2), 199-206 (2012).
  23. Whelan, J. A., Russell, N. B., Whelan, M. A. A method for the absolute quantification of cDNA using real-time PCR. J Immunol Methods. 278 (1-2), 261-269 (2003).
  24. Too, H. P. Real time PCR quantification of GFRalpha-2 alternatively spliced isoforms in murine brain and peripheral tissues. Brain Res Mol Brain Res. 114 (2), 146-153 (2003).
  25. Turton, K. B., Annis, D. S., Rui, L., Esnault, S., Mosher, D. F. Ratios of Four STAT3 Splice Variants in Human Eosinophils and Diffuse Large B Cell Lymphoma Cells. PloS One. 10 (5), e0127243(2015).
  26. Maurer, L. M., et al. Extended binding site on fibronectin for the functional upstream domain of protein F1 of Streptococcus pyogenes. J Biol Chem. 285 (52), 41087-41099 (2010).
  27. Current protocols in molecular biology. Ausubel, F. M., et al. , Greene Pub. Associates; J. Wiley. (1987).
  28. Grant, S. G., Jessee, J., Bloom, F. R., Hanahan, D. Differential plasmid rescue from transgenic mouse DNAs into Escherichia coli methylation-restriction mutants. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (12), 4645-4649 (1990).
  29. Kocsis, L., Herman, P., Eke, A. The modified Beer-Lambert law revisited. Phys Med Biol. 51 (5), N91-N98 (2006).
  30. Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 55 (4), 611-622 (2009).
  31. Pfaffl, M. W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res. 29 (9), e45(2001).
  32. A-Z of quantitative PCR. Bustin, S. A. , International University Line. (2004).
  33. Zhang, H. F., Lai, R. STAT3 in cancer-friend or foe. Cancers (Basel). 6 (3), 1408-1440 (2014).
  34. Caldenhoven, E., et al. STAT3beta, a splice variant of transcription factor STAT3, is a dominant negative regulator of transcription. J Biol Chem. 271 (22), 13221-13227 (1996).
  35. Zammarchi, F., et al. Antitumorigenic potential of STAT3 alternative splicing modulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (43), 17779-17784 (2011).
  36. Liu, Y., Beyer, A., Aebersold, R. On the Dependency of Cellular Protein Levels on mRNA Abundance. Cell. 165 (3), 535-550 (2016).
  37. Narimatsu, M., et al. Tissue-specific autoregulation of the stat3 gene and its role in interleukin-6-induced survival signals in T cells. Mol Cell Biol. 21 (19), 6615-6625 (2001).
  38. Szafranski, K., et al. Physiological state co-regulates thousands of mammalian mRNA splicing events at tandem splice sites and alternative exons. Nucleic Acids Res. 42 (14), 8895-8904 (2014).
  39. Sundin, M., et al. Novel STAT3 mutation causing hyper-IgE syndrome: studies of the clinical course and immunopathology. J Clin Immunol. 34 (4), 469-477 (2014).
  40. Oltean, S., Bates, D. O. Hallmarks of alternative splicing in cancer. Oncogene. 33 (46), 5311-5318 (2014).
  41. Boultwood, J., Dolatshad, H., Varanasi, S. S., Yip, B. H., Pellagatti, A. The role of splicing factor mutations in the pathogenesis of the myelodysplastic syndromes. Adv Biol Regul. 54, 153-161 (2014).
  42. Tilgner, H., et al. Comprehensive transcriptome analysis using synthetic long-read sequencing reveals molecular co-association of distant splicing events. Nat Biotechnol. 33 (7), 736-742 (2015).
  43. Hiller, M., et al. Widespread occurrence of alternative splicing at NAGNAG acceptors contributes to proteome plasticity. Nat Genet. 36 (12), 1255-1257 (2004).
  44. Rosenfeld, J. A., Malhotra, A. K., Lencz, T. Novel multi-nucleotide polymorphisms in the human genome characterized by whole genome and exome sequencing. Nucleic Acids Res. 38 (18), 6102-6111 (2010).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Warianty splicingu STAT3bezwzgl dna qPCRwzgl dna qPCRilo ciowe oznaczanie wariant w splicingustandardy plazmidowewalidacja starter wparametry cyklicznetraktowanie cytokinamiSTAT3 w eozynofilachanaliza wsp splicingu

Powiązane artykuły