Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Szybka jednoetapowa synteza enzymatyczna i całkowicie wodne oczyszczanie analogów trehalozy

9.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54485

⸱

17 lutego 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, Central Michigan University, 2Department of Chemistry, University of Southern Maine

W tym artykule

Podsumowanie

Analogi trehalozy stają się ważnymi cząsteczkami do zastosowań bio(technicznych)logicznych i biomedycznych. Opisujemy zoptymalizowany protokół enzymatycznej syntezy i oczyszczania analogów trehalozy, który jest prosty, wydajny, szybki i przyjazny dla środowiska. Wykazano jego zastosowanie do szybkiej produkcji i podawania sondy do wykrywania prątków.

Streszczenie

Chemicznie modyfikowane wersje trehalozy, lub analogi trehalozy, mają zastosowanie między innymi w biologii, biotechnologii i naukach farmaceutycznych. Na przykład analogi trehalozy z wykrywalnymi znacznikami były używane do wykrywania Mycobacterium tuberculosis i mogą mieć zastosowanie jako środki do diagnostyki obrazowej gruźlicy. Poszukiwane są również hydrolitycznie stabilne wersje trehalozy ze względu na ich potencjał do stosowania jako bezkaloryczne substancje słodzące i środki bioprotekcyjne. Pomimo atrakcyjności tej klasy związków do różnych zastosowań, ich potencjał pozostaje niewykorzystany ze względu na brak solidnej drogi ich produkcji. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół szybkiej i wydajnej jednoetapowej syntezy biokatalitycznej analogów trehalozy, który omija problemy związane z syntezą chemiczną. Dzięki wykorzystaniu termostabilnego enzymu syntazy trehalozy (TreT) firmy Thermoproteus tenax, analogi trehalozy mogą być generowane w jednym kroku z analogów glukozy i glukozy difosforanu urydyny z wysoką wydajnością (do konwersji ilościowej) w ciągu 15-60 minut. Prosty i szybki protokół oczyszczania niechromatograficznego, który składa się z dializy spinowej i wymiany jonowej, może dostarczyć wiele analogów trehalozy o znanym stężeniu w roztworze wodnym w ciągu zaledwie 45 minut. W przypadkach, gdy nadal pozostaje nieprzereagowany analog glukozy, można przeprowadzić chromatograficzne oczyszczanie produktu analogu trehalozy. Ogólnie rzecz biorąc, metoda ta zapewnia "zieloną" platformę biokatalityczną do przyspieszonej syntezy i oczyszczania analogów trehalozy, która jest wydajna i dostępna dla osób niebędących chemikami. Aby zilustrować możliwość zastosowania tej metody, opisujemy protokół syntezy, całkowicie wodnego oczyszczania i podawania prątkom sondy chemicznej na bazie trehalozy, z których wszystkie zajęły mniej niż 1 godzinę i umożliwiły wykrywanie fluorescencji prątków. Przewidujemy, że w przyszłości protokół ten będzie mógł, między innymi, znaleźć zastosowanie do szybkiej syntezy sond na bazie trehalozy do diagnostyki gruźlicy. Na przykład krótkożyciowe analogi trehalozy modyfikowane radionuklidami (np. 18trehaloza modyfikowana F) mogą być wykorzystywane do zaawansowanych metod obrazowania klinicznego, takich jak pozytonowa tomografia emisyjna i tomografia komputerowa (PET-CT).

Wprowadzenie

Trehaloza jest symetrycznym, nieredukującym disacharydem składającym się z dwóch reszt glukozy połączonych wiązaniem 1,1-α,α-glikozydowym (Rysunek 1A). Chociaż trehaloza nie występuje u ludzi i innych ssaków, jest powszechnie spotykana u bakterii, grzybów, roślin i bezkręgowców 1. Główną rolą trehalozy w większości organizmów jest ochrona przed stresami środowiskowymi, takimi jak odwodnienie 1. Ponadto niektóre ludzkie patogeny wymagają trehalozy do przejawiania wirulencji, w tym wywołująca gruźlicę Mycobacterium tuberculosis, która wykorzystuje trehalozę jako mediator biosyntezy otoczki komórkowej oraz jako blok budulcowy do konstrukcji immunomodulujących glikolipidów 2.

Schemat strukturalny trehalozy i jej analogów; modyfikacje chemiczne w celu zwiększenia stabilności lub poprawy detekcji.
Rysunek 1: Trehaloza i analogi trehalozy. (A) Struktury naturalnej trehalozy oraz nienaturalnego analogu trehalozy, gdzie X oznacza modyfikację strukturalną. (B) Przykłady analogów trehalozy opisanych w literaturze, które mają potencjalne zastosowania w biokonserwacji i obrazowaniu biologicznym.

Ze względu na swoją unikalną strukturę i funkcje fizjologiczne, trehaloza przyciągnęła znaczną uwagę w kontekście zastosowań bio(techno)logicznych i biomedycznych 3. Właściwości ochronne trehalozy obserwowane w naturze — np. jej niezwykła zdolność do pomagania w utrzymaniu życia w roślinach „zmartwychwstających”, które przeszły ekstremalne odwodnienie 4 — skłoniły do jej szerokiego zastosowania w biokonserwacji. Trehaloza była wykorzystywana do konserwacji szerokiej gamy próbek biologicznych, takich jak kwasy nukleinowe, białka, komórki i tkanki 3. Na przykład trehaloza jest stosowana jako dodatek stabilizujący w wielu dostępnych na rynku produktach farmaceutycznych, w tym w kilku przeciwnowotworowych przeciwciałach monoklonalnych 3. Ponadto trehaloza jest używana jako słodzik w przemyśle spożywczym i jest szeroko stosowana do konserwacji produktów zarówno w przemyśle spożywczym, jak i kosmetycznym. Wprowadzenie trehalozy do tego typu zastosowań komercyjnych było początkowo ograniczone przez brak możliwości pozyskania dużych ilości czystej trehalozy ze źródeł naturalnych lub poprzez syntezę. Ostatnio jednak opracowano wydajny proces enzymatyczny do ekonomicznej produkcji trehalozy ze skrobi, co przyczyniło się do jej powszechnego zastosowania komercyjnego 5.

Chemicznie zmodyfikowane pochodne trehalozy, nazywane w niniejszym opracowaniu analogami trehalozy, zyskują coraz większą uwagę w kontekście różnorodnych zastosowań (ogólna struktura przedstawiona na Rysunku 1A; konkretne przykłady analogów trehalozy przedstawione na Rysunku 1B) 6. Na przykład lakto-trehaloza jest analogiem trehalozy, w którym jedna z jednostek glukozy została zastąpiona galaktozą, w związku z czym grupa hydroksylowa w pozycji 4 posiada odwróconą konfigurację stereochemiczną. Lakto-trehaloza wykazuje takie same właściwości stabilizujące jak trehaloza, lecz jest odporna na degradację przez enzymy jelitowe, co czyni ją atrakcyjną jako bezkaloryczna dodatka do żywności 6, 7.

Zainteresowanie naszej grupy analogami trehalozy wiąże się przede wszystkim z ich wartością jako sond i inhibitorów specyficznych dla prątków. Grupy Barry'ego i Davisa opracowały koniugowany z fluoresceiną analog keto-trehalozy, nazwany FITC-keto-trehalose, który wykazał zdolność do metabolicznego znakowania ściany komórkowej żywych M. tuberculosis, umożliwiając jego wykrycie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej 8. Laboratorium Bertozzi opracowało mniejsze analogi azydotrehalozy (TreAz), które mogły metabolicznie znakować ścianę komórkową, a następnie zostać wykryte przy użyciu chemii klik i analizy fluorescencyjnej 9. Postępy te wskazują na możliwość wykorzystania sond opartych na trehalozie jako środków diagnostyki obrazowej gruźlicy. Analogi trehalozy były również badane jako inhibitory M. tuberculosis ze względu na ich potencjał do zaburzania szlaków w bakterii, które są niezbędne dla jej żywotności i wirulencji 10,11,12.

Do tej pory główną przeszkodą w opracowywaniu analogów trehalozy do zastosowań bio(techno)logicznych i biomedycznych był brak wydajnych metod syntetycznych. Dwie tradycyjne drogi otrzymywania analogów trehalozy opierają się na syntezie chemicznej (Rycina 2). Jedna z dróg polega na desymetryzacji/modyfikacji naturalnej trehalozy, natomiast druga polega na rozpoczęciu procesu od odpowiednio funkcjonalizowanych monosacharydowych bloków budulcowych i przeprowadzeniu glikozylowania chemicznego w celu utworzenia wiązania 1,1-α,α-glikozydowego. Podejścia te, omówione niedawno w artykułach przeglądowych 13, 14, okazały się przydatne w wieloetapowej syntezie niewielkich ilości złożonych naturalnych produktów zawierających trehalozę, takich jak sulfolipid-1 z M. tuberculosis 15. Jednak oba podejścia są zazwyczaj niewydajne, czasochłonne, niedostępne dla osób niebędących chemikami, a dodatkowo nie są uważane za przyjazne dla środowiska. Zatem w przypadku syntezy niektórych typów analogów trehalozy strategie te nie są idealne.

Synteza chemiczna i enzymatyczna analogów trehalozy; schemat ze ścieżkami reakcji i modyfikacjami.
Rysunek 2: Metody syntezy analogów trehalozy. Metody chemiczne syntezy analogów trehalozy, przedstawione po lewej stronie, wykorzystują wieloetapowe procedury obejmujące trudne kroki ochrony/deprotekcji, desymetryzacji i/lub glikozylacji. Synteza enzymatyczna, przedstawiona po prawej stronie, wykorzystuje enzymy do stereoselektywnej konwersji prostych, niechronionych substratów w analogi trehalozy w roztworze wodnym. Opisany tutaj protokół enzymatyczny wykorzystuje enzym syntazę trehalozy (TreT) do konwersji analogów glukozy i UDP-glukozy w analogi trehalozy w jednym kroku. Kieruj się tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Wydajna droga biokatalityczna do analogów trehalozy ułatwiłaby produkcję, ocenę i zastosowanie tej obiecującej klasy cząsteczek. Choć komercyjny proces enzymatyczny produkcji trehalozy5 nie nadaje się do syntezy analogów, ponieważ wykorzystuje skrobię jako substrat, w naturze istnieją inne szlaki biosyntezy, które można wykorzystać do syntezy analogów trehalozy. Jednak badania w tym obszarze, które zostały niedawno omówione w przeglądzie 6, były ograniczone. W jednym raporcie wykorzystano metodę inspirowaną szlakiem biosyntezy trehalozy u Escherichia coli w celu otrzymania pojedynczego analogu fluoro-trehalozy z odpowiadającej mu fluoro-glukozy. Podejście to wymaga jednak trójenzymowego układu o ograniczonej wydajności i uniwersalności 8. Innym badanym podejściem jest wykorzystanie trehalozofosforylazy (TreP) w kierunku odwrotnym, co w zasadzie pozwala na jednokrokową syntezę analogów trehalozy z analogów glukozy i glukozo-1-fosforanu 6, 16, 17. Chociaż podejście to może być obiecujące w przyszłości, zarówno inwertujące, jak i retencyjne TreP wykazują obecnie wady w syntezie analogów. Na przykład inwertujące TreP wymagają niezwykle kosztownej cząsteczki donora (β-D-glukozo-1-fosforanu), a retencyjne TreP charakteryzują się niską wydajnością ekspresji enzymu/stabilnością oraz ograniczoną promiskuitetnością substratową. Zanim synteza analogów wspomagana przez TreP stanie się praktyczna, konieczne będą znaczące ulepszenia (np. poprzez inżynierię enzymatyczną).

Obecnie najbardziej praktycznym podejściem do enzymatycznej syntezy analogów trehalozy jest zastosowanie enzymu syntazy trehalozy (TreT), który przekształca glukozę i glukozę z urydynodifosforanem (UDP-glukozę) w trehalozę w jednym etapie 6. Niedawno zgłosiliśmy zastosowanie TreT z Thermoproteus tenax — enzymu termostabilnego i jednokierunkowego 18 — do syntezy analogów trehalozy z analogów glukozy i UDP-glukozy (Rysunek 3) 19. Enzym ten działa wyłącznie w kierunku syntetycznym, co pozwala uniknąć problemu degradacji trehalozy występującego w systemie TreP. Ta jednowzorowa reakcja może zostać ukończona w ciągu 1 godziny, a szeroka gama analogów trehalozy została uzyskana z wysoką wydajnością (do >99% w analizie za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC)) z łatwo dostępnych substratów będących analogami glukozy (patrz Tabela 1 w sekcji Wyniki Reprezentatywne).

Schemat konwersji UDP-glukozy do analogów trehalozy przy użyciu enzymu TreT w 70°C w celu glikozylacji.
Rycina 3: Jednostopniowa synteza analogów trehalozy katalizowana przez TreT. Enzym TreT z T. tenax może stereoselektywnie łączyć łatwo dostępne analogi glukozy i UDP-glukozę, tworząc analogi trehalozy w jednym etapie. R1-R4 = zmienna modyfikacja strukturalna, np. modyfikacje azydowe, fluorowe, deoksy-, tio-, stereochemiczne lub znakowanie izotopowe; Y = zmienny heteroatom, np. tlen lub siarka, bądź heteroatom znakowany izotopowo.

W niniejszym materiale przedstawiamy szczegółowy protokół procesu syntezy TreT, obejmujący ekspresję i oczyszczanie TreT z E. coli, zoptymalizowane warunki reakcji TreT oraz ulepszoną metodę oczyszczania prowadzoną w całości w fazie wodnej. Ten zmodyfikowany protokół umożliwia szybką i wydajną syntezę oraz oczyszczanie różnorodnych analogów trehalozy w skali półpreparatywnej (10-100 mg). Demonstrujemy również zastosowanie tego protokołu do przygotowania i podania sondy na bazie trehalozy prątkom w czasie krótszym niż 1 godzina, co umożliwiło szybką detekcję fluorescencyjną komórek prątków.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Ekspresja i oczyszczanie TreT z Top10 E. coli

UWAGA: Prosimy o kontakt z autorami w celu uzyskania szczepu E. coli z ekspresją TreT (plazmid pBAD TreT, zawierający gen T. tenax tret pod kontrolą białka AraC, przekształconego w Top10 E. coli 19) oraz towarzyszącej mu umowy o transferze materiału. Poniższy protokół zazwyczaj podaje wydajność białka na poziomie około 4 mg/l.

  1. Przygotuj 3 ml nocnej hodowli E. coli z ekspresją TreT.
    1. Streak Top10 E. coli transformowane wektorem ekspresyjnym pBAD-TreT na płytce agarowej z bulionu lizogennego (LB) zawierającej 100 μg / ml ampicyliny.
    2. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez około 48 godzin.
    3. Wybrać pojedynczą kolonię z płytki i zaszczepić 3 ml płynnej pożywki LB zawierającej 100 μg/ml ampicyliny w probówce hodowlanej.
    4. Umieścić probówkę w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C x 175 obr./min na noc.
  2. Indukuj ekspresję białka w E. coli wykazującej ekspresję TreT.
    1. Dodaj 750 ml Terrific Bulth uzupełnionego 100 μg/ml ampicyliny do kolby hodowlanej Fernbacha o pojemności 2,800 ml. Przenieść 1 ml bulionu z kolby do kuwety w celu późniejszego wykorzystania jako ślepa próba.
    2. Dodać 3 ml kultury wyhodowanej przez noc w kroku 1.1.4 do kolby hodowlanej, a następnie umieścić kolbę w inkubatorze i wstrząsnąć w temperaturze 37 °C x 200 obr./min. Okresowo sprawdzać absorbancję kultury przy długości fali 600 nm w porównaniu z ślepą próbą zebraną w kroku 1.2.1.
    3. Gdy absorbancja przy 600 nm osiągnie zakres 0,5-1,0, indukować ekspresję TreT poprzez dodanie 750 μl 1 M roztworu arabinozy (1 mM stężenie końcowe) do hodowli. Umieścić kolbę z powrotem w inkubatorze i wytrząsać przez noc w temperaturze 37 °C x 200 obr./min.
  3. Osadzać i lizować komórki E. coli wykazujące ekspresję TreT. coli.
    1. Przenieść kulturę do butelki polipropylenowej i wirować przez 15 minut w temperaturze 4000 x g w temperaturze 4 °C.
    2. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 15 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
    3. Przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i odwirowywać przez 15 minut w temperaturze 4 000 x g w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i albo przystąpić do lizy komórek (etap 1.3.4), albo przechowywać osad przez czas nieokreślony w temperaturze -80 °C.
    4. Rozpuścić 1 mini tabletkę inhibitora proteazy w 20 ml buforu do przemywania (50 mM NaH2PO4, 500 mM NaCl, 20 mM imidazolu, pH 8,0) w stożkowej probówce o pojemności 50 ml.
    5. Przenieść bufor płuczący zawierający inhibitor proteazy do stożkowej probówki zawierającej osad. Wirować, aż granulka zostanie ponownie zawieszona.
    6. Przenieś ponownie zawieszone komórki do zlewki o pojemności 100 ml i poddaj je lizie za pomocą sonikacji (sekwencja impulsów 45 sekund włączenia, 45 sekund przerwy z czasem pracy 2 minuty i 15 sekund przy amplitudzie 75 procent).
    7. Przenieść lizat do metalowej probówki stożkowej o pojemności 50 ml i wirować przez 60 minut przy 15 000 x g w temperaturze 4 °C.
    8. Klarować lizat, przechodząc przez filtr strzykawkowy 0,2-0,45 μm do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
      UWAGA: Typowe stężenie otrzymanego lizatu wynosi 100 mg/ml.
  4. Oczyść TreT z lizatu komórek E. coli za pomocą szybkiej chromatografii cieczowej białek (FPLC).
    1. Ustaw FPLC z kolumną powinowactwa do niklu (objętość złoża 5 ml). Umyj kolumnę 10 ml wody dejonizowanej lub do momentu, gdy kolumna będzie czysta z wszelkich zanieczyszczeń. Zrównoważyć kolumnę przy użyciu 20 ml buforu do przemywania (50 mM NaH2PO4, 500 mM NaCl, 20 mM imidazolu, pH 8,0) przy natężeniu przepływu 1 ml/min.
    2. Załadować lizat (20 ml) otrzymany z kroku 1.3.8 do kolumny i wymyć nieoznakowane białka buforem do przemywania z szybkością przepływu 1 ml/min, aż absorbancja osiągnie poziom tła (zwykle wymagane jest 80-100 ml buforu do płukania).
    3. Eluować znakowany przez Hisa TreT za pomocą liniowego gradientu buforu elucyjnego (50 mM NaH2PO4, 500 mM NaCl, 250 mM imidazolu, pH 8,0) od 1-100% przez 60 minut przy natężeniu przepływu 1 ml / min. Zebrać 4 ml frakcji, aż TreT zostanie eluowany, a absorbancja osiągnie poziom wyjściowy.
      UWAGA: Zazwyczaj do wymycia białka potrzeba 60 ml buforu elucyjnego, a białko eluuje w zakresie 60-100% buforu elucyjnego. Otrzymuje się około 10-15 ml czystego TreT w buforze elucyjnym.
    4. Oznaczyć stężenie TreT, mierząc absorbancję przy 280 nm w stosunku do ślepej próby buforu elucyjnego.
  5. Wymiana TreT na bufor tris(hydroksymetylo)aminometanowy (Tris) przez dializę.
    1. Po przygotowaniu rurki do dializy zgodnie z instrukcją producenta należy ją zagruntować poprzez przepłukanie wodą dejonizowaną, a następnie buforem Tris (50 mM Tris, 300 mM NaCl, pH 8,0).
    2. Załaduj próbkę TreT do rurki dializacyjnej za pomocą strzykawki i igły. Dializować przez noc w oparciu o 2 litry buforu Tris.
    3. Oznaczyć stężenie TreT, mierząc absorbancję przy 280 nm w stosunku do ślepej próby pobranej z przemywania dializami
      4. .
    4. Przenieść roztwór TreT do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i przystąpić do syntezy analogu trehalozy (etap 2) lub przechowywać enzym w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: TreT jest białkiem termostabilnym. TreT był przechowywany w buforze Tris w temperaturze 4 °C przez kilka miesięcy, nie obserwując znaczącej utraty aktywności.

2. Jednoetapowa synteza analogów trehalozy przy użyciu enzymu TreT

UWAGA: Poniższy protokół opisuje skalę reakcji opartą na objętości 4 ml, która może dostarczyć około 15-30 mg analogu trehalozy w zależności od wydajności reakcji i masy cząsteczkowej produktu. Składniki reakcji można skalować, aby w razie potrzeby uzyskać mniej lub więcej analogu trehalozy.

  1. Dodaj analog glukozy (0,080 mmol, masa zależy od masy cząsteczkowej), UDP-glukoza (0,160 mmol, 97,6 mg) i MgCl2 (0,080 mmol, 16,3 mg) do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Końcowe stężenia tych składników wynoszą odpowiednio 20 mM, 40 mM i 20 mM.
  2. Dodać TreT do buforu Tris (otrzymanego z kroku 1.5.4) i, jeśli to konieczne, odpowiednią objętość buforu Tris (50 mM Tris, 300 mM NaCl, pH 8,0), aby uzyskać końcowe stężenie enzymu 300 μg/ml i końcową objętość 4 ml. Delikatnie pipetować mieszaninę w górę i w dół lub odwrócić probówkę, aby rozpuścić ciała stałe.
  3. Inkubować reakcję w temperaturze 70 °C z wytrząsaniem przy 300 obr./min przez 1 godzinę, następnie umieścić probówkę na lodzie do ostygnięcia.

3. Oczyszczanie analogów trehalozy z surowej mieszaniny reakcji enzymatycznych

  1. Wstępnie przepłukać odśrodkową jednostkę filtrującą (nominalna masa cząsteczkowa graniczna (NWML) 10 kDa) w celu usunięcia śladowych ilości glicerolu z membrany, dodając 3 ml dejonizowanej wody do odśrodkowego zespołu filtrującego i odwirowując przy 3 000 x g, aż cała ciecz przejdzie przez filtr do rurki (około 20 min). Powtórz jeszcze dwa razy. Wykonaj ten krok bezpośrednio przed lub w trakcie reakcji (krok 2.3).
  2. Po schłodzeniu mieszaniny reakcji enzymatycznej (otrzymanej z kroku 2.3) przenieść ją do wstępnie przepłukanego filtra odśrodkowego. Przepłukać probówkę reakcyjną 1 ml wody dejonizowanej i przenieść do filtra odśrodkowego. Powtórzyć płukanie probówki reakcyjnej w celu maksymalnego odzysku produktu.
  3. Odwirować filtr odśrodkowy przy 3 000 x g, aż cała ciecz przejdzie przez filtr do rurki (około 20 minut). Przepłukać górną komorę filtra odśrodkowego 3 ml wody dejonizowanej i odwirować przy 3 000 x g, aż cała ciecz przejdzie przez filtr do rurki (około 20 minut). Powtórz płukanie, aby uzyskać maksymalny odzysk produktu.
  4. Wyrzuć górną komorę filtra odśrodkowego. Dodać żywicę jonowymienną ze złożem mieszanym (3 g) do filtratu na dnie probówki (typowa objętość filtratu wynosi 8-15 ml w zależności od liczby płukań). Mieszać w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę za pomocą mieszadła magnetycznego z prędkością wystarczającą do utrzymania kulek żywicy zawieszonych w roztworze.
  5. Zdekantować supernatant i przefiltrować go w celu usunięcia żywicy. Dodaj 5 ml wody dejonizowanej, aby spłukać pozostałą żywicę. Zdekantować supernatant i przefiltrować go, łącząc go z roztworem produktu z pierwszej dekantacji. Powtórz płukanie żywicy, aby uzyskać maksymalny odzysk produktu.
  6. Przeanalizować reakcję za pomocą chromatografii cienkowarstwowej (TLC) lub HPLC w celu określenia, czy osiągnięto pełną konwersję materiału wyjściowego analogu glukozy do produktu analogu trehalozy. Patrz krok 4.1 dla analizy TLC i krok 4.2 dla analizy HPLC.
  7. Usuń wodę przez liofilizację lub odparowanie obrotowe, aby uzyskać wysuszony produkt. Jeżeli podczas analizy TLC lub HPLC nie zaobserwowano nieprzereagowanego analogu glukozy, oczyszczanie chromatograficzne nie jest konieczne. Zważyć produkt w celu uzyskania wydajności reakcji i przeprowadzić analizę spektroskopową magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) (krok 4.3) w celu potwierdzenia struktury i czystości produktu.
  8. Jeśli podczas analizy TLC zaobserwowano nieprzereagowany analog glukozy, należy go oddzielić od analogu trehalozy za pomocą kolumny wykluczającej rozmiar.
    1. Przygotuj kolumnę o wymiarach 1 x 100 cm zawierającą dejonizowane, nasycone wodą, bardzo drobne media wykluczające wielkość kulki poliakryloamidu P2 zgodnie z instrukcjami producenta.
      UWAGA: Kolumna wykluczająca rozmiar może być ponownie użyta po umyciu wodą dejonizowaną.
    2. Ponownie rozpuścić wysuszony produkt reakcji enzymatycznej (otrzymany z kroku 3.7) w 0,5 ml wody dejonizowanej. Zastosuj roztwór produktu do kolumny wykluczającej rozmiar ręcznie lub za pomocą adaptera przepływu kolumny. Przepłucz fiolkę, w której znajdował się surowy produkt, innym 0,5 ml wody dejonizowanej i załaduj ją do kolumny wykluczającej rozmiar.
    3. Eluować produkt wodą dejonizowaną za pomocą przepływu grawitacyjnego i zebrać frakcje o objętości około 2 ml.
    4. Przeanalizuj ułamki za pomocą TLC (krok 4.1). Zebrać frakcje zawierające czysty analog trehalozy.
    5. Usuń wodę przez liofilizację lub odparowanie obrotowe, aby uzyskać wysuszony produkt. Zważyć produkt w celu uzyskania wydajności reakcji i przejść do analizy NMR (patrz krok 4.3).

4. Analiza produktów analogowych trehalozy

  1. Przeprowadzić analizę chromatografii cienkowarstwowej (TLC) reakcji TreT.
    UWAGA: Ta procedura może być również używana do analizowania ułamków kolumny wykluczającej rozmiar. Może być konieczne zagęszczenie mieszaniny reakcyjnej lub frakcji kolumnowych przed analizą TLC w celu zaobserwowania barwienia związków na płytce TLC.
    1. Zaznaczyć ołówkiem pasy na powierzchni płytki TLC i nanieść analit(-y) oraz odpowiedni wzorzec (wzorce) na odpowiednie paski, w tym wzorzec analogu glukozy, wzorzec analogu trehalozy (jeśli jest dostępny), mieszaninę reakcyjną (lub frakcje zebrane z oczyszczania kolumny wykluczającej rozmiar) i plamkę dodatkową. Po nałożeniu każdej próbki na płytkę TLC, pozostaw płytkę do wyschnięcia.
      UWAGA: Do analizy reakcji zwykle na płytkę TLC nakłada się 2 μl próbki.
    2. Wywołaj płytkę TLC przy użyciu n-butanolu/etanolu/wody dejonizowanej (5:3:2).
    3. Wysuszyć rozwiniętą płytkę TLC, a następnie zanurzyć ją w 5% H2SO4 w etanolu (plama cukrowa) i podgrzać na gorącej płycie na wysokim ustawieniu, aż będzie można zobaczyć plamy zawierające cukier (zwykle 5 min).
  2. Przeprowadzić analizę HPLC mieszanin reakcyjnych TreT przy użyciu dowolnego systemu HPLC zdolnego do oddzielania i wykrywania węglowodanów. Protokół ten obejmuje separację węglowodanów za pomocą kolumny aminopropylowej HPLC i detekcję za pomocą indeksu refrakcji.
    1. Przymocować do HPLC kolumnę aminopropylową (4,6 x 250 mm) zawierającą osłonę kolumny wstępnej.
    2. Zrównoważyć kolumnę aminopropylową z 80% acetonitrylem w wodzie dejonizowanej przy natężeniu przepływu 0,4 ml/min.
    3. Załadować roztwór produktu reakcji (lub wzorca) na kolumnę aminopropylową.
    4. Eluować produkt (lub wzorzec) 80% acetonitrylem w wodzie dejonizowanej przy natężeniu przepływu 0,4 ml/min i temperaturze kolumny 50 °C. Zazwyczaj stosuje się czas pracy 40 min.
      UWAGA: Zarówno materiał wyjściowy analogu glukozy, jak i produkt analogowy trehalozy można wykryć za pomocą współczynnika załamania światła, chociaż można zastosować inne metody, takie jak wykrywanie rozpraszania światła przez parowanie (ELSD). W opisanych warunkach analogi glukozy zazwyczaj eluują się w ciągu 10-15 minut, a analogi trehalozy w ciągu 15-25 minut.
  3. Analiza NMR oczyszczonych analogów trehalozy.
    1. Rozpuścić oczyszczony analog trehalozy w D2O (700 μl) i przenieść roztwór do probówki NMR.
    2. Uzyskaj widma 1 H i 13C NMR zgodnie z odpowiednimi protokołami obiektu NMR.

5. Zastosowanie analogów trehalozy syntetyzowanych przez TreT do wykrywania prątków

  1. Syntetyzować, oczyszczać i podawać 6-TreAz do M. smegmatis (Msmeg).
    1. Dodaj 6-azydo-6-deoksyglukopiranozę (6-GlcAz, 0,020 mmol, 4,1 mg), UDP-glukozę (0,040 mmol, 24,4 mg) i MgCl2 (0,020 mmol, 4,1 mg) do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
    2. Dodać TreT do buforu Tris (otrzymanego z kroku 1.5.4), aby uzyskać końcowe stężenie enzymu 300 μg/ml i końcową objętość 1 ml. Delikatnie pipetować mieszaninę w górę i w dół lub odwrócić probówkę, aby rozpuścić ciała stałe.
    3. Inkubować reakcję w temperaturze 70 °C, wytrząsając przez 15 minut.
    4. Rozcieńczyć enzymatyczną mieszaninę reakcyjną 3 ml wody dejonizowanej i przenieść ją do wstępnie umytego filtra odśrodkowego (NMWL 10 kDa). Odwirować jednostkę filtrującą przy 3 000 x g, aż większość cieczy przejdzie przez filtr do probówki, około 10 minut.
    5. Wyrzuć górną komorę filtra odśrodkowego. Dodaj żywicę jonowymienną ze złożem mieszanym (0,75 g) do probówki i mieszaj/wstrząsaj w temperaturze pokojowej przez 25 minut. Zdekantować supernatant i przefiltrować go w celu usunięcia żywicy.
      UWAGA: Kroki 5.1.1-5.1.5 zapewniają wodny roztwór 6-azydo-trehalozy (6-TreAz) o stężeniu około 5 mM w czasie krótszym niż 1 godzina. Stężenie 5 mM szacuje się na podstawie ilościowej konwersji substratu na produkt i rozcieńczenia, które ma miejsce podczas etapów oczyszczania, przy założeniu minimalnych strat produktu na tych etapach. W razie potrzeby roztwór można sterylnie przefiltrować przed dodaniem do próbki biologicznej.
    6. Dodać odpowiednią objętość roztworu produktu 6-TreAz do logarytmicznej hodowli M. smegmatis (Msmeg), zazwyczaj w celu uzyskania końcowej objętości kultury 100-1000 μL i końcowego stężenia 6-TreAz ~25 μM. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez żądany czas, zwykle 60 min.
  2. Wykonaj chemię kliknięcia, aby skoniugować fluorofor z komórkami znakowanymi azydkiem. W tym protokole należy użyć cykloaddycji azydkowo-alkinowej katalizowanej Cu (CuAAC), aby dostarczyć fluorofor do azydków na powierzchni komórki w Msmeg.
    1. Odwirować komórki przy stężeniu 3 900 x g przez 5 minut, a następnie przepłukać komórki PBS zawierającym 0,5% albuminy surowicy bydlęcej. Powtórz dwa razy.
    2. Ponownie zawiesić granulowane komórki w 4% paraformaldehydzie w PBS, aby je utrwalić. Po 10 minutach inkubacji powtórzyć krok 5.2.1 w celu umycia komórek.
    3. Ponownie zawiesić granulowane komórki w 138 μl PBS.
    4. Dodać 3 μl 1 mM roztworu podstawowego alkino-karboksyrodaminy 110 (alkino-488) w DMSO.
    5. Dodać 3 μl świeżo przygotowanego 60 mM roztworu podstawowego askorbinianu sodu do wody dejonizowanej.
    6. Dodać 3 μl 6,4 mM roztworu podstawowego tris[(1-benzylo-1H-1,2,3-triazol-4-ylo)metylo]aminy (TBTA) w tert-butanolu/dimetylosulfotlenku (DMSO) 4:1.
    7. Dodać 3 μl 50 mM roztworu podstawowego CuSO4 do wody dejonizowanej.
    8. Pipetować zawiesinę komórkową w górę i w dół, a następnie inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
    9. Powtórz krok 5.2.1, aby umyć komórki. Ponownie zawiesić komórki w 150 μl PBS.
  3. Wykonaj analizę fluorescencji komórkowej. W tym protokole użyj mikroskopii fluorescencyjnej do wizualizacji fluorescencji komórkowej znakowanego Msmeg.
    1. Dodać 10 μl komórek bakteryjnych zawieszonych w PBS do szkiełka mikroskopowego i delikatnie rozprowadzić płyn cienką warstwą za pomocą krawędzi szkiełka nakrywkowego. Pozostaw do wyschnięcia na powietrzu w ciemności.
    2. Na wysuszoną próbkę dodać 10 μl podłoża montażowego, następnie nałożyć na próbkę szkiełka nakrywkowe i nałożyć klej (np. lakier do paznokci) w celu unieruchomienia.
    3. Zobrazuj szkiełka za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego przy 100-krotnym powiększeniu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

T. tenax TreT otrzymano z *E. coli* z wydajnością około 4 mg/L, stosując standardowe techniki ekspresji i oczyszczania białek. Pojedynczy etap chromatografii powinowactwa do niklu był wystarczający do oczyszczenia TreT z *E. coli* lizat (reprezentatywny zapis z FPLC przedstawiono w Rycina 4). Jak ustalono w naszej pierwszej publikacji na temat procesu syntezy TreT, rekombinowany T. tenax TreT jest w stanie z wysoką wydajnością przekszta...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Analogi trehalozy mogą mieć wpływ na różne dziedziny, od konserwowania żywności i farmaceutyków po diagnostykę i leczenie zakażeń mikrobiologicznych 6. Istniejące wieloetapowe metody syntezy chemicznej są przydatne do wytwarzania złożonych analogów trehalozy z wieloma miejscami modyfikacji (np. naturalnie występującymi złożonymi glikolipidami prątków). Jednak metody te są niezmiennie długotrwałe i nieefektywne, nawet gdy są stosowane do syntezy stosunkowo prostych monopodstawionych analog...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca została sfinansowana z grantu z National Institutes of Health (R15 AI117670) dla B.M.S i P.J.W., a także z Cottrell College Scholar Award od Research Corporation (20185) dla P.J.W. L.M.M. była wspierana przez Provost's Fellowship z CMU.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Agar LBResearch Products InternationalL24021
Sól sodowa ampicylinySigma AldrichA9518
Bulion LuriaResearch Products InternationalL24045
TerrificBulion Research Products InternationalT15050
L-(+)-ArabinozaSigma AldrichA3256
Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiGE HealthcareSH30256
ImidazolSigma AldrichI5513
Chlorek soduBDHBDH9286
Fosforan sodu, jednozasadowyFisher ScientificS374
Filtr strzykawkowy, 0,45 i mikro; mFisher Scientific09719D
Inhibitor proteazy minitabletki, wolne od EDTAThermo Scientific88666
Kolumna powinowactwa do niklu HisTrap HP, 5 mlGE Healthcare17-5248-02
TRIS base ultrapureResearch Products InternationalT60040
Rurki do dializy, MWCO 12– 14 000Fisher Scientific21-152-16
Analogi glukozyCarboSynth, Sigma Aldrich, Santa Cruz Biotechnology, American Radiolabeled ChemicalsPrzykłady dostawców, którzy oferują wiele analogów glukozy
6-Azido-6-deoksyglukopiranoza (6-GlcAz)CarboSynthMA02620
UDP-Glukozaabcam Biochemicalsab120384
Chlorek magnezu sześciowodny Fisher ScientificM33
Amicon Ultra-15 filtr odśrodkowyEMD MilliporeUFC901008
Bio-Rex RG 501-X8 żywica jonowymienna ze złożem mieszanymBio-Rad444-9999
Extra-Fine Bio-Gel P2 mediaBio-Rad150-4118
Płytki do chromatografii cienkowarstwowej z żelem krzemionkowym na bazie szkłaEMD Millipore1056280001
n-ButanolFisher ScientificA399
EtanolFisher ScientificS25310A
Kwas siarkowyFisher ScientificA300
AcetonitrylEMD MiliporeAX0145
Tlenek deuteru, 99,8%Acros Organics351430075
Kolumna aminopropylowa HPLCSigma Aldrich58338
Albumina surowicy bydlęcejSigma Aldrich5470
Para-formaldehydTed Pella18505
Alkine-488Sigma Aldrich761621
Askorbinian soduSigma AldrichA7631
Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)metylo]amina (TBTA)Kliknij Narzędzia chemiczne1061
tert-ButanolSigma Aldrich360538
dimetylosulfotlenekSigma AldrichW387520
Siarczan miedzi(II)Sigma AldrichC1297
Fluoromount-G Podłoże montażoweSouthern Biotechnology10001

Bibliografia

  1. Elbein, A. D., Pan, Y. T., Pastuszak, I., Carroll, D. New insights on trehalose: a multifunctional molecule. Glycobiology. 13, 17-27 (2003).
  2. Tournu, H., Fiori, A., Van Dijck, P. Relevance of trehalose in pathogenicity: some general rules, yet many exceptions. PLoS Pathog. 9, 1003447(2013).
  3. Ohtake, S., Wang, Y. J. Trehalose: Current use and future applications. J. Pharm. Sci. 100, 2020-2053 (2011).
  4. Adams, R. P., Kendall, E., Kartha, K. K. Comparison of free sugars in growing and desiccated plants of Selaginella lepidophylla. Biochem. Syst. Ecol. 18, 107-110 (1990).
  5. Kubota, M. Glycoenzymes. Ohnishi, M. , Japan Scientific Societies Press. (2000).
  6. Walmagh, M., Zhao, R., Desmet, T. Trehalose analogues: latest insights in properties and biocatalytic production. Int. J. Mol. Sci. 16, 13729-13745 (2015).
  7. Kim, H. -M., Chang, Y. -K., Ryu, S. -I., Moon, S. -G., Lee, S. -B. Enzymatic synthesis of a galactose-containing trehalose analogue disaccharide by Pyrococcus horikoshii trehalose-synthesizing glycosyltransferase: Inhibitory effects on several disaccharidase activities. J. Mol. Catal. B: Enzym. 49, 98-103 (2007).
  8. Backus, K. M., et al. Uptake of unnatural trehalose analogs as a reporter for Mycobacterium tuberculosis. Nat. Chem. Biol. 7, 228-235 (2011).
  9. Swarts, B. M., et al. Probing the mycobacterial trehalome with bioorthogonal chemistry. J. Am. Chem. Soc. 134, 16123-16126 (2012).
  10. Rose, J. D., et al. Synthesis and biological evaluation of trehalose analogs as potential inhibitors of mycobacterial cell wall biosynthesis. Carbohydr. Res. 337, 105-120 (2002).
  11. Wang, J., et al. Synthesis of trehalose-based compounds and their inhibitory activities against Mycobacterium smegmatis. Bioorg. Med. Chem. 12, 6397-6413 (2004).
  12. Gobec, S., et al. Design, synthesis, biochemical evaluation and antimycobacterial action of phosphonate inhibitors of antigen 85C, a crucial enzyme involved in biosynthesis of the mycobacterial cell wall. Eur. J. Med. Chem. 42, 54-63 (2007).
  13. Sarpe, V. A., Kulkarni, S. S. Regioselective protection and functionalization of trehalose. Trends in Carbohydr. Res. 5, 8-33 (2013).
  14. Chaube, M. A., Kulkarni, S. S. Stereoselective construction of 1,1-alpha,alpha-glycosidic bonds. Trends in Carbohydr. Res. 4, 1-19 (2013).
  15. Leigh, C. D., Bertozzi, C. R. Synthetic studies toward Mycobacterium tuberculosis sulfolipid-I. J. Org. Chem. 73, 1008-1017 (2008).
  16. Chaen, H., et al. Efficient enzymatic synthesis of disaccharide, alpha-D-galactosyl-alpha-D-glucoside, by trehalose phosphorylase from Thermoanaerobacter brockii. J. Appl. Glycosci. 48, 135-137 (2001).
  17. Vander Borght, J., Soetaert, W., Desmet, T. Engineering the acceptor specificity of trehalose phosphorylase for the production of trehalose analogs. Biotechnol. Progr. 28, 1257-1262 (2012).
  18. Kouril, T., Zaparty, M., Marrero, J., Brinkmann, H., Siebers, B. A novel trehalose synthesizing pathway in the hyperthermophilic Crenarchaeon Thermoproteus tenax: the unidirectional TreT pathway. Arch. Microbiol. 190, 355-369 (2008).
  19. Urbanek, B. L., et al. Chemoenzymatic synthesis of trehalose analogues: rapid access to chemical probes for investigating mycobacteria. ChemBioChem. 15, 2066-2070 (2014).
  20. Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A stepwise Huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes. Angew. Chem. Int. Ed. 41, 2596-2599 (2002).
  21. Tornøe, C. W., Christensen, C., Meldal, M. Peptidotriazoles on solid phase: [1,2,3]-triazoles by regiospecific copper(I)-catalyzed 1,3-dipolar cycloadditions of terminal alkynes to azides. J. Org. Chem. 67, 3057-3064 (2002).
  22. Kalscheuer, R., Weinrick, B., Veeraraghavan, U., Besra, G. S., Jacobs, W. R. Trehalose-recycling ABC transporter LpqY-SugA-SugB-SugC is essential for virulence of Mycobacterium tuberculosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 21761-21766 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Enzym TreTdializa wirowawymiana jonowaanalog glukozyUDP glukozasonda do chemii klikalnejMycobacterium tuberculosisoczyszczanie niechromatograficzne
Szybka jednoetapowa synteza enzymatyczna i całkowicie wodne oczyszczanie analogów trehalozy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.