Nieinwazyjna i technicznie nieintensywna metoda indukcji i fenotypowania eksperymentalnego bakteryjnego zapalenia płuc u myszy

Summary

W literaturze opisano kilka metod modelowania bakteryjnego zapalenia płuc u myszy. W niniejszym artykule opisano nieinwazyjną, niedrogą i szybką metodę wywoływania zapalenia płuc poprzez aspirację (tj. wdychanie) inokulum bakteryjnego pipetowanego do jamy ustnej i gardła. Szczegółowo opisano również dalsze metody oceny wrodzonej odpowiedzi immunologicznej płuc.

Abstract

Chociaż pozaszpitalne zapalenie płuc pozostaje poważnym problemem zdrowia publicznego, mysie modele bakteryjnego zapalenia płuc ostatnio ułatwiły znaczący postęp przedkliniczny w naszym zrozumieniu leżącej u podstaw patogenezy komórkowej i molekularnej. Mysie modele in vivo ujmują zintegrowaną fizjologię i odporność odpowiedzi obronnej gospodarza w sposób, który nie został ujawniony przez alternatywne, uproszczone podejścia ex vivo. W literaturze opisano kilka metod dopłucnej inokulacji bakterii u myszy, w tym aerozolizację, podawanie donosowe, przezustną kaniulację dotchawiczą w warunkach "ślepych" i wizualnych oraz przezskórną kaniulację dotchawiczą. Wszystkie metody mają względne zalety i ograniczenia. W niniejszym artykule szczegółowo opisujemy nieinwazyjną, technicznie nieintensywną, niedrogą i szybką metodę dotchawniczego dostarczania bakterii, która polega na aspiracji (tj. Wdychaniu) przez mysz zakaźnego inokulum pipetowanego do jamy ustnej gardła w znieczuleniu ogólnym. Metoda ta może być stosowana do dostarczania płucnego szerokiej gamy nieżrących środków biologicznych i chemicznych i jest stosunkowo łatwa do nauczenia, nawet dla laboratoriów z minimalnym wcześniejszym doświadczeniem w zabiegach płucnych. Oprócz opisania metody zachłystowego zapalenia płuc, przedstawiamy również procedury krok po kroku do oznaczania późniejszej wrodzonej odpowiedzi immunologicznej płuc in vivo myszy, w szczególności metody ilościowego określania klirensu bakteryjnego i komórkowej odpowiedzi immunologicznej zakażonych dróg oddechowych. To zintegrowane i proste podejście do oceny zapalenia płuc pozwala na szybką i solidną ocenę wpływu manipulacji genetycznych i środowiskowych na wrodzoną odporność płuc.

Introduction

Pozaszpitalne zapalenie płuc pozostaje główną przyczyną zgonów z powodu infekcji w USA, z niewielką ogólną zmianą wskaźników śmiertelności w ciągu ostatnich 40 lat, pomimo poprawy w strategiach szczepień i antybiotyków^1,2. Pomimo braku zauważalnego postępu na poziomie zdrowia publicznego, w ostatnich latach poczyniono ogromne postępy w naszym zrozumieniu molekularnej i komórkowej patogenezy zapalenia płuc, a wiele z tych kroków naprzód stało się możliwe dzięki zastosowaniu mysich modeli infekcji płuc. Genetyczna podatność myszy, podobieństwo mysiego i ludzkiego układu odpornościowego oraz szeroki wachlarz mysich odczynników immunologicznych, które stały się dostępne na rynku, ułatwiły szybki postęp w tej dziedzinie.

Mysie modele bakteryjnego zapalenia płuc opisane w literaturze zazwyczaj polegały na jednej z czterech technicznych dróg inokulacji patogenów: i) aerozolizacji; ii) podawanie donosowe; iii) przekaz ustny; oraz iv) chirurgiczne wstrzyknięcie dotchawicze (tj. tracheotomia)³. Wszystkie drogi infekcji mają zalety i wady³. W szczególności względne narażenie górnych dróg oddechowych, możliwość domieszki flory ustnej nosa, wymagania dotyczące znieczulenia ogólnego, zmienność inokulum podawanego do dystalnego płuca, rozmieszczenie płatowe dostarczonych patogenów, wymagania dotyczące wiedzy technicznej i chorobowość zabiegowa różnią się znacznie w przypadku tych podejść.

Powszechnie stosowane techniki infekcji ustnej obejmują kaniulację dotchawiczą (przezkrtaniową) za pomocą "ślepego" (niewizualnego) podejścia lub pod bezpośrednią wizualizacją krtani^3-5. Obie metody, choć solidne, wymagają znacznego szkolenia, a także niosą ze sobą ryzyko urazu górnych dróg oddechowych. W niniejszym raporcie opisujemy technicznie nieintensywną, nieinwazyjną, niedrogą i szybką metodę infekcji przezustnej, za pomocą której bakterie (Klebsiella pneumoniae w podanym przykładzie) pipetowane do jamy ustnej i gardła znieczulonej myszy są dostarczane do płuc poprzez aspirację (tj. wdychanie). My i inni z powodzeniem zastosowaliśmy technikę zachłystowego zapalenia płuc^6-9. Ta wszechstronna i łatwa do opanowania metoda dostarczania do płuc może być rozszerzona o dostarczanie do płuc wielu dodatkowych czynników nieżrących, w tym cytokin i innych białek, cząsteczek związanych z patogenami (np. lipopolisacharydu), komórek (tj. transfer adoptywny) i toksyn (np. bleomycyna). Oprócz omówienia ważnych kwestii technicznych, opisujemy również zintegrowane, ilościowe podejście do oceny późniejszej odpowiedzi gospodarza na zapalenie płuc, w tym dalszy pomiar klirensu bakteryjnego (tj. ilościowego oznaczania jednostki tworzącej kolonie [CFU] w płucach i narządach obwodowych) oraz akumulacji leukocytów w przestrzeni powietrznej.

Protocol

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z Ustawą o Dobrostanie Zwierząt oraz Polityką Publicznej Służby Zdrowia Stanów Zjednoczonych dotyczącą humanitarnej opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych po przeglądzie przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt NIEHS.

1. Przygotowanie kultury K. pneumoniae

Uwaga: Wykonaj wszystkie kroki w kapturze poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL2) lub innym wyznaczonym obszarze BSL2 i wyrzuć odpady zgodnie z wytycznymi instytutu BSL2.

1. W przypadku wzrostu zawiesiny K. pneumoniae należy rozmrozić glicerolowy zapas bakterii i zaszczepić roboczą kulturę, przenosząc 1 ml bulionu K. pneumoniae do 50 ml tryptycznego bulionu sojowego (TSB) w kolbie o pojemności 500 ml lub większej.
2. Przygotować zapasy glicerolu, dodając 900 μl hodowanego K. pneumoniae w fazie logarytmicznej do 100 μl sterylnego glicerolu i zamrażając w temperaturze -20 °C lub -80 °C. Do długotrwałego przechowywania zalecana jest temperatura -80 °C.
3. Hodowlę bakterii z etapu 1.1 należy przeprowadzić przez wytrząsanie kolby przez noc (14-18 godzin) w temperaturze 37 °C przy 200-225 obr./min. W celu pobudzenia wzrostu w fazie logarytmicznej, rano rozcieńczyć 1-5 ml tej nocnej kultury do kolby zawierającej 50 ml TSB i umieścić z powrotem w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przez ~2,5 godziny.
4. Przenieść 1 ml kultury K. pneumoniae z ostatniego etapu do probówki o pojemności 1,5 ml i wirować w temperaturze 7 500 x g przez 2 minuty. Powinna być widoczna biała granulka. Usunąć supernatant bez naruszania osadu, delikatnie zawiesić bakterie pipetą w 1 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej i ponownie wirować z prędkością 7 500 x g przez 2 minuty.
   1. Wykonaj ten etap prania 2x, podnosząc ostatni, umyty granul w 1 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej.
5. Wykonać logarytmiczne seryjne rozcieńczenia tego zgrabnego inokulum. Na przykład, dodać 400 μl inokulum do 3,6 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej szeregowo, aby uzyskać serię rozcieńczeń 10-1-10-9.
6. Oznaczyć OD₆₀₀ umytych K. pneumoniae, umieszczając 1 ml rozcieńczeń 1:10 i 1:100 w jednorazowych kuwetach i odmierzając OD₆₀₀, najpierw zaślepiając sterylnym roztworem soli fizjologicznej. Mierz duplikaty, aby zapewnić dokładność. OD₆₀₀ 1,0 jest w przybliżeniu równoważne 4-7 x 10⁸ CFU/ml. Należy pamiętać, że zależność między OD a CFU/ml może nie być liniowa.
   1. Użyj OD₆₀₀ z rozcieńczeń, aby obliczyć stężenie K. pneumoniae, stosując powyższą konwersję OD:CFU/ml i uwzględniając rozcieńczenie.
7. Użyj stężenia K. pneumoniae, aby przygotować pożądaną dawkę inokulum CFU w objętości <100 μl do podania myszom (patrz poniżej).
8. Również 100 μl rozcieńczeń 10-6-10-9 i 100 μl sterylnego soli fizjologicznej na indywidualnych płytkach z tryptycznym agarem sojowym (TSA) w temperaturze pokojowej. Inkubować w temperaturze 37 °C przez noc i policzyć kolonie bakterii w celu obliczenia dokładnego stężenia, które zostało użyte w doświadczeniu i kontroli zanieczyszczenia.
   UWAGA: Rzeczywiste stężenie bakterii w końcowym inokulum może wynosić ± 500 jtk/ml niż przewiduje się na podstawie absorbancji. Eksperymentatorzy powinni w idealnym przypadku potwierdzić zależność OD₆₀₀:CFU/ml w badaniach pilotażowych przed użyciem in vivo u myszy, empirycznie dostosowując konwersję OD₆₀₀:CFU/ml w oparciu o swoje osobiste doświadczenia.

2. Mysia dotchawicza (i.t.) Aspiracja K. pneumoniae z jamy ustnej i gardła

1. Upewnij się, że myszy są jednoznacznie identyfikowane za pomocą znaku ogona, tatuażu lub innego zatwierdzonego identyfikatora.
2. Sporządzić inokulum dozujące bakterie za pomocą pipety P200 przed usunięciem myszy z izofluranu w celu przyspieszenia procedury. Aby uzyskać najlepsze wyniki przy aspiracji IT, użyj objętości <100 μl, aby zapobiec przepełnieniu. W tym celu należy użyć 2000 CFU/50 μl K. pneumoniae.
3. Znieczulenie myszy należy umieścić w przezroczystej komorze z gazem izofluranowym (np. 2% izofluranem przy natężeniu przepływu 1 l/min) lub zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi. Liczba myszy do znieczulenia razem zależy od poziomu komfortu eksperymentatora, zwykle 1-2 na raz. Obserwuj oddech i potwierdź poziom znieczulenia, gdy widoczne są głębokie oddechy i można policzyć 2-3 sekundy między oddechami.
   UWAGA: Jeśli istnieje obawa o możliwe zakłócające działanie lotnych (wziewnych) środków znieczulających, znieczulenie można uzyskać zamiast tego za pomocą dootrzewnowego wstrzyknięcia ketaminy/ksylazyny. Przy metodzie opisanej powyżej znieczulenie głębokie trwa tylko kilka minut. W przypadku wywołania przedłużonego znieczulenia należy zastosować maść do oczu, aby zapobiec wysuszeniu oka.
4. Po znieczuleniu myszy umieść ją w pozycji półleżącej, zawieszonej na siekaczach szczęki na gumce rozciągniętej między kołkami na pochyłej płycie z pleksiglasu (ryc. 1).
5. Delikatnie pociągnij język myszy na bok za pomocą, niepręgowanych kleszczy i wprowadź dawkę do jamy ustnej za pomocą pipety P200. Zachowaj szczególną ostrożność, aby uniknąć urazu języka lub części ustnej gardła.
6. Trzymając język schowany, delikatnie zasłaniaj nos palcem w rękawiczce, aż mysz weźmie wdech. Kontynuuj zakrywanie nosa, aż mysz weźmie dwie lub więcej inhalacji, a w jamie ustnej nie będzie widać płynu. Zakrycie nosa pomaga zapewnić, że mysz będzie wdychać bakterie do płuc, ponieważ myszy są obowiązkowymi oddychaczami przez nos.
7. Wyjmij mysz z deski do szczepienia i wróć do klatki, kładąc mysz na plecach, aby zapobiec blokowaniu nozdrzy przez ściółkę lub zanieczyszczenia, podczas gdy mysz dochodzi do siebie po znieczuleniu.
8. Gdy wszystkie myszy zostaną podawkowane i obudzą się ze znieczulenia, trzymaj myszy w boksie/pomieszczeniu zawierającym tylko myszy, którym podano K. pneumoniae. Codziennie monitoruj myszy, w tym masę ciała, jeśli po zakażeniu minęło więcej niż 48 godzin.
9. Używaj codziennego zacieru i/lub dodatkowego ciepła, jeśli pozwalasz myszom przetrwać dłużej niż 48 godzin.

3. Pobieranie i analiza płynu do płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BALF)

1. Eutanazja myszy zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi. W tym przypadku należy zastosować śmiertelny zastrzyk 150 mg/kg pentobarbitalu sodu lub równoważną dawkę komercyjnego roztworu do eutanazji, a następnie wykrwawienie, ponieważ pozwala to uniknąć możliwych powikłań dla płuc związanych z wdychaniem CO₂ i zwichnięciem szyjki macicy.
2. Umieść mysz na plecach i wysterylizuj mysz, spryskując futro 70% etanolem, szczególnie w okolicy klatki piersiowej i szyi.
3. Wykonaj podłużne cięcie tuż pod mostkiem, a następnie przytrzymując mostek kleszczami, naciąć przeponę, pozwalając płucu opaść z powrotem do jamy klatki piersiowej. Przeciąć przez klatkę piersiową po obu stronach układu krwionośnego, a następnie w górę przez szyję, odsłaniając tchawicę.
4. Ponieważ tchawica jest otoczona podłużnymi mięśniami po obu stronach, ostrożnie przeciąć środek i popchnąć tkankę na boki, ponieważ pozwala to uniknąć przecięcia otaczającego naczynia krwionośnego, co mogłoby wprowadzić krew do tchawicy. Jeśli układ krwionośny jest nacięty, oczyść okolice gazą przed uzyskaniem dostępu do światła tchawicy.
5. Użyj nożyczek chirurgicznych lub igły, aby naciąć tchawicę około 1/4 drogi w dół od głowy i wprowadzić kaniulę przymocowaną do strzykawki o pojemności 1 ml wstępnie załadowanej 1 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) doogonowo do tchawicy. W przypadku myszy w wieku <8 tygodni lub samic należy zmniejszyć objętość płukania do 600-800 μl.
6. Powoli wciśnij objętość do płuc, pozwalając wszystkim płatom się napompować, a następnie wyciągnij objętość z powrotem za pomocą strzykawki, powtarzając 3 razy. Jeśli PBS wydostaje się z nozdrzy, kaniula nie została wepchnięta wystarczająco głęboko do tchawicy lub napompowanie następuje zbyt szybko. Alternatywnie, jeśli płuca nie są dobrze napompowane, kaniula została wepchnięta zbyt głęboko, więc lekko się wycofaj.
7. Zebrać zebrane płyny do płukania w tubce o pojemności 15 ml na lodzie.
8. Wirować płyn do płukania przestrzeni powietrznej o sile 1 200 x g przez 5 minut, zebrać supernatant do probówki o pojemności 1,5 ml i zamrozić w temperaturze -80 °C. Następnie użyj supernatantu (tj. BALF) do pomiaru białka, cytokin i do różnych innych testów biochemicznych. Osad reprezentuje komórki z przestrzeni oskrzelowo-pęcherzykowej.
9. Jeśli czerwone krwinki (RBC) są widoczne w osadzie komórkowym na podstawie koloru, poddać lizie 1 ml buforu do lizy ACK przez 1 minutę, a następnie dodać 5 ml 1x PBS, aby zatrzymać reakcję lizy i rozcieńczyć bufor. Ze wszystkimi próbkami należy obchodzić się identycznie, zarówno potraktowanymi buforem do lizy ACK, jak i nie.
10. Wirować komórki w temperaturze 1 200 x g przez 5 minut, zdekantować supernatant i umieścić komórki w 1 ml 1x PBS.
11. Wiruj i policz komórki na hemocytometrze w celu zliczenia całkowitych komórek przestrzeni powietrznej.
12. W zależności od gęstości komórek dodać około 80-150 μl (~80 μl dla zakażonej myszy i ~150 dla myszy naiwnej) do komory szkiełka na wirówce cytospinowej. Obracaj komórki na szkiełkach mikroskopowych w celu późniejszego barwienia w celu określenia różnic w populacjach komórek.
13. Pozostaw komórki do wyschnięcia na szkiełkach przez noc. Zabarwić komórki potrójnym barwnikiem (np. Hema 3 [patrz tabela]), zanurzając szkiełka 7 razy w utrwalaczu, 9 razy w barwie 1 i 7 razy w barwie 2 (bez płukania między plamami) i pozostawić do wyschnięcia. Po wyschnięciu bejcy szkiełko nakrywkowe przesuwa się i ręcznie liczy różnice za pomocą mikroskopu. Ogólnie rzecz biorąc, neutrofile i monocyty/makrofagi można łatwo odróżnić po ich wielkości i morfologii jądrowej.

4. Określanie obciążenia bakteryjnego w tkankach płuc i obwodowych

1. Przed rozpoczęciem: przygotować probówki z 900 μl 1x PBS dla płuc i śledziony oraz 90 μl 1x PBS dla krwi. Tabliczki znamionowe do hodowli bakterii i ustawione w temperaturze pokojowej; W związku z tym, po pobraniu tkanki, czas między homogenizacją a posiewem zostanie zminimalizowany w celu rozwoju bakterii.
   Uwaga: Ze względu na niejednorodne odkładanie się bakterii w płucach, które może wystąpić podczas aspiracji, zaleca się wykorzystanie poszczególnych myszy do analizy całkowitej komórkowości dróg oddechowych lub całkowitego (obustronnego) obciążenia bakteryjnego płuc.
2. Poddaj mysz eutanazji zgodnie z krokiem 3.1, a następnie pobierz krew z lewej komory, umieszczając ją w rurki heparynizowanej, aby uniknąć zakrzepów. Usunąć wszystkie płaty płuc i umieścić w probówce o pojemności 15 ml zawierającej 5 ml 1x PBS, a następnie usunąć śledzionę i umieścić w 2 ml 1x PBS. Umieść probówki na lodzie. Uważaj, aby czyścić narzędzia etanolem między każdą chusteczką/myszką.
3. Homogenizować tkankę na lodzie, najlepiej za pomocą jednorazowych homogenizatorów, które można wymieniać między każdą próbką. Jednorazowe końcówki homogenizatora można sterylizować w autoklawie w celu ponownego użycia między eksperymentami.
4. Po homogenizacji tkanki należy wykonać seryjne rozcieńczenia i płytkę. Próbki danej tkanki/rozcieńczenia należy umieścić w dwóch egzemplarzach na pojedynczej płytce TSA, rysując linię podziału na tworzywie sztucznym. Sugestie dotyczące posiewu i rozcieńczania przedstawiono poniżej (we wszystkich przypadkach 10 μl próbki rozprowadza się na płytce) i opierają się na 24-godzinnej sekcji zwłok po zakażeniu. W przypadku analizy próbek w ciągu 48-72 godzin może być konieczne posiew większej liczby rozcieńczeń ze względu na zwiększone obciążenie bakteryjne w późniejszych punktach czasowych.
   1. Dla krwi - rozcieńczyć w stosunku 1:10, dodając 10 μl krwi do 90 μl sterylnego 1x PBS. Płytka schludna i próbki rozcieńczone w stosunku 1:10 w dwóch egzemplarzach. Po pokryciu krwi należy odwirować pozostałą krew o sile 9 300 x g przez 10 minut, aby pobrać osocze do pomiaru cytokin i chemokin.
   2. Dla płuc - rozcieńczyć 1:10 - 1:100, dodając 100 μl homogenizowanego płuca do 900 μl sterylnego 1x PBS szeregowo. Płytka jest czystym homogenatem i wszystkie rozcieńczenia w dwóch egzemplarzach.
   3. W przypadku śledziony - rozcieńczyć 1:10-1:100, dodając 100 μl homogenizowanej śledziony do 900 μl sterylnego 1x PBS szeregowo. Płytka czystej jednorodności i oba rozcieńczenia w dwóch powtórzeniach.
5. Pozostawić rozsiane próbki do krótkiego wyschnięcia.
6. Odwrócić płytki TSA i umieścić na noc w statycznym inkubatorze o temperaturze 37 °C.
7. Określ liczbę bakterii kolonizujących, uśredniając kolonie bakteryjne z obu stron płytki i z każdego rozcieńczenia. Uwzględnij początkowe rozcieńczenia 5 ml dla płuc i 2 ml dla śledziony, aby określić całkowite tkankowe CFU.

Results

myszy C57BL/6 zostały zarażone 2000 CFU K. pneumoniae 43816 (serotyp 2) poprzez aspirację ustno-gardłową do płuc. Przy tej dawce myszy zazwyczaj zaczynają wykazywać objawy kliniczne 12-24 godziny po zakażeniu, w tym letarg, potarganą sierść i utratę masy ciała o 5-10% (ryc. 2A). W ciągu 48-72 godzin po zakażeniu wiele myszy wykazuje objawy choroby i zachorowalności, które zwykle poprzedzają średnio 20% utrata masy ciała i skutkują zgarbionymi pozycjami ze zmniejs...

Discussion

Mysie modele bakteryjnego zapalenia płuc, w połączeniu z celowaniem genowym oraz interwencjami biologicznymi i farmakologicznymi in vivo , dostarczyły kluczowych informacji na temat odpowiedzi obronnej gospodarza płucnego. Ogromny postęp dokonał się w szczególności w naszym zrozumieniu chemokin i cząsteczek adhezyjnych, które regulują rekrutację neutrofili do zainfekowanej przestrzeni powietrznej^10,11. Modele zapalenia płuc in vivo , w przeciwieństwie do metod opartych na komórkach lub altern...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Klebsiella pneumoniae, serotyp 2	ATCC	43816
Tryptyczny bulion sojowy	Cewniki Becton Dickenson	211825
Excel Safelet IV, 18 G x 1 1/4"	Claflin Sprzęt medyczny	MEDC-031122
Hema 3 Roztwór 1	Fisher	23-122-937
Hema 3 Roztwór 2	Fisher	23-122-952
Hema 3 Fixative	Fisher	23-122-929
27½ strzykawki tuberkulinowe	Fisher	14-826-87
Kolektory osocza heparyny litowej		Jednorazowe
kształcie litery L	Lab Scientific	DSC
1x PBS, pH 7,4	przygotowany we własnym zakresie	nie dotyczy	Woda destylowana (5 l), NaCl (40 g), KCl (1 g), Na2HPO4 (5,75 g), KH2PO4 (1 g)
Bufor do lizy ACK	przygotowany we własnym zakresie	nie dotyczy	NH4Cl (4,145 g), KHCO3 (0,5 g), EDTA (18,6 mg), uzupełnić do 500 ml wodą destylowaną i pH do 7,4