Nieinwazyjna i technicznie nieintensywna metoda indukcji i fenotypowania eksperymentalnego bakteryjnego zapalenia płuc u myszy

Summary

W literaturze opisano kilka metod modelowania bakteryjnego zapalenia płuc u myszy. W niniejszym artykule opisano nieinwazyjną, niedrogą i szybką metodę wywoływania zapalenia płuc poprzez aspirację (tj. wdychanie) inokulum bakteryjnego pipetowanego do jamy ustnej i gardła. Szczegółowo opisano również dalsze metody oceny wrodzonej odpowiedzi immunologicznej płuc.

Abstract

Chociaż pozaszpitalne zapalenie płuc pozostaje poważnym problemem zdrowia publicznego, mysie modele bakteryjnego zapalenia płuc ostatnio ułatwiły znaczący postęp przedkliniczny w naszym zrozumieniu leżącej u podstaw patogenezy komórkowej i molekularnej. Mysie modele in vivo ujmują zintegrowaną fizjologię i odporność odpowiedzi obronnej gospodarza w sposób, który nie został ujawniony przez alternatywne, uproszczone podejścia ex vivo. W literaturze opisano kilka metod dopłucnej inokulacji bakterii u myszy, w tym aerozolizację, podawanie donosowe, przezustną kaniulację dotchawiczą w warunkach "ślepych" i wizualnych oraz przezskórną kaniulację dotchawiczą. Wszystkie metody mają względne zalety i ograniczenia. W niniejszym artykule szczegółowo opisujemy nieinwazyjną, technicznie nieintensywną, niedrogą i szybką metodę dotchawniczego dostarczania bakterii, która polega na aspiracji (tj. Wdychaniu) przez mysz zakaźnego inokulum pipetowanego do jamy ustnej gardła w znieczuleniu ogólnym. Metoda ta może być stosowana do dostarczania płucnego szerokiej gamy nieżrących środków biologicznych i chemicznych i jest stosunkowo łatwa do nauczenia, nawet dla laboratoriów z minimalnym wcześniejszym doświadczeniem w zabiegach płucnych. Oprócz opisania metody zachłystowego zapalenia płuc, przedstawiamy również procedury krok po kroku do oznaczania późniejszej wrodzonej odpowiedzi immunologicznej płuc in vivo myszy, w szczególności metody ilościowego określania klirensu bakteryjnego i komórkowej odpowiedzi immunologicznej zakażonych dróg oddechowych. To zintegrowane i proste podejście do oceny zapalenia płuc pozwala na szybką i solidną ocenę wpływu manipulacji genetycznych i środowiskowych na wrodzoną odporność płuc.

Introduction

Pozaszpitalne zapalenie płuc pozostaje główną przyczyną zgonów z powodu infekcji w USA, z niewielką ogólną zmianą wskaźników śmiertelności w ciągu ostatnich 40 lat, pomimo poprawy w strategiach szczepień i antybiotyków^1,2. Pomimo braku zauważalnego postępu na poziomie zdrowia publicznego, w ostatnich latach poczyniono ogromne postępy w naszym zrozumieniu molekularnej i komórkowej patogenezy zapalenia płuc, a wiele z tych kroków naprzód stało się możliwe dzięki zastosowaniu mysich modeli infekcji płuc. Genetyczna podatność myszy, podobieństwo mysiego i ludzkiego układu odpornościowego oraz szeroki wachlarz mysich odczynników immunologicznych, które stały się....

Protocol

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z Ustawą o Dobrostanie Zwierząt oraz Polityką Publicznej Służby Zdrowia Stanów Zjednoczonych dotyczącą humanitarnej opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych po przeglądzie przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt NIEHS.

1. Przygotowanie kultury K. pneumoniae

Uwaga: Wykonaj wszystkie kroki w kapturze poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL2) lub innym wyznaczonym obszarze BSL2 i wyrzuć odpady zgodnie z wytycznymi instytutu BSL2.

1. W przypadku wzrostu zawiesiny K. pneumoniae należy rozmrozić glicerolowy zapas bakteri....

Results

myszy C57BL/6 zostały zarażone 2000 CFU K. pneumoniae 43816 (serotyp 2) poprzez aspirację ustno-gardłową do płuc. Przy tej dawce myszy zazwyczaj zaczynają wykazywać objawy kliniczne 12-24 godziny po zakażeniu, w tym letarg, potarganą sierść i utratę masy ciała o 5-10% (ryc. 2A). W ciągu 48-72 godzin po zakażeniu wiele myszy wykazuje objawy choroby i zachorowalności, które zwykle poprzedzają średnio 20% utrata masy ciała i skutkują zgarbionymi pozycjami ze zmniejs.......

Discussion

Mysie modele bakteryjnego zapalenia płuc, w połączeniu z celowaniem genowym oraz interwencjami biologicznymi i farmakologicznymi in vivo , dostarczyły kluczowych informacji na temat odpowiedzi obronnej gospodarza płucnego. Ogromny postęp dokonał się w szczególności w naszym zrozumieniu chemokin i cząsteczek adhezyjnych, które regulują rekrutację neutrofili do zainfekowanej przestrzeni powietrznej^10,11. Modele zapalenia płuc in vivo , w przeciwieństwie do metod opartych na komórkach lub altern.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Klebsiella pneumoniae, serotyp 2	ATCC	43816
Tryptyczny bulion sojowy	Cewniki Becton Dickenson	211825
Excel Safelet IV, 18 G x 1 1/4"	Claflin Sprzęt medyczny	MEDC-031122
Hema 3 Roztwór 1	Fisher	23-122-937
Hema 3 Roztwór 2	Fisher	23-122-952
Hema 3 Fixative	Fisher	23-122-929
27½ strzykawki tuberkulinowe	Fisher	14-826-87
Kolektory osocza heparyny litowej		Jednorazowe
kształcie litery L	Lab Scientific	DSC
1x PBS, pH 7,4	przygotowany we własnym zakresie	nie dotyczy	Woda destylowana (5 l), NaCl (40 g), KCl (1 g), Na2HPO4 (5,75 g), KH2PO4 (1 g)
Bufor do lizy ACK	przygotowany we własnym zakresie	nie dotyczy	NH4Cl (4,145 g), KHCO3 (0,5 g), EDTA (18,6 mg), uzupełnić do 500 ml wodą destylowaną i pH do 7,4