Wychwytywanie powinowactwa do kompleksu białkowego z komórek ssaków poddanych mieleniu w kriomerze

Podsumowanie

Tutaj opisujemy protokoły rozbijania komórek ssaków poprzez mielenie w stanie stałym w temperaturze kriogenicznej, wytwarzanie ekstraktu komórkowego z powstałego proszku komórkowego i izolowanie interesujących kompleksów białkowych poprzez wychwytywanie powinowactwa na paramagnetycznych kulkach w skali mikronowej sprzężonych z przeciwciałami.

Streszczenie

Przechwytywanie powinowactwa jest skuteczną techniką izolowania endogennych kompleksów białkowych do dalszych badań. W połączeniu z przeciwciałem technika ta jest również często określana jako immunoprecypitacja. Przechwytywanie koligacji można zastosować w skali laboratoryjnej i w kontekście wysokiej przepływności. W połączeniu ze spektrometrią mas białek, wychwytywanie powinowactwa okazało się być koniem pociągowym analizy interaktomowej. Chociaż istnieje potencjalnie wiele sposobów wykonania wielu wymaganych kroków, poniższe protokoły implementują nasze preferowane metody. Charakterystyczne są dwie cechy: zastosowanie kriomielonego proszku komórkowego do produkcji ekstraktów komórkowych oraz kulki paramagnetyczne sprzężone z przeciwciałami jako pożywka powinowactwa. W wielu przypadkach uzyskaliśmy lepsze wyniki niż te uzyskane przy użyciu bardziej konwencjonalnych praktyk przechwytywania powinowactwa. Kriomielenie pozwala uniknąć wielu problemów związanych z innymi formami pękania komórek. Zapewnia skuteczne łamanie materiału, jednocześnie unikając problemów z denaturacją związanych z nagrzewaniem lub pienieniem. Zachowuje natywne stężenie białka aż do momentu ekstrakcji, łagodząc dysocjację makromolekularną. Skraca czas spędzany przez wyekstrahowane białka w roztworze, ograniczając szkodliwe działania enzymatyczne i może zmniejszać niespecyficzną adsorpcję białek przez pożywkę o powinowactwie. W ciągu ostatnich kilku lat pożywki o powinowactwie magnetycznym w skali mikronowej stały się bardziej powszechne, coraz częściej zastępując tradycyjne podłoża na bazie agarozy i sefarozy. Podstawowe zalety nośników magnetycznych obejmują zazwyczaj niższą niespecyficzną adsorpcję białek; brak limitu wykluczenia wielkości, ponieważ wiązanie kompleksu białkowego zachodzi na powierzchni kulki, a nie w porach; oraz łatwość manipulacji i obsługi za pomocą magnesów.

Wprowadzenie

Typowym zastosowaniem prezentowanych procedur jest stabilizacja i uzyskanie wysokiej wydajności i czystości endogennych kompleksów białkowych, które są przedmiotem zainteresowania dla charakterystyki interaktomicznej¹. Przyjmuje się, że dynamiczne sieci zarówno stabilnie, jak i przejściowo powiązanych kompleksów makromolekularnych, składające się głównie z białek, koordynują procesy komórkowe^2,3. Chociaż istnieje wiele eksperymentalnych podejść do identyfikacji interakcji białko-białko, wychwytywanie powinowactwa jest jedną z najczęściej stosowanych metod izolowania i preparowania fizjologicznych kompleksów białkowych^4-6. Co więcej, technika ta ma tę zaletę, że daje kompleksy makromolekularne jako jednostki fizyczne, a nie tylko jako punkty danych w odczycie; Korzystne jest to, że otrzymane kompleksy mogą być zatem wykorzystane w wielu dodatkowych dalszych testach biochemicznych, enzymatycznych i strukturalnych^7-9. Przedstawione protokoły zostały opracowane w odpowiedzi na potrzebę mapowania sieci interakcji białko-białko oraz scharakteryzowania kompleksów makromolekularnych w ich rolach jako cząsteczek efektorowych biologii komórki. Są one szczegółowo opisane w odniesieniu do ich zastosowania do komórek ssaków hodowanych w hodowli tkankowej, ale mają również zastosowanie do szerokiego zakresu próbek biologicznych, po odpowiednich poprawkach specyficznych dla systemu.

Historia przechwytywania powinowactwa sięga początku XX wieku, kiedy to pierwsze eksperymenty chromatograficzne immunopowinowactwa — przypominające to, co obecnie powszechnie określa się mianem immunoprecypitacji (IP) — pojawiły się w literaturze na początku lat 50. Główny nurt techniki rozwijał się przez przełom tego stulecia do chwili obecnej^10-13. Różnorodne badania komórkowe i biologii molekularnej wykorzystywały mechaniczne pękanie komórek przez mielenie w temperaturach kriogenicznych przez co najmniej ostatnie czterdzieści lat^14-19; a separacje molekularne z wykorzystaniem (super)paramagnetycznych kulek stają się coraz bardziej powszechne w ciągu ostatnich dwóch dekad²⁰. Połączenie tych różnych technologii posłużyło do synergistycznego ulepszenia wyników, które można uzyskać w eksperymentach z wychwytywaniem powinowactwa kompleksów białkowych¹, o czym świadczy obszerny dorobek opracowany przez nas i szerszą społeczność badawczą^{7,9,11,18,19,21-23}. Wyniki potwierdzające przedstawiono na rysunku 1.

Zbiór zastrzeżeń i uwag dotyczących przeprowadzania skutecznych eksperymentów z przechwytywaniem powinowactwa można znaleźć w odnośniku¹. Zazwyczaj podejście to jest najbardziej odpowiednie do: (I) skatalogowania interakcji białka będącego przedmiotem zainteresowania, tj. wykorzystania spektrometrii mas białek (MS) do identyfikacji nieznanych dotąd białek oczyszczających (analiza eksploracyjna); (II) test na obecność określonego partnera oddziałującego, tj. użycie MS lub western blot w celu wykrycia określonego białka lub ograniczonego zestawu białek, co do których istnieje podejrzenie, że wchodzą w interakcje z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania (badanie hipotezy); lub (III) przygotować endogennie złożone kompleksy białkowe zawierające białko będące przedmiotem zainteresowania do dalszych badań za pomocą dodatkowych technik (praca przygotowawcza). Przed rozpoczęciem eksperymentalnego reżimu wychwytywania powinowactwa absolutnie niezbędne jest posiadanie wysokiej jakości odczynnika powinowactwa, który wiąże się z białkiem docelowym, zazwyczaj przeciwciałem kompetentnym w zakresie IP przeciwko natywnemu białku docelowemu będącemu przedmiotem zainteresowania lub przeciwko znacznikowi dołączonemu do białka fuzyjnego. Bardzo ważne jest również posiadanie odpowiednich metod eksperymentalnego odczytu: ogólne barwienie białek (takie jak Coomassie blue, Sypro Ruby lub srebro, zgodnie z SDS-PAGE), western blotting i białkowe MS są powszechnie stosowane w połączeniu z wychwytywaniem powinowactwa¹. Przedstawione protokoły wykorzystują sprzężone z przeciwciałami kulki magnetyczne jako pożywkę powinowactwa. Podczas gdy funkcja pożywki powinowactwa może być początkowo zwalidowana w testach, które wykorzystują niewiele parametrów eksperymentalnych, aby uzyskać najlepsze wyniki, każdy eksperyment powinien być empirycznie zoptymalizowany^1,11,24. Protokoły są podzielone na trzy odrębne fazy: (1) przygotowanie materiału z zamrożonych komórek; (2) pękanie komórek przez mielenie w stanie stałym w temperaturze kriogenicznej; oraz (3) ekstrakcja białek i wychwytywanie powinowactwa za pomocą kulek paramagnetycznych sprzężonych z przeciwciałami.

Protokół

1. Zbieranie i zamrażanie komórek

1. Hodować 1-8 g materiału komórkowego przy użyciu odpowiednich warunków hodowli dla interesującej nas linii komórkowej^25,26. Ten protokół jest zoptymalizowany dla maksymalnie 8 gramów komórek (~10⁹ komórek), zmodyfikowany z referencji^19,27,28. Zazwyczaj ~5 g komórek HEK-293 lub HeLa można uzyskać z ośmiu 500 cm² płytek hodowlanych wyhodowanych do ~90% konfluencji.
   UWAGA: Protokoły te wykorzystują ciekły azot (LN₂), który może powodować poważne oparzenia kriogeniczne. Załóż odzież ochronną i zachowaj odpowiednie środki ostrożności.
2. Odlać pożywkę wzrostową (odpady) do dużej zlewki.
3. Umieść naczynie hodowlane na lodzie w dużej prostokątnej misce na lód.
4. Dodać 20 ml lodowatego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) do szalki hodowlanej i uwolnić komórki z naczynia za pomocą dużego skrobaka do komórek; przenieść komórki do probówki o pojemności 50 ml, wstępnie schłodzonej na lodzie; trzymać probówkę na lodzie.
   UWAGA: Na wszystkich etapach obsługi komórek należy używać pipety elektrycznej ustawionej na "niskie" i pipet o pojemności 25 ml, aby uniknąć nadmiernego ścinania komórek podczas manipulacji transferem. Przed rozpoczęciem procedury należy umieścić 50 ml probówek zbiorczych i 1x PBS w pojemniku na lód.
5. Dodaj dodatkowe 10 ml lodowatego 1x PBS do tego samego naczynia. Zebrać pozostałe komórki i przenieść je do probówki o pojemności 50 ml.
6. Powtórz tę czynność dla każdej potrawy; zawiesiny komórek z różnych szalek można łączyć, aby zmniejszyć liczbę próbek i ilość odpadów z tworzyw sztucznych.
   UWAGA: Ponieważ same komórki nie będą stanowić dużej części objętości zawiesiny, zawiesinę komórek o wartości trzech płytek można połączyć w dwie probówki o pojemności 50 ml. Ponieważ probówki o pojemności 50 ml w rzeczywistości mieszczą więcej niż objętość nominalna, osiem płytek można zwykle rozłożyć na pięciu takich probówkach.
7. Wirować przez 5 minut w temperaturze 1 000 x g, 4 °C.
8. Ostrożnie odlej supernatant. Ponownie zawiesić każdą granulkę w 10 ml lodowatego 1x PBS. Skonsolidować zawieszone granulki, do 5 na probówkę o pojemności 50 ml, aby zmniejszyć liczbę próbek.
9. Wirować 5 minut przy 1.000 x g, 4 °C.
10. Ostrożnie odlej supernatant. Zawiesić osad w 10 ml lodowatego 1x PBS
11. Wyjąć tłok ze strzykawki o pojemności 20 ml i odłożyć go na bok. Zakryć dyszę strzykawki i przenieść do niej zawiesinę komórek.
12. Umieścić strzykawkę w probówce o pojemności 50 ml i odwirować przez 5 minut w temperaturze 1 000 x g, 4 °C.
13. Odessać supernatant za pomocą pipety z cienką końcówką przymocowanej do systemu pułapki próżniowej, aż zacznie być zasysana tylko górna warstwa komórek. W ten sposób powstaje osad o mokrych komórkach.
14. Odkręcić strzykawkę, włożyć tłok i wlać komórki bezpośrednio do dużej plastikowej zlewki wypełnionej LN₂, przechowywanej w kąpieli LN₂ w styropianowym pudełku. Na siłę zanurz pozostałe komórki ze strzykawki.
15. Przenieść zamrożone komórki do probówek o pojemności 50 ml przez nalanie. Luźno zakryj probówki, aby nadmiar LN₂ odparował; Przechowywać je przez noc w temperaturze -80 °C. Następnego dnia całkowicie dokręcić nakrętki. Zamrożoną komórkę można przechowywać w ten sposób w temperaturze -80 °C do czasu kriomielenia.
    UWAGA: Nie zamykaj szczelnie probówek, zanim cały LN₂ widocznie wyparuje, w przeciwnym razie nadmierne ciśnienie może spowodować eksplozję rurki. Niezamykanie probówek po rozproszeniu LN₂ może spowodować gromadzenie się szronu na materiale komórek, dodawanie nadmiaru masy wody i skuteczne zmniejszenie stężenia białka podczas mielenia.

2. Kriogeniczne rozerwanie zamrożonych komórek

UWAGA: Wszystkie narzędzia do frezowania i manipulacji powinny być wstępnie schłodzone LN₂. Mała karafka będzie potrzebna do dodania LN₂ do słoika i do wylania LN₂ na wierzch zamkniętego słoika do mielenia. Narzędzie domowej roboty jest pokazane w odnośniku¹⁹. Do obsługi chłodzonego aparatu mielącego LN₂ potrzebne będą rękawice kriogeniczne. Używane tutaj pokrywki słoików do mielenia (patrz Tabela materiałów) są zazwyczaj dostarczane z zainstalowaną gumową uszczelką; będzie to musiało zostać zastąpione dostępną w handlu teflonową uszczelką pokrywy, aby niezawodnie wykonać następujący protokół. Ponadto, ponieważ ciśnienie z gazowego N₂ może wzrosnąć do wysokiego poziomu w słoiku podczas mielenia, zalecamy zainstalowanie dostępnego na rynku zaworu ciśnieniowego 5 bar/500 kPa jako środka ostrożności²⁸.

1. Wyjąć kulki komórkowe z miejsca przechowywania w temperaturze -80 °C i umieścić w uchwycie probówki o pojemności 50 ml w kąpieli LN₂.
2. Wstępnie schłodzić słoik o pojemności 50 ml, dwie kulki 20 mm i pokrywkę w czystym prostokątnym wiaderku na lód zawierającym LN₂. Wstępnie schłodzić izolator z politetrafluoroetylenu (PTFE), jeśli go używasz; albo zestaw krążków (zob. odniesienie²⁷), albo rękaw i krążek (zob. rysunek 2). Wstępne chłodzenie jest zakończone, gdy gwałtowne gotowanie LN₂ uspokoi się.
3. Ustaw odpowiednią przeciwwagę na frezarce.
   UWAGA: Będzie to równe masie słoika, pokrywce słoika, używanym kulom mielącym i ilości komórek, które należy dodać do słoika. W przypadku stosowania jakichkolwiek izolatorów PTFE należy również uwzględnić ich masę. Sugerujemy wcześniejsze zapisanie masy słoika, pokrywki i kulek (oraz ich łącznej masy, w tym zastosowanego izolatora) i zapisanie ich na arkuszu informacyjnym przechowywanym w pobliżu młyna.
4. Za pomocą kleszczy umieść dwie wstępnie schłodzone kule mielące o średnicy 20 mm i zamrożone komórki we wstępnie schłodzonym słoiku do mielenia.
   Uwaga: Ze względu na niewielkie ubytki materiału na powierzchni słoika i kuli podczas mielenia, procent odzyskanego materiału wzrasta wraz ze wzrostem masy mielonych komórek. Przy opisanej metodzie straty materiału są bardzo niewielkie, rzędu ~0,3 g masy mokrej komórki (WCW). Wytyczne producenta wskazują, że maksymalna objętość załadowanej próbki powinna wynosić ~1/3 objętości słoika. ²⁹ Całkowita objętość kulek powinna wynosić ~1/3, a pozostała ~1/3 wolnej przestrzeni jest przeznaczona na swobodny ruch kulek.
5. Dodaj LN₂ do słoika do ~1/2 napełnienia, umieść pokrywkę na słoiku i przenieś zestaw do młynka.
   UWAGA: Najpierw zainstaluj wybrany izolator, jeśli go używasz.
6. Zacisnąć zespół na miejscu i wykonać trzy cykle frezowania w następującym programie: 400 obr./min, 3 min, odwrotne obroty co minutę, bez przerwy w interwale. Schłodzić słoik do mielenia za pomocą LN₂ pomiędzy każdym cyklem.
   UWAGA: Podczas mielenia generowany jest wyraźny odgłos stukania, gdy kulki zderzają się w słoiku w ruchu planetarnym. Jeśli te dźwięki nie są słyszalne, frezowanie nie występuje. Zakończ cykl mielenia, nie licz tego cyklu, przesuń zespół słoika z powrotem do LN₂ i sprawdź zawartość słoika. Upewnij się, że nie utworzył się lód, a jeśli tak, odłup go od ścianek słoika za pomocą wstępnie schłodzonej szpatułki. Zacznij ponownie od kroku 2.5.
   Jeśli nie używasz izolatora lub krążków izolatora, przesuń zespół słoika z powrotem do LN₂ między cyklami, aby ponownie ostygł i za każdym razem dodawaj LN₂ do ~1/2 pełna. Dodane LN₂ odparują w słoiku, gdy temperatura słoika wzrośnie podczas mielenia. Powoduje to wzrost ciśnienia w słoiku. Dlatego odłączając słoik od młynka, należy bardzo powoli zwolnić zacisk. Jeśli zacisk zostanie szybko zwolniony, proszek komórkowy może uciec z szybkim obniżeniem ciśnienia. Powolne zwalnianie zacisku pozwala na ucieczkę ciśnienia ze słoika w delikatny, kontrolowany sposób i zapobiega utracie materiału komórkowego. Często słychać delikatne ulatnianie się gazowego N₂ podczas powolnego zwalniania zacisku - jest to normalne.
   W przypadku korzystania z izolatora tulejowo-krążkowego, zespół słoika można pozostawić w młynie, a LN₂ dodać do zespołu izolator/słoik na miejscu.
7. Przenieś słoik z powrotem do LN₂ i odstaw na chwilę, aby ostygł. W przypadku korzystania z izolatora rękawowo-krążkowego, słoik można wyjąć z rękawa za pomocą dwóch szpatułek, zapewniając dźwignię po obu stronach. Gdy słoik spocznie w LN₂, ostrożnie zdejmij pokrywkę, usuń kulki za pomocą kleszczy i przenieś proszek do wstępnie schłodzonej probówki o pojemności 50 ml za pomocą wstępnie schłodzonej szpatułki. Dodanie odrobiny LN₂ do otwartego słoika / proszku może pomóc w usunięciu proszku, który zbryla się na kulkach, przed ich wyjęciem.
   UWAGA: Po otwarciu słoika dodaj do niego niewielką ilość LN₂ przed wyjęciem kulek. Pomoże to odzyskać proszek zbrylony na powierzchniach. Proszek komórkowy należy przechowywać w temperaturze -80 °C lub niższej do czasu użycia. Z naszego doświadczenia wynika, że proszek komórkowy może być przechowywany w ten sposób, zasadniczo w nieskończoność, bez wpływu na wydajność.

3. Wychwytywanie powinowactwa kompleksów białkowych z ekstraktów komórkowych

UWAGA: Poniższy protokół implementuje pożywkę powinowactwa składającą się z ligandu powinowactwa, przynęty lub przeciwciała, które oddziałuje z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania, sprzężonego z paramagnetycznymi kulkami w skali mikronów. Można je przygotować we własnym zakresie^19,30 przy użyciu dostępnych na rynku zestawów lub zakupić jako gotowe odczynniki.

1. Preparat ekstraktu komórkowego
   UWAGA: Podczas pracy z proszkiem komórkowym należy pamiętać o używaniu przyborów i probówek wstępnie schłodzonych LN₂. Probówki zawierające proszek komórkowy należy zawsze trzymać na LN₂, gdy nie ma temperatury -80 °C. Umieścić 50 ml probówki (probówki) zawierającej proszek komórkowy w stojaku na probówki, w styropianowym pojemniku z LN₂.
   1. Odważyć 100 mg proszku komórkowego do probówki o pojemności 1,5 lub 2 ml do mikrofuge.
      UWAGA: Zaobserwowaliśmy, że ta ilość komórek jest dobrym punktem wyjścia, który zazwyczaj daje docelowe białko w zakresie od dziesiątek do setek nanogramów po wychwyceniu powinowactwa do umiarkowanie eksprymowanego białka (~ 50 kDa masy, obecnego w tysiącach kopii na komórkę), zakładając, że wydajność ekstrakcji i wychwytywania celu wynosi ≳70%. Takie plony zapewniają bezpośrednią wizualizację oczyszczonej frakcji za pomocą SDS-PAGE i barwienia białek.
   2. Waga analityczna tarowania z pustą probówką do mikrofuge. Dozuj proszek komórkowy do probówki za pomocą schłodzonej łyżki lub szpatułki LN₂. Sprawdzić masę proszku dozowanego w probówce na wadze analitycznej.
      UWAGA: Aby ułatwić ważenie proszków komórkowych, można użyć małych miarek wolumetrycznych. Stwierdzono, że dają one powtarzalne wyniki (zob. odniesienie¹⁹). Najlepsze wyniki uzyskaliśmy przy użyciu probówek wirówkowych z nakrętką lub "safe-lock". Ciśnienie z parowania LN₂, które może dostać się do probówek, może spowodować otwarcie standardowych probówek do mikrowirówek podczas późniejszego ogrzewania tuż przed dodaniem roztworu ekstrakcyjnego - potencjalnie powodując utratę próbki.
   3. Otwórz tubkę (lub poluzuj nakrętkę) z proszkiem komórkowym i odstaw na 1 minutę w temperaturze RT. Spowoduje to uwolnienie ciśnienia w probówce i zapobiegnie natychmiastowemu zamarznięciu roztworu ekstrakcyjnego po dodaniu do proszku. Podczas tej 1-minutowej inkubacji nie obserwuje się rozmrażania.
   4. Dodać 400 μl ekstrahentu uzupełnionego inhibitorami proteazy i krótko wirować, a następnie przytrzymać na lodzie, przechodząc do kroku 3.1.5. Próbki powinny być trzymane na lodzie między wszystkimi kolejnymi manipulacjami aż do elucji.
      UWAGA: Najlepszy skład ekstrahentu będzie zależał od kompleksu (kompleksów) białkowego, który ma być oczyszczony. Pewne ogólne wskazówki znajdują się w tabeli 1 i odniesieniach uzupełniających.
   5. Użyj ultrasonografu z mikrokońcówką, aby podać próbce krótki impuls o niskiej energii w celu rozproszenia wszelkich agregatów. (Ultra)sonikacja za pomocą 4 impulsów (po 2 sekundy każdy, 2 A; około 15-20 J całkowitej energii).
      UWAGA: Wirowanie dozuje proszek komórkowy do ekstrahentu, ale w zależności od charakteru roztworu można zaobserwować pewne agregaty. Odkryliśmy, że rozproszenie tych agregatów zapewnia najlepsze plony podczas późniejszego wychwytywania powinowactwa. Krótka sonikacja mikrokońcówką łatwo rozprasza te agregaty. Roztwór powinien wydawać się półprzezroczysty, ale jednorodny, bez widocznych zagięć. Sonikatory do kąpieli wodnej mają zwykle zbyt małą moc, aby skutecznie rozproszyć takie agregaty bez znacznie dłuższego czasu obsługi próbki, ale mogą być odpowiednie przy odpowiednich ustawieniach.
   6. Sklarować ekstrakt przez odwirowanie (np. 20 000 x g, 10 min, 4 °C).
      UWAGA: Podwielokrotność oczyszczonego ekstraktu komórkowego może być zachowana w celu porównania z zawartością osadu, supernatantu wychwytu po powinowactwie i frakcji otrzymanych po elucji z pożywki o powinowactwie w celu określenia skuteczności ekstrakcji i wychwytu białka docelowego, np. przez western blot (patrz Dyskusja).
   7. Usunąć supernatant (ekstrakt klarowany) i przejść do wychwytywania powinowactwa.
      UWAGA: Osad może być ponownie ekstrahowany w buforze ładującym próbkę SDS-PAGE w temperaturze 70 °C w celu określenia stopnia uwolnienia białka docelowego podczas początkowej ekstrakcji niedenaturującej przez porównanie z ekstraktem otrzymanym w kroku 3.1.6.
2. Przechwytywanie powinowactwa
   1. Umyj wstępnie podłoże o powinowactwie magnetycznym. Można to zrobić podczas wirowania ekstraktów komórkowych.
   2. Umieść rurkę (rurki) na magnesie. Koraliki zgromadzą się z boku rurki w ciągu kilku sekund, umożliwiając usunięcie roztworu do przechowywania.
   3. Dodać 500 μl roztworu ekstrakcyjnego do kulek. Krótko zmieszaj wirowo ze średnią prędkością (wystarczającą do ponownego zawieszenia). Pulsacyjnie wiruj probówki w mini-wirówce, aby zebrać całą zawartość na dno. W ten sposób zapewnia się minimalne przenoszenie rozwiązań. Umieść rurki na magnesie i zassaj roztwór.
      UWAGA: Nośniki magnetyczne o charakterystycznych cechach są dostępne u wielu różnych dostawców komercyjnych. Wyniki mogą się różnić w zależności od tych cech, w tym wielkości kulki, jednorodności, powłoki powierzchniowej i chemii sprzężenia przeciwciał. Zaleca się przeprowadzenie równoległych prób w Twojej aplikacji przed wyborem odczynnika.
   4. Rozpocznij wychwytywanie powinowactwa, przenosząc oczyszczony ekstrakt komórkowy do probówki o pojemności 1,5-2,0 ml zawierającej wstępnie umyte podłoże powinowactwa i krótko odwirować w celu ponownego zawieszenia.
   5. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C, ciągłe, delikatnie mieszając na kole rotatora; kulki powinny pozostać zawieszone przez cały czas inkubacji.
   6. Pulsacyjnie wiruj probówki w mini-wirówce, aby zebrać całą zawartość na dno probówki. Odessać supernatant i przemyć kulki trzykrotnie 1 ml roztworu ekstrakcyjnego na zimno, jak opisano w kroku 3.2.3. Umieść rurki na magnesie. Usuń roztwór. Kontynuuj, aby dodać następne rozwiązanie i powtórz. Podczas 2^{. płukania} przenieś kulki i roztwór do płukania razem do świeżej probówki do mikrofuge, pipetując. Zmniejsza to zanieczyszczenie próbki, w punkcie elucji, przypadkowymi białkami zaadsorbowanymi na ściankach probówki używanej do inkubacji z ekstraktem komórkowym. Po 3^praniu kulki należy krótko odwirować pulsacyjnie w mini-wirówce, aby zebrać całą zawartość na dno. Umieść rurkę z powrotem na magnesie i usuń resztki płynu. Pozwala to na usunięcie ostatnich kilku μl roztworu przed elucją, zapewniając, że eluowane próbki będą miały jednolite objętości. Zapewnia również, że elucja będzie skuteczna, ponieważ roztwór elucyjny nie zostanie rozcieńczony przez resztkowe płukanie; takie pozostałości mogą również przyczyniać się do działania soli i zmieniać migrację białek w SDS-PAGE (patrz poniżej).
      UWAGA: Podwielokrotność supernatantu po związaniu może być zachowana w celu porównania z klarowanym ekstraktem otrzymanym w ppkt 3.1.6. przez western blot. Wynik wskaże stopień wyczerpania białka docelowego z ekstraktu komórkowego.
   7. Elute w sposób natywny lub denaturacyjny; rozważ strategię najlepszą dla aplikacji podrzędnej¹.
      UWAGA: Szczegóły dotyczące natywnych strategii elucji będą zależeć od użytego znacznika powinowactwa (patrz Dyskusja). Dla większości użytkowników najbardziej praktycznym podejściem początkowym będzie denaturacja elucji za pomocą buforu próbki SDS-PAGE, a następnie analiza próbki za pomocą SDS-PAGE z barwieniem białkami³¹.
      UWAGA: Skład bufora próbki będzie zależał od zastosowanego systemu elektroforezy. Wiele laboratoriów odlewa własne żele tris-glicynowe, wykorzystując nieciągłą elektroforezę i system buforowy Laemmli^32-34. Typowa receptura bufora próbki (1x) obejmuje: 10% (w/v) sacharozy, 50 mM DTT, 2% (w/v) SDS, 62,5 mM Tris-Cl pH 8,8, 0,0004% (w/v) błękit bromofenolowy³¹. Sugerujemy przygotowanie akcji 1,1x, która pomija DTT. 1/10 objętości 500 mM naziemnej telewizji cyfrowej należy dodać do próbki przed SDS-PAGE (patrz poniżej). Dostępnych jest również wiele dostępnych na rynku systemów SDS-PAGE; Mogą to być próbek specyficzne dla systemu.
   8. Dodać bufor próbki SDS-PAGE bez środka redukującego (w celu ograniczenia uwalniania łańcuchów przeciwciał z kulek) i inkubować przez 5-10 minut w temperaturze pokojowej z mieszaniem.
      UWAGA: Spowoduje to zakłócenie większości interakcji opartych na powinowactwie, uwalniając wychwycone białka do supernatantu. Bardziej trwałe interakcje mogą być korzystne dzięki podwyższonej temperaturze do uwolnienia (zwykle wystarczy 70 °C).
   9. Zbierz i zapisz supernatant. Próbki można zamrażać w temperaturze -20 °C w przypadku krótkiego przechowywania (kilka dni) lub w temperaturze -80 °C w przypadku przedłużonego przechowywania do czasu uzyskania analizy.
   10. Poddać próbki SDS-PAGE, a następnie barwieniu białek przy użyciu standardowych technik³¹. MS może być stosowany do scharakteryzowania składu próbki¹. Poszczególne prążki białkowe mogą zostać wycięte w celu identyfikacji lub cała próbka może być scharakteryzowana w jednej analizie poprzez elektroforezowanie próbki tylko przez krótki czas (4–6 mm w głąb żelu) i przetworzenie wszystkich białek w próbce razem jako "korek żelowy"
       UWAGA: Dodaj DTT przed rozpoczęciem elektroforezy. Jeżeli planowane jest przejście do stwardnienia rozsianego, próbki mogą być alkilowane po elektroforezie³⁵; Jednak często wygodniej jest alkilować przed elektroforezą³⁶.

Wyniki

Rysunek 1, panel I pokazuje, że kriomielenie i kulki magnetyczne mogą ze sobą współpracować w celu poprawy jakości próbki. Panele IA-C pokazują, że materiał składający się z nierozpuszczalnego podłoża użytego do wychwytywania powinowactwa może wpływać na odzyskany proteom¹⁹. Interesujące białko, oczyszczona bakteryjna fosfataza alkaliczna (BAP) znakowana FLAG, została wzbogacona o ekstrakty z komórek ludzkich. Nie oczekuje się, że BAP będzie specyficznie oddziaływał z ludzkimi białkami i kooczyszczał je. Sygnatura białek oczyszczających, oceniana za pomocą barwienia SDS-PAGE i Coomassie, różniła się w zależności od użytego podłoża. Kulki magnetyczne w skali mikronowej wykazały najczystszy profil, wskazując na stosunkowo niski poziom niespecyficznej adsorpcji białek. Panele ID i IE ilustrują, że metoda lizy komórek może również wpływać na odzyskany proteom. W podanym przykładzie endogenny kompleks białkowy (kompleks NEXT³⁷) poddano wychwytywaniu powinowactwa z cyromielonych lub sonikowanych ekstraktów komórkowych¹⁹. Mniej zanieczyszczeń o dużej masie zaobserwowano, gdy ekstrakt komórkowy został wyprodukowany z kriomielonego proszku komórkowego.

Wyzwaniem przy użyciu przechwytywania powinowactwa do badania endogennych kompleksów białkowych może być trudno odróżnić prawdziwe fizjologiczne interakcje białka będącego przedmiotem zainteresowania od wyników fałszywie dodatnich (FP). FP mogą powstawać z wielu źródeł, w tym z nieswoistej adsorpcji do probówek i naczyń, pożywki powinowactwa, przeciwciała lub ligandu powinowactwa i/lub z samego białka będącego przedmiotem zainteresowania. W związku z tym należy włożyć wiele wysiłku w optymalizację procesu przechwytywania. Wykrywanie FP pozostaje głównym wyzwaniem, dla którego opracowano wiele różnych narzędzi, w tym eksperymentalne^38-40 i podejścia obliczeniowe^41-43, z których każde ma inne zalety i wady. W naszych własnych eksperymentach zauważyliśmy wcześniej wzór wiązania białka FP, uzyskany po inkubacji pożywki magnetycznej α-FLAG z ekstraktami z komórek kontrolnych, który różnił się od wzoru uzyskanego w obecności białek znakowanych 3xFLAG. Co więcej, te FP mogą być uwalniane z pożywki przez inkubację z peptydem^{3xFLAG 7}. Obserwacja ta jest zgodna z oportunistycznym wiązaniem FP z paratopem α-FLAG przy braku pokrewnego epitopu. Zrozumienie natury tego tła FP jest ważne, ponieważ wiele badań wykorzystuje nieoznakowaną "rodzicielską linię komórkową" jako pozorowaną kontrolę wychwytywania powinowactwa; Te kontrole mogą być zatem nieodpowiednie do określenia swoistości interakcji ze znakowanym białkiem. Aby określić wiązanie tła przez nasze pożywkę powinowactwa, gdy paratopy przeciwciał są zajęte lub nie, przeprowadziliśmy eksperymenty z symulowanym wychwytywaniem powinowactwa przy użyciu pożywki magnetycznej α-FLAG i ekstraktów komórkowych HEK 293T (bez ekspresji znakowanego białka) w obecności lub braku kolca peptydu 3xFLAG. Wyniki przedstawiono na rysunku 1, panel II. Krótko mówiąc, pożywkę magnetyczną α-FLAG inkubowano w ekstraktach komórkowych (≳10 mg/ml białka całkowitego) zawierających 500 mM NaCl i 1% v/v Triton X-100 w 20 mM HEPES-Na pH 7,4 przez 30 minut. Pożywkę następnie inkubowano z peptydem 3xFLAG w stężeniu 1 mg/ml w celu konkurencyjnego wyparcia wszelkich białek związanych z paratopem α-FLAG natywnie lub z buforem próbki SDS-PAGE w celu uzyskania elucji denaturującej. Dodatkowo ten sam eksperyment przeprowadzono, gdy ekstrakty komórkowe zostały wzbogacone o 1 μg/ml i 10 μg/ml peptydu 3xFLAG. Wszystkie wymyte frakcje poddano barwieniu SDS-PAGE i srebrem. Zaobserwowaliśmy, że przy braku pokrewnego epitopu, pożywka α-FLAG wychwytuje wykrywalny poziom białek tła, które można eluować peptydem 3xFLAG - w przykładzie dostarczonym przez rysunek 1-II zaobserwowano dominujący gatunek w zakresie od 37 do 50 kDa. Wzór eluowany za pomocą bufora próbki SDS-PAGE był porównywalny, z dodatkowymi wybitnymi gatunkami. Jednak w obecności 1 μg/ml peptydu 3xFLAG, wiązanie FP z pożywką powinowactwa zostało wyeliminowane poniżej poziomu detekcji i nie zaobserwowano go ani w natywnej, ani denaturującej frakcji elucyjnej. Wynik ten sugeruje, że niezajęte paratopy przeciwciał mogą być rozwiązłe przy braku pokrewnego epitopu i znacząco przyczyniać się do proteomu uzyskanego podczas wychwytywania powinowactwa nawet w przypadku przeciwciał, które wiążą swój epitop z wysokim powinowactwem, jak ma to miejsce w przypadku pary 3xFLAG/α-FLAG M2. Zasugerowano również, że bardzo rygorystyczne warunki z użyciem wysokiej zawartości soli, często wybierane w celu złagodzenia niespecyficznego wiązania, mogą być nieskuteczne w przypadku braku interakcji antygen/przeciwciało. W ramach obserwacji przeprowadziliśmy podobny eksperyment, w tym analizę za pomocą SDS-PAGE, a także ilościowe stwardnienie rozsiane (ryc. S1). Spośród 347 białek oznaczonych ilościowo zaobserwowaliśmy, że każde białko z wyjątkiem jednego (wskaźnik fałszywych odkryć = 1%; Tabela S1) była związana z białkiem przynęty oznaczonym 3xFLAG w porównaniu z próbką kontrolną z peptydem 3xFLAG. Wyniki te wskazują, że w naszych eksperymentach przytłaczająca większość obserwowanych białek prawdopodobnie oczyszcza się ze znakowanym białkiem lub są niedocelowymi produktami ubocznymi niezajętych paratopów α-FLAG. Z naszego doświadczenia wynika, że wyniki wychwytywania wysokiego powinowactwa sygnału do szumu są zilustrowane w SDS-PAGE i barwieniu białek przez dyskretny wzór ostrych, obfitych i z grubsza stechiometrycznych pasm, a także niedostatek barwienia tła z innych słabszych pasm; Liczne przykłady tej zasady można zobaczyć w odnośniku¹¹.

Motywem stosowania izolatora z PTFE (który jest zalecany) podczas kriomielenia jest zmniejszenie szybkości nagrzewania się słoika podczas mielenia, zmniejszenie obciążenia powtarzającego się chłodzenia LN₂ podczas procesu mielenia oraz zmniejszenie stopnia tworzenia się lodu w słoiku. Ułatwia to stałą wydajność mielenia i ułatwia obsługę proszku komórkowego. Przykładowe izolatory można znaleźć w odnośniku²⁷ (krążki) i zilustrować na rysunku 2 poniżej (tuleja i krążek).

Rysunek 1: Wybierz reprezentatywne wyniki. (I) Panel ten został zmodyfikowany w stosunku do numeru^{referencyjnego 19}. Coomassie Niebieski barwiony żel poliakryloamidowy SDS. (PO LEWEJ) Kulki magnetyczne w skali mikronowej wykazują mniejsze wiązanie poza celem niż media na bazie agarozy. (A) koraliki magnetyczne; B) agaroza tradycyjna; C) agaroza impregnowana żelazem (magnetyczna); każdy sprzężony z przeciwciałami anty-FLAG M2 i używany do wychwytywania znakowanej FLAG bakteryjnej fosfatazy alkalicznej (BAP; znakowanej) wzbogaconej w ekstrakty wytwarzane z kriomielonych komórek HEK-293. Oczyszczanie na bazie agarozy wykazało wyższy poziom niespecyficznej adsorpcji (nieznakowane pasma). (PO PRAWEJ) Ekstrakty wytwarzane z kriomielonych komórek HeLa wykazują niższą adsorpcję poza celem na kulkach magnetycznych sprzężonych z przeciwciałami niż te wytwarzane przez sonikację, gdy są stosowane do oczyszczania endogennego kompleksu białkowego. 44 RBM7 oznaczony LAP był powinowactwem wychwyconym za pomocą kulek magnetycznych sprzężonych z poliklonalnymi przeciwciałami anty-GFP w celu oczyszczenia kompleksu NEXT^19,37 (D) Ekstrakt wytwarzany z kriomielonego proszku; (E) ekstrakty otrzymywane w wyniku sonikacji nienaruszonych komórek. Pionowy pasek podkreśla obszar żelu, w którym obserwuje się, że niespecyficzne interakcje o dużej masie są wzbogacone w próbce przygotowanej przez sonikację. Czarne strzałki wskazywały oczekiwane konkretne interakcje (oznaczone). Pasma obserwowane ~ 50 kDa na pasach D i E można przypisać ciężkim łańcuchom IgG lamy. (II) Żel poliakrylamidowy SDS barwiony srebrem. (Std.) Próbne wychwytywanie powinowactwa przeprowadzone na ekstraktach komórek HEK-293T w standardowy sposób. Po wychwyceniu elucję związanego materiału uzyskano poprzez (N) elucję niedenaturującą peptydem 3xFLAG lub (D) elucję denaturującą w buforze próbki SDS-PAGE; (PB 1) jako Std., ale peptyd 3xFLAG został włączony do roztworu ekstrakcyjnego w stężeniu 1 μg/ml w celu zablokowania paratopów α-FLAG na podłożu powinowactwa; (PB 10) jako PB 1, ale w obecności 10 μg/ml peptydu 3xFLAG. Znakowane są prążki związane z IgG i peptyd 3xFLAG. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Izolator PTFE z tuleją i krążkiem. Pokazano słoik z PTFE o pojemności 250 ml (1). Słoik do mielenia ze stali nierdzewnej o pojemności 50 ml (2) mieści się w słoiku z PTFE (3) i zapewnia możliwość pozostawienia słoika do mielenia zainstalowanego w młynie między cyklami. Górny krążek izolacyjny z PTFE (2) jest używany między zespołem zacisku a pokrywką słoika. Aby schłodzić zainstalowany słoik i zespół izolatora (3), LN₂ dodaje się bezpośrednio do korpusu izolatora, otaczającego słoik. Następnie można rozpocząć kolejny cykl mielenia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Odczynnik	Sugerowane stężenie	Notatki
chlorek sodu	0,1-0,5 mln	Wysokie stężenia (>300 mM) mają tendencję do poprawy ekstrakcji białka całkowitego i utrzymywania tła na niskim poziomie, ale mogą usunąć niektóre stabilne interaktory. Stężenia poniżej 150 mM zazwyczaj nie są skuteczne w redukcji niespecyficznego tła.
Octan amonu	0,2-2 mln	Sól składająca się z dwóch, która daje roztwór o neutralnym pH57. Wyższe stężenia stabilizują niektóre kompleksy białkowe. Kwaśne roztwory mogą powstawać w wyniku starych, niewłaściwie przechowywanych zapasów krystalicznych z powodu utraty amoniaku. Nie są wymagane żadne dodatkowe pH ani sole w ekstraktorach zawierających octan amonu. Może być łączony z NaCl w celu modulacji uzyskanych wyników.
Animacja 20	0,1% v/v	Niejonowy detergent58; zwykle w połączeniu z NaCl.
Tryton X-100	0,5-1% v/v	Detergent niejonowy58; zwykle w połączeniu z NaCl lub NH4CH3CO2H
Żuchwy	5 mM	Detergent ootterionowy58; zwykle w połączeniu z NaCl.
Sarkosyl	1 mM	Anionowy detergent58, który redukuje tło i może usuwać stabilne złożone składniki, potencjalnie ujawniając połączenia binarne; zwykle w połączeniu z NaCl.
Tris-Cl	20 mM	pKa 8,8 przy 4 °C, 8,1 przy 25 °C.
	(pH 8,0)
HEPES-Na	20 mM	pKa 7,8 w 4 °C, 7,5 w 25 °C. NaOH lub KOH używane do równoważenia pH w zależności od soli (np. NaCl, KCl lub CH3CO2K) użytej w ekstrahencie.
	(pH 7,4)

Tabela 1: Kilka sugerowanych odczynników przydatnych do oczyszczania kompleksów białkowych. W tej tabeli wymieniono niektóre odczynniki, które uznaliśmy za przydatne do oczyszczania kompleksów białkowych z ludzkich linii komórkowych, z sugerowanymi stężeniami roboczymi. Typowy preparat ekstrahentu zawiera bufor pH, sól i detergent^{1,11,24,45-48}. Najlepszą praktyką jest zidentyfikowanie najmniej złożonej kombinacji odczynników, która daje pożądany wynik.

Rysunek S1: Mieszanie po oczyszczeniu (MAP-) Analiza SILAC wyników fałszywie dodatnich. ja. Schemat ideowy: W tym eksperymencie kompleksy białkowe ORF2p znakowane 3xFLAG (wyrażone z pLD401) zostały oczyszczone odpowiednio z ciężkich i znakowanych światłem komórek HEK-293T⁷. Znakowany światłem ekstrakt komórkowy został wzbogacony peptydem 3xFLAG, aby zapobiec wychwytywaniu powinowactwa ORF2p znakowanego 3xFLAG przez konkurencyjne hamowanie; Nie oczekuje się, że zablokuje to wiązanie białek, które mogą występować nieswoiście z podłożem magnetycznym lub nieparatopowymi strukturami przeciwciała. Po wyelucji z kulek magnetycznych, ciężkie i lekkie próbki zmieszano po oczyszczeniu i przeanalizowano za pomocą ilościowego MS (MAP-SILAC³⁹) w celu określenia frakcji białek związanych z którąkolwiek próbką; szczegółowe informacje metodologiczne znajdują się w tabeli S1. II. Żel barwiony srebrem, ilustrujący, że materiały znakowane światłem i ciężkością dają porównywalne wyniki (porównaj L z H) oraz że oczyszczanie przeprowadzone w obecności kolca 3xFLAG (LI) było konkurencyjnie hamowane. Poniżej znajduje się barwiony korek żelowy Coomassie Blue G-250 składający się z mieszanych frakcji H i Li, przed analizą proteomiczną na bazie żelu, jak opisano w tabeli S1. Kliknij tutaj, aby pobrać większą wersję tego rysunku.

Tabela S1: MAP-SILAC. Arkusz ten zawiera dane uzyskane podczas wykonywania eksperymentu MAP-SILAC opisanego na rysunku S1. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Dyskusja

Te trzy protokoły działają w tandemie, aby (1) przygotować komórki do uszkodzenia w stanie stałym przez kriomielenie, (2) osiągnąć pęknięcie w planetarnym młynie kulowym i (3) wyprodukować ekstrakty z proszku komórkowego do wychwytywania białka będącego przedmiotem zainteresowania kompleksem z jego fizjologicznymi interaktorami. Istnieje wiele różnych technik lizy komórek, w tym podejścia mechaniczno-fizyczne wykorzystujące zgniatanie, ścinanie i/lub nacisk, a także podejścia chemiczne/enzymatyczne, z których każda ma inne zalety i wady^49,50. Każdy badacz jest zachęcany do zbadania metod najbardziej odpowiednich dla jego analiz, mając na uwadze, że każde wybrane podejście do rozbijania komórek i ekstrakcji białek prawdopodobnie wprowadzi błędy^51,52 wymagające optymalizacji empirycznej (omówione poniżej). Metody mechaniczne mogą wytwarzać wysokie temperatury i/lub siły ścinające, które mogą rozbijać kompleksy białkowe. Kriomielenie pozwala uniknąć efektów ogrzewania dzięki zastosowaniu chłodzenia próbek LN₂ na czas trwania procesu. Uważa się, że planetarne młyny kulowe opierają się na siłach uderzenia i tarcia, w tym naprężeniach ścinających, jako składnikach redukcji wielkości cząstek^53,54. W opisanych ustawieniach nie zaobserwowano degeneracji kompleksów białkowych. Rzeczywiście, wyekstrahowaliśmy i odzyskaliśmy pozornie nienaruszone kompleksy porów jądrowych ~50 MDa¹¹ i enzymatycznie aktywne retrotranspozony wykazujące wyższą aktywność właściwą niż preparaty wykorzystujące "delikatną" lizę na bazie detergentów⁷. Chemiczne/enzymatyczne metody lizy komórek mają to do siebie, że zawartość komórki jest uwalniana do środowiska in vitro , które wspomaga rozerwanie błon komórkowych i makrocząsteczek strukturalnych, ale może nie być odpowiednie do utrzymania integralności kompleksu białkowego (kompleksów) białkowego(-ych) będącego przedmiotem zainteresowania. Często ani składniki kompleksów utworzonych z białka będącego przedmiotem zainteresowania, ani warunki potrzebne do stabilizacji docelowych kompleksów nie są znane z góry. Główną zaletą mielenia w stanie stałym jest to, że pękanie i ekstrakcja są rozłączone, co pozwala na przygotowanie materiału źródłowego bez dodatku cieczy, przechowywanie (w temperaturze -80 °C lub niższej), gromadzenie i wygodne pobieranie do eksperymentów na żądanie; Na przykład w celu zbadania zoptymalizowanych warunków in vitro do wychwytywania powinowactwa. Interakcje białkowe są najbardziej stabilne przy wysokim stężeniu^55,56, dlatego minimalizacja objętości ekstrahentu może być korzystna dla zachowania interakcji fizjologicznych. Z drugiej strony istnieją względy praktyczne - kompleksy białkowe muszą zostać wydzielone z komórek i trafić do nielepkiej fazy wodnej, wolnej od nierozpuszczalnych agregatów, w celu wymieszania docelowych kompleksów z pożywką powinowactwa. Ponadto do usystematyzowania i odtwarzalności potrzebna jest pewna standaryzacja i kontrola środowiska in vitro (pH, stężenie soli itp.). Stwierdzamy, że ekstrakty wytwarzane w zakresie rozcieńczeń 1:4-1:9 (w:v) spełniają wymagania praktyczne i teoretyczne, dając wyniki wysokiej jakości. Dodatkowo należy określić optymalną proporcję ekstraktu komórkowego do pożywki powinowactwa. Odbywa się to empirycznie poprzez miareczkowanie ekstraktów o różnej ilości pożywki o powinowactwie i może mieć wykrywalny wpływ na stosunek sygnału do szumu w eksperymencie, omówiony poniżej. Doskonałe zubożenie białka docelowego wynosi zwykle ≥70% rozpuszczalnej frakcji białka docelowego, ale >90% jest pożądane i może być osiągalne przy starannej parametryzacji warunków ekstrakcji. Wiele takich praktycznych rozważań omówiono w odnośniku¹. Kulki paramagnetyczne są manipulowane za pomocą magnesów neodymowych w specjalistycznym uchwycie probówki do mikrowirówki, chociaż opłacalne są domowe alternatywy. Po umieszczeniu w uchwycie koraliki zbierają się z boku rurki pod wpływem pola magnetycznego. Roztwory można następnie usunąć bez naruszania kulek.

Jednym z ograniczeń przedstawionego protokołu kriomielenia, opracowanego z użyciem planetarnego młyna kulowego (patrz tabela materiałów), jest to, że do skutecznego mielenia i odzyskiwania proszku komórkowego za pomocą tego urządzenia wymagana jest minimalna ilość materiału (>1 g). Takie ilości można łatwo uzyskać za pomocą wielu drobnoustrojów, linii komórkowych i organizmów modelowych, a często można je również uzyskać za pomocą tkanek wyciętych ze zwierząt laboratoryjnych. Jednak niektóre linie komórkowe mogą być bardzo trudne do wyhodowania w obfitości, a tkanki zwierzęce mogą być rzadkie. Mniejsze ilości materiału można w porównywalny sposób zmielić za pomocą innych urządzeń wykorzystujących mniejsze pojemniki, choć potencjalnie kosztem osiągniętego rozdrobnienia proszku. Ponadto koszt mechanicznych urządzeń do mielenia może być zbyt wysoki dla niektórych laboratoriów. Kriomielenie można osiągnąć przy użyciu wielu alternatywnych konfiguracji^14-19, w tym, najtańszego, ręcznego przy użyciu tłuczka i moździerza, chociaż wydajność pękania znacznie spada. Protokoły wychwytywania powinowactwa zazwyczaj mają na celu wysoką wydajność lizy komórek, aby ułatwić maksymalną ekstrakcję białka do roztworu, a tym samym maksymalny potencjał wychwytywania docelowych kompleksów białkowych. Z drugiej strony, w przypadku ekstraktów z drożdży do splicingu in vitro , wykazano, że maksymalna liza może nie być równoznaczna z maksymalną aktywnością biochemiczną in vitro ^57,58. Nie zaobserwowaliśmy takich problemów w testowanych przez nas do tej pory systemach, dlatego nie ograniczamy celowo pękania naszych komórek podczas kriomielenia. Niemniej jednak należy pamiętać o tej możliwości przy optymalizacji testów enzymatycznych in vitro . Chociaż kriomielenie jest wysoce skuteczną metodą rozbijania komórek, ograniczona ilość sonikacji często korzystnie wpływa na produkcję jednorodnych ekstraktów z całych komórek z tkanek ssaków, ponieważ niejednorodne agregaty można czasami zaobserwować podczas oględzin: zwykle w warunkach ekstrakcji przy użyciu niskich lub umiarkowanych stężeń soli (100-300 mM) i niejonowego detergentu (0,1-1% v/v). Ponieważ zaobserwowaliśmy, że obecność tych agregatów może zmniejszyć wydajność i/lub jakość późniejszego wychwytywania powinowactwa, rutynowo wdrażamy sonikację w celu ich rozproszenia (nawet jeśli nie są one obserwowane gołym okiem). Agregaty są zgodne ze zglomerowanymi fragmentami błony, porównywalnymi do tych wcześniej opisywanych w ekstraktach ze zmielonych komórek drożdży⁵⁸. Sonikacja jest również stosowana w niektórych protokołach do ścinania DNA i uwalniania fragmentów chromatyny do roztworu, jednak stopień sonikacji zastosowany w tym protokole nie powoduje znacznej fragmentacji DNA. Kolejną przeszkodą może być ograniczona dostępność (lub wysoki koszt) doskonałego liganda lub przeciwciała o powinowactwie przeciwko konkretnemu białku będącemu przedmiotem zainteresowania. Szeroka gama dostępnych na rynku odczynników powinowactwa może być wykorzystana, gdy organizm modelowy jest podatny na znakowanie genomowe lub transfekcję z ektopowymi wektorami ekspresyjnymi, co pozwala na ekspresję białek będących przedmiotem zainteresowania jako fuzje znakowane powinowactwem. Jednak produkcja niestandardowych przeciwciał staje się coraz bardziej wykonalna, a zarówno przeciwciała poliklonalne, jak i monoklonalne mogą doskonale sprawdzać się w zastosowaniach związanych z wychwytywaniem powinowactwa. Te liczne rozważania są również omówione bardziej szczegółowo w odnośniku¹.

Przykłady tego, w jaki sposób metoda lizy komórek i wybór pożywki o powinowactwie mogą wpływać na wyniki, przedstawiono na rysunku 1. Przykłady efektów wywieranych przez różne ekstraktory można zobaczyć w piśmiennictwie^1,11,24. Ponieważ te i inne parametry eksperymentalne wpływają na jakość wychwytywania powinowactwa, co utrudnia rozróżnienie FP, opracowano repozytoria "proteomów koralików" i podejścia obliczeniowe do eliminacji niespecyficznych zanieczyszczeń, aby pomóc w identyfikacji FP^40-43. Niemniej jednak takie podejścia jedynie w ograniczonym stopniu zastępują optymalne przygotowanie próbki⁵⁹. Przestrzeganie najlepszych praktyk i empiryczna optymalizacja eksperymentu z przechwytywaniem powinowactwa zapewni najwyższej jakości próbki do dalszych analiz, które zostaną omówione poniżej. Łatwą do wdrożenia praktyką, która może poprawić czystość próbki, jest elucja natywna. Elucja natywna jest najczęściej stosowana w celu uzyskania izolowanego kompleksu białkowego powinowactwa, w stanie nienaruszonym, do dalszych eksperymentów; Ponieważ jednak często zwiększa czystość próbki, może być również stosowany tylko z tego powodu. Jednak, jak wykazano na rysunku 1, panel II, zdolność natywnej elucji do poprawy czystości próbki może zależeć od dokładnego miareczkowania ilości pożywki o powinowactwie do obfitości białka docelowego w ekstrakcie komórkowym - gdy pożywka jest w nadmiarze, niezajęte paratopy mogą pozwolić na akumulację białek FP poza celem obserwowanych we frakcjach natywnie eluowanych. Korzystając z opisanych tutaj odczynników i procedur, z naszego doświadczenia wynika, że największym pojedynczym czynnikiem przyczyniającym się do FP w naszych eksperymentach jest samo oznakowane białko po usunięciu z kontekstu żywej komórki. (Rys. 1.II i Rys. S1). W takich przypadkach kontrole rodzicielskiej linii komórkowej, które dają nieistotne proteomy przy braku antygenu, nie mają praktycznej wartości; Podobnie jest w przypadku kontroli tylko znaczników lub skoków, które są pozbawione czegokolwiek poza antygenem docelowym. Dlatego tam, gdzie jest to możliwe, wdrażamy I-DIRT^7,38, który bezpośrednio mierzy akumulację interakcji białek po lizie za pomocą ilościowego MS. Jak wspomniano w kroku 3.2.7 protokołu, procedury elucji natywnej będą się różnić w zależności od szczegółów zastosowanego systemu powinowactwa. Elucja natywna jest najczęściej osiągana przez konkurencyjne przemieszczenie znakowanego kompleksu białkowego lub proteolityczne rozszczepienie znacznika, uwalniając kompleks z pożywki powinowactwa. Istnieje kilka systemów powinowactwa składających się z małych znaczników epitopów, dla których sam epitop jest dostępny jako peptyd przydatny do konkurencyjnej elucji znakowanych kompleksów białkowych⁶⁰. Podobnie, dostępnych jest kilka proteaz, które specyficznie rozszczepiają pokrewne miejsca strategicznie umieszczone w białkach fuzyjnych oznaczonych powinowactwem⁶¹. W zależności od specyfiki wybranych systemów powinowactwa można przyjąć odpowiedni schemat elucji.

Ogólnie rzecz biorąc, jakość uzyskanych wyników będzie miała znaczący wpływ na jakość przygotowania próbki. Ważne jest, aby pracować ostrożnie i precyzyjnie na każdym etapie tych protokołów i tak szybko, jak to możliwe, zachowując ostrożność i precyzję. Wskazane jest śledzenie partycjonowania białka będącego przedmiotem zainteresowania na każdym etapie, aby zrozumieć skuteczność każdej manipulacji. Na przykład: jak obfite jest białko będące przedmiotem zainteresowania w danej komórce lub tkance? Być może badane białko (i jego kompleksy) będzie trudne do scharakteryzowania za pomocą spektrometrii mas ze względu na niską liczebność. Jeśli oczyszczone kompleksy są wykrywalne przez ogólne barwienie białek (zakres około nanogramów), spektrometria mas prawdopodobnie zakończy się sukcesem. Jeśli wychwycone białko będące przedmiotem zainteresowania można wykryć tylko za pomocą czułego, wzmocnionego chemiluminescencyjnego western blot (w przybliżeniu zakres pikogramów), spektrometria mas jest mniej skuteczna. Nawet jeśli interesujące białko występuje obficie w komórce, jak obfite jest w wyprodukowanym ekstrakcie komórkowym? Czy białko dzieli się na roztwór, czy jest w osadzie? W tym drugim przypadku można opracować nowe rozwiązanie ekstrakcyjne, które może poprawić regenerację. Po połączeniu ekstraktu komórkowego z pożywką powinowactwa, jak skutecznie wychwytywane jest białko? Czy białko pozostaje związane przez kolejne płukania? A co z innymi białkami oczyszczającymi? Zapisując podwielokrotność każdej próbki na odpowiednich etapach protokołu, można łatwo odpowiedzieć na te pytania, zazwyczaj poprzez western blot na białku będącym przedmiotem zainteresowania lub ogólne barwienie białek, ale inne testy mogą być również odpowiednie. Optymalizacja każdego kroku zwiększy wydajność i czystość wychwytywanych kompleksów, chociaż może istnieć kompromis, który należy osiągnąć w maksymalizacji jednego lub drugiego atrybutu.

Typowym zastosowaniem wychwytywania powinowactwa dla wielu badaczy jest identyfikacja potencjalnych interaktorów in vivo dla niewielkiej liczby białek będących przedmiotem zainteresowania; Kandydaci ci są zwykle poddawani walidacji za pomocą podejść ortogonalnych in vivo w celu wykazania biologicznego znaczenia interakcji fizycznych. Wychwytywanie powinowactwa jest również wykorzystywane w badaniach wysokoprzepustowych do generowania list białek kooczyszczających obserwowanych na podstawie (prawie) całego proteomu, ułatwiając wnioskowanie obliczeniowe dotyczące przypuszczalnych kompleksów in vivo . W literaturze można znaleźć liczne przykłady takich badań. W tym podejściu rezygnuje się z optymalizacji warunków chwytania dla danego celu na rzecz eksploracji wielu celów; W związku z tym same wywnioskowane kompleksy rzadko są odzyskiwane w pełni nienaruszone i wysoce czyste w danej próbce. Częściowe nakładanie się kompozycji obserwowane między wieloma odrębnymi próbkami uchwyconymi pod względem powinowactwa jest raczej wykorzystywane jako podstawa wniosków⁴². Oba podejścia wnoszą cenne dane do naszego zrozumienia interaktomii. Niemniej jednak jedną z głównych zalet wychwytywania powinowactwa jest to, że często daje ono możliwość uzyskania kompleksów w stanie nienaruszonym i wysoce oczyszczonym, pod warunkiem, że dołoży się starań w celu optymalizacji procedury. Wierzymy, że przyszłość tego podejścia leży w zwiększeniu łatwości i efektywności optymalizacji wychwytywania endogennych kompleksów białkowych¹¹, w celu dokładniejszej oceny gamy fizjologicznych interaktorów i częstszego stosowania w dalszych badaniach biochemicznych, enzymologicznych i strukturalnych, np. Piśmiennictwo ^7,9,23.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Pożywki wzrostowe i przyrządy do hodowli komórek Do			produkcji zamrożonych komórek (I)
500 cm2 naczyń	hodowlanych Corning	431110	Do produkcji zamrożonych komórek (I)
Duża zlewka (1-2 L)			produkcji zamrożonych komórek (I)
Prostokątna miska lodowa	Fisher Naukowy	13-900-747	Do produkcji zamrożonych komórek (I) i kriomielenia (II)
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)			Do produkcji zamrożonych komórek (I)
Skrobaki do dużych komórek	Fisher Scientific	08-100-242	Do wytwarzania zamrożonych komórek (I)
Ciekły azot			Do wytwarzania zamrożonych komórek (I), kriomielenia (II) i wychwytywania powinowactwa (III)
Probówki stożkowe 50 ml	Corning	352098	Do wytwarzania zamrożonych komórek (I) i kriomielenia (II)
Strzykawka typu Luer lock 20 ml Do			produkcji zamrożonych komórek (I)
Nasadki do strzykawek Leur lock	www.dymax.com	T11182	Do produkcji komórek zamrożonych (I)
Chłodzone Wirówka			Do produkcji zamrożonych komórek (I)
Stojak na probówki 50 ml, 4 pozycje			Do wytwarzania zamrożonych komórek (I), kriomielenie (II) i wychwytywanie powinowactwa (III)
Pudełko			Do produkcji zamrożonych komórek (I), kriomielenia (II) i wychwytywania powinowactwa (III)
Planetarny młyn kulowy, PM 100	Retsch	20.540.0001	Do kriomielenia (II)
Słoik do mielenia ze stali nierdzewnej, 50 ml	Retsch	01.462.0149	Do kriomielenia (II)
Kule do mielenia ze stali nierdzewnej, 20 mm i Oslash;	Retsch	05.368.0062	Do kriomielenia (II)
Uszczelka pokrywy: Uszczelka sprężynowa w obudowie PFA, 2,62 mm 44,63 mm	www.marcorubber.com	T1044-2,62x44,63	Do kriomielenia (II)
karafka mini-LN2	domowej roboty	patrz nr ref. 19	Do kriomielenia (II)
Izolator słoików z PTFE o pojemności 250 ml (opcjonalnie)	domowej roboty	Uniwersytet Rockefellera	Do kriomielenia (II); może być wyprodukowany przez The Rockefeller University High Energy Physics Instrument Shop lub dostarczone plany projektowe, na życzenie
Izolator krążka PTFE (opcjonalnie)	domowej roboty	Uniwersytet Rockefellera	Do kriofrezowania (II); może być wyprodukowany przez The Rockefeller University High Energy Physics Instrument Shop lub dostarczone plany projektowe na życzenie.
Zawór bezpieczeństwa 5 bar/500 kPa (opcjonalnie)	Zawór zwrotny serii http://www.leeimh.com/ 558	Do kriomielenia (II)
Probówki do mikrofugi 1,5-2 ml Do			wychwytywania powinowactwa (III)
Ekstrahent			Do wychwytywania powinowactwa (III)
Kompletne tabletki koktajlowe z inhibitorem proteazy bez EDTA	Applied Science	11873580001	Do wychwytywania powinowactwa (III)
Mieszalnik			Do wychwytywania powinowactwa (III)
Wiadro			Do wychwytywania powinowactwa (III)
Sonikator z mikrokońcówką, Q700	Qsonica	Q700	Do wychwytywania powinowactwa (III)
Sonda mikrokońcówkowa 1/16" o niskiej intensywności	Qsonica	4717	Do wychwytywania powinowactwa (III)
Mikrowirówka		stołowa z chłodzeniem	Do wychwytywania powinowactwa (III)
Dynabeads M-270 Epoxy	Thermo Fisher	14302D	Do wychwytywania powinowactwa (III)
Przeciwciało lub ligand powinowactwa sprzężony z Dynabeads	domowej roboty		Do wychwytywania powinowactwa (III); patrz odniesienie 19
Rotator próbek			Do wychwytywania powinowactwa (III)
Magnes neodymowy	Life Technologies	123-21D	Do przejmowania powinowactwa (III)
Bufor do próbek SDS-PAGE (bez środka redukującego)			Do wychwytywania powinowactwa (III)
DTT			Do wychwytywania powinowactwa (III)
System			Do wychwytywania powinowactwa (III)
Żel			Do wychwytywania powinowactwa (III)
Barwnik			Do wychwytywania powinowactwa (III)