Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Manipulacja genetyczna patogenu roślinnego Ustilago maydis w celu zbadania biologii grzybów i interakcji mikroorganizmów roślinnych

14.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54522

⸱

30 września 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Microbiology, Heinrich-Heine University Düsseldorf, 2Bioeconomy Science Center (BioSC), 3Department of Genetics, Institute of Applied Biosciences, Karlsruhe Institute of Technology, 4Cluster of Excellence in Plant Sciences (CEPLAS), Heinrich-Heine University Düsseldorf

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy solidną strategię wymiany genów w celu genetycznego manipulowania grzybem Ustilago maydis. Ten protokół wyjaśnia, jak generować mutanty delecji w celu zbadania fenotypów infekcji. Można go rozszerzyć o modyfikację genów w dowolny sposób, np. poprzez dodanie sekwencji kodującej znacznik białka fluorescencyjnego.

Streszczenie

Delecja genu odgrywa ważną rolę w analizie funkcji genu. Jedną z najskuteczniejszych metod zakłócania genów w sposób ukierunkowany jest zastąpienie całego genu selektywnym markerem w drodze rekombinacji homologicznej. Podczas rekombinacji homologicznej zachodzi wymiana DNA między sekwencjami o dużym podobieństwie. W związku z tym liniowe sekwencje genomowe otaczające gen docelowy mogą być wykorzystane do specyficznego skierowania wybieralnego markera do pożądanego miejsca integracji. końce konstruktu delecji aktywują systemy naprawy DNA komórki, a tym samym sprzyjają integracji konstruktu poprzez rekombinację homologiczną lub łączenie końców niehomologicznych. W organizmach z wydajną rekombinacją homologiczną wskaźnik udanej delecji genu może osiągnąć ponad 50%, co czyni tę strategię cennym systemem rozrywania genów. Grzyb smutku Ustilago maydis jest modelowym mikroorganizmem eukariotycznym wykazującym tak wydajną rekombinację homologiczną. Spośród około 6900 genów, wiele zostało funkcjonalnie scharakteryzowanych za pomocą mutantów delecyjnych, a powtarzające się niepowodzenia prób wymiany genów wskazują na podstawową funkcję genu. Późniejsza charakterystyka funkcji genu poprzez znakowanie markerami fluorescencyjnymi lub mutacjami przewidywanych domen również opiera się na wymianie DNA poprzez rekombinację homologiczną. W tym miejscu szczegółowo przedstawiamy strategię generowania szczepu U. maydis na najprostszym przykładzie, jakim jest delecja genu.

Wprowadzenie

Ustilago maydis to fitopatogenny grzyb modelowy, który był intensywnie badany przez dziesięciolecia 1,2. Występuje w dwóch morfologiach, stadium drożdżopodobnym, niepatogennym i nitkowatej, zakaźnej formie 3. Uniwersalne przełomowe odkrycia, takie jak rekombinacja homologiczna i mechanizmy naprawy DNA, zostały dokonane w drożdżopodobnym stadium wzrostu tego grzyba 4. Ponadto dobrze scharakteryzowano morfologiczne przełączenie na filament zakaźny i czynniki wirulencji ważne dla infekcji 5,6. Rosnąca wiedza molekularna na temat biologii i zjadliwości tego grzyba głowni opiera się na prostej strategii wymiany genów 7-9 popartej doskonałą adnotacją genomu 10 oraz łatwości genetyki odwrotnej przy użyciu np. dobrze zorganizowanej kolekcji plazmidów w naszym instytucie (http://www.mikrobiologie.hhu.de/ustilago-community.html). Standaryzowane, szybkie testy infekcji w siewkach kukurydzy pozwalają na szczegółowe badania czynników chorobotwórczości 11.

Genom U. maydis zawiera około 6 900 genów 10. Aby zbadać ich funkcję, można je usuwać pojedynczo lub w połączeniu dzięki wydajnemu systemowi rekombinacji homologicznej. Obszary flankujące o długości około 1 kb zawierające idealnie homologiczne końce są idealne dla szybkości rekombinacji homologicznej większej niż 50%, ale już 250 pz z niehomologicznymi końcami pozwala na pewien stopień poprawnej integracji konstruktu 9. Obecnie do selekcji transformantów 7,9 stosuje się pięć różnych kaset oporowych, hygR, cbxR, natR, G418R i fleoR pośredniczących w oporności na higromycynę, karboksynę, nourseotrycynę, G418 i fleomycynę. Ponadto oporność na higromycynę została opracowana w kasecie nadającej się do recyklingu (FRT-hygR), która może być usunięta przez przejściową ekspresję heterologicznej rekombinazy FLP 12. Pozwala to na usunięcie kasety oporowej, a tym samym teoretycznie nieograniczone modyfikacje genetyczne. Fleomycyna jest mutagenna 13, tak więc w przypadku nowych kaset, w szczególności kasety hygR nadającej się do recyklingu, stosowanie fleoR maleje. Poczwórne mutanty można zatem wytworzyć przy użyciu pozostałych czterech kaset, ale w przypadku mutantów pięciokrotnych zalecany jest system FRT-hygR 14.

Ta ogólna strategia delecji genów została pomyślnie przeniesiona na inne grzyby smutne, takie jak Sporisorium reilianum 15, U. hordei 16 lub U. esculenta 17 i dlatego oferuje potencjał do dalszych zastosowań w organizmach jeszcze genetycznie nierozwiązywalnych z wydajnym systemem rekombinacji homologicznej. Co więcej, organizmy pozbawione rekombinacji homologicznej mogą być modyfikowane w celu poprawy inżynierii genetycznej, czego przykładem jest delecja genów zaangażowanych w niehomologiczne łączenie końców u Neurospora crassa 18,19.

Tutaj opisujemy opublikowaną strategię delecji genu dla U. maydis 7,9 w szczegółach eksperymentalnych, koncentrując się na szybkiej i dokładnej weryfikacji kandydatów. Jako przykład używamy chitynaz grzybów i przedstawiamy generowanie pojedynczych mutantów, a także szczepów z wielokrotną delecją 20,21. Chitynazy są ciekawymi przykładami, ponieważ działają na chitynę w sztywnej ścianie komórkowej. Przebudowa ściany komórkowej jest wymagana do zmian morfologicznych podczas podziału komórki, przejścia na wzrost nitkowaty i tworzenia zarodników. W związku z tym w przypadku mutantów delecyjnych można spodziewać się fenotypów w całym cyklu życia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Generowanie konstrukcji usuwających

  1. Wygeneruj plazmid zawierający konstrukt delecji (rysunek 1) składający się z odpowiedniej flanki 1 kb w górę (UF) i w dół (DF) oraz odpowiedniej kasety oporowej otoczonej miejscami ograniczenia cięcia.
    UWAGA: Można zastosować dowolną strategię klonowania (dla klonowania patrz odniesienie 22) zalecamy klonowanie Golden Gate dla takich plazmidów 9.
  2. Wyciąć konstrukt delecji z plazmidu za pomocą noża, aby uzyskać 1 μg DNA konstruktu delecji 9. Oczyść konstrukt delecji w celu wyeliminowania enzymu i buforu 22, np. przy użyciu dostępnych w handlu odczynników i postępuj zgodnie z instrukcjami producenta.
    UWAGA: Szkielet wektora może pozostać w mieszaninie transformacyjnej.

2. Przygotowanie protoplastów

UWAGA: Utrzymuj sterylne warunki przez cały czas trwania eksperymentu. Ściana komórkowa stanowi silną barierę ochronną, która ogranicza dostęp cząsteczek do błony komórkowej. Aby umożliwić wychwyt DNA zawierającego konstrukt delecji, ściana komórkowa musi zostać usunięta przez enzymy rozkładające ścianę komórkową w reakcji protolastowej. Krytycznymi etapami przygotowania protoplastów są: 1) stabilizacja osmotyczna pożywki i 2) unikanie naprężeń mechanicznych na protoplastach.

  1. Oznaczyć probówki o pojemności 2 ml okrągłym dnem, aby zamrozić protoplasty i schłodzić je w temperaturze -20 °C. Rozpocząć hodowlę wstępną w 3 ml YEPS-Light ze świeżej płytki szczepu o pożądanym tle genetycznym. Inkubować na obracającym się kole przez 24 godziny w temperaturze 28 °C.
    UWAGA: Szczep może być solopatogennym szczepem SG200 10, szczepami typu dzikiego, szczepami testowymi, takimi jak AB33 23, lub dowolnym zmutowanym tłem do generowania podwójnych mutantów. Upewnij się, że odmiana jest wolna od pożądanego oporu.
  2. Rozcieńczyć kulturę w 50 ml YEPS-Light w kolbie z przegrodami i inkubować na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze 28 °C z prędkością 200 obr./min.
    UWAGA: Czas podwojenia wynosi około 2 godzin dla odmian typu dzikiego. Zezwalaj na co najmniej trzy duplikaty.
  3. Rosną aż do fazy wykładniczej. Upewnij się, że gęstość optyczna, mierzona przy długości fali 600 nm (OD600), wynosi około 0,8 (dopuszczalne jest 0,6 do 1,0). OD600 1,0 odpowiada około 1 do 2 x 107komórek U. maydis na ml.
  4. Sprawdź komórki pod kątem zanieczyszczeń pod mikroskopem. Użyj 40-krotnego powiększenia. Komórki pełnej kultury o pojemności 50 ml osadzać przez 5 minut, 1 500 x g i odrzucić supernatant. Zawiesić osad w 25 ml cytrynianu sodu, roztworu sorbitolu (SCS), odwirować 5 minut, 1 500 x g i odrzucić supernatant.
    UWAGA: Zanieczyszczenia bakteryjne można zidentyfikować jako małe i często poruszające się komórki. Zanieczyszczenia grzybicze można zidentyfikować na podstawie innego kształtu lub wielkości komórek w porównaniu z komórkami w kształcie cygara U. maydis.
  5. Podczas wirowania przygotować roztwór protoplastowy (12,5 mg/ml enzymów lizujących Trichoderma, w SCS; przygotować 3 ml na komórkę; przefiltrować wysterylizować przez filtr 22 μm; roztwór musi być świeży, aby uzyskać optymalną aktywność enzymatyczną). SCS jest stabilizatorem osmotycznym zapobiegającym pękaniu protoplastu po usunięciu ściany komórkowej.
  6. Zawiesić osad w 2 ml roztworu protoplastowego. Inkubować przez 5 do 20 minut w temperaturze pokojowej i sprawdzić pod mikroskopem, aż 30 do 40% komórek będzie okrągłych lub przypominających główki od szpilek (ryc. 2).
    UWAGA: Od teraz wykonuj wszystkie kroki na lodzie i ostrożnie obchodź się z protoplastami!
  7. Przemyć 3x w 10 ml zimnego (4 °C) SCS, odwirować przy 1.000 x g przez 5 min.
  8. Zawiesić osad w 10 ml zimnego sorbitolu, TrisHCl, roztworu CaCl2 (STC), wirować w temperaturze 1 000 x g przez 5 minut, odrzucić supernatant. Zawiesić osad w 1 ml zimnego STC, zrobić 100 μl porcji w schłodzonych probówkach. Zamrozić podwielokrotności w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia.

3. Transformacja U. maydis

UWAGA: Transformacja protoplastów U. maydis opiera się na metodzie przemiany za pośrednictwem glikolu polietylenowego (PEG), która jest technicznie prosta i w przeciwieństwie do elektroporacji czy transformacji biolistycznej nie wymaga specjalistycznego sprzętu.

  1. Przygotować dwuwarstwowe płytki selekcyjne (2 płytki na reakcję przemiany). Dolna warstwa zawiera antybiotyk w podwojonym stężeniu. Odmierzyć pipetą 12 ml RegLight zawierającego 400 μg/ml higromycyny (lub 300 μg/ml nourseotrycyny lub 4 μg/ml karboksynany lub 1 mg/ml G418) na płytkę Petriego. Unikaj bąbelków.
    UWAGA: Płyty dolnej warstwy mogą być przechowywane przez kilka dni w temperaturze 4 °C, ale górną warstwę należy przygotować na świeżo podczas przemiany (patrz poniżej).
  2. Rozmrozić protoplasty na lodzie (1 probówka/transformacja). Dodać 1 μl heparyny (15 mg/ml). Dodać 1 μg DNA (konstrukt linearyzowany) lub 10 μlH2O(kontrola wody). Inkubować przez 10 minut na lodzie.
  3. W tym czasie na górną warstwę rozprowadzić 12 ml upłynnionego RegLight (zagotować i schłodzić do 60 °C) na dolnej płytce RegLight.
    UWAGA: Ta warstwa nie zawiera antybiotyków.
  4. Dodać 500 μl STC/PEG (glikolu polietylenowego) do probówki transformacyjnej (3.2) i dokładnie wymieszać, odwracając probówkę. Inkubować 15 minut na lodzie.
  5. Rozprowadź każdą reakcję przemiany na dwóch dwuwarstwowych płytkach RegLight. Rozprowadź ostrożnie i powoli szklaną pipetą. Inkubować płytki w pozycji pionowej w temperaturze 28 °C przez 5 do 7 dni, aż transformanty wyrosną jako kolonie. Zdobądź około 100-200 kolonii na talerzu.
    UWAGA: Niższe liczby mogą być spowodowane przez "złe" protoplasty, które albo zawierają zbyt dużo ściany komórkowej i dlatego nie mogą pobierać DNA, albo nie mogą się regenerować. Te pierwsze można testować przez transformację z samoreplikującym się plazmidem, drugie przez testowanie regeneracji na płytkach bez antybiotyków.
  6. Przygotować płytki YEPS-Light zawierające odpowiedni antybiotyk o stężeniu 200 μg/ml higromycyny (lub 150 μg/ml nourseotrycyny lub 2 μg/ml karboksyny lub 500 μg/ml G418; stężenia te są równe połowie stężenia stosowanego dla płytek dennych). Ponownie oczyść co najmniej 24 domniemane kolonie transformantów na tych płytkach. Należy uzyskać pojedyncze kolonie. W tym samym czasie pozbądź się oryginalnego szczepu na podłożach nieselektywnych.
    UWAGA: Płytki można przechowywać w temperaturze 4 °C przez 1-2 tygodnie.

4. Weryfikacja poprawnych zdarzeń usuwania

UWAGA: Mutacje są weryfikowane w trzyetapowej procedurze (Rysunek 1). Po pierwsze, kandydaci, którzy zawierają kopię genu typu dzikiego, są wykluczani przez PCR. Po drugie, integracja kasety rezystancyjnej z locus jest weryfikowana za pomocą PCR. Po trzecie, integracja kasety rezystancyjnej tylko z pożądanym locus jest weryfikowana przez analizę Southern blot. Staranna weryfikacja szczepu jest niezbędna, aby zmutowane fenotypy naprawdę korelowały z delecją.

  1. Pierwszy diagnostyczny PCR 20
    1. Zaprojektuj parowanie starterów w genie, który ma zostać usunięty, co daje produkt o wartości 250-600 pz (ryc. 1). Takie małe produkty są łatwe do amplifikacji w PCR kolonii i wystarczająco długie, aby można je było wykryć w standardowej elektroforezie żelowej.
    2. Dla każdego kandydata i oryginalnego szczepu jako kontroli pozytywnej, ponownie zawiesić niewielką ilość (ilość główki od szpilki) materiału komórkowego pojedynczej kolonii za pomocą wykałaczki w 20 μl 0,02 M NaOH. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 min.
      UWAGA: Używaj świeżych kolonii. Jeśli płytki są starsze niż 1 tydzień, powtórz smugę, aby uzyskać świeżą kolonię.
    3. Natychmiast zużyć 1 μl zawiesiny komórek do PCR. Uruchom standardową reakcję PCR i przeanalizuj powstałe fragmenty.
      UWAGA: Te próbki nie mogą być przechowywane.
      UWAGA: Ten PCR testuje obecność genu typu dzikiego, a tym samym umożliwia szybką identyfikację ujemnych kandydatów, w których gen będący przedmiotem zainteresowania nie został zastąpiony. Klony dające prążki w tej reakcji PCR zostaną odrzucone. Jeden taki negatywny klon i tak powinien być przenoszony jako dodatkowa kontrola negatywna. Kandydaci, którzy nie posiadają produktu PCR, muszą zostać poddani dalszej analizie. W przypadku genów bez szkodliwych skutków około połowa kandydatów powinna zawierać gen typu dzikiego, podczas gdy druga połowa nie powinna prowadzić do powstania prążka. Odpowiadałoby to współczynnikowi rekombinacji homologicznej wynoszącemu 50%.
  2. Drugi diagnostyczny PCR
    1. Przygotowanie genomowego DNA.
      UWAGA: Genomowe DNA (gDNA) można przygotować przy użyciu dwóch różnych protokołów. Pierwszy z nich obejmuje odczynniki toksyczne, takie jak fenol i chloroform, dlatego powinien być obsługiwany tylko przez doświadczonych badaczy (opisanych w 4.2.1.1 do 4.2.1.5), podczas gdy drugi może być również obsługiwany przez mniej doświadczonych studentów (opisany w 4.2.1.6 do 4.2.1.11). Oba protokoły działają niezawodnie. Krok 4.2.1.1 jest identyczny dla obu protokołów.
      1. Zaszczepić 5 ml YEPS-Light każdym kandydatem i inkubować na obracającym się kole przez 24 godziny w temperaturze 28 °C. Upuść 2 μl kultury na płytkę CM. Utrzymuj kulturę w sterylności.
        UWAGA: Poniżej znajduje się standardowy protokół (UWAGA: kroki toksyczne).
      2. Umieść 1 miarkę (~200 μl) szklanych kulek przemytych HCl do probówek o pojemności 2 ml. Dodać 2 ml kultury U. maydis. Wirowanie 12 000 x g przez 5 min. Odrzucić supernatant (na tym etapie osad można zamrozić). Dodać 500 μl fenolu/chloroformu/alkoholu izoamylowego (25:24:1) do granulki. OSTROŻNOŚĆ! FENOL JEST TOKSYCZNY!
      3. Dodać 500 μl buforu do lizy Usti 1. Wstrząsaj przez 6 do 10 minut na wibraxie przy 1,000 obr./min. Sprawdź, czy osad komórkowy jest całkowicie zawieszony, ale unikaj długotrwałego potrząsania, aby zapobiec ścinaniu gDNA. Wirować z prędkością 12 000 x g przez 15 minut. Przenieść 400 μl fazy wodnej do nowej probówki reakcyjnej (nie dotykać interfazy).
      4. Dodać 1 ml 100 % (v/v) etanolu. Odwróć probówkę 3x, aby wymieszać, obserwuj chmurę DNA, która wkrótce się pojawi. Wirować z prędkością 12 000 x g przez 5 minut. Usunąć supernatant i przemyć 200 μl 70% EtOH. Na tym etapie nie należy ponownie zawieszać osadu.
      5. Całkowicie usunąć supernatant (nie dopuścić do całkowitego wyschnięcia osadu). Dodać 50 μl TE/RNazy. Rozpuścić gDNA przez wytrząsanie z prędkością 400 obr./min w temperaturze 50°C przez 10 min. Przeanalizować 2 μl gDNA w 0,8 % żelu agarozowym 20,
        UWAGA: Poniższe kroki obejmują alternatywny nietoksyczny protokół.
    2. Alternatywne przygotowanie genomowego DNA
      1. Umieść 1 miarkę (~200 μl) umytych szklanych kulek HCl do probówek o pojemności 2 ml. Dodać 2 ml kultury U. maydis i wirować w 12 000 x g przez 5 minut. Wyrzuć supernatant (na tym etapie granulki można zamrozić).
      2. Dodać 500 μl buforu Usti Lysis 2 do osadu. Wstrząsaj przez 5 do 15 minut na wibraxie przy 1,000 obr./min. Sprawdź, czy osad ogniwa jest całkowicie zawieszony.
      3. Inkubować probówki w temperaturze 65 °C przez 15 do 20 minut. Kluczowe znaczenie ma użycie odpowiednich inkubatorów przeznaczonych do przechowywania probówek o pojemności 2 ml. Następnie umieść go na lodzie na 5 minut.
      4. Dodać 100 μl 8 M octanu potasu, odwirować lub odwrócić 8 do 10 razy. Wiruj 12 000 x g przez 15 minut przy RT.
      5. Przenieść 500 μl supernatantu do świeżej probówki o pojemności 1,5 ml i dodać 400 μl izopropanolu. Wiruj lub odwróć 8 do 10 razy. Wirowanie 12 000 x g przez 15 min. Usunąć supernatant i przemyć 500 μl 70% EtOH. Wirowanie 12 000 x g przez 5 min.
      6. Całkowicie zmoczyć supernatant! Na koniec dodaj krótkie wirowanie (10 sekund), aby usunąć resztki płynu. Pozostaw osad DNA do wyschnięcia na 3 do 5 minut. Dodać 50 μl TE/RNAazy i inkubować w temperaturze 50 °C przez 10 do 15 minut przy 400 obr./min.
    3. Metoda PCR
      1. Zaprojektuj dwie pary spłonek, z których jedna wiąże się na zewnątrz boków, a odpowiadająca jej w kasecie oporowej (UF-f, RC-r; RC-f, DF-r, Rysunek 1) 9.
      2. Użyj 1 μl rozcieńczenia gDNA każdego kandydata w stosunku 1:10 jako matrycę w 2 reakcjach PCR weryfikujących poprawność insercji przed i za 9.
      3. Użyj standardowych reakcji PCR dla każdego kandydata i przeanalizuj otrzymane fragmenty 22,
        UWAGA: Te PCR testują wprowadzenie kasety oporności do właściwego locus genomowego. Jeśli produkty są uzyskiwane dla obu stron, kandydat jest prawdopodobnie prawidłowym wstawieniem. Jednak również kandydaci, w przypadku których można było potwierdzić tylko jedną stronę (w górę lub w dół), powinni zostać przewiezieni do dalszej analizy w przypadku, gdy reakcje PCR po prostu nie powiodły się dla jednej flanki.
  3. Weryfikacja prawidłowej insercji genomowej za pomocą analizy Southern Blot 22
    1. Strawić 15 μl gDNA (4.2.1) zmutowanych kandydatów i odpowiadającego im dzikiego typu/szczepu progenitorowego za pomocą odpowiedniego enzymu, który wycina poza locus/konstrukt, a ponadto przecina albo gen, albo w kasecie oporności, prowadząc do wyraźnie rozróżnialnych wzorców (Figura 1) 8,
      UWAGA: Żadne z oczekiwanych prążków nie powinno być większe niż 10 kb, tak aby można je było wyraźnie odróżnić od niestrawionego DNA.
    2. Użyj górnej i dolnej flanki jako sond. Aby je oznaczyć, na przykład, użyj zestawu do etykietowania PCR DIG lub innej podobnej standardowej metody. Wymieszaj oznakowane sondy w stosunku molekularnym 1:1 i przeprowadź Southern blot. Zachowaj co najmniej dwa niezależne poprawne transformanty.
      UWAGA: Wzór typu dzikiego powinien być wyraźnie wykrywalny w oryginalnym szczepie, a prawidłowe klony powinny zawierać tylko oczekiwane prążki. Dodatkowe prążki obecne tylko u kandydatów wskazują na inne insercje konstruktu w niewłaściwym locus. Takie klony należy wyrzucić. Ujemny kandydat zidentyfikowany w pierwszym diagnostycznym PCR powinien zawierać prążki typu dzikiego i prążki (nieprzewidywalne pod względem wielkości) błędnie zintegrowanego konstruktu delecji.
  4. Zapasy glicerolu
    UWAGA: Zapasy glicerolu służą do utrzymania klonów przez lata w kolekcjach szczepów. Na każdego mutanta powinny przypadać co najmniej dwa niezależne transformanty. Pozwala to na porównanie fenotypów, które powinny być identyczne.
    1. Hodować 5 ml kultur potwierdzonych zmutowanych szczepów w YEPS-Light na obracającym się kole przez 24 godziny w temperaturze 28 °C Wymieszać 500 μl każdej kultury z 500 μl pożywki NSY-glicerolu. Odwróć probówkę, aż kultura i podłoże dobrze się wymieszają. Glicerol w pożywce zapobiega tworzeniu się kryształków lodu.
    2. Zamrażać w temperaturze -80 °C. Ponownie poddać próbkę części zamrożonej kultury, aby sprawdzić, czy wywar jest funkcjonalny.

5. Mikroskopijne fenotypy

  1. Hoduj 5 ml kultur dzikich i zmutowanych szczepów w YEPS-Light na obracającym się kole przez 12 godzin w temperaturze 28 °C.
  2. Następnego dnia rozcieńczyć kulturę do OD600 około 0,1 i uprawiać ją do OD600 między 0,5 a 0,7. OD600 1,0 odpowiada około 1 do 2 x 107 komórek U. maydis na ml.
  3. Sprawdź morfologię komórki pod mikroskopem.
    UWAGA: Zdrowe komórki mają kształt cygara (ryc. 4, WT). Wyraźne wakuole lub tworzenie włókien wskazują, że komórki są zestresowane.
    UWAGA: W zależności od oczekiwanego zmutowanego fenotypu, analiza może być dostosowana, np. jeśli stosowane są szczepy reporterowe, na tym etapie można przeprowadzić odpowiedni test. W przypadku zmiany morfologii komórki należy przeprowadzić analizę statystyczną, np. w celu określenia średniej długości komórki.

6. Test infekcji

UWAGA: Test infekcji sadzonek został już wcześniej zobrazowany w tym czasopiśmie 11. Można to przeprowadzić przy użyciu haploidalnego, solopatogennego tła szczepu, takiego jak SG200 10, lub poprzez zmieszanie kompatybilnych partnerów godowych, którzy obaj są nosicielami mutacji.

  1. Uprawiaj co najmniej 40 sadzonek kukurydzy na odmianę przez 7 dni w cyklu świetlnym trwającym 16 godzin, 200 μE, 28 °C/22 °C (dzień/noc). Powinny być w fazie 3 liści i mieć 10-15 cm wysokości w dniu infekcji
    2. .
  2. Dwa dni przed zakażeniem należy rozpocząć wstępną hodowlę szczepów w 5 ml YEPS-Light na obracającym się kole przez 24 godziny w temperaturze 28 °C. Wyhoduj główną kulturę w 50 ml YEPS-Light do OD600 = 1,0 (szybkość podziału komórek = 2 godziny, należy pozostawić minimum 3 podziały, można wykonać O/N).
  3. Odwirować komórki 50 ml kultury o sile 1 500 x g przez 5 minut i odrzucić supernatant. Przemyć 3x sterylnymH2O. Zawiesić komórki w sterylnymH2Odo OD600 3,0. W razie potrzeby wymieszaj partnerów do krycia.
  4. Wstrzyknąć 250 - 500 μl zawiesiny komórkowej do łodygi 7-dniowych siewek kukurydzy za pomocą małej strzykawki. Stosować sterylny H2O jako kontrolę. Trzymaj zainfekowane sadzonki przez dodatkowe 7-14 dni w tych samych warunkach świetlnych i temperaturowych. Oceń fenotyp każdej rośliny według zdrowego, chlorozy, tworzenia antocyjanów, małych guzów, dużych guzów, martwych roślin 10,
    UWAGA: Ocenę można wykonać już po 7 dniach i powtórzyć po 14 dniach, aby śledzić infekcję w czasie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Konstrukcje delecyjne dla wszystkich czterech genów chitynolitycznych zakodowanych w genomie U. maydis zostały wytworzone metodą klonowania Golden Gate, wykorzystując kasetę hygR do delecji cts1, natR do delecji cts2, kasetę G418R do delecji cts3 oraz cbxR do delecji cts4 20. Ogólny przegląd strategii wymiany genów przedstawiono na przykładzie delecji cts3 (Rycina 1). Poje...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten opisuje, w jaki sposób generować mutanty delecyjne do odwrotnych badań genetycznych u U. maydis. Punktem wyjścia jest konstrukt delecji, który zawiera sekwencje flankujące genu będącego przedmiotem zainteresowania, zawierające sekwencje o wielkości około 1 kb przed początkiem i za kodonem stop, a także odpowiednią kasetę rezystancyjną, ponieważ została ona wcześniej zoptymalizowana 7,9. Konstrukty muszą być generowane indywidualnie dla każdego genu i dokładnie weryfikowane pod kątem błędó...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Specjalne podziękowania dla Dr. Benedikt Steuten za krytyczną lekturę manuskryptu. Oryginalne prace nad chitynazami zostały przeprowadzone przez dr Thorstena Langnera. Laboratorium VG jest wspierane przez Klaster Doskonałości w Naukach o Roślinach (CEPLAS, DFG EXC 1028) i BioSC, laboratorium KS jest wspierane przez BioSC. KB jest wspierany przez BioSC. Działalność naukowa Centrum Nauki Biogospodarka (BioSC) została wsparta finansowo przez Ministerstwo Innowacji, Nauki i Badań w ramach Strategieprojektu NRW BioSC (nr 313/323-400-00213). LF jest wspierany przez stypendium doktoranckie Międzynarodowej Grupy Badawczej DFG 1525 iGRADplant.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kwas aminobenzoeinowy (wolny kwas)Sigma AldrichA-9878
Agar Bacto BD214010alternatywnie użyj lokalnego dostawcy
Bacto peptonBD211677alternatywnie użyj lokalnego dostawcy
Ekstrakt drożdżowy Bacto BD212750alternatywnie korzystaj z lokalnego dostawcy
CaCl2*2H2OGrü ssing GmbH10234alternatywnie skorzystaj z lokalnego dostawcy
Ca-Pantothenat (Hemi-Ca. sól)Sigma AldrichP-2250
Carboxin Sigma Aldrich45371
Casaminokwasy BD223050
CholinchloridSigma AldrichC-1879
Kwas cytrynowyChemSolute24,321,000alternatywnie użyj lokalnego dostawcy
CuSO4*5H2OFluka61240alternatywnie użyj lokalnego dostawcy
D(+)Sacharoza Roth4621.1alternatywnie użyj lokalnego dostawcy
DNA degr. wolny kwas Sigma-AldrichD-3159
EDTASigma AldrichE4378
FeCl3*6H2OGrü ssing GmbH10288alternatywnie użyj lokalnego dostawcy
Geneticin (G418) sól dwusiarczanowaSigma AldrichA1720
Trichoderma enzymy lizująceSigma AldrichL1412
D(+) GlukozaCaelo2580alternatywnie użyj lokalnego dostawcy
Gliceryna Fisher ChemicalG065015alternatywnie korzystać z lokalnego dostawcy
H3BO3AppliChemA2940Substancja niebezpieczna. Prosimy o zapoznanie się z instrukcjami bezpieczeństwa producenta.
Heparyna sól sodowaSigma AldrichH3393-50KU
Hygromycyna B-roztwórRoth1287.2Substancja niebezpieczna. 
KClVWR26764298alternatywnie korzystać z lokalnego dostawcy
KH2PO4AppliChemA3620alternatywnie korzystać z lokalnego dostawcy
MgSO4 bezwodnyMerck7487-88-9wody ma kluczowe znaczenie. Alternatywnie użyj lokalnego dostawcy
MnCl2*4H2OAppliChemA2087alternatywnie użyj lokalnego dostawcy
myo-InositolSigmaAldrich I-5125
Na2-EDTA*2H2OAppliChemA2937alternatywnie użyj lokalnego dostawcy
Na2MoO4*2H2ORoth0274.2alternatywnie użyj lokalnego dostawcy
Na2SO4Grü ssing GmbH12174alternatywnie użyj lokalnego dostawcy
NaClFisher ChemicalS316060alternatywnie użyj lokalnego dostawcy
NaOHChemSolute13 751 000alternatywnie użyj lokalnego dostawcy
NH4NO3RothK299.1alternatywnie użyj lokalnego dostawcy
Kwas nikotynowy (wolny kwas)Sigma AldrichN-4126
Siarczan diwodoru Nourseothricin   Werner BioAgents5 001 000
Bulion odżywczy Lokalni dostawcyDifco
Fenol:Chloroform:Alkohol izoamylowy (25:24:1) pH 6,7Sigma AldrichP3803Substancja niebezpieczna. Prosimy o zapoznanie się z instrukcjami bezpieczeństwa producenta.
glikol polietylenowy (PEG)Sigma AldrichP-3640
Octan potasuAppliChem121479alternatywnie użyj lokalnego dostawcy
Pirydoksyna (monochlorochlorek)Sigma AldrichP-9755
Ryboflawina Sigma AldrichR4500
RNaseASigma AldrichR5503
SDSRothCn30.3alternatywnie użyj
małej strzykawkiBD300300alternatywnie użyj sterylnego filtra lokalnego dostawcy
, 22 i mikro; mVWR28145-477alternatywnie użyj lokalnego dostawcy
SorbitolRoth6213.1alternatywnie użyj lokalnego dostawcy
Chlorowodorek tiaminyServa36020.02alternatywnie użyj lokalnego dostawcy
tri-Na-cytrynian FisherChemicalS332060alternatywnie użyj lokalnego dostawcy
Tris- (hydroksymetylo)aminometanVWR103156Xalternatywnie użyj lokalnego dostawcy
Tris chlorowodorek Roth9090.4alternatywnie użyj lokalnego dostawcy
Triton X-100 Serva 37240alternatywnie użyj lokalnego dostawcy
ZnCl2Fluka96470alternatywnie użyj lokalnego dostawcy
Skład roztworów/przygotowanie materiałuSkład roztworów
KarboksynaZapas: 5 mg/ml w metanolu, stężenie końcowe: 2 i mikro; g/ml
CM płytki0,25 % (m/v) Casaminokwasy, 0,1 % (m/v) ekstrakt drożdżowy, 1,0 % (v/v) roztwór witaminy Holliday, 6,25 % (v/v); Roztwór soli Holliday, 0,05 % (m/v) degr. DNA wolny kwas, 0,15 % (m/v) NH4NO3, 2,0 % (w/v) bakto agar; dostosować do pH 7,0 przy użyciu 5 M NaOH; po autoklawowaniu dodać 1 % glukozy 
Geneticin (G418)Podstawa: 50 mg / ml w H2O, końcowe stężenie: 500 &mikro; g/ml
Koraliki szklane przemyte HCl (0,35-0,45 mm)Przykryj szklane kulki skoncentrowanym HCl (25 %, 7,8 M) i inkubuj przez 60 minut. Kołysz się kilka razy. Zdekantować HCl (przechowywać zdekantowany płyn) i umyć szklane kulki 3 M HCl (przechowywać zdekantowany płyn). Umyj szklane kulki kilkakrotnie podwójnie destylowanym H2O, aż pH wyniesie 7 (płyn nie powinien być już żółto-zielony). Podzielić szklane kulki na części i wysuszyć je w temperaturze 180 stopni Celsjusza. Zdekantowany HCl musi zostać zneutralizowany przed utylizacją.
HeparynaZapas: 15 mg/ml
soli Holliday16,0 ‰ (w/v) KH2PO4, 4.0 i permil; (w/v) Na2SO4, 8.0 ‰ (w/v) KCl, 1.32 &promil; (w/v) CaCl2*2H2O, 8.0 ‰ (v/v) pierwiastki śladowe, 2,0 i permil; (w/v) MgSO4; sterylny filtrat
Holliday roztwór witaminy 0,1 i permil; (w/v) Tiamina, 0,05 permil; (w/v) Ryboflawina, 0,05 i promil; (w/v) Pirydoksyna, 0,2 i permil; (w/v) Ca-Pantothenat, (0,05‰ (w/v) Kwas aminobenzoeinowy, 0,2 permil; (w/v) Kwas nikotynowy, 0,2 i permil; (w/v) Cholinchlorek, 1,0 i permil; (w/v) mio-inozytol; może być przechowywany w temperaturze -20 & C
HigromycynaZapas: 50 mg / ml w PBS, końcowe stężenie: 200 &mikro; g/ml
NourseothricinZapas: 200 mg/ml w H2O, stężenie końcowe: 150 &mikro; g/ml
NSY-pożywkaglicerynowa 0,8 % (w/v) Pożywka Bulion, 0,1 % (w/v) Ekstrakt drożdżowy, 0,5 % (w/v) Sacharoza,  80,0 % (v/v) 87% Gliceryna (f.c. 69,6%) 
RegLight1,0% (w/v) Ekstrakt drożdżowy  0,4 % (w/v) Pepton baktowy, 0,4 % (w/v) Sacharoza, 18,22 % (w/v) Sorbitol, 1,5% (w/v) Agar
SCS, pH 5,8Roztwór 1: 20 mM cytrynianu tri-Na, 1 M sorbitolu; kolucja 2: 20 mM Kwas cytrynowy, 1 M Sorbitol, dodać roztwór 2 do roztworu 1 aż do osiągnięcia pH 5,8; autoklaw
STC, pH 81 M Sorbitol, 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM CaCl2; filtr sterylny
STC/PEG40 % (v/v) PEG w buforze STC 
Bufor TE, pH 81,31 mM Tris-Base, 8,69 mM Tris-HCl, 10 mM Na2-EDTA*2H2O
TE/RNaza10 &mikro; g/ml RNazaA w buforze TE
Pierwiastki śladowe0,06‰ (w/v) H3BO3, 0,14‰ (w/v) MnCl*4H2O, 0,4 ‰ (w/v) ZnCl2, 0,4 ‰ (w/v) Na2MoO4*H2O:2, 0.1 ‰ (w/v) FeCl3*6H2O, 0,04‰ (w/v) CuSO4*5H2O
Trichoderma roztwór12,5 mg/ml SCS; filtr sterylny; przygotować na krótko przed użyciem
Tris-HCl pH 7,5806 mM Tris-HCl, 194 mM Tris-Base; sprawdzić pH i w razie potrzeby dostosować za pomocą HCl; autoklaw
Bufor do lizy ustnej 1, pH 810 mM Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM NaCl, 1% (w/v) SDS, 2% (v/v) TritonX-100, 1 mM EDTA. Nie mierz pH za pomocą pH-metru. 
Bufor do lizy ustnej 2mix Bufor do lizy Usti 1 z 1x TE w stosunku 1:1
YEPS-Light medium1,0% (w/v) Ekstrakt drożdżowy, 0,4% (w/v) Pepton baktowy, 0,4% (w/v) Sacharoza, na płytki: 1,5% (w/v) Bacto Agar
Brak lokalnego dostawcy roztwór enzymów lizujących

Bibliografia

  1. Dean, R., et al. The Top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 13, 414-430 (2012).
  2. Vollmeister, E., et al. Fungal development of the plant pathogen Ustilago maydis. Fems Microbiol Rev. 36, 59-77 (2012).
  3. Banuett, F. Ustilago maydis, the delightful blight. Trends in Genetics. 8, 174-180 (1992).
  4. Holloman, W. K., Schirawski, J., Holliday, R. The homologous recombination system of Ustilago maydis. Fungal Genetics and Biology. 45, S31-S39 (2008).
  5. Feldbrügge, M., Kämper, J., Steinberg, G., Kahmann, R. Regulation of mating and pathogenic development in Ustilago maydis. Current Opinion in Microbiology. 7, 666-672 (2004).
  6. Ökmen, B., Doehlemann, G. Inside plant: Biotrophic strategies to modulate host immunity and metabolism. Current Opinion in Plant Biology. 20, 19-25 (2014).
  7. Brachmann, A., König, J., Julius, C., Feldbrügge, M. A reverse genetic approach for generating gene replacement mutants in Ustilago maydis. Molecular Genetics and Genomics. 272, 216-226 (2004).
  8. Kämper, J. A PCR-based system for highly efficient generation of gene replacement mutants in Ustilago maydis. Molecular Genetics and Genomics. 271, 103-110 (2004).
  9. Terfrüchte, M., et al. Establishing a versatile Golden Gate cloning system for genetic engineering in fungi. Fungal Genetics and Biology. 62, 1-10 (2014).
  10. Kämper, J., et al. Insights from the genome of the biotrophic fungal plant pathogen Ustilago maydis. Nature. 444, 97-101 (2006).
  11. Chavan, S., Smith, S. M. A Rapid and Efficient Method for Assessing Pathogenicity of Ustilago maydis on Maize and Teosinte Lines. Journal of Visualized Experiments. (83), e50712(2014).
  12. Khrunyk, Y., Münch, K., Schipper, K., Lupas, A. N., Kahmann, R. The use of FLP-mediated recombination for the functional analysis of an effector gene family in the biotrophic smut fungus Ustilago maydis. New Phytologist. 187, 957-968 (2010).
  13. van Peer, A. F., de Bekker, C., Vinck, A., Wösten, H. A. B., Lugones, L. G. Phleomycin Increases Transformation Efficiency and Promotes Single Integrations in Schizophyllum commune. Appl Environ Microb. 75, 1243-1247 (2009).
  14. Sarkari, P., et al. Improved expression of single-chain antibodies in Ustilago maydis. Journal of Biotechnology. 191, 165-175 (2014).
  15. Schirawski, J., Heinze, B., Wagenknecht, M., Kahmann, R. Mating type loci of Sporisorium reilianum: Novel pattern with three a and multiple b specificities. Eukaryotic Cell. 4, 1317-1327 (2005).
  16. Cervantes-Chavez, J. A., Ali, S., Bakkeren, G. Response to Environmental Stresses, Cell-wall Integrity, and Virulence Are Orchestrated Through the Calcineurin Pathway in Ustilago hordei. Mol Plant Microbe In. 24, 219-232 (2011).
  17. Yu, J. J., et al. An efficient genetic manipulation protocol for Ustilago esculenta. FEMS Microbiology Letters. 362, (2015).
  18. Ninomiya, Y., Suzuki, K., Ishii, C., Inoue, H. Highly efficient gene replacements in Neurospora strains deficient for nonhomologous end-joining. P Natl Acad Sci USA. 101, 12248-12253 (2004).
  19. Colot, H. V., et al. A high-throughput gene knockout procedure for Neurospora reveals functions for multiple transcription factors. P Natl Acad Sci USA. 103, 10352-10357 (2006).
  20. Langner, T., et al. Chitinases Are Essential for Cell Separation in Ustilago maydis. Eukaryot Cell. 14, 846-857 (2015).
  21. Langner, T., Göhre, V. Fungal chitinases: function, regulation, and potential roles in plant/pathogen interactions. Current Genetics. , (2015).
  22. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloining: a laboratry manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
  23. Brachmann, A., Weinzierl, G., Kämper, J., Kahmann, R. Identification of genes in the bW/bE regulatory cascade in Ustilago maydis. Molecular Microbiology. 42, 1047-1063 (2001).
  24. Becht, P., Vollmeister, E., Feldbrügge, M. Role for RNA-binding proteins implicated in pathogenic development of Ustilago maydis. Eukaryotic Cell. 4, 121-133 (2005).
  25. Vollmeister, E., et al. Tandem KH domains of Khd4 recognize AUACCC and are essential for regulation of morphology as well as pathogenicity in Ustilago maydis. RNA. 15, 2206-2218 (2009).
  26. Stock, J., et al. Applying unconventional secretion of the endochitinase Cts1 to export heterologous proteins in Ustilago maydis. Journal of Biotechnology. 161, 80-91 (2012).
  27. Baumann, S., Pohlmann, T., Jungbluth, M., Brachmann, A., Feldbrügge, M. Kinesin-3 and dynein mediate microtubule-dependent co-transport of mRNPs and endosomes. Journal of Cell Science. 125, 2740-2752 (2012).
  28. Pohlmann, T., Baumann, S., Haag, C., Albrecht, M., Feldbrügge, M. A FYVE zinc finger domain protein specifically links mRNA transport to endosome trafficking. eLife. 4, (2015).
  29. Kronstad, J. W., Leong, S. A. Isolation of two Alleles of the b-Locus of Ustilago. P Natl Acad Sci USA. 86, 978-982 (1989).
  30. Koepke, J., et al. The RNA-binding protein Rrm4 is essential for efficient secretion of endochitinase Cts1. Molecular & cellular proteomics. 10, (2011).
  31. Schuler, D., et al. Hxt1, a monosaccharide transporter and sensor required for virulence of the maize pathogen Ustilago maydis. New Phytologist 206. , 1086-1100 (2015).
  32. Schuster, M., Schweizer, G., Reissmann, S., Kahmann, R. Genome editing in Ustilago maydis using the CRISPR-Cas system. Fungal Genetics and Biology. , (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Delecja genurekombinacja homologicznatransformacja protoplast wanaliza Southern blotweryfikacja PCRgeny chitynazgenetyka grzyb wgenerowanie szczep w
Manipulacja genetyczna patogenu roślinnego Ustilago maydis w celu zbadania biologii grzybów i interakcji mikroorganizmów roślinnych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.