Ten manuskrypt opisuje rozwój modelu zwierzęcego, który pozwala na bezpośrednie testowanie wpływu niedotlenienia guza na przerzuty i rozszyfrowywanie mechanizmów jego działania. Chociaż opisane tutaj eksperymenty koncentrują się na mięsaku Ewinga, podobne podejście można zastosować do innych typów nowotworów.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
In vivo (in vivo) Model do badania wpływu hipoksji na przerzuty nowotworu
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Niedotlenienie zostało powiązane z przerzutami mięsaka Ewinga (ES) na podstawie obserwacji klinicznych i danych in vitro, jednak brakuje bezpośrednich dowodów na jego działanie pro-przerzutowe, a dokładne mechanizmy jego działania są niejasne. W tym miejscu przedstawiamy model zwierzęcy, który pozwala na bezpośrednie testowanie wpływu niedotlenienia guza na rozprzestrzenianie się ES i badanie zaangażowanych szlaków leżących u jego podstaw. Podejście to łączy dwie dobrze ugruntowane strategie eksperymentalne, ortotopowy ksenoprzeszczep komórek ES i podwiązanie tętnicy udowej (FAL), które indukuje niedokrwienie kończyn tylnych. Ludzkie komórki ES wstrzyknięto do mięśni brzuchatych łydki myszy SCID / beżowych, a pierwotne guzy pozwolono urosnąć do rozmiaru 250 mm3. Na tym etapie albo guzy zostały wycięte (grupa kontrolna), albo zwierzęta poddano FAL w celu wytworzenia niedotlenienia guza, a następnie wycięciu guza 3 dni później. Skuteczność FAL została potwierdzona znacznym wzrostem wiązania hipoksysondy-1 w tkance nowotworowej, ciężką martwicą guza i całkowitym zahamowaniem wzrostu guza pierwotnego. Co ważne, pomimo tych bezpośrednich skutków niedokrwienia, zaobserwowano wzmożone rozsiewanie komórek nowotworowych z guzów niedotlenionych. Ta eksperymentalna strategia umożliwia analizę porównawczą właściwości przerzutowych guzów pierwotnych o tej samej wielkości, ale znacząco różniących się poziomach niedotlenienia. Stanowi również nową platformę do dalszej oceny mechanistycznych podstaw zmian wywołanych niedotlenieniem, które zachodzą podczas progresji guza z przerzutami in vivo. Ponadto, chociaż model ten został stworzony przy użyciu komórek ES, przewidujemy, że ta eksperymentalna strategia może być wykorzystana do testowania wpływu niedotlenienia w innych mięsakach, a także guzach ortotopowo wszczepionych w miejsca o dobrze zdefiniowanej drodze dopływu krwi.
Wprowadzenie
Mięsak Ewinga (ES) jest agresywnym nowotworem złośliwym atakującym dzieci i młodzież. 1 Guzy rozwijają się w tkankach miękkich i kościach, często w kończynach. Chociaż obecność przerzutów jest najsilniejszym niekorzystnym czynnikiem prognostycznym u pacjentów z ES, mechanizmy leżące u podstaw ich rozwoju pozostają niejasne. 2 Niedotlenienie guza jest jednym z niewielu czynników związanych z progresją ES. U pacjentów z ES obecność nieperfundowanych obszarów w tkance nowotworowej wiąże się ze złym rokowaniem. 3 In vitro niedotlenienie zwiększa inwazyjność komórek ES i wyzwala ekspresję genów proprzerzutowych. 4-6 Jednak pomimo tych linii dowodowych, nie ma bezpośredniego dowodu na progresję i rozprzestrzenianie się ES wywołanej hipoksją. Co więcej, mechanizmy, za pomocą których hipoksja wywiera takie skutki, są obecnie nieznane. W związku z tym stworzyliśmy model in vivo, aby wypełnić lukę między istniejącymi danymi in vitro a obserwacjami klinicznymi. Ten system modelowy umożliwia bezpośrednie badanie wpływu hipoksji na nowotwory występujące w ich naturalnym środowisku, wykorzystując obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (MRI) do śledzenia progresji guza i przerzutów in vivo w połączeniu z analizami patologicznymi i molekularnymi ex vivo (ryc. 1).
Ponieważ obecnie nie jest dostępny żaden ustalony transgeniczny model ES, badania in vivo nad przerzutowymi właściwościami tych nowotworów polegają na wstrzykiwaniu komórek ludzkich myszom z obniżoną odpornością. Podczas gdy wykorzystanie zwierząt z upośledzoną odpornością może zaniżać wpływ układu odpornościowego na postęp choroby, możliwość wykorzystania komórek ludzkich zwiększa przekładalność takich badań. Spośród różnych modeli ksenoprzeszczepów, ogólnoustrojowe iniekcje do żyły ogonowej są najłatwiejsze do wykonania, jednak pomijają początkowe etapy wynaczynienia komórek nowotworowych i uciekają z pierwotnego miejsca wzrostu. 7-12 Z drugiej strony, ksenoprzeszczep ortotopowy, który polega na wstrzyknięciu komórek nowotworowych do kości (kości udowej, żebra) lub mięśni, jest bardziej wymagający technicznie, ale także bardziej biologicznie istotny w przypadku raka u ludzi. 13-16 Jednak w przeszłości wysoka zachorowalność związana z szybkim wzrostem guzów pierwotnych często wymagała eutanazji zwierząt przed rozwinięciem się przerzutów. W tym badaniu wykorzystaliśmy wcześniej ustalony model iniekcji komórek do mięśnia brzuchatego łydki, a następnie wycięcia powstałego guza pierwotnego w połączeniu z podłużnym monitorowaniem progresji przerzutów za pomocą MRI. 17,18 Takie wstrzyknięcia w mięsień brzuchaty łydki w bliskiej odległości od kości piszczelowej pozwalają na wzrost guza w dwóch naturalnych środowiskach ES - mięśniach i kościach - i powodują odległe przerzuty do miejsc zwykle dotkniętych u ludzi. 18 W ten sposób model ten dokładnie podsumowuje procesy przerzutowe zachodzące u pacjentów z ES podczas progresji choroby.
Lokalizacja pierwotnych guzów w dolnej części tylnej kończyny ułatwia również precyzyjną kontrolę dopływu krwi do tkanki nowotworowej. Podwiązanie tętnicy udowej (FAL) jest dobrze ugruntowaną techniką wykorzystywaną w badaniach nad angiogenezą w celu zablokowania przepływu krwi do dystalnych obszarów nogi i zbadania unaczynienia tkanek w odpowiedzi na niedokrwienie. 19,20 Co ważne, po początkowym spadku przepływu krwi następuje otwarcie naczynia pobocznego i reperfuzja tkanek obserwowana po około 3 dniach od FAL. 20 Tak więc, gdy jest wykonywany w kończynie z guzem, model ten odtwarza zdarzenia hipoksji/reperfuzji, które występują naturalnie w szybko rosnących guzach i umożliwia ucieczkę przerzutowych komórek nowotworowych z powodu przywrócenia perfuzji do dolnej kończyny tylnej przez nowo otwarte naczynia poboczne. 21 Co ważne, procedura ta musi być wykonywana, gdy rozmiar guza jest wystarczająco mały, aby zapobiec nadmiernemu niedotlenieniu w guzach kontrolnych (zwykle przy objętości łydki nośnej guza 150 - 250 mm3), zapewniając znaczne różnice w poziomach niedotlenienia guza między grupami kontrolnymi i leczonymi FAL.
Oprócz podłużnego monitorowania wpływu hipoksji na opóźnienie ES i częstotliwość przerzutów, model ten pozwala również na pobieranie tkanek i rozwój nowych linii komórkowych zarówno z guzów pierwotnych, jak i z przerzutów. Co ważne, wcześniejsze prace wykazały, że linie komórkowe pochodzące z przerzutów wykazują zwiększony potencjał przerzutowy po ponownym wprowadzeniu do zwierząt, co wskazuje, że rozprzestrzenianie się guza wiąże się z trwałymi zmianami w fenotypie komórek nowotworowych, a tym samym potwierdza użycie tych linii komórkowych do rozszyfrowania procesów przerzutowych. 18 Łącznie modele te mogą być obecnie wykorzystywane do analiz genetycznych i molekularnych niezbędnych do identyfikacji szlaków przerzutowych wywołanych hipoksją.
Ponieważ niedotlenienie jest czynnikiem pro-przerzutowym zwiększającym złośliwość różnych nowotworów, nasz model może być wykorzystany jako platforma do zbadania roli niedotlenienia w innych typach nowotworów, które naturalnie rozwijają się w kończynach, takich jak kostniakomięsak i mięsak prążkowanokomórkowy. 21-23 Co więcej, podobne podejście można zastosować do nowotworów złośliwych rosnących w innych lokalizacjach anatomicznych o dobrze zdefiniowanej drodze dopływu krwi. Docelowo model może być modyfikowany, a jego użyteczność dalej rozszerzana, w zależności od indywidualnych potrzeb badawczych.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Georgetown.
1. Przygotowanie komórek do iniekcji ortotopowych
- Hodowla ludzkich komórek ES w standardowych warunkach. Do wstrzyknięcia 5 myszom należy użyć około jednej 15-centymetrowej płytki do hodowli komórkowej nieprzekraczającej 70% zgryzu.
UWAGA: W tym badaniu komórki SK-ES1 hodowano w pożywce McCoy's 5A z 15% płodową surowicą bydlęcą (FBS) na płytkach pokrytych kolagenem, a komórki TC71 hodowano w RPMI z 10% FBS i 1% kwasem 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowym (HEPES). Oba podłoża suplementowano antybiotykami – penicyliną (100 jednostek/ml), streptomycyną (100 μg/ml) i fungizonem (1 μg/ml). - Przemyć komórki ES solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) i trypsynizować przy 70% zbiegu z 0,25% trypsyną/kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA) przez 5 minut.
- Usunąć komórki ES z płytki z pożywką do hodowli komórkowych, a następnie odwirować przez 5 minut przy 200 x g w temperaturze pokojowej. Ponownie zawiesić komórki ES w 10 ml zimnego PBS, a następnie policzyć liczbę komórek.
- Odwirować komórki ES przez 5 minut przy 200 x g w temperaturze pokojowej, a następnie ponownie zawiesić przy 2 x 10 7 (SK-ES1) lub 107 (TC71) komórek na ml w zimnym PBS. Utrzymuj końcową zawiesinę komórek na lodzie podczas wykonywania wstrzyknięć.
2. Ortotopowa iniekcja komórek ES do mięśnia brzuchatego łydki
- Użyj 4-6 tygodniowych samic myszy SCID/beżowych.
- Aby wstrzyknąć komórki ES, delikatnie przytrzymaj mysz i ustabilizuj jej lewą nogę między czwartym a piątym palcem, odsłaniając przyśrodkową stronę dolnej kończyny tylnej.
- Za pomocą igły 28 G 1/2 wstrzyknąć 0,1 ml wcześniej przygotowanej zawiesiny komórkowej, która zawiera 2 x 106 (SK-ES1) lub 106 (TC71) komórek ES do mięśnia brzuchatego łydki (ryc. 2A).
UWAGA: Chociaż maksymalna objętość do wstrzyknięć domięśniowych wynosi zwykle 0,05 ml, w przypadku tej konkretnej procedury konieczne jest zwiększenie objętości do 0,1 ml ze względu na dużą liczbę wstrzykiwanych komórek. Ta procedura została zatwierdzona przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Georgetown.- Wbić igłę w mięsień brzuchaty łydki z przodu pod kątem około 30 - 45 stopni w kierunku grzebienia piszczelowego/guzowatości.
- Lekko wycofać igłę, gdy dotknie grzebienia piszczelowego/guzowatości. Powoli wstrzykiwać roztwór zawiesiny komórek, stopniowo wycofując igłę, aby zwolnić ciśnienie.
- Monitoruj myszy, którym wstrzyknięto tabletki, przez następne 24 godziny pod kątem oznak niepokoju.
UWAGA: Badacze z mniejszym doświadczeniem w obchodzeniu się ze zwierzętami powinni rozważyć znieczulenie myszy do wstrzyknięć do komórek nowotworowych. Niektóre instytucje mogą wymagać znieczulenia ze względów bezpieczeństwa.
3. Monitorowanie wzrostu guza pierwotnego
- Codziennie monitoruj wzrost guzów pierwotnych, aż wielkość guza osiągnie pożądaną objętość.
UWAGA: W obecnym badaniu jako punkt wyjścia eksperymentu wykorzystano objętość cielęcia wynoszącą 250mm3 (ryc. 2B). Zazwyczaj potrzeba około 1-2 tygodni, aby guzy osiągnęły ten rozmiar.- Codziennie mierz obwód łydki za pomocą suwmiarki cyfrowej na podstawie jej długości przyśrodkowo-bocznej i przedniej-tylnej.
- Określ objętość łydki według wzoru (D x d2/6) x 3,14, gdzie D to dłuższa średnica, a d to krótsza średnica dolnej kończyny tylnej zawierającej guz.
UWAGA: Rozmiar normalnego cielęcia dorosłej myszy wynosi około 40 - 50 mm3. Jego objętość zwiększy się z powodu wzrostu guza, a w późniejszych stadiach cielę będzie składać się głównie z tkanki nowotworowej.
4. Podwiązanie tętnicy udowej (FAL) w celu wywołania niedotlenienia w kończynie tylnej, na której znajduje się nowotwór
- Przygotuj narzędzia chirurgiczne potrzebne do tej operacji: zakrzywione lub spiczaste kleszcze, spiczaste kleszcze, nożyczki chirurgiczne i uchwyt na igłę. Wysterylizuj te narzędzia przed zabiegiem za pomocą autoklawu lub sterylizatora z gorącymi kulkami. Dodatkowo przygotuj cienkie waciki bawełniane do tej operacji.
UWAGA: Zaleca się ponowną sterylizację narzędzi na końcówkach w razie potrzeby podczas zabiegu. - Środek przeciwbólowy (karprofen 5 mg/kg) wstrzyknąć podskórnie (SQ). Aby wykryć i potwierdzić niedotlenienie, wstrzyknąć hypoksyprobe-1 (pimonidazol, 60 mg/kg).
UWAGA: Dawka ta wynosi 1,5 mg na mysz i jest osiągana przez wstrzyknięcie 0,1 ml roztworu 15 mg/ml sondy hipoksy do PBS dootrzewnowo (IP). Sonda hipoksymetryczna jest następnie wykrywalna post mortem w tkankach zwierzęcych za pomocą immunohistochemii. - Umieść mysz w komorze indukcyjnej znieczulenia zawierającej 3 - 5% izofluranu w 100% tlenu przy natężeniu przepływu 1 l/min.
- Pozostaw mysz w komorze indukcyjnej, aż przestanie reagować na bodźce zewnętrzne. Następnie wyjmij zwierzę z komory indukcyjnej. Umieść zwierzę w pozycji leżącej na sterylnej serwicie umieszczonej na podkładce rozgrzewającej na powierzchni operacyjnej. Użyj stożka nosowego, aby podłączyć go do ciągłego przepływu 1 - 3% izofluranu w 100% tlenu przy natężeniu przepływu 0,8 l/min.
- Nałóż sterylną, nieleczniczą maść okulistyczną na każde oko, aby zapobiec wysuszeniu rogówki. Aby dokładnie zdepilować obszar chirurgiczny, nałóż krem do depilacji, pozostawiając go na skórze nie dłużej niż 10 sekund. Następnie zetrzyj krem do depilacji za pomocą podkładki do przygotowania etanolu.
- Wyprostuj i zabezpiecz tylną kończynę kawałkiem taśmy około 45 stopni od linii środkowej myszy. Gdy tylna kończyna jest już zabezpieczona, przetrzyj odsłoniętą skórę 10% wacikiem/roztworem widonu/jodu, a następnie etanolem, powtarzając jeszcze dwa razy każdy. Przez pozostałą część zabiegu chirurgicznego użyj mikroskopu stereoskopowego, aby uzyskać powiększony widok okolicy kończyn tylnych.
- Za pomocą spiczastych kleszczy i nożyczek chirurgicznych wykonaj nacięcie skóry o długości około 1 cm od połowy uda w kierunku okolicy pachwinowej. Za pomocą cienkich wacików nasączonych solą fizjologiczną delikatnie zetrzyj podskórną tkankę tłuszczową otaczającą mięsień uda.
- Ostrożnie odsłoń leżącą poniżej tętnicę udową poprzez rozwarstwienie przez podskórną tkankę tłuszczową. Ustabilizuj ranę i pole operacyjne, aby odsłonić unaczynienie środkowego górnego mięśnia przywodziciela.
- Za pomocą cienkich kleszczyków delikatnie przebij błoniastą osłonę kości udowej, aby odsłonić pęczek nerwowo-naczyniowy. Używając czystego zestawu cienkich kleszczy, wypreparuj i oddziel tętnicę udową od żyły udowej i nerwu w bliższym położeniu w pobliżu pachwiny, dystalnie do więzadła pachwinowego. Zachowaj ostrożność, aby uniknąć przebicia ściany żyły udowej.
- Po rozwarstwieniu należy wprowadzić pasmo nici jedwabnej 6-0 pod tętnicę udową i dystalnie do gałęzi bocznej tętnicy udowej obwodowej (LCFA). Okłać tętnicę udową za pomocą podwójnych węzłów (ryc. 3).
- Zamknij nacięcie za pomocą szwów polipropylenowych 6-0. Po zamknięciu nacięcia wstrzyknij SQ 0,5 ml ciepłej soli fizjologicznej w celu terapii równowagi płynów. Umieść zwierzę na udrapowanej ciepłej podkładce w klatce regeneracyjnej i monitoruj w sposób ciągły, aż się obudzi.
- Obserwuj zwierzęta przez pierwsze 6 godzin po zabiegu i wstrzykuj środek przeciwbólowy (karprofen 5 mg/kg, SQ) codziennie przez 3 dni. Usuń szwy 10 dni po operacji za pomocą sterylnych nożyczek.
5. Wycięcie guza pierwotnego przez amputację nogi
UWAGA: Amputuj dolną kończynę tylną z guzem, gdy rozmiar łydki osiągnie 250 mm3 dla grupy kontrolnej lub 3 dni po FAL dla grupy niedotlenionej.
- Ogol włosy od kończyny nośnej od dystalnej kości piszczelowej do okolicy miednicy za pomocą maszynki do strzyżenia włosów, delikatnie trzymając zwierzę. Przed zabiegiem wstrzyknąć środek przeciwbólowy (karprofen 5 mg/kg, SQ).
- Umieść mysz w komorze indukcyjnej znieczulenia zawierającej 3 - 5% izofluranu w 100% tlenu przy natężeniu przepływu 1 l/min. Pozostaw mysz w komorze indukcyjnej do momentu, gdy przestanie reagować na bodźce zewnętrzne. Następnie wyjmij zwierzę z komory indukcyjnej.
- Umieść zwierzę w prawej bocznej pozycji leżącej na sterylnej serwecie umieszczonej na podkładce rozgrzewającej na powierzchni operacyjnej. Użyj stożka nosowego, aby podłączyć go do ciągłego przepływu izofluranu 1 - 3% w 100% tlenu przy natężeniu przepływu 0,8 l/min. Nałóż sterylną, nieleczniczą maść okulistyczną na każde oko, aby zapobiec wysuszeniu rogówki
- Przygotować miejsce operacji za pomocą 10% powidonu/wymazówki/roztworu, a następnie etanolu, powtarzając 3 razy. Nałóż sterylną gazę (np. obłożenie chirurgiczne) na mysz, aby uzyskać sterylne pole operacyjne.
- Wykonaj środkowe nacięcie skóry na obwodzie kości udowej, a następnie rozwarstwienie i cofnięcie skóry proksymalnie. Odsłonić przyśrodkową szypułkę nerwowo-naczyniową kości udowej po środkowej stronie nogi, a następnie podwiązać w pobliżu więzadła pachwinowego za pomocą wchłanialnego materiału szwowego powlekanego 4-0 (poliglaktyna 910).
- Wykonaj nożyczkami transsekcję grup mięśniowych w środkowej części kości udowej, a następnie rozwarstwienie tkanek miękkich do stawu biodrowo-ogonowego. Za pomocą noża do kości wykonaj osteotomię w połowie kości udowej. Za pomocą sterylnego cienkiego bawełnianego wacika lub wchłanialnej gąbki żelatynowej delikatnie dociśnij miejsce osteotomii, aby zminimalizować i zapobiec krwawieniu.
- Zamknij leżącą nad nią skórę za pomocą chirurgicznych klipsów do ran i wstrzyknij 0,5 ml ciepłej soli fizjologicznej SQ w celu terapii równowagi płynów. Umieść zwierzę na udrapowanej ciepłej podkładce w klatce regeneracyjnej i monitoruj w sposób ciągły, aż się obudzi.
- Po operacji należy pobrać próbki tkanek z guzów pierwotnych w celu izolacji RNA, DNA lub białka, zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C. W przypadku pierwotnej hodowli komórkowej na tym etapie należy pobrać próbki tkanek, jak opisano w sekcji 9 poniżej. Utrwal pozostałą tkankę kończyny w 10% neutralnie buforowanej formalinie do histologii i immunochemii, w tym wykrywania hipoksysondy-1.
- Monitoruj zwierzęta pod kątem lokomocji, bólu i spożycia pokarmu przez pierwsze 6 godzin po zabiegu, a następnie codziennie przez 3 dni. Środek przeciwbólowy (karprofen 5 mg/kg, SQ) należy wstrzykiwać codziennie przez 3 dni. Klipsy do ran należy usunąć 10 dni po amputacji za pomocą środka do usuwania klipsów do ran.
6. Monitorowanie myszy pod kątem obecności przerzutów
- Obserwuj myszy codziennie i oceniaj je pod kątem klinicznych objawów przerzutów co najmniej dwa razy w tygodniu.
- Obserwuj zwierzęta pod kątem obecności makroprzerzutów prezentujących się jako masy, które rozwijają się w różnych miejscach, zazwyczaj na ramionach, przeciwległych nogach i szczękach. W tym celu należy dokładnie obmacać okolice głowy, szyi i pachy oraz przeciwległą kończynę tylną. Sprawdź, czy nie ma przerzutów do narządów wewnętrznych poprzez wzdęcie brzucha wraz z rezonansem magnetycznym.
- Sprawdź, czy nie ma przerzutów do płuc, naciskając palcem wskazującym wyrostek ksylifoidalny (dolny koniec mostka). 24
UWAGA: To ciśnienie zmniejsza wydolność oddychania przeponowego. Myszy z zaawansowanymi przerzutami do płuc wykazują oznaki niewydolności oddechowej objawiające się ciężkim oddychaniem. - Obserwuj zwierzęta pod kątem objawów neurologicznych, takich jak paraliż nóg i ataksja sugerujące przerzuty do ośrodkowego układu nerwowego.
- Monitoruj myszy co najmniej raz w tygodniu pod kątem utraty wagi, jako wskaźnik potencjalnego postępu choroby. Utrata masy ciała przekraczająca 15% masy ciała sprzed zabiegu jest uważana za humanitarny punkt końcowy.
7. Rezonans magnetyczny (MRI) do wykrywania przerzutów
- Wykonaj rezonans magnetyczny, aby wykryć przerzuty w żądanych punktach czasowych. 18
UWAGA: W niniejszym badaniu użyto spektrometru poziomego o natężeniu 7 tesli. Rezonans magnetyczny wykonano w 15. i 35. dniu po amputacji dla komórek SK-ES1 oraz w 15. dniu dla komórek TC71. - Umieść mysz w komorze indukcyjnej znieczulenia zawierającej 1 - 3% izofluranu w mieszaninie gazów składającej się z 30% tlenu i 70% podtlenku azotu.
- Pozostaw mysz w komorze indukcyjnej, aż przestanie reagować na bodźce zewnętrzne. Następnie wyjmij zwierzę z komory indukcyjnej.
- Przenieś znieczuloną mysz na stereotaktyczny uchwyt z monitorowaniem oddechu i temperatury z ciągłym podawaniem 1,5% izofluranu i 30% podtlenku azotu. Nałóż sterylną, nieleczniczą maść okulistyczną na każde oko, aby zapobiec wysuszeniu rogówki. Wyobraź sobie zwierzę w 40- lub 23-milimetrowej cewce objętościowej myszy Bruker do obrazowania całego ciała lub mózgu.
- Użyj dwuwymiarowej, ważonej T2 sekwencji RARE : TR = 3 000 ms, TE = 24 ms, matryca = 256, FOV = 4,35 x 3,0 cm, grubość warstwy = 0,5 mm, współczynnik RARE = 4 i średnie = 4. Rozdział 18
- Umieść zwierzę w ciepłej klatce regeneracyjnej i monitoruj w sposób ciągły, aż się obudzi.
UWAGA: Myszy szybko wyzdrowieją, ponieważ stosuje się płytką płaszczyznę znieczulenia. - Monitoruj zwierzęta przez pierwsze 6 godzin po obrazowaniu, aby upewnić się, że nie ma żadnych niepożądanych skutków znieczulenia.
8. Eutanazja i sekcja
zwłok- Poddać myszy eutanazji, gdy u zwierząt pojawią się przerzuty wykrywalne za pomocą rezonansu magnetycznego i/lub kliniczne objawy progresji choroby.
UWAGA: W obecnym badaniu myszy zostały uśmiercone w 50 i 25 dniu po amputacji dla zwierząt noszących odpowiednio ksenoprzeszczepy SK-ES1 i TC71. W niektórych przypadkach wcześniejsza eutanazja była konieczna ze względu na duże obciążenie przerzutami. - Poddaj myszy eutanazji poprzez narażenie na CO2 w dawce 1,5 l/min (CO2 w ilości 10 - 30% objętości komory eutanazyjnej). Aby zapewnić śmierć zwierzęcia, należy wykonać zwichnięcie szyjki macicy po ekspozycji na CO2 .
- Spryskaj całą mysz 70% etanolem i umieść ją w okapie z przepływem laminarnym. Pobrać krew przez nakłucie serca za pomocą igły 25 G 1/2 ze strzykawką o pojemności 1 ml i przenieść do probówki do pobierania krwi zawierającej 2 mg EDTA.
- Pobrać następujące tkanki: śledzionę, nadnercza, jajniki, nerki, wątrobę, płuca, mózg, prawą nogę, szpik kostny zarówno z kości ramiennej, jak i kręgosłupa, a także makroskopowe przerzuty obecne w innych lokalizacjach. Pytania z dnia 25,26
- Umocuj połowę każdej tkanki w 10% neutralnie buforowanej formalinie w celu histologii i immunochemii, w tym wykrywania hipoksysondy-1. Drugą połowę należy zamrozić w ciekłym azocie, a następnie przechowywać w temperaturze -80 °C w celu izolacji RNA, DNA lub białka. 25,26 W przypadku pierwotnej hodowli komórkowej należy pobrać próbki tkanek w sposób opisany w sekcji 9 poniżej.
9. Pierwotna hodowla komórkowa
- Aby przeprowadzić pierwotną hodowlę komórkową, należy wypreparować tkanki z amputowanej kończyny (sekcja 5 powyżej) lub podczas sekcji zwłok (sekcja 8 powyżej) w sterylnych warunkach w okapie z przepływem laminarnym.
- Przygotować pożywkę do hodowli komórkowych odpowiednią dla linii komórkowej używanej do iniekcji ortotopowych, uzupełnioną penicyliną (200 jednostek/ml), streptomycyną (200 μg/ml), fungizonem (1 μg/ml) i 0,2% profilaktycznym antybiotykiem mykoplazmowym. Umieścić 2,5 ml pożywki do hodowli podstawowej na 6-centymetrowej płytce do hodowli komórkowych.
- Wybierz żywe obszary tkanki nowotworowej z guzów pierwotnych lub przerzutów, a następnie wyizoluj dwa do trzech segmentów w odległości 2-3 mm każdy za pomocą sterylnych nożyczek.
UWAGA: Żywotna tkanka nowotworowa zwykle znajduje się na krawędziach guza i można ją odróżnić od martwicy na podstawie jej różowawego lub czerwonawego koloru, znacznego połysku i ogólnego mokrego wyglądu. W przeciwieństwie do tego, tkanka martwicza jest powszechnie widoczna w środku guza i przedstawia się jako białawo-kremowa masa o matowym, wyglądzie. 27 Rozdział 27 - Przenieść wyizolowane segmenty na 6-centymetrową płytkę do hodowli komórkowej zawierającą pożywkę pierwotną opisaną w kroku 9.2.
- Komórki hodowlane w warunkach standardowych, jak opisano w sekcji 1 (UWAGA) i 9.2. 18,28 Sprawdź kulturę pod kątem wyrostów komórkowych powstałych z fragmentów tkanki, które należy zaobserwować w ciągu kilku dni. Gdy komórki osiągną konfluencję, trypsynizuj je i rozmnażaj zgodnie ze standardowymi technikami hodowli komórkowych.
UWAGA: Pierwotna hodowla komórkowa może być następnie wykorzystana do oceny wzrostu i właściwości przerzutowych komórek pochodzących z guzów kontrolnych i niedotlenionych, a także ich cech molekularnych, jak opisano wcześniej. Rozdział 18
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Po wstrzyknięciu komórek ES do mięśnia brzuchatego łydki pozwala się guzy pierwotne urosnąć do objętości 250 mm3 (Rysunek 1, 2). Czas niezbędny do osiągnięcia tej objętości przez guzy wynosi zazwyczaj od 10 do 15 dni dla TC71 oraz od 20 do 25 dni dla ksenoprzeszczepów SK-ES1. Guzy o objętości 250 mm3 wykazują stosunkowo niski poziom endogennej hipoksji (około 3% tkanki guza), co potwierdzono barwieniem hypoxyprobe-1 (pimonizol) (Rysunek 4A, C...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Nasz model polega na porównaniu przerzutów w dwóch grupach eksperymentalnych – grupie kontrolnej, w której guz może rozwinąć się w kończynie tylnej, a następnie amputacji po osiągnięciu objętości łydki 250 mm3 oraz grupie narażonej na niedotlenienie, w której kończyna tylna z guzem jest poddawana FAL w tej samej objętości, a następnie amputacji 3 dni później. Mimo że w tych eksperymentach guzy leczone FAL są amputowane z niewielkim opóźnieniem, w porównaniu z guzami kontrolnymi, ich rozmiar nie zwiększa się w ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez granty National Institutes of Health (NIH): UL1TR000101 (wcześniej UL1RR031975) w ramach Clinical and Translational Science Awards Program, 1RO1CA123211, 1R03CA178809, R01CA197964 i 1R21CA198698 dla JK. Rezonans magnetyczny wykonano w Laboratorium Badań Przedklinicznych Obrazowania (PIRL) Georgetown-Lombardi Comprehensive Cancer Center, a przetwarzanie tkanek w Georgetown-Lombardi Comprehensive Cancer Center's Histopathology & Tissue Shared Resource, oba wspierane przez grant NIH/NCI P30-CA051008. Autorzy dziękują Danowi Chalothornowi i Jamesowi E. Faberowi z Wydziału Biologii i Fizjologii Komórki Uniwersytetu Karoliny Północnej w Chapel Hill za pomoc w pośmiertnej angiografii rentgenowskiej oraz dostarczenie wglądu i wiedzy na temat kolaterogenezy.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| SK-ES1 Ludzkie komórki mięsaka Ewinga (ES) | ATCC | ||
| TC71 Ludzkie komórki | Uprzejmie dostarczone z Dr. Toretsky | ||
| McCoy's 5A (zmodyfikowany) Medium | Gibco przez Life Technologies | 12330-031 | |
| RPMI-1640 | ATCC | 30-2001 | |
| PBS | Corning Cellgro | 21-040-CV | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442-500mL | |
| 0,25% Trypsyna-EDTA (1x) | Gibco firmy Life Technologies | 25200-056 | |
| Penicylina-Streptomycyna | Gibco firmy Life Technologies | 15140-122 | |
| Fungizone® Przeciwgrzybicze | Gibco firmy Life Technologies | 15290-018 | |
| MycoZap™ Profilaktyczne | Lonza | VZA-2032 | |
| Kolagen typu I Ogon szczura o wysokiej koncentracji | BD Biosciences | 354249 | |
| SCID/beżowe myszy | Harlan lub Charles River | 250 (Charles River) lub 18602F (Harlan) | |
| 1 ml Strzykawki insulinowe z przymocowanym na stałe 28 G ½ igła | BD | 329424 | |
| Sól fizjologiczna (0,9% chlorek sodu do wstrzykiwań, USP) | Hospira, INC | NDC 0409-7984-37 | |
| Suwmiarki cyfrowe | World Precision Instruments, Inc | 501601 | |
| Narzędzia chirurgiczne | Fine Science Tools | ||
| Rimadyl (karprofen) do wstrzykiwań | Zoetis | ||
| Hypoxyprobe-1 (stały chlorowodorek pimonidazolu) | HPI, Inc | HP-100mg | |
| hypoxyprobe-2 (CCI-103F-250 mg) | HPI, Inc | CCI-103F-250mg | |
| Powidon-jod Swasówka | PDI | S41350 | |
| Sterylna podkładka nasączona do przygotowywania alkoholu | Fisher HealthCare | 22-363-750 | |
| LubriFresh P.M. (lubrykant do oczu maść) | Major Pharaceuticals | NDC 0904-5168-38 | |
| VWR Podkłady chłonne z wodoodporną barierą przeciwwilgociową | VWR | 56617-014 | |
| Jednobiegowa maszynka do strzyżenia weterynarza Oster Golden A5 z ostrzem w rozmiarze 50 | Oster | 078005-050-002 (maszynka do strzyżenia), 078919-006-005 (ostrze) | |
| Balsam Nair z olejkiem dla dzieci | Church & Dwight Co., Inc. | ||
| Jedwab 6-0 | Specjalizacje Chirurgiczne Corp | 752B | |
| Szew prolenowy (polipropylenowy) 6-0 | Ethicon | 8680G | |
| Vicryl (Poliglaktyna 910) szew 4-0 | Aplikatory Ethicon | J386H | |
| Fisherbrand (bawełna oczyszczona) | Fisher Scientific | 23-400-115 | |
| Wchłanialne gąbki dentystyczne GelFoam - rozmiar 4 | Pfizer Pharmaceutical | 9039605 | |
| Autoclip Wound Clip Applier | BD | 427630 | |
| Mikroskop stereoskopowy | Olympus | SZ61 | |
| Środek do usuwania automatycznych klipsów | BD | ||
| Klips Aound | BD | 427631 | |
| MRI 7 Tesla | Bruker Corporation | ||
| Paravision 5.0 oprogramowanie | Bruker Corporation | ||
| CO2 System eutanazji | VetEquip | ||
| 25 G 5/8 Igła (do nakłucia serca) | Strzykawka BD | 305122 | |
| 0,1 ml (do nakłucie serca) | Terumo | SS-01T | |
| K3-EDTA Mikroprobówka 1,3 ml | Sarstedt | 41.1395.105 | |
| 10% neutralna formalina maślana | Fisher Scientific | SF100-4 |
Bibliografia
- Lessnick, S. L., Ladanyi, M. Molecular pathogenesis of Ewing sarcoma: new therapeutic and transcriptional targets. Annu Rev Pathol. 7, 145-159 (2012).
- Ladenstein, R. Primary disseminated multifocal Ewing sarcoma: results of the Euro-EWING 99 trial. J Clin Oncol. 28, 3284-3291 (2010).
- Dunst, J., Ahrens, S., Paulussen, M., Burdach, S., Jurgens, H. Prognostic impact of tumor perfusion in MR-imaging studies in Ewing tumors. Strahlenther Onkol. 177, 153-159 (2001).
- Aryee, D. N. Hypoxia modulates EWS-FLI1 transcriptional signature and enhances the malignant properties of Ewing's sarcoma cells in vitro. Cancer Research. 70, 4015-4023 (2010).
- Knowles, H. J., Schaefer, K. L., Dirksen, U., Athanasou, N. A. Hypoxia and hypoglycaemia in Ewing's sarcoma and osteosarcoma: regulation and phenotypic effects of Hypoxia-Inducible Factor. BMC cancer. 10, 372(2010).
- Tilan, J. U. Hypoxia shifts activity of neuropeptide Y in Ewing sarcoma from growth-inhibitory to growth-promoting effects. Oncotarget. 4, 2487-2501 (2013).
- Franzius, C. Successful high-resolution animal positron emission tomography of human Ewing tumours and their metastases in a murine xenograft model. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 33, 1432-1441 (2006).
- Hauer, K. DKK2 mediates osteolysis, invasiveness, and metastatic spread in Ewing sarcoma. Cancer Research. 73, 967-977 (2012).
- Manara, M. C. Preclinical in vivo study of new insulin-like growth factor-I receptor--specific inhibitor in Ewing's sarcoma. Clin Cancer Res. 13, 1322-1330 (2007).
- Scotlandi, K. Murine model for skeletal metastases of Ewing's sarcoma. J Orthop Res. 18, 959-966 (2000).
- Vormoor, J. Establishment of an in vivo model for pediatric Ewing tumors by transplantation into NOD/scid mice. Pediatr Res. 49, 332-341 (2001).
- Picarda, G. Preclinical evidence that use of TRAIL in Ewing's sarcoma and osteosarcoma therapy inhibits tumor growth, prevents osteolysis, and increases animal survival. Clin Cancer Res. 16, 2363-2374 (2010).
- Vormoor, B. Development of a preclinical orthotopic xenograft model of ewing sarcoma and other human malignant bone disease using advanced in vivo imaging. PLoS One. 9, e85128(2014).
- Wang, Y. Platelet-derived growth factor receptor beta inhibition increases tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) sensitivity: imatinib and TRAIL dual therapy. Cancer. 116, 3892-3902 (2010).
- Wang, Y. X. Inhibiting platelet-derived growth factor beta reduces Ewing's sarcoma growth and metastasis in a novel orthotopic human xenograft model. In Vivo. 23, 903-909 (2009).
- Odri, G. A. Zoledronic acid as a new adjuvant therapeutic strategy for Ewing's sarcoma patients. Cancer Research. 70, 7610-7619 (2010).
- Merchant, M. S. Interferon gamma enhances the effectiveness of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor agonists in a xenograft model of Ewing's sarcoma. Cancer Research. 64, 8349-8356 (2004).
- Hong, S. H. High neuropeptide Y release associates with Ewing sarcoma bone dissemination - in vivo model of site-specific metastases. Oncotarget. 6, 7151-7165 (2015).
- Lee, E. W. Neuropeptide Y induces ischemic angiogenesis and restores function of ischemic skeletal muscles. J Clin Invest. 111, 1853-1862 (2003).
- Tilan, J. U. Platelet neuropeptide Y is critical for ischemic revascularization in mice. FASEB J. , (2013).
- Toffoli, S., Michiels, C. Intermittent hypoxia is a key regulator of cancer cell and endothelial cell interplay in tumours. The FEBS journal. 275, 2991-3002 (2008).
- Das, B. Hypoxia enhances tumor stemness by increasing the invasive and tumorigenic side population fraction. Stem cells (Dayton, Ohio). 26, 1818-1830 (2008).
- Arndt, C. A., Rose, P. S., Folpe, A. L., Laack, N. N. Common musculoskeletal tumors of childhood and adolescence. Mayo Clin Proc. 87, 475-487 (2012).
- Mendoza, A. A novel noninvasive method for evaluating experimental lung metastasis in mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 52, 584-589 (2013).
- Feldman, D. B., Seely, J. C. Necropsy Guide: Rodents and the Rabbit. , CRC Press. (1988).
- Parkinson, C. M. Diagnostic necropsy and selected tissue and sample collection in rats and mice. J Vis Exp. , (2011).
- Raymond, A. K., Lazar, A. J. Bone Sarcoma. PP, L. in, S, P. atel , Springer. (2013).
- Dietel, M., Arps, H., Gerding, D., Trapp, M., Niendorf, A. Establishment of primary cell cultures: experiences with 155 cell strains. Klin Wochenschr. 65, 507-512 (1987).
- Varghese, A. J., Gulyas, S., Mohindra, J. K. Hypoxia-dependent reduction of 1-(2-nitro-1-imidazolyl)-3-methoxy-2-propanol by Chinese hamster ovary cells and KHT tumor cells in vitro and in vivo. Cancer Research. 36, 3761-3765 (1976).
- ATCC. , http://www.atcc.org/products/all/HTB-86.aspx#characteristics (2014).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
