Artykuł metodologiczny

Ekstrakcja strukturalnych zewnątrzkomórkowych substancji polimerowych z tlenowego osadu granulowanego

24.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54534

⸱

26 września 2016

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biotechnology, Delft University of Technology, 2Department of Biotechnology, Norwegian Biopolymer Laboratory (NOBIPOL), Norwegian University of Science and Technology

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół zapewnia metodologię rozpuszczania tlenowego granulowanego osadu w celu ekstrakcji alginianopodobnych polimerów zewnątrzkomórkowych (ALE).

Streszczenie

Aby ocenić i opracować metodologie ekstrakcji żelotwórczych zewnątrzkomórkowych substancji polimerowych (EPS), EPS z tlenowego osadu granulowanego (AGS) został wyekstrahowany przy użyciu sześciu różnych metod (wirowanie, sonikacja, kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA), formamid z wodorotlenkiem sodu (NaOH), formaldehyd z NaOH i węglanem sodu (Na2CO3) z ciepłem i ciągłym mieszaniem). AGS pobrano z pilotażowego reaktora oczyszczania ścieków. Właściwości żelu jonowego ekstrahowanego EPS w sześciu różnych metodach ekstrakcji przetestowano za pomocą jonów wapnia (Ca2+). Spośród sześciu zastosowanych metod ekstrakcji tylko ekstrakcja Na2CO3 mogła rozpuścić matrycę hydrożelową AGS. Odzyskane tą metodą alginianopodobne polimery zewnątrzkomórkowe (ALE) utworzyły jonowe kulki żelowe z Ca2+. Kulki Ca2+-ALE były stabilne w EDTA, formamid z NaOH, a formaldehyd z NaOH, co wskazuje, że ALE są jedną częścią polimerów strukturalnych w EPS. Zaleca się stosowanie metody ekstrakcji, która łączy obróbkę fizyczną i chemiczną w celu rozpuszczenia AGS i ekstrakcji strukturalnego EPS.

Wprowadzenie

W ostatnich latach proces tlenowego osadu granulowanego (AGS) stał się popularnym biologicznym procesem oczyszczania ścieków, z powodzeniem stosowanym w kilku pełnowymiarowych oczyszczalniach ścieków1. W przeciwieństwie do konwencjonalnego procesu osadu czynnego, w procesie AGS mikroorganizmy tworzą granulki zamiast kłaczków2. Granulki te mają lepszą zdolność do osiadania, są w stanie wytrzymać wyższe wskaźniki obciążenia organicznego i mają wyższą tolerancję na toksyczność niż kłaczki osadu czynnego3.

W przeciwieństwie do biofilmów, AGS powstaje spontanicznie, bez udziału jakiegokolwiek materiału nośnego4. W AGS, podobnie jak w biofilmach, mikroorganizmy wytwarzają znaczną ilość wysoce uwodnionych zewnątrzkomórkowych substancji polimerowych (EPS)5, tworząc matrycę hydrożelową, w której ulegają samounieruchomieniu 4-6. EPS są złożoną mieszaniną, składającą się z polisacharydów, białek, kwasów nukleinowych, (fosfo)lipidów, substancji humusowych i niektórych polimerów międzykomórkowych5,7,8. Te substancje polimerowe oddziałują ze sobą poprzez siły elektrostatyczne, wiązania wodorowe, przyciągające siły jonowe i/lub reakcje biochemiczne itp.5, tworząc gęstą i zwartą trzeciorzędową strukturę sieciową. Polimery w EPS, które są zdolne do tworzenia hydrożeli4,9 i przyczyniają się do tworzenia trzeciorzędowej struktury sieciowej, są pod tym względem uważane za strukturalne EPS, podzbiór całkowitego EPS.

EPS są odpowiedzialne za strukturę chemiczną i właściwości fizyczne granulek5. Dlatego tak ważne jest zrozumienie funkcji każdego związku EPS. Do ekstrakcji EPS10-15 stosuje się różne podejścia. Jednak ze względu na ich ekstremalną złożoność, prawie niemożliwe jest wyodrębnienie wszystkich składników EPS jedną metodą. Do tej pory nie ma jednej uniwersalnej metody ekstrakcji EPS. Wybór metody ekstrakcji wpływa nie tylko na całkowitą ilość, ale także na skład odzyskanych polimerów13,16-20. W zależności od rodzaju osadu i interesującego EPS wymagane są różne metody.

Ekstrakcja polimerów tworzących żel, scharakteryzowanie ich właściwości i zbadanie ich interakcji między sobą oraz z EPS nietworzącym żelu pomoże odkryć rolę EPS w tworzeniu tlenowych granulowanych osadów. Co więcej, polimery tworzące żel są również użytecznymi biopolimerami w zastosowaniach przemysłowych. Jedno z możliwych zastosowań zostało już pokazane poprzez zastosowanie polimerów tworzących żel z AGS jako materiału powłokowego w celu zwiększenia wodoodporności papieru21.

Dlatego potrzebne są metody ekstrakcji, specyficzne dla żelotwórczego EPS. Celem pracy jest opracowanie metodyki ekstrakcji żelotwórczego EPS z AGS. Do ekstrakcji EPS z AGS wybrano sześć metod ekstrakcji 10-15,22, które są często stosowane w literaturze. Dla każdej metodologii porównano całkowitą ilość i właściwości żelotwórcze ekstrahowanego EPS.

Protokół

UWAGA: AGS pobrano z reaktora pilotażowego Nereda w oczyszczalni ścieków w Utrechcie w Holandii. Reaktor był zasilany ściekami komunalnymi. Osad granulowany miał wskaźnik objętości osadu (SVI5min) wynoszący 59,5 ml/gVSS. Próbki osadu pobrano w kwietniu, pod koniec cyklu tlenowego. Po pobraniu próbek osad został natychmiast przetransportowany do laboratorium, przesiany i przechowywany w temperaturze -20 °C do momentu wykorzystania.

1. EPS Ekstrakcja

UWAGA: Odwirować granulowany osad o stężeniu 4 000 × g i temperaturze 4 °C przez 20 minut i zdekantować supernatant. Zbierz granulki w granulkach do ekstrakcji. Zawartość substancji stałych ogółem (TS) i lotnych (VS) w granulkach oznaczono metodami standardowymi23. Współczynnik przeliczeniowy między mokrą masą granulek – masą granulek pobranych bezpośrednio z osadu – a TS został określony przed ekstrakcją. Wszystkie ekstrakcje przeprowadzono w trzech egzemplarzach.

UWAGA: Do każdej metody ekstrakcji użyto 3 g mokrego granulatu. Ich wartości TS i VS (0,39 g TS i 0,34 g VS), mierzone w trzech egzemplarzach, wykorzystano do obliczenia wydajności ekstrakcji.

  1. Ekstrakcja wirowa11
    1. Przenieść 3 g (mokra masa) granulek do probówki wirówkowej i napełnić probówkę wirówkową do 50 ml wodą demineralizowaną.
    2. Lekko potrząśnij ręcznie probówką wirówkową.
    3. Odwirować probówkę wirówkową zawierającą mieszaninę w temperaturze 4 000 × g i temperaturze 4 °C przez 20 minut.
    4. Zebrać supernatant do szklanej zlewki, wyrzucić osad i kontynuować pracę z supernatantem, jak opisano w sekcji 1.7.
  2. Ekstrakcja dźwiękowa10
    1. Przenieść 3 g (mokra masa) granulek do probówki wirówkowej i napełnić probówkę wirówkową do 50 ml wodą demineralizowaną.
    2. Zastosować do mieszaniny pulsacyjną sonikację na lodzie przez 2,5 minuty przy 40 W.
    3. Odwirować probówkę wirówkową zawierającą mieszaninę w temperaturze 4 000 × g i temperaturze 4 °C przez 20 minut.
    4. Zebrać supernatant do szklanej zlewki, wyrzucić osad i kontynuować pracę z supernatantem, jak opisano w sekcji 1.7.
  3. Ekstrakcja kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA)11
    1. Przenieść 3 g (mokra masa) granulatu do szklanej butelki o pojemności 100 ml i napełnić butelkę do 50 ml 2% (w/v) roztworem EDTA.
    2. Lekko wstrząśnij butelką ręcznie i przechowuj ją w lodówce w temperaturze 4 °C przez 3 godziny.
    3. Przenieść mieszaninę do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.
    4. Odwirować probówkę wirówkową zawierającą mieszaninę w temperaturze 4 000 × g i temperaturze 4 °C przez 20 minut.
    5. Zebrać supernatant do szklanej zlewki, wyrzucić osad i kontynuować pracę z supernatantem, jak opisano w sekcji 1.7.
  4. Formamid – ekstrakcja wodorotlenkiem sodu (NaOH)13
    1. Przenieść 3 g (mokra masa) granulatu do szklanej butelki o pojemności 100 ml i napełnić butelkę do 50 ml wodą demineralizowaną.
    2. Dodać 0,3 ml 99% formamidu.
    3. Lekko wstrząśnij butelką ręcznie i przechowuj ją w lodówce w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę.
    4. Dodać 20 ml 1 M NaOH do zawiesiny granulek.
    5. Lekko wstrząśnij butelką ręcznie i przechowuj ją w lodówce w temperaturze 4 °C przez 3 godziny.
    6. Przenieść mieszaninę równomiernie do dwóch probówek wirówkowych o pojemności 50 ml.
    7. Odwirować probówki wirówkowe zawierające mieszaninę w temperaturze 4 000 × g i temperaturze 4 °C przez 20 minut.
    8. Zebrać supernatant do szklanej zlewki, wyrzucić osad i kontynuować pracę z supernatantem, jak opisano w sekcji 1.7.
  5. Formaldehyd – ekstrakcja NaOH11
    1. Przenieść 3 g (mokra masa) granulatu do szklanej butelki o pojemności 100 ml i napełnić butelkę do 50 ml wodą demineralizowaną.
    2. Dodać 0,3 ml 37% formaldehydu.
    3. Lekko wstrząśnij butelką ręcznie i przechowuj ją w lodówce w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę.
    4. Dodać 20 ml 1 M NaOH do zawiesiny granulek.
    5. Lekko wstrząśnij butelką ręcznie i przechowuj ją w lodówce w temperaturze 4 °C przez 3 godziny.
    6. Przenieść mieszaninę równomiernie do dwóch probówek wirówkowych o pojemności 50 ml.
    7. Odwirować probówki wirówkowe zawierające mieszaninę w temperaturze 4 000 × g i temperaturze 4 °C przez 20 minut.
    8. Zebrać supernatant do szklanej zlewki, wyrzucić osad i kontynuować pracę z supernatantem, jak opisano w sekcji 1.7.
  6. Wysoka temperatura – ekstrakcja węglanu sodu (Na2CO3)9,22,24
    1. Podgrzej 150 ml wody z kranu w szklanej zlewce o pojemności 1 000 ml na mieszadle magnetycznym do temperatury 80 °C.
    2. Przenieść 3 g (mokra masa) granulek do kolby z przegrodami o pojemności 250 ml i napełnić kolbę do 50 ml wodą demineralizowaną.
    3. Dodać 0,25 g Na2CO3 bezwodnego lub 0,67 g Na2CO3•10H2O do kolby, aby uzyskać stężenie 0,5% (w/v) Na2CO3 .
    4. Umieścić kolbę zawierającą mieszaninę w łaźni wodnej. Przykryć kolbę i szklankę zlewki oddzielnie folią aluminiową, aby zapobiec parowaniu.
    5. Mieszać mieszaninę przez 35 minut przy 400 obr./min w temperaturze 80 °C.
    6. Przenieść mieszaninę do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.
    7. Odwirować probówkę wirówkową zawierającą mieszaninę w temperaturze 4 000 × g i temperaturze 4 °C przez 20 minut.
    8. Zebrać sklarowany osad i wyrzucić osad.
  7. Pomiar TS i VS wszystkich ekstraktów zgodnie z metodami standardowymi23.
    1. Pobrać supernatant i dializować go przez 24 godziny w 1 000 ml ultraczystej wody (worek do dializy z odciętą masą cząsteczkową 3 500 Da (MWCO))11,12. Po 12 godzinach należy zmienić wodę do dializy, aby wzmocnić efekt dializy.
    2. Przenieść rozsądną frakcję (około 1/3) dializowanego supernatantu do aluminiowej naczynia w celu pomiaru TS i VS23,
      UWAGA: Suszyć próbkę przez noc w temperaturze 105 °C. Różnica wagowa pustego naczynia aluminiowego i naczynia aluminiowego zawierającego wysuszoną próbkę to zawartość TS. Następnie należy wypalić to samo aluminiowe naczynie zawierające próbkę w temperaturze 550 °C przez 2 godziny. Różnica wagowa między pustym naczyniem aluminiowym a naczyniem aluminiowym zawierającym spaloną próbkę to zawartość popiołu. Różnica między zawartością TS a popiołu polega na zawartości VS.
    3. Dla każdego ekstraktu przenieść pozostałą frakcję dializowanego supernatantu do szklanych zlewek o pojemności 10 ml. Zagęszczać szwarodnik przez 2 dni w temperaturze 60 °C do końcowej objętości 1-2 ml w celu zwiększenia stężenia polimeru w supernatancie.

2. Ekstrakcja alginianopodobnego polimeru zewnątrzkomórkowego (ALE)

  1. Ekstrakt otrzymany w kroku 1.6.8 należy poddać dializie zgodnie z krokiem 1.7.1.
  2. Przenieść dializowany ekstrakt do szklanej zlewki o pojemności 250 ml. Powoli mieszaj ekstrakcję przy 100 obr./min i temperaturze pokojowej. Stale monitoruj zmiany pH za pomocą elektrody pH, dodając 1 M kwas solny (HCl) do końcowego pH 2,2 ± 0,05 w celu uzyskania ALE w postaci kwaśnej.
  3. Po dostosowaniu pH do 2,2 przenieść ekstrakt do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i odwirować w temperaturze 4 000 × g i temperaturze 4 °C przez 20 minut.
  4. Odrzucić sklarowany osad i zebrać żelopodobny osad. Żelowaty granulat to ALE w postaci kwaśnej.
  5. Aby otrzymać sodową (lub potasową) formę ALE, należy powoli dodać 0,5 M NaOH (lub 0,5 M wodorotlenku potasu) do żelu otrzymanego w kroku 2.4, powoli mieszając żel szklanym patyczkiem ręcznie, aż do osiągnięcia pH 8,5.

3. Test tworzenia hydrożelu jonowego

UWAGA: W celu sprawdzenia, czy wyekstrahowany EPS ma właściwości tworzenia hydrożelu jonowego, zastosowano test tworzenia kulek z jonami Ca2+ 25.

  1. Po zagęszczeniu ekstraktu w kroku 1.7.3 do objętości 1-2 ml, powoli wymieszać mieszaninę szklanym patyczkiem i dostosować jej pH do 8,5 za pomocą 0,5 M NaOH.
  2. Pobrać ekstrakt z kroku 3.1 lub ALE sodu z kroku 2.5 i powoli wlać ekstrakt pipetą Pasteura do 2,5% (w/v) roztworu chlorku wapnia (CaCl2).
    UWAGA: Jeśli wyekstrahowany EPS ma właściwości tworzące jonowy hydrożel hydrożelowy, utworzą się kulki w kształcie kropli (kuliste). Jeśli wyekstrahowany EPS nie ma właściwości tworzących jonowy hydrożel, ekstrakt rozproszy się w roztworze CaCl2.

4. Test stabilności hydrożelu jonowego

UWAGA: Aby lepiej zrozumieć rolę jonowego hydrożelu EPS w tworzeniu struktury AGS, przeprowadzono testy stabilności na kulkach jonowego hydrożelu z ekstrakcji Na2CO3 , zebranych w kroku 3.2.

  1. Trzymaj kulki hydrożelowe przez 30 minut w roztworze CaCl2.
  2. Za pomocą łyżki wyjmij kulki hydrożelowe z roztworu CaCl2 i podziel kulki na cztery równe frakcje.
  3. Przechowuj frakcję 1 w 10 ml wody demineralizowanej przez 4 godziny w temperaturze 4 °C.
    Następujące testy stabilności przeprowadzono w taki sam sposób, jak opisano w metodach ekstrakcji 1.3 - 1.5.
  4. Frakcję 2 należy przechowywać w 10 ml 2% (w/v) roztworu EDTA przez 3 godziny w temperaturze 4 °C.
  5. Frakcję 3 należy przechowywać w 7,15 ml wody demineralizowanej z 60 μl 99% formamidu przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C. Następnie dodać 2,85 ml 1 M NaOH i przechowywać frakcję 3 przez 3 godziny w temperaturze 4 °C.
  6. Frakcję 4 przechowywać w 7,15 ml wody demineralizowanej z 60 μl 37% formaldehydu przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C. Następnie dodać 2,85 ml 1 M NaOH i przechowywać frakcję 4 przez 3 godziny w temperaturze 4 °C.
  7. Monitorować, czy podczas przechowywania występuje widoczny rozpad kulek w warunkach opisanych w ppkt 4.3-4.6, aby ocenić, czy kulki wytrzymują warunki ekstrakcji.

Wyniki

Ekstrakcja EPS
Wygląd granulek po zastosowaniu różnych procedur ekstrakcji EPS przedstawiono na Rysunku 1. Kształt i struktura żelowa granulek pozostały nienaruszone po wirowaniu (Rysunek 1a) oraz ekstrakcji EDTA (Rysunek 1c). Sonikacja doprowadziła do rozpadu granulek na fragmenty o różnych rozmiarach. Mętność w fazie ciekłej mogła wynikać z zawiesiny małych fragmentów (Rysunek 1b), ponieważ mętność znacznie zmalała po wirowaniu. Sam formamid i formaldehyd nie miały wpływu na zmianę kształtu granulek ani ich struktury żelowej (dane nie pokazano). Po dodaniu NaOH faza ciekła przybrała żółtawy kolor. Z powierzchni granulek oddzielił się pewien puszysty materiał, który utworzył warstwę nad osadzonymi granulkami (Rysunek 1d oraz 1e). Niemniej jednak kształt granulek nie uległ zmianie. Dodatek NaOH najwyraźniej poprawił solubilizację EPS, ale nie był w stanie uszkodzić struktury matrycy żelowej. W porównaniu do tego, po ekstrakcji Na2CO3 granulki całkowicie zniknęły (Rysunek 1f). Zamiast nich utworzyła się mieszanina cieczy o charakterze zolu i drobnych cząsteczek przypominających galaretkę, co wskazuje, że matryca żelowa granulek została faktycznie solubilizowana.

Schemat procesu sedymentacji; sześć etapów w szczelnych fiolkach; osadzanie się cząsteczek w cieczy w czasie.
Rycina 1. Ekstrakcje EPS z tlenowego osadu granularnego. W celu lepszej wizualizacji wpływu każdej metody ekstrakcji na granule, eksperymenty przeprowadzono w 25 ml szklanych butelkach. Po procedurze ekstrakcji ekstrakty pozostawiono na 1 hr w temperaturze pokojowej, aby umożliwić osadzenie się zawiesiny. (a) ekstrakcja przez wirowanie, (b) ekstrakcja przez sonikację, (c) ekstrakcja EDTA, (d) ekstrakcja formamidem – NaOH, (e) ekstrakcja formaldehydem – NaOH, (f) ekstrakcja w wysokiej temperaturze – Na2CO3. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wydajność EPS w stosunku do frakcji VS dla każdej z metod przedstawiono na Rysunku 2. Wydajność wyrażono w mg VSEPS na g początkowego VSgranule. Ilość EPS uzyskana za pomocą formaldehydu + NaOH, formamid + NaOH oraz Na2CO3 + ciepło + mieszanie była wyższa niż w przypadku wirowania, sonikacji i ekstrakcji EDTA. Podobne wyniki dla tych technik ekstrakcji wykazano również w poprzednich badaniach11-13,15, co wskazuje, że warunki zasadowe zwiększają rozpuszczalność EPS26,27. Ilość EPS odzyskana za pomocą Na2CO3 była najwyższa, przekraczając ponad 20-krotnie ilość uzyskaną wyłącznie przez wirowanie. Dodatkowo, całkowitą wydajność EPS w ekstrakcji Na2CO3 można dalej zwiększyć poprzez wielokrotne ekstrakcje. Druga ekstrakcja z wykorzystaniem osadu odrzuconego w kroku 1.6.8 (sekcja protokołu) pierwszej ekstrakcji zwiększyła całkowitą wydajność o 28%, a ekstrakcja czterokrotna zwiększyła całkowitą wydajność nawet o 46%.

Wykres słupkowy wydajności chemicznej i zawartości popiołu; metody ekstrakcji — wirowanie, sonikacja, EDTA.
Rysunek 2. Wyniki wszystkich metod ekstrakcji w odniesieniu do wydajności VS i zawartości popiołu. Dla każdej ekstrakcji pierwszy słupek reprezentuje wydajność VS w mg VSEPS na g początkowego VSgranule. Drugi słupek reprezentuje procentową zawartość wagową popiołu w ekstrahowanym TS. Słupki błędów ilustrują odchylenie standardowe trzech ekstrakcji przeprowadzonych dla każdej techniki ekstrakcji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Ekstrakcja polimeru zewnątrzkomórkowego podobnego do alginianu (ALE)
Po dostosowaniu pH EPS wyekstrahowanego metodą ekstrakcji Na2CO3 do wartości 2,2, wytrąciło się 63% całkowitej zawartości VS. Osad ten stanowi kwasowy ALE25. Pozostała frakcja to prawdopodobnie EPS, który może zostać rozpuszczony w warunkach ekstrakcji, lecz nie może utworzyć osadu przy pH 2,2.

Test tworzenia hydrożelu jonowego
Granulaty tlenowe opisano jako struktury podobne do hydrożelu. Proces granulacji uznano za zjawisko tworzenia żelu, w którym glikozydy pełnią rolę czynnika żelującego4,9,25,28. Zazwyczaj Ca2+ jest jednym z najpowszechniejszych kationów w ściekach. Ponadto łatwo wiąże się z kwaśnymi polisacharydami (np. alginianami i kwasem poligalakturonowym), prawdopodobnie pełniąc funkcję przeciwjonu pośredniczącego w żelowaniu29, co prowadzi do powstania jonowo sieciowanego hydrożelu. Zaobserwowano, że dodatek jonów Ca2+ może przyspieszać granulację osadu tlenowego30. W związku z tym Ca2+-EPS (hydrożel jonowy) może odgrywać istotną rolę w budowie struktury matrycy żelowej w tlenowym osadzie granularnym. W tym kontekście sprawdzenie, czy wyekstrahowane EPS tworzą hydrożel jonowy w obecności jonów Ca2+, może służyć jako test pozwalający ustalić, czy wyekstrahowane EPS są polimerami strukturalnymi przyczyniającymi się do formowania matrycy żelowej w tlenowym osadzie granularnym9.

W niniejszym badaniu, spośród EPS wyekstrahowanych z AGS (Rycina 3a) różnymi metodami, tylko EPS wyekstrahowany za pomocą Na2CO3 zachował kształt kropli w 2,5% (w/v) roztworze CaCl2 i utworzył stabilne jonowe kuleczki hydrożelu. Ponadto sodowy ALE otrzymany z tego EPS w kolejnych etapach (ekstrakcja polimeru ALE, Rycina 3b) wykazał tę samą właściwość. Kolor i morfologia kuleczek żelu Ca2+-ALE (Rycina 3c) są podobne do tlenowego osadu granularnego (Rycina 3a). Wygląda na to, że EPS wyekstrahowany metodą z użyciem Na2CO3 przyczynia się do tworzenia macierzy żelowej w tlenowym osadzie granularnym. ALE, będący głównym składnikiem tego EPS, to polimery strukturalne zdolne do tworzenia hydrożelu jonowego.

Test stabilności hydrożelu jonowego
Zaobserwowano, że podczas ekstrakcji EPS granulaty tlenowe zachowały swój kulisty kształt w EDTA, formaldehydzie + NaOH oraz formamidzie + NaOH (Rysunek 1). Aby sprawdzić, czy wyekstrahowane polimery strukturalne odgrywają rolę w stabilności granulatów, kuleczki Ca2+-ALE poddano dokładnie takiej samej obróbce jak granulaty tlenowe podczas ekstrakcji. Co ciekawe, kuleczki Ca2+-ALE wykazały podobną stabilność jak AGS (Rysunek 3d - 3f), tzn. kuleczki Ca2+-ALE były niezwykle stabilne w EDTA. Odnotowano niewielką ilość ALE oddzielającą się z powierzchni kuleczek Ca2+-ALE (małe brązowe kłaczki na Rysunku 3e oraz 3f), gdy kuleczki Ca2+-ALE były namaczane odpowiednio w formaldehydzie + NaOH i formamidzie + NaOH przez trzy godziny. Ta podobieństwo w zakresie stabilności między kuleczkami Ca2+-ALE a granulatami tlenowymi wskazuje, że ALE są jednym z istotnych polimerów strukturalnych tworzących macierz żelową AGS.

Eksperyment kiełkowania nasion; szalki Petri pokazują nasiona na różnych etapach; analiza wzorców wzrostu.
Rycina 3. Granulki tlenowe i ekstrahowany ALE. (a) Granulki w wodzie zdemineralizowanej przed ekstrakcją. (b) Zakwaszony ALE (ekstrahowany zgodnie z paragrafami 1.6 i 2) po wirowaniu przy 4,000 × g i 4 °C przez 20 min. Wyniki testu stabilności hydrożelu jonowego. (c) Kuleczki Ca2+-ALE przechowywane w wodzie zdemineralizowanej przez 4 hr w 4 °C. (d) Kuleczki Ca2+-ALE przechowywane w 2% EDTA przez 3 hr w 4 °C. (e) Kuleczki Ca2+-ALE przechowywane w formamidzie + NaOH przez 4 hr w 4 °C. (f) Kuleczki Ca2+-ALE przechowywane w formaldehydzie + NaOH przez 4 hr w 4 °C. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Uwagi do części dotyczącej protokołu
Ekstrakcja EPS/ALE jest opisana dla objętości 50 ml i 3 g granulatu. Te wartości mają charakter orientacyjny. Ekstrakcje z wyższymi stężeniami granulek mogą zmniejszyć wydajność ekstrahowanego EPS. Podczas ekstrakcji ALE temperatura powinna być utrzymywana na stałym poziomie 80 °C przez 30 minut. Czas potrzebny do podgrzania mieszaniny (około 5 minut) jest zawarty w protokole. Ponadto skuteczność ekstrakcji zwiększa się dzięki zastosowaniu mieszadła magnetycznego o tym samym rozmiarze, co średnica dna kolby. Zapewni to dobre właściwości mieszania i efekty mielenia, sprzyjając ekstrakcji EPS.

W dalszej części sekcji protokołu określa się wydajność TS i VS wszystkich ekstrakcji (supernatant zebrany w krokach 1.1-1.6). Dializa musi być wykonywana przed pomiarem TS i VS, aby zmniejszyć możliwe błędy wynikające z obecności substancji chemicznych używanych do ekstrakcji. Zaleca się MWCO na poziomie 3,500 Da w celu usunięcia tych chemikaliów przy jednoczesnym zachowaniu makrocząsteczek EPS w worku do dializy. Worek do dializy powinien mieć większą objętość niż objętość ekstraktu. Jest to konieczne, ponieważ objętość ekstraktu zwiększy się podczas dializy (np. w przypadku ekstrakcji EDTA do 40% wzrostu objętości). Stopień usunięcia substancji chemicznej za pomocą dializy można określić, mierząc pH w próbce przed i po dializie. Alternatywnie, pomiary przewodności wody do dializy pokazują zakres usuwania jonów.

Aby uzyskać ALE z całkowitej ilości wyekstrahowanego EPS (kroki 1.6 i 2), etap dializy jest opcjonalny. Niemniej jednak dializa ma trzy zalety: zmniejsza ilość HCl potrzebną do wytrącania, poprawia przenoszenie masy kwasowej w ekstrakcie i zmniejsza zawartość popiołu w otrzymanym ALE. Do wytrącania ALE zaleca się stosowanie szklanej zlewki o znacznie większej objętości niż ekstrakt. Na2CO3 jest zwykle przedawkowany podczas ekstrakcji. Dodany HCl najpierw reaguje z Na2CO3 pozostawionym w ekstrakcie, powodując powstanie dwutlenku węgla i, jeśli próbka nie była wcześniej dializowana, pienienie się. Podczas dodawania HCl ekstrakt należy powoli mieszać za pomocą mieszadła magnetycznego o tej samej wielkości co dno zlewki. Mieszadło tej wielkości i powolne mieszanie spowoduje równomierne wymieszanie bez naruszania struktury osadu. Jeśli w ekstrakcie tworzą się kwaśne grudki żelu, zlewkę należy lekko zakręcić ręcznie. Wytrącanie przeprowadza się przy stężeniu kwasu 1 M, aby uniknąć dużego wzrostu objętości ekstraktu, przy jednoczesnym uzyskaniu jednorodnego rozkładu kwasu w próbce. Wyższe stężenia kwasów mogą powodować regionalny spadek pH i tworzenie się kwaśnych grudek żelu. pH niższe niż 2,0 zmniejsza ilość ALE, którą można odzyskać, prawdopodobnie z powodu zmian strukturalnych polimerów przy niższym pH. Dlatego ważne jest, aby utrzymać końcowe pH na poziomie 2,20 ± 0,05.

Ograniczenia
Metoda ekstrakcji ALE ma na celu ekstrakcję strukturalnych zewnątrzkomórkowych polimerów EPS z AGS lub ogólnie biofilmów i nie jest przeznaczona do ekstrakcji wszystkich obecnych EPS. Aby wyodrębnić cały EPS, konieczna jest kombinacja więcej niż jednej metody ekstrakcji. Ponadto, jak wykazano przy wzroście wydajności VSEPS poprzez zastosowanie podwójnej i poczwórnej ekstrakcji, jedna ekstrakcja nie spowoduje ekstrakcji całego strukturalnego EPS. Ekstrakcja ALE to ostra metoda ekstrakcji EPS, łącząca ciągłe mieszanie z warunkami cieplnymi i zasadowymi. Z tego powodu możliwe jest, że część materiału wewnątrzkomórkowego zostanie wyekstrahowana razem z EPS. Chociaż liza komórek może być spowodowana fizycznymi i chemicznymi technikami ekstrakcji (sonikacja31,32, NaOH31,32, EDTA11,32, CER32, ciepło32 i wysokie szybkości ścinania przez mieszanie19), obecność materiału wewnątrzkomórkowego w odzyskanym EPS nadal wymaga weryfikacji. Właściwości jonotwórcze żelu wyekstrahowanego EPS są głównym celem tych badań, nie analizowano, czy odzyskany EPS zawiera materiał wewnątrzkomórkowy. Przyszłe badania będą koncentrować się na identyfikacji materiału wewnątrzkomórkowego w wyekstrahowanym EPS.

Solubilizacja matrycy hydrożelowej AGS ma kluczowe znaczenie dla ekstrakcji strukturalnego EPS
EPS tworzy gęstą i zwartą matrycę hydrożelową w AGS. Chociaż EPS zawiera różne klasy makrocząsteczek organicznych, takich jak polisacharydy, białka, kwasy nukleinowe, (fosfo)lipidy, substancje humusowe i niektóre polimery międzykomórkowe7,5,8, nie wszystkie z nich tworzą żel. Tylko te polimery tworzące żel są tutaj uważane za polimery strukturalne w EPS.

Celem ekstrakcji EPS jest najpierw rozpuszczenie EPS, a następnie zebranie rozpuszczonego EPS. Jeśli strukturalny EPS (tj. EPS tworzący hydrożel) jest celem ekstrakcji, najpierw należy rozpuścić żelową matrycę AGS. Tylko metody, które mogą rozpuścić matrycę żelową, są w stanie wyodrębnić strukturalny EPS. W tych badaniach niektóre często stosowane metody ekstrakcji EPS, takie jak wirowanie10-15, sonikacja10,14,15, EDTA 10-12,14,15, formaldehyd + NaOH10-15 i formamid + NaOH13 nie były w stanie skutecznie wyizolować strukturalnego EPS. Wynika to z faktu, że matryca hydrożelowa granulek tlenowych nie została rozpuszczona tymi metodami. Z tego powodu testy stabilności w sekcji 4 przeprowadzono tylko w warunkach występujących w ekstrakcji EDTA, formamid + NaOH i formaldehyd + NaOH. Te trzy ekstrakcje nie były w stanie wyizolować strukturalnego EPS, ale nadal uzyskały najwyższą wydajność VSEPS oprócz ekstrakcji Na2CO3 . Nie zastosowano warunków ekstrakcji Na2CO3 , ponieważ ta metoda ekstrakcji wyraźnie rozpuszczała matrycę AGS. W związku z tym warunki zastosowane podczas badania stabilności uznano za reprezentatywne.

Ekstrakcja żywicą kationowymienną (CER), inną często stosowaną metodą ekstrakcji EPS, nie była brana pod uwagę w tym porównaniu, ponieważ wcześniejsze badania nad ekstrakcją EPS za pomocą CER nie przyniosły lepszych wyników niż zastosowane tutaj ekstrakcje chemiczne.

Żeloforming EPS w AGS
Żelotwórcze EPS są uważane za strukturalny EPS w hydrożelowej matrycy AGS. Warto podkreślić, że istnieją różne rodzaje hydrożeli, takie jak żele jonowe, żele indukowane temperaturą i żele indukowane pH. To badanie koncentruje się tylko na EPS, które tworzą żele jonowe. Biorąc pod uwagę dużą frakcję wydobywanego żelu strukturalnego, jest to prawdopodobnie dominujący strukturalny styropian. Z pewnością istnieje możliwość, że inne rodzaje EPS, które tworzą różne rodzaje hydrożeli (np. żel indukowany pH28) występują w tym samym lub innym rodzaju granulek tlenowych. Niemniej jednak, bez względu na to, jaki rodzaj hydrożelu jest celowany, solubilizacja matrycy żelowej EPS jest najważniejszym krokiem do ekstrakcji żelu EPS.

Obecnie przeprowadzono niewiele badań nad strukturalnym styropianem szlamu granulowanego. Ekstrakcja ALE opisana w tym protokole jest zdolna do ekstrakcji żelotwórczego EPS z AGS i będzie wykorzystywana w przyszłych badaniach do charakteryzowania strukturalnego EPS. Należy przeprowadzić więcej badań nad AGS, strukturalnym EPS i niestrukturalnym EPS, aby lepiej zrozumieć proces i funkcję granulacji i EPS. W szczególności należy zbadać następujące trzy punkty: dlaczego mikroorganizmy wytwarzają tak dużą ilość EPS, jaki jest dokładny skład EPS i jak zmienia się skład EPS w zależności od zmian środowiskowych. Wykrywanie i analizowanie wszystkich zaangażowanych związków i ich interakcji pomoże zrozumieć biofilmy i jak je wykorzystać na naszą korzyść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Te badania były finansowane przez SIAM Gravitation Grant 024.002.002, Holenderską Organizację Badań Naukowych oraz przez Holenderską Fundację Technologiczną (STW - Simon Stevin Meester 2013). Autorzy pragną podziękować Mario Pronkowi za dostarczenie próbek granulowanego szlamu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kolba z przegrodami 250 mlKimble25630-250
Zlewka szklana 1 000 mlVWR213-1128
RCT basic, mieszadło magnetyczne z termometremIKA3810000
dekahydrat węglanu soduMerck KGaA1063911000
probówki wirówkowe 50 mlgreiner bio-one227261
Multifuge 1 S-R, wirówkaHeraeus/ThermoScientific-kwas
solny, 37%Sigma-Aldrich30721-1L-GL-D
Zlewka szklana 250 mlVWR213-1124
chlorek wapnia dwuwodnyMerck KGaA1023821000
1 ml Pipeta PasteuraCopan201C

Bibliografia

  1. Pronk, M., de Kreuk, M. K., de Bruin, B., Kamminga, P., Kleerebezem, R., van Loosdrecht, M. C. M. Full scale performance of the aerobic granular sludge process for sewage treatment. Water Res. 84, 207-217 (2015).
  2. Kreuk, M. K., Kishida, N., van Loosdrecht, M. C. M. Aerobic granular sludge - state of the art. Water Sci. Technol. 55 (8-9), 75(2007).
  3. Adav, S. S., Lee, D. J., Show, K. Y., Tay, J. H. Aerobic granular sludge: Recent advances. Biotechnol. Adv. 26, 411-423 (2008).
  4. Seviour, T., Pijuan, M., Nicholson, T., Keller, J., Yuan, Z. Understanding the properties of aerobic sludge granules as hydrogels. Biotechnol. Bioeng. 102 (5), 1483-1493 (2009).
  5. Flemming, H. -C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nat. Rev. Microbiol. 8 (9), 623-633 (2010).
  6. Seviour, T., Yuan, Z., van Loosdrecht, M. C. M., Lin, Y. Aerobic sludge granulation: A tale of two polysaccharides? Water Res. 46 (15), 4803-4813 (2012).
  7. Wingender, J., Neu, T. R., Flemming, H. -C. What are Bacterial Extracellular Polymeric Substances. Microb. Extracell. Polym. Subst. Charact. Struct. Funct. , 27-53 (1999).
  8. Flemming, H. -C., Neu, T. R., Wozniak, D. J. The EPS Matrix: The "House of Biofilm Cells.". J. Bacteriol. 189 (22), 7945-7947 (2007).
  9. Lin, Y. M., Sharma, P. K., van Loosdrecht, M. C. M. The chemical and mechanical differences between alginate-like exopolysaccharides isolated from aerobic flocculent sludge and aerobic granular sludge. Water Res. 47 (1), 57-65 (2013).
  10. Fang, H. H. P., Jia, X. S. Extraction of extracellular polymer from anaerobic sludges. Biotechnol. Tech. 10 (11), 803-808 (1996).
  11. Liu, H., Fang, H. H. P. Extraction of extracellular polymeric substances (EPS) of sludges. J. Biotechnol. 95, 249-256 (2002).
  12. Comte, S., Guibaud, G., Baudu, M. Effect of extraction method on EPS from activated sludge: An HPSEC investigation. J. Hazard. Mater. 140 (1-2), 129-137 (2007).
  13. Adav, S. S., Lee, D. J. Extraction of extracellular polymeric substances from aerobic granule with compact interior structure. J. Hazard. Mater. 154, 1120-1126 (2008).
  14. Pan, X., Liu, J., Zhang, D., Chen, X. I., Li, L., Song, W., Yang, J. A comparison of five extraction methods for extracellular polymeric substances (EPS) from biofilm by using three-dimensional excitation-emission matrix (3DEEM) fluorescence spectroscopy. Water SA. 36 (1), 111-116 (2010).
  15. D'Abzac, P., Bordas, F., Van Hullebusch, E., Lens, P. N. L., Guibaud, G. Extraction of extracellular polymeric substances (EPS) from anaerobic granular sludges: Comparison of chemical and physical extraction protocols. Appl. Microbiol. Biotechnol. 85 (5), 1589-1599 (2010).
  16. Comte, S., Guibaud, G., Baudu, M. Relations between extraction protocols for activated sludge extracellular polymeric substances (EPS) and EPS complexation properties: Part I. Comparison of the efficiency of eight EPS extraction methods. Enzyme Microb. Technol. 38 (1-2), 237-245 (2006).
  17. Adav, S. S., Lee, D. J., Tay, J. H. Extracellular polymeric substances and structural stability of aerobic granule. Water Res. 42, 1644-1650 (2008).
  18. Caudan, C., Filali, A., Lefebvre, D., Spérandio, M., Girbal-Neuhauser, E. Extracellular polymeric substances (EPS) from aerobic granular sludges: Extraction, fractionation, and anionic properties. Appl. Biochem. Biotechnol. 166 (7), 1685-1702 (2012).
  19. Frølund, B., Palmgren, R., Keiding, K., Nielsen, P. H. Extraction of extracellular polymers from activated sludge using a cation exchange resin. Water Res. 30 (8), 1749-1758 (1996).
  20. Nielsen, P. H., Jahn, A. Extraction of EPS. Microb. Extracell. Polym. Subst. Charact. Struct. Funct. , 49-72 (1999).
  21. Lin, Y. M., Nierop, K. G. J., Girbal-Neuhauser, E., Adriaanse, M., van Loosdrecht, M. C. M. Sustainable polysaccharide-based biomaterial recovered from waste aerobic granular sludge as a surface coating material. Sustain. Mater. Technol. 4, 24-29 (2015).
  22. Lin, Y. M., Wang, L., Chi, Z. M., Liu, X. Y. Bacterial Alginate Role in Aerobic Granular Bio-particles Formation and Settleability Improvement. Sep. Sci. Technol. 43 (7), 1642-1652 (2008).
  23. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. , American Public Health Association. Washington DC. (1998).
  24. Mchugh, D. J. A guide to the seaweed industry. , FAO Fish. Tech. Pap. 441. Food and Agriculture Organization of the United Nations. Rome, Italy. (2003).
  25. Lin, Y., de Kreuk, M., van Loosdrecht, M. C. M., Adin, A. Characterization of alginate-like exopolysaccharides isolated from aerobic granular sludge in pilot-plant. Water Res. 44 (11), 3355-3364 (2010).
  26. Zorel, J. A., Aquino, S. F., Sanson, aL., Castro-Borges, W., Silva, S. Q. Evaluation of EPS extraction protocols from anaerobic sludge for gel-based proteomic studies. Water Sci. Technol. 72 (4), 535(2015).
  27. Ruiz-Hernando, M., Cabanillas, E., Labanda, J., Llorens, J. Ultrasound, thermal and alkali treatments affect extracellular polymeric substances (EPSs) and improve waste activated sludge dewatering. Process Biochem. 50 (3), 438-446 (2015).
  28. Seviour, T., Pijuan, M., Nicholson, T., Keller, J., Yuan, Z. Gel-forming exopolysaccharides explain basic differences between structures of aerobic sludge granules and floccular sludges. Water Res. 43, 4469-4478 (2009).
  29. de Kerchove, A. J., Elimelech, M. Formation of polysaccharide gel layers in the presenceof Ca2+ and K+ ions: Measurements and mechanisms. Biomacromolecules. 8 (1), 113-121 (2007).
  30. Jiang, H. L., Tay, J. H., Liu, Y., Tay, S. T. L. Ca2+ augmentation for enhancement of aerobically grown microbial granules in sludge blanket reactors. Biotechnol. Lett. 25 (2), 95-99 (2003).
  31. Liang, Z., Li, W., Yang, S., Du, P. Extraction and structural characteristics of extracellular polymeric substances (EPS), pellets in autotrophic nitrifying biofilm and activated sludge. Chemosphere. 81 (5), 626-632 (2010).
  32. Guo, X., Liu, J., Xiao, B. Evaluation of the damage of cell wall and cell membrane for various extracellular polymeric substance extractions of activated sludge. J. Biotechnol. 188, 130-135 (2014).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Ekstrakcja EPSwęglan sodutworzenie hydrożelujony wapniaprocedura dializyregulacja pHtworzenie kuleczek żelowychtest stabilności EDTA
Ekstrakcja strukturalnych zewnątrzkomórkowych substancji polimerowych z tlenowego osadu granulowanego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.