Ekstrakcja strukturalnych zewnątrzkomórkowych substancji polimerowych z tlenowego osadu granulowanego

Podsumowanie

Protokół zapewnia metodologię rozpuszczania tlenowego granulowanego osadu w celu ekstrakcji alginianopodobnych polimerów zewnątrzkomórkowych (ALE).

Streszczenie

Aby ocenić i opracować metodologie ekstrakcji żelotwórczych zewnątrzkomórkowych substancji polimerowych (EPS), EPS z tlenowego osadu granulowanego (AGS) został wyekstrahowany przy użyciu sześciu różnych metod (wirowanie, sonikacja, kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA), formamid z wodorotlenkiem sodu (NaOH), formaldehyd z NaOH i węglanem sodu (Na₂CO₃) z ciepłem i ciągłym mieszaniem). AGS pobrano z pilotażowego reaktora oczyszczania ścieków. Właściwości żelu jonowego ekstrahowanego EPS w sześciu różnych metodach ekstrakcji przetestowano za pomocą jonów wapnia (^Ca2+). Spośród sześciu zastosowanych metod ekstrakcji tylko ekstrakcja Na₂CO₃ mogła rozpuścić matrycę hydrożelową AGS. Odzyskane tą metodą alginianopodobne polimery zewnątrzkomórkowe (ALE) utworzyły jonowe kulki żelowe z Ca²⁺. Kulki Ca²⁺-ALE były stabilne w EDTA, formamid z NaOH, a formaldehyd z NaOH, co wskazuje, że ALE są jedną częścią polimerów strukturalnych w EPS. Zaleca się stosowanie metody ekstrakcji, która łączy obróbkę fizyczną i chemiczną w celu rozpuszczenia AGS i ekstrakcji strukturalnego EPS.

Wprowadzenie

W ostatnich latach proces tlenowego osadu granulowanego (AGS) stał się popularnym biologicznym procesem oczyszczania ścieków, z powodzeniem stosowanym w kilku pełnowymiarowych oczyszczalniach ścieków¹. W przeciwieństwie do konwencjonalnego procesu osadu czynnego, w procesie AGS mikroorganizmy tworzą granulki zamiast kłaczków². Granulki te mają lepszą zdolność do osiadania, są w stanie wytrzymać wyższe wskaźniki obciążenia organicznego i mają wyższą tolerancję na toksyczność niż kłaczki osadu czynnego³.

W przeciwieństwie do biofilmów, AGS powstaje spontanicznie, bez udziału jakiegokolwiek materiału nośnego⁴. W AGS, podobnie jak w biofilmach, mikroorganizmy wytwarzają znaczną ilość wysoce uwodnionych zewnątrzkomórkowych substancji polimerowych (EPS)⁵, tworząc matrycę hydrożelową, w której ulegają samounieruchomieniu ^4-6. EPS są złożoną mieszaniną, składającą się z polisacharydów, białek, kwasów nukleinowych, (fosfo)lipidów, substancji humusowych i niektórych polimerów międzykomórkowych^5,7,8. Te substancje polimerowe oddziałują ze sobą poprzez siły elektrostatyczne, wiązania wodorowe, przyciągające siły jonowe i/lub reakcje biochemiczne itp.5, tworząc gęstą i zwartą trzeciorzędową strukturę sieciową. Polimery w EPS, które są zdolne do tworzenia hydrożeli^4,9 i przyczyniają się do tworzenia trzeciorzędowej struktury sieciowej, są pod tym względem uważane za strukturalne EPS, podzbiór całkowitego EPS.

EPS są odpowiedzialne za strukturę chemiczną i właściwości fizyczne granulek⁵. Dlatego tak ważne jest zrozumienie funkcji każdego związku EPS. Do ekstrakcji EPS^10-15 stosuje się różne podejścia. Jednak ze względu na ich ekstremalną złożoność, prawie niemożliwe jest wyodrębnienie wszystkich składników EPS jedną metodą. Do tej pory nie ma jednej uniwersalnej metody ekstrakcji EPS. Wybór metody ekstrakcji wpływa nie tylko na całkowitą ilość, ale także na skład odzyskanych polimerów^13,16-20. W zależności od rodzaju osadu i interesującego EPS wymagane są różne metody.

Ekstrakcja polimerów tworzących żel, scharakteryzowanie ich właściwości i zbadanie ich interakcji między sobą oraz z EPS nietworzącym żelu pomoże odkryć rolę EPS w tworzeniu tlenowych granulowanych osadów. Co więcej, polimery tworzące żel są również użytecznymi biopolimerami w zastosowaniach przemysłowych. Jedno z możliwych zastosowań zostało już pokazane poprzez zastosowanie polimerów tworzących żel z AGS jako materiału powłokowego w celu zwiększenia wodoodporności papieru²¹.

Dlatego potrzebne są metody ekstrakcji, specyficzne dla żelotwórczego EPS. Celem pracy jest opracowanie metodyki ekstrakcji żelotwórczego EPS z AGS. Do ekstrakcji EPS z AGS wybrano sześć metod ekstrakcji ^10-15,22, które są często stosowane w literaturze. Dla każdej metodologii porównano całkowitą ilość i właściwości żelotwórcze ekstrahowanego EPS.

Protokół

UWAGA: AGS pobrano z reaktora pilotażowego Nereda w oczyszczalni ścieków w Utrechcie w Holandii. Reaktor był zasilany ściekami komunalnymi. Osad granulowany miał wskaźnik objętości osadu (SVI_5min) wynoszący 59,5 ml/g_VSS. Próbki osadu pobrano w kwietniu, pod koniec cyklu tlenowego. Po pobraniu próbek osad został natychmiast przetransportowany do laboratorium, przesiany i przechowywany w temperaturze -20 °C do momentu wykorzystania.

1. EPS Ekstrakcja

UWAGA: Odwirować granulowany osad o stężeniu 4 000 × g i temperaturze 4 °C przez 20 minut i zdekantować supernatant. Zbierz granulki w granulkach do ekstrakcji. Zawartość substancji stałych ogółem (TS) i lotnych (VS) w granulkach oznaczono metodami standardowymi²³. Współczynnik przeliczeniowy między mokrą masą granulek – masą granulek pobranych bezpośrednio z osadu – a TS został określony przed ekstrakcją. Wszystkie ekstrakcje przeprowadzono w trzech egzemplarzach.

UWAGA: Do każdej metody ekstrakcji użyto 3 g mokrego granulatu. Ich wartości TS i VS (0,39 g TS i 0,34 g VS), mierzone w trzech egzemplarzach, wykorzystano do obliczenia wydajności ekstrakcji.

1. Ekstrakcja wirowa¹¹
   1. Przenieść 3 g (mokra masa) granulek do probówki wirówkowej i napełnić probówkę wirówkową do 50 ml wodą demineralizowaną.
   2. Lekko potrząśnij ręcznie probówką wirówkową.
   3. Odwirować probówkę wirówkową zawierającą mieszaninę w temperaturze 4 000 × g i temperaturze 4 °C przez 20 minut.
   4. Zebrać supernatant do szklanej zlewki, wyrzucić osad i kontynuować pracę z supernatantem, jak opisano w sekcji 1.7.
2. Ekstrakcja dźwiękowa¹⁰
   1. Przenieść 3 g (mokra masa) granulek do probówki wirówkowej i napełnić probówkę wirówkową do 50 ml wodą demineralizowaną.
   2. Zastosować do mieszaniny pulsacyjną sonikację na lodzie przez 2,5 minuty przy 40 W.
   3. Odwirować probówkę wirówkową zawierającą mieszaninę w temperaturze 4 000 × g i temperaturze 4 °C przez 20 minut.
   4. Zebrać supernatant do szklanej zlewki, wyrzucić osad i kontynuować pracę z supernatantem, jak opisano w sekcji 1.7.
3. Ekstrakcja kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA)¹¹
   1. Przenieść 3 g (mokra masa) granulatu do szklanej butelki o pojemności 100 ml i napełnić butelkę do 50 ml 2% (w/v) roztworem EDTA.
   2. Lekko wstrząśnij butelką ręcznie i przechowuj ją w lodówce w temperaturze 4 °C przez 3 godziny.
   3. Przenieść mieszaninę do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.
   4. Odwirować probówkę wirówkową zawierającą mieszaninę w temperaturze 4 000 × g i temperaturze 4 °C przez 20 minut.
   5. Zebrać supernatant do szklanej zlewki, wyrzucić osad i kontynuować pracę z supernatantem, jak opisano w sekcji 1.7.
4. Formamid – ekstrakcja wodorotlenkiem sodu (NaOH)¹³
   1. Przenieść 3 g (mokra masa) granulatu do szklanej butelki o pojemności 100 ml i napełnić butelkę do 50 ml wodą demineralizowaną.
   2. Dodać 0,3 ml 99% formamidu.
   3. Lekko wstrząśnij butelką ręcznie i przechowuj ją w lodówce w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę.
   4. Dodać 20 ml 1 M NaOH do zawiesiny granulek.
   5. Lekko wstrząśnij butelką ręcznie i przechowuj ją w lodówce w temperaturze 4 °C przez 3 godziny.
   6. Przenieść mieszaninę równomiernie do dwóch probówek wirówkowych o pojemności 50 ml.
   7. Odwirować probówki wirówkowe zawierające mieszaninę w temperaturze 4 000 × g i temperaturze 4 °C przez 20 minut.
   8. Zebrać supernatant do szklanej zlewki, wyrzucić osad i kontynuować pracę z supernatantem, jak opisano w sekcji 1.7.
5. Formaldehyd – ekstrakcja NaOH¹¹
   1. Przenieść 3 g (mokra masa) granulatu do szklanej butelki o pojemności 100 ml i napełnić butelkę do 50 ml wodą demineralizowaną.
   2. Dodać 0,3 ml 37% formaldehydu.
   3. Lekko wstrząśnij butelką ręcznie i przechowuj ją w lodówce w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę.
   4. Dodać 20 ml 1 M NaOH do zawiesiny granulek.
   5. Lekko wstrząśnij butelką ręcznie i przechowuj ją w lodówce w temperaturze 4 °C przez 3 godziny.
   6. Przenieść mieszaninę równomiernie do dwóch probówek wirówkowych o pojemności 50 ml.
   7. Odwirować probówki wirówkowe zawierające mieszaninę w temperaturze 4 000 × g i temperaturze 4 °C przez 20 minut.
   8. Zebrać supernatant do szklanej zlewki, wyrzucić osad i kontynuować pracę z supernatantem, jak opisano w sekcji 1.7.
6. Wysoka temperatura – ekstrakcja węglanu sodu (Na₂CO₃)^9,22,24
   1. Podgrzej 150 ml wody z kranu w szklanej zlewce o pojemności 1 000 ml na mieszadle magnetycznym do temperatury 80 °C.
   2. Przenieść 3 g (mokra masa) granulek do kolby z przegrodami o pojemności 250 ml i napełnić kolbę do 50 ml wodą demineralizowaną.
   3. Dodać 0,25 g Na₂CO₃ bezwodnego lub 0,67 g Na₂CO₃•10H₂O do kolby, aby uzyskać stężenie 0,5% (w/v) Na₂CO₃ .
   4. Umieścić kolbę zawierającą mieszaninę w łaźni wodnej. Przykryć kolbę i szklankę zlewki oddzielnie folią aluminiową, aby zapobiec parowaniu.
   5. Mieszać mieszaninę przez 35 minut przy 400 obr./min w temperaturze 80 °C.
   6. Przenieść mieszaninę do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.
   7. Odwirować probówkę wirówkową zawierającą mieszaninę w temperaturze 4 000 × g i temperaturze 4 °C przez 20 minut.
   8. Zebrać sklarowany osad i wyrzucić osad.
7. Pomiar TS i VS wszystkich ekstraktów zgodnie z metodami standardowymi²³.
   1. Pobrać supernatant i dializować go przez 24 godziny w 1 000 ml ultraczystej wody (worek do dializy z odciętą masą cząsteczkową 3 500 Da (MWCO))^11,12. Po 12 godzinach należy zmienić wodę do dializy, aby wzmocnić efekt dializy.
   2. Przenieść rozsądną frakcję (około 1/3) dializowanego supernatantu do aluminiowej naczynia w celu pomiaru TS i VS²³,
      UWAGA: Suszyć próbkę przez noc w temperaturze 105 °C. Różnica wagowa pustego naczynia aluminiowego i naczynia aluminiowego zawierającego wysuszoną próbkę to zawartość TS. Następnie należy wypalić to samo aluminiowe naczynie zawierające próbkę w temperaturze 550 °C przez 2 godziny. Różnica wagowa między pustym naczyniem aluminiowym a naczyniem aluminiowym zawierającym spaloną próbkę to zawartość popiołu. Różnica między zawartością TS a popiołu polega na zawartości VS.
   3. Dla każdego ekstraktu przenieść pozostałą frakcję dializowanego supernatantu do szklanych zlewek o pojemności 10 ml. Zagęszczać szwarodnik przez 2 dni w temperaturze 60 °C do końcowej objętości 1-2 ml w celu zwiększenia stężenia polimeru w supernatancie.

2. Ekstrakcja alginianopodobnego polimeru zewnątrzkomórkowego (ALE)

1. Ekstrakt otrzymany w kroku 1.6.8 należy poddać dializie zgodnie z krokiem 1.7.1.
2. Przenieść dializowany ekstrakt do szklanej zlewki o pojemności 250 ml. Powoli mieszaj ekstrakcję przy 100 obr./min i temperaturze pokojowej. Stale monitoruj zmiany pH za pomocą elektrody pH, dodając 1 M kwas solny (HCl) do końcowego pH 2,2 ± 0,05 w celu uzyskania ALE w postaci kwaśnej.
3. Po dostosowaniu pH do 2,2 przenieść ekstrakt do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i odwirować w temperaturze 4 000 × g i temperaturze 4 °C przez 20 minut.
4. Odrzucić sklarowany osad i zebrać żelopodobny osad. Żelowaty granulat to ALE w postaci kwaśnej.
5. Aby otrzymać sodową (lub potasową) formę ALE, należy powoli dodać 0,5 M NaOH (lub 0,5 M wodorotlenku potasu) do żelu otrzymanego w kroku 2.4, powoli mieszając żel szklanym patyczkiem ręcznie, aż do osiągnięcia pH 8,5.

3. Test tworzenia hydrożelu jonowego

UWAGA: W celu sprawdzenia, czy wyekstrahowany EPS ma właściwości tworzenia hydrożelu jonowego, zastosowano test tworzenia kulek z jonami Ca^{2+ 25}.

1. Po zagęszczeniu ekstraktu w kroku 1.7.3 do objętości 1-2 ml, powoli wymieszać mieszaninę szklanym patyczkiem i dostosować jej pH do 8,5 za pomocą 0,5 M NaOH.
2. Pobrać ekstrakt z kroku 3.1 lub ALE sodu z kroku 2.5 i powoli wlać ekstrakt pipetą Pasteura do 2,5% (w/v) roztworu chlorku wapnia (CaCl₂).
   UWAGA: Jeśli wyekstrahowany EPS ma właściwości tworzące jonowy hydrożel hydrożelowy, utworzą się kulki w kształcie kropli (kuliste). Jeśli wyekstrahowany EPS nie ma właściwości tworzących jonowy hydrożel, ekstrakt rozproszy się w roztworze CaCl₂.

4. Test stabilności hydrożelu jonowego

UWAGA: Aby lepiej zrozumieć rolę jonowego hydrożelu EPS w tworzeniu struktury AGS, przeprowadzono testy stabilności na kulkach jonowego hydrożelu z ekstrakcji Na₂CO_{3 ,} zebranych w kroku 3.2.

1. Trzymaj kulki hydrożelowe przez 30 minut w roztworze CaCl₂.
2. Za pomocą łyżki wyjmij kulki hydrożelowe z roztworu CaCl₂ i podziel kulki na cztery równe frakcje.
3. Przechowuj frakcję 1 w 10 ml wody demineralizowanej przez 4 godziny w temperaturze 4 °C.
   Następujące testy stabilności przeprowadzono w taki sam sposób, jak opisano w metodach ekstrakcji 1.3 - 1.5.
4. Frakcję 2 należy przechowywać w 10 ml 2% (w/v) roztworu EDTA przez 3 godziny w temperaturze 4 °C.
5. Frakcję 3 należy przechowywać w 7,15 ml wody demineralizowanej z 60 μl 99% formamidu przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C. Następnie dodać 2,85 ml 1 M NaOH i przechowywać frakcję 3 przez 3 godziny w temperaturze 4 °C.
6. Frakcję 4 przechowywać w 7,15 ml wody demineralizowanej z 60 μl 37% formaldehydu przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C. Następnie dodać 2,85 ml 1 M NaOH i przechowywać frakcję 4 przez 3 godziny w temperaturze 4 °C.
7. Monitorować, czy podczas przechowywania występuje widoczny rozpad kulek w warunkach opisanych w ppkt 4.3-4.6, aby ocenić, czy kulki wytrzymują warunki ekstrakcji.

Wyniki

Ekstrakcja EPS
Wygląd granulek po zastosowaniu różnych procedur ekstrakcji EPS pokazano na rysunku 1. Kształt i żelowa struktura granulek pozostały nienaruszone po odwirowaniu (ryc. 1a) i ekstrakcji EDTA (ryc. 1c). Granulki rozbito na fragmenty o różnej wielkości za pomocą sonikacji. Zmętnienie w fazie ciekłej może być spowodowane zawieszeniem małych fragmentów (rysunek 1b), ponieważ zmętnienie znacznie spadło po odwirowaniu. Sam formamid i formaldehyd nie miały wpływu na zmianę kształtu granulki i jej struktury żelowej (danych nie pokazano). Po dodaniu NaOH faza ciekła zmieniła kolor na żółtawy. Część puszystego materiału została oderwana od powierzchni granulek i utworzyła warstwę na wierzchu osiadłych granulek (ryc. 1d i 1e). Mimo to kształt granulek nie uległ zmianie. Dodatek NaOH najwyraźniej poprawił rozpuszczalność EPS, ale nie mógł uszkodzić struktury matrycy żelowej. Dla porównania, granulki całkowicie zniknęły po ekstrakcji Na₂CO₃ (ryc. 1f). Zamiast tego powstała mieszanina cieczy podobnej do zolu i maleńkich galaretopodobnych cząstek, co pokazuje, że żelowa matryca granulek była rzeczywiście rozpuszczona.

Rysunek 1. Ekstrakcja tlenowego osadu granulowanego EPS. W celu lepszej wizualizacji wpływu każdej metody ekstrakcji na granulki, eksperymenty przeprowadzono w szklanych butelkach o pojemności 25 ml. Po procedurze ekstrakcji ekstrakty przechowywano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, aby umożliwić osadzenie się zawiesiny. a) Ekstrakcja wirująca, b) Ekstrakcja sonikacyjna, c) Ekstrakcja EDTA, d) Formamid – ekstrakcja NaOH, e) Formaldehyd – ekstrakcja NaOH, f) Wysoka temperatura – ekstrakcja Na₂CO₃ . Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wydajność EPS w odniesieniu do frakcji VS dla każdej metody jest zilustrowana na rysunku 2. Plon podawany jest w mg VS_EPS na g początkowej_granulki VS. Ilość EPS otrzymanego przez formaldehyd + NaOH, formamid + NaOH i Na₂CO₃ + ciepło + mieszanie była wyższa niż w przypadku wirowania, sonikacji i ekstrakcji EDTA. Podobne wyniki dla tych technik ekstrakcji wykazały również wcześniejsze badania ^11-13,15 wskazujące, że warunki alkaliczne zwiększają rozpuszczalność EPS^26,27. Ilość EPS odzyskanego przez Na₂CO₃ była najwyższa, ponad 20 razy większa niż uzyskana tylko przez odwirowanie. Dodatkowo, całkowity uzysk EPS z ekstrakcji Na₂CO₃ może być dodatkowo zwiększony przez wielokrotną ekstrakcję. Druga ekstrakcja przy użyciu osadu odrzuconego w kroku 1.6.8 (sekcja protokołu) pierwszej ekstrakcji zwiększyła całkowitą wydajność o 28%, poczwórna ekstrakcja zwiększyła nawet całkowitą wydajność o 46%.

Rysunek 2. Wyniki wszystkich metod ekstrakcji w odniesieniu do uzysku VS i zawartości popiołu. Dla każdej ekstrakcji pierwszy słupek reprezentuje wydajność VS w mg VS_EPS na g początkowej_granulki VS. Drugi słupek reprezentuje procentową zawartość wagową popiołu w wydobytym TS. Słupki błędów ilustrują odchylenie standardowe trzech ekstrakcji przeprowadzonych dla każdej techniki ekstrakcji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ekstrakcja alginianopodobnego polimeru zewnątrzkomórkowego (ALE)
Po dostosowaniu pH EPS wyekstrahowanego przez ekstrakcję Na₂CO₃ do 2,2, wytrącono 63% całkowitego VS. Osad jest kwaśny ALE²⁵. Frakcją resztkową był prawdopodobnie EPS, który może być rozpuszczony w warunkach ekstrakcji, ale nie może tworzyć osadu przy pH 2,2.

Test tworzenia hydrożelu jonowego
Granulki tlenowe zostały opisane jako podobne do hydrożelu. Proces granulacji został uznany za zjawisko żelotwórcze, w którym glikozydy są substancją żelującą^4,9,25,28. Zwykle Ca²⁺ jest jednym z najczęstszych kationów w ściekach. Ponadto łatwo wiąże się z kwaśnymi polisacharydami (np. alginianami i kwasem poligalakturonowym), prawdopodobnie jako przeciwjon pośredniczący w żelowaniu²⁹. W ten sposób powstaje jonowo usieciowany hydrożel. Zaobserwowano, że dodatek jonów^Ca2+ może przyspieszyć granulację osadu tlenowego³⁰. Dlatego Ca²⁺-EPS (hydrożel jonowy) może odgrywać ważną rolę w budowaniu struktury matrycy żelowej w tlenowym osadzie granulowanym. W związku z tym to, czy wyekstrahowany EPS tworzy hydrożel jonowy z jonami^Ca2+, można wykorzystać jako test w celu sprawdzenia, czy wyekstrahowany EPS jest polimerem strukturalnym przyczyniającym się do tworzenia matrycy żelowej w tlenowym osadzie granulowanym⁹.

W tym badaniu, dla EPS ekstrahowanego z AGS (Rysunek 3a) różnymi metodami, tylko EPS ekstrahowany przez Na₂CO₃ zachowywał kształt kropelki w roztworze 2,5% (w/v) CaCl₂ i tworzył stabilne kulki hydrożelu jonowego. Co więcej, ALE sodu otrzymane z tego EPS przez dodatkowe etapy (ekstrakcja polimeru ALE, rysunek 3b) również wykazywał tę samą właściwość. Kolor i morfologia kulek żelowych Ca^{2 +} ALE (ryc. 3c) są podobne do tlenowego szlamu granulowanego (ryc. 3a). Najwyraźniej EPS ekstrahowany metodą Na₂CO₃ przyczynia się do tworzenia matrycy żelowej w tlenowym osadzie granulowanym. ALE, który jest głównym składnikiem tego EPS, to polimery strukturalne, zdolne do tworzenia hydrożelu jonowego.

Test stabilności hydrożelu jonowego
Zaobserwowano, że podczas ekstrakcji EPS granulki tlenowe zachowały swój kulisty kształt w EDTA, formaldehydzie + NaOH i formamidzie + NaOH (ryc. 1). Aby zrozumieć, czy wyekstrahowane polimery strukturalne odgrywają rolę w stabilności granulek, kulki Ca²⁺-ALE zostały potraktowane dokładnie w taki sam sposób, jak granulki tlenowe podczas ekstrakcji. Co ciekawe, kulki Ca²⁺-ALE wykazywały podobną stabilność jak AGS (Rysunek 3d - 3f), tj. kulki Ca²⁺-ALE były wyjątkowo stabilne w EDTA. Niewielka ilość ALE oderwała się od powierzchni kulek Ca^{2 +} -ALE (małe brązowawe kłaczki na rysunku 3e i 3f), gdy kulki Ca^{2 +} ALE były moczone odpowiednio w formaldehydzie + NaOH i formamidzie + NaOH przez trzy godziny. To podobieństwo pod względem stabilności między kulkami Ca²⁺-ALE a granulkami tlenowymi wskazuje, że ALE są jedną z części ważnych polimerów strukturalnych tworzących matrycę żelową AGS.

Rysunek 3. Granulat tlenowy i ekstrahowane ALE. a) Granulki w wodzie demineralizowanej przed ekstrakcją. b) Kwaśne ALE (ekstrahowane zgodnie z ppkt 1.6 i 2) po odwirowaniu w temperaturze 4 000 × g i w temperaturze 4 °C przez 20 minut. Wyniki testu stabilności hydrożelu jonowego. c) Kulki Ca²⁺-ALE przechowywane w wodzie demineralizowanej przez 4 godziny w temperaturze 4 °C. d) Kulki Ca²⁺-ALE przechowywane w 2% EDTA, przez 3 godziny w temperaturze 4 °C. e) Kulki Ca²⁺-ALE przechowywane w formamidzie + NaOH przez 4 godziny w temperaturze 4 °C. f) Kulki Ca²⁺-ALE przechowywane w formaldehydzie + NaOH przez 4 godziny w temperaturze 4 °C. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Uwagi do części dotyczącej protokołu
Ekstrakcja EPS/ALE jest opisana dla objętości 50 ml i 3 g granulatu. Te wartości mają charakter orientacyjny. Ekstrakcje z wyższymi stężeniami granulek mogą zmniejszyć wydajność ekstrahowanego EPS. Podczas ekstrakcji ALE temperatura powinna być utrzymywana na stałym poziomie 80 °C przez 30 minut. Czas potrzebny do podgrzania mieszaniny (około 5 minut) jest zawarty w protokole. Ponadto skuteczność ekstrakcji zwiększa się dzięki zastosowaniu mieszadła magnetycznego o tym samym rozmiarze, co średnica dna kolby. Zapewni to dobre właściwości mieszania i efekty mielenia, sprzyjając ekstrakcji EPS.

W dalszej części sekcji protokołu określa się wydajność TS i VS wszystkich ekstrakcji (supernatant zebrany w krokach 1.1-1.6). Dializa musi być wykonywana przed pomiarem TS i VS, aby zmniejszyć możliwe błędy wynikające z obecności substancji chemicznych używanych do ekstrakcji. Zaleca się MWCO na poziomie 3,500 Da w celu usunięcia tych chemikaliów przy jednoczesnym zachowaniu makrocząsteczek EPS w worku do dializy. Worek do dializy powinien mieć większą objętość niż objętość ekstraktu. Jest to konieczne, ponieważ objętość ekstraktu zwiększy się podczas dializy (np. w przypadku ekstrakcji EDTA do 40% wzrostu objętości). Stopień usunięcia substancji chemicznej za pomocą dializy można określić, mierząc pH w próbce przed i po dializie. Alternatywnie, pomiary przewodności wody do dializy pokazują zakres usuwania jonów.

Aby uzyskać ALE z całkowitej ilości wyekstrahowanego EPS (kroki 1.6 i 2), etap dializy jest opcjonalny. Niemniej jednak dializa ma trzy zalety: zmniejsza ilość HCl potrzebną do wytrącania, poprawia przenoszenie masy kwasowej w ekstrakcie i zmniejsza zawartość popiołu w otrzymanym ALE. Do wytrącania ALE zaleca się stosowanie szklanej zlewki o znacznie większej objętości niż ekstrakt. Na₂CO₃ jest zwykle przedawkowany podczas ekstrakcji. Dodany HCl najpierw reaguje z Na₂CO₃ pozostawionym w ekstrakcie, powodując powstanie dwutlenku węgla i, jeśli próbka nie była wcześniej dializowana, pienienie się. Podczas dodawania HCl ekstrakt należy powoli mieszać za pomocą mieszadła magnetycznego o tej samej wielkości co dno zlewki. Mieszadło tej wielkości i powolne mieszanie spowoduje równomierne wymieszanie bez naruszania struktury osadu. Jeśli w ekstrakcie tworzą się kwaśne grudki żelu, zlewkę należy lekko zakręcić ręcznie. Wytrącanie przeprowadza się przy stężeniu kwasu 1 M, aby uniknąć dużego wzrostu objętości ekstraktu, przy jednoczesnym uzyskaniu jednorodnego rozkładu kwasu w próbce. Wyższe stężenia kwasów mogą powodować regionalny spadek pH i tworzenie się kwaśnych grudek żelu. pH niższe niż 2,0 zmniejsza ilość ALE, którą można odzyskać, prawdopodobnie z powodu zmian strukturalnych polimerów przy niższym pH. Dlatego ważne jest, aby utrzymać końcowe pH na poziomie 2,20 ± 0,05.

Ograniczenia
Metoda ekstrakcji ALE ma na celu ekstrakcję strukturalnych zewnątrzkomórkowych polimerów EPS z AGS lub ogólnie biofilmów i nie jest przeznaczona do ekstrakcji wszystkich obecnych EPS. Aby wyodrębnić cały EPS, konieczna jest kombinacja więcej niż jednej metody ekstrakcji. Ponadto, jak wykazano przy wzroście wydajności VS_EPS poprzez zastosowanie podwójnej i poczwórnej ekstrakcji, jedna ekstrakcja nie spowoduje ekstrakcji całego strukturalnego EPS. Ekstrakcja ALE to ostra metoda ekstrakcji EPS, łącząca ciągłe mieszanie z warunkami cieplnymi i zasadowymi. Z tego powodu możliwe jest, że część materiału wewnątrzkomórkowego zostanie wyekstrahowana razem z EPS. Chociaż liza komórek może być spowodowana fizycznymi i chemicznymi technikami ekstrakcji (sonikacja^31,32, NaOH^31,32, EDTA^11,32, CER³², ciepło³² i wysokie szybkości ścinania przez mieszanie¹⁹), obecność materiału wewnątrzkomórkowego w odzyskanym EPS nadal wymaga weryfikacji. Właściwości jonotwórcze żelu wyekstrahowanego EPS są głównym celem tych badań, nie analizowano, czy odzyskany EPS zawiera materiał wewnątrzkomórkowy. Przyszłe badania będą koncentrować się na identyfikacji materiału wewnątrzkomórkowego w wyekstrahowanym EPS.

Solubilizacja matrycy hydrożelowej AGS ma kluczowe znaczenie dla ekstrakcji strukturalnego EPS
EPS tworzy gęstą i zwartą matrycę hydrożelową w AGS. Chociaż EPS zawiera różne klasy makrocząsteczek organicznych, takich jak polisacharydy, białka, kwasy nukleinowe, (fosfo)lipidy, substancje humusowe i niektóre polimery międzykomórkowe^7,5,8, nie wszystkie z nich tworzą żel. Tylko te polimery tworzące żel są tutaj uważane za polimery strukturalne w EPS.

Celem ekstrakcji EPS jest najpierw rozpuszczenie EPS, a następnie zebranie rozpuszczonego EPS. Jeśli strukturalny EPS (tj. EPS tworzący hydrożel) jest celem ekstrakcji, najpierw należy rozpuścić żelową matrycę AGS. Tylko metody, które mogą rozpuścić matrycę żelową, są w stanie wyodrębnić strukturalny EPS. W tych badaniach niektóre często stosowane metody ekstrakcji EPS, takie jak wirowanie^10-15, sonikacja^10,14,15, EDTA 10-12,14,15, formaldehyd + NaOH^10-15 i formamid + NaOH¹³ nie były w stanie skutecznie wyizolować strukturalnego EPS. Wynika to z faktu, że matryca hydrożelowa granulek tlenowych nie została rozpuszczona tymi metodami. Z tego powodu testy stabilności w sekcji 4 przeprowadzono tylko w warunkach występujących w ekstrakcji EDTA, formamid + NaOH i formaldehyd + NaOH. Te trzy ekstrakcje nie były w stanie wyizolować strukturalnego EPS, ale nadal uzyskały najwyższą wydajność VS_EPS oprócz ekstrakcji Na₂CO₃ . Nie zastosowano warunków ekstrakcji Na₂CO₃ , ponieważ ta metoda ekstrakcji wyraźnie rozpuszczała matrycę AGS. W związku z tym warunki zastosowane podczas badania stabilności uznano za reprezentatywne.

Ekstrakcja żywicą kationowymienną (CER), inną często stosowaną metodą ekstrakcji EPS, nie była brana pod uwagę w tym porównaniu, ponieważ wcześniejsze badania nad ekstrakcją EPS za pomocą CER nie przyniosły lepszych wyników niż zastosowane tutaj ekstrakcje chemiczne.

Żeloforming EPS w AGS
Żelotwórcze EPS są uważane za strukturalny EPS w hydrożelowej matrycy AGS. Warto podkreślić, że istnieją różne rodzaje hydrożeli, takie jak żele jonowe, żele indukowane temperaturą i żele indukowane pH. To badanie koncentruje się tylko na EPS, które tworzą żele jonowe. Biorąc pod uwagę dużą frakcję wydobywanego żelu strukturalnego, jest to prawdopodobnie dominujący strukturalny styropian. Z pewnością istnieje możliwość, że inne rodzaje EPS, które tworzą różne rodzaje hydrożeli (np. żel indukowany pH²⁸) występują w tym samym lub innym rodzaju granulek tlenowych. Niemniej jednak, bez względu na to, jaki rodzaj hydrożelu jest celowany, solubilizacja matrycy żelowej EPS jest najważniejszym krokiem do ekstrakcji żelu EPS.

Obecnie przeprowadzono niewiele badań nad strukturalnym styropianem szlamu granulowanego. Ekstrakcja ALE opisana w tym protokole jest zdolna do ekstrakcji żelotwórczego EPS z AGS i będzie wykorzystywana w przyszłych badaniach do charakteryzowania strukturalnego EPS. Należy przeprowadzić więcej badań nad AGS, strukturalnym EPS i niestrukturalnym EPS, aby lepiej zrozumieć proces i funkcję granulacji i EPS. W szczególności należy zbadać następujące trzy punkty: dlaczego mikroorganizmy wytwarzają tak dużą ilość EPS, jaki jest dokładny skład EPS i jak zmienia się skład EPS w zależności od zmian środowiskowych. Wykrywanie i analizowanie wszystkich zaangażowanych związków i ich interakcji pomoże zrozumieć biofilmy i jak je wykorzystać na naszą korzyść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kolba z przegrodami 250 ml	Kimble	25630-250
Zlewka szklana 1 000 ml	VWR	213-1128
RCT basic, mieszadło magnetyczne z termometrem	IKA	3810000
dekahydrat węglanu sodu	Merck KGaA	1063911000
probówki wirówkowe 50 ml	greiner bio-one	227261
Multifuge 1 S-R, wirówka	Heraeus/Thermo	Scientific-kwas
solny, 37%	Sigma-Aldrich	30721-1L-GL-D
Zlewka szklana 250 ml	VWR	213-1124
chlorek wapnia dwuwodny	Merck KGaA	1023821000
1 ml Pipeta Pasteura	Copan	201C