Artykuł metodologiczny

Wysokoprzepustowy, multipleksowany i ukierunkowany test proteomiczny, płyn mózgowo-rdzeniowy do ilościowego określania biomarkerów neurodegeneracyjnych i statusu izoform apolipoproteiny E

DOI:

10.3791/54541

⸱

20 października 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Translational Omics, Genetics and Genomic Medicine Deptartment, Great Ormond Street Institute of Child Health, University College London, 2Dementia Research Centre, Institute of Neurology, University College London, 3Clinical Neurochemistry Laboratory, Institute of Neuroscience and Physiology, Department of Psychiatry and Neurochemistry, The Sahlgrenska Academy, University of Gothenburg, 4Neurology Unit, Department of Pathophysiology and Transplantation, University of Milan, 5Great Ormond Street Hospital for Children, University College London

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy wysokoprzepustowy, multipleksowy i celowany test proteomicznego płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF), opracowany z potencjałem do klinicznego tłumaczenia. Test może określić ilościowo potencjalne markery i czynniki ryzyka neurodegeneracji, takie jak warianty apolipoproteiny E (E2, E3 i E4), oraz zmierzyć ich ekspresję alleli.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wiele chorób neurodegeneracyjnych wciąż nie ma skuteczne leczenie. Wiarygodne biomarkery do identyfikacji i klasyfikacji tych chorób będą miały istotne znaczenie dla rozwoju przyszłych nowych terapii. Często potencjalne nowe biomarkery nie trafiają do kliniki ze względu na ograniczenia w ich opracowywaniu i wysokie koszty. Jednak ukierunkowana proteomika wykorzystująca chromatografię cieczową z monitorowaniem wielu reakcji - tandem/spektrometria mas (MRM LC-MS / MS), w szczególności przy użyciu spektrometrów mas z potrójnym kwadrupolem, jest jedną z metod, którą można wykorzystać do szybkiej oceny i walidacji biomarkerów do klinicznego przeniesienia do laboratoriów diagnostycznych. Tradycyjnie platforma ta była szeroko wykorzystywana do pomiaru małych cząsteczek w laboratoriach klinicznych, ale to potencjał do analizy białek sprawia, że jest atrakcyjną alternatywą dla metod opartych na testach ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay). Opisujemy tutaj, w jaki sposób ukierunkowana proteomika może być wykorzystana do pomiaru multipleksowanych markerów demencji, w tym do wykrywania i ilościowego oznaczania znanego czynnika ryzyka apolipoproteiny E izoformy 4 (ApoE4).

Aby test nadawał się do translacji, został zaprojektowany tak, aby był szybki, prosty, wysoce szczegółowy i opłacalny. Aby to osiągnąć, każdy etap rozwoju testu musi być zoptymalizowany pod kątem poszczególnych białek i tkanek, w których są analizowane. Ta metoda opisuje typowy przepływ pracy, w tym różne wskazówki i porady dotyczące opracowania ukierunkowanego proteomiki MRM LC-MS/MS do translacji.

Rozwój metody jest optymalizowany przy użyciu niestandardowych syntetyzowanych wersji tryptycznych peptydów kwantypotypowych, które kalibrują MS do wykrywania, a następnie są wprowadzane do płynu mózgowo-rdzeniowego w celu określenia poprawnej identyfikacji endogennego peptydu w separacji chromatograficznej przed analizą w MS. Aby uzyskać bezwzględną ocenę ilościową, do testu włącza się stabilne, znakowane izotopowo wersje wzorców wewnętrznych peptydów z krótkimi znacznikami sekwencji aminokwasów i zawierające miejsce rozszczepienia trypsyny.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rosnący wpływ chorób neurodegeneracyjnych, takich jak choroba Alzheimera, otępienie z ciałami Lewy'ego i choroba Parkinsona, staje się problemem społeczno-ekonomicznym w wielu krajach1. Istnieje zapotrzebowanie na dodatkowe biomarkery, które można wykorzystać do identyfikacji i klasyfikacji pacjentów we wczesnych stadiach choroby oraz do monitorowania wszelkich potencjalnych nowych metod leczenia. Ogólnym celem tej metody jest stworzenie ogólnego potoku dla usprawnionego, ekonomicznego i szybszego sposobu walidacji potencjalnych markerów neurodegeneracji płynu mózgowo-rdzeniowego. Uzasadnieniem jest wykorzystanie ukierunkowanej proteomiki lub peptydu MRM LC-MS/MS jako łatwej do modyfikacji metody oceny wielu potencjalnych biomarkerów białkowych z eksperymentów odkrywczych. Można je następnie multipleksować w szybkim rozdzielaniu chromatograficznym (<10 min) i oceniać. W tym multipleksowym badaniu przesiewowym dla biomarkerów neurodegeneracyjnych uwzględniliśmy znany czynnik ryzyka demencji izoformę E4 apolipoproteiny (ApoE4), dzięki czemu możemy jednocześnie określić jej status i poziom ekspresji, eliminując w ten sposób potrzebę oddzielnych testów genotypowania2. LC MS/MS jest rutynowo stosowana jako metoda z wyboru do dokładnego oznaczania ilościowego małych cząsteczek w porównaniu z innymi metodami, takimi jak ELISA lub test radioimmunologiczny (RIA). Ta zmiana w wykorzystaniu technologii SM do analizy białek była napędzana głównie przez problemy z technologiami opartymi na odporności. Należą do nich specyficzność krzyżowa, zmienność między partiami, ograniczony okres trwałości i wysokie koszty. W związku z tym proteomika celowana szybko staje się coraz większą alternatywą dla metod opartych na przeciwciałach, takich jak Western blotting, RIA i ELISA. Jednak zdolność do multipleksowania wielu markerów w jednym teście jest główną przewagą tej techniki nad metodami opartymi na immunologii3. Technika ta ma zastosowanie do wielu tkanek i została wykorzystana jako strategia walidacji w wielu badaniach proteomicznych, w tym w osoczu4 i moczu5,6.

Technika może być zastosowana w każdym laboratorium, które ma dostęp i doświadczenie w korzystaniu z potrójnych kwadrupolowych spektrometrów masowych. Projektowanie peptydów jest stosunkowo proste przy rosnącym wykorzystaniu baz danych typu open source. Konkurencyjny rynek syntezy niestandardowych peptydów sprawia, że są one znacznie bardziej przystępne cenowo. Ciężkie peptydy są jednak drogie i dlatego markery powinny być oceniane na małej kohorcie przed przejściem do większej skali. Istnieje rosnący potencjał wykorzystania tej techniki w klinicznych warunkach diagnostycznych, przy czym większość dużych szpitali posiada platformy oparte na potrójnym kwadrupolu, które można łatwo dostosować do przeprowadzania ukierunkowanych testów proteomicznych. Jednym z takich zastosowań tej metody, które stają się rutynowym ustawieniem diagnostycznym, jest jej niedawne zastosowanie w badaniach przesiewowych kropli krwi u noworodków w kierunku niedokrwistości sierpowatokrwinkowej7.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Schemat ogólnego protokołu opisanego tutaj znajduje się w Rys. 1. Wszystkie próbki użyte do opracowania tej metody są nadwyżkami klinicznych próbek diagnostycznych i posiadają aprobatę etyczną komisji etycznej London Bloomsbury Ethics.

figure-protocol-1
Rysunek 1. Schemat ilustrujący ogólny proces tworzenia ukierunkowanego testu CSF MRM LC-MS/MS. Kandydujące peptydy markerowe do oceny są wybierane z docelowych białek. Dzięki zastosowaniu niestandardowych syntetyzowanych peptydów tworzona jest ukierunkowana metoda multipleksu LC-MS/MS. Po dokonaniu oceny test może być wykorzystany do oceny skuteczności potencjalnych markerów neurodegeneracji.

1. Wybór i projektowanie peptydów

UWAGA: Kryterium dla peptydu markerowego jest to, że musi być unikalny (proteotypowy) i reprezentować ilościową obfitość białka (quantotyp). Aby określić, czy peptyd jest unikalny, czy nie, można skorzystać z wyszukiwarki "blast" na stronie internetowej Uniprot (http://www.uniprot.org/blast/).

  1. Zdefiniuj wykaz docelowych białek (markerów), tj. ApoE (patrz Tabela 2).
    UWAGA: Jeśli marker został zidentyfikowany na podstawie poprzednich eksperymentów profilowania proteomicznego8, wybierz peptyd, który daje najlepszą odpowiedź z tego zestawu danych.
  2. Jeśli te informacje są niedostępne, skorzystaj ze stron internetowych typu open source, takich jak trawienie trypsyny in silico docelowych białek, za pomocą narzędzia programowego, takiego jak MS-Digest.
  3. Wybierz peptyd, który jest tryptyczny i nie jest podatny na modyfikacje potranslacyjne.
    UWAGA: Informacje te można sprawdzić na stronie internetowej Uniprot www.uniprot.org. Należy unikać peptydów podatnych na modyfikacje chemiczne podczas przygotowywania próbki LC-MS.
  4. Zamów niestandardową syntezę wybranych peptydów.
    UWAGA: Peptydy markerowe mogą być syntetyzowane na zamówienie przez różne firmy komercyjne. Dla ApoE peptyd kwantytypowy stosowany do pomiaru całkowitych poziomów ApoE określono jako AATVGSLAGQPLQER. Proteotypowe sekwencje peptydowe używane do oznaczania wariantów E2 i E4 to peptydy tryptyczne odpowiednio dla pozycji 158 (RLAVYQAGAR i CLAVYQAGAR) i pozycji 112 (LGADMEDVCGR i LGADMEDVR).

2. Przygotowanie standardowych peptydów

UWAGA: Aby wybrać najlepsze przejścia ilościowe, należy zoptymalizować wykrywanie matrycy (CSF). Najbardziej efektywnym sposobem optymalizacji multipleksowanych peptydów jest tworzenie pul peptydów o znanych stężeniach. Pule te mogą być następnie wykorzystywane do opracowywania metod i krzywych standardowych.

  1. Zawiesić syntetyczne peptydy (szczegółowe informacje na temat peptydów podano w tabeli 2) do stężenia podstawowego 1 mg/ml zgodnie z instrukcjami producenta. Domyślnie, jeśli instrukcje nie są dostępne, ponownie zawiesić peptydy w 50:50 (v/v) acetonitrylu (ACN)/H2O.
  2. Przygotować rozcieńczenia peptydu w stosunku 1:10 ze stężenia podstawowego i zebrać 1,000 pmol każdego peptydu w probówce wirówkowej o niskim poziomie wiązania. Wysuszyć w koncentratorze speed-vac końcową kałużę i przechowywać w temperaturze -20 °C. Przygotować kilka basenów do wykorzystania w przyszłości.
  3. Porcjować 100 μl płynu mózgowo-rdzeniowego do probówek o niskim stopniu wiązania. Liofilizować płyn mózgowo-rdzeniowy.
  4. Zawiesić podwielokrotność połączonych 1 000 peptydów pmol w buforze wytrawiającym (100 mM Tris HCl, pH 7,8, 6 M mocznik, 2 M tiomocznik, 2% ASB14) w celu uzyskania stężeń 10 i 1 pmol/μl.
  5. Wprowadzić połączone peptydy do liofilizowanych 100 μl podwielokrotności płynu mózgowo-rdzeniowego w stężeniach 0, 1, 2, 5, 10 i 15 pM. Dodaj 20 ng nienaruszonego, niespokrewnionego białka, takiego jak enolaza drożdżowa, aby działało jako wewnętrzny wzorzec i kontrolowało efektywność trawienia trypsyny.
  6. Uzupełnić porcje płynu mózgowo-rdzeniowego buforem trawiącym do końcowej ilości 20 μl. Wir.
  7. Dodać 1,5 μl ditiotreitolu (30 mg w 1 ml 100 mM Tris HCl, pH 7,8) i wstrząsać w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
  8. Dodać 3 μl jodoacetamidu (35 mg w 1 ml 100 mM Tris HCl, pH 7,8) i wstrząsać w temperaturze pokojowej przez 45 minut w ciemności.
  9. Dodać 165 μl ddH2O.
  10. Dodać 10 μl zmodyfikowanego roztworu trypsyny o stopniu sekwencjonowania 0,1 μg/μl zawieszonego w 50 mM buforze wodorowęglanu amonu o pH 7,8. Inkubować w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C O/N i zatrzymać trawienie przez zamrożenie próbek. Przechowywać strawione produkty w temperaturze -20 °C do czasu przygotowania do analizy.

3. Optymalizacja wykrywania peptydów MS

  1. Skopiuj i wklej sekwencję peptydu, który ma być zoptymalizowany, do odpowiedniego oprogramowania, np. Skyline9. Kliknij sekwencję peptydową, aby uzyskać informacje o oczekiwanej masie jonów prekursorowych i jonach produktowych.
  2. Rozcieńczyć peptydy ze stężenia podstawowego (patrz sekcja 2.1) do stężenia 1 ng/ml w celu opracowania metody MS.
  3. Peptydy należy wstrzykiwać bezpośrednio do spektrometru mas przy zoptymalizowanym natężeniu przepływu (zwykle 0,1 - 0,8 ml/min) i przy energii zderzenia 0 - 5%.
  4. Zdobądź widmo MS w celu zidentyfikowania eksperymentalnych wielokrotnie naładowanych jonów prekursorowych8. Wybierz jon prekursorowy (m/z), który daje największą intensywność (zalecane są podwójnie lub potrójnie naładowane jony prekursorowe).
  5. Ponownie wlej peptyd i zastosuj energię zderzenia, aby rozdrobnić peptyd przez dysocjację wywołaną zderzeniem (CID). Zoptymalizuj energie stożka i zderzeń, aby uzyskać najlepszy wzór fragmentacji (zaleca się jony fragmentacyjne naładowane pojedynczo lub podwójnie oraz masę jonu fragmentacyjnego najlepiej większą niż jon macierzysty).
  6. Sprawdź, czy uzyskane eksperymentalnie przejścia są zgodne z przejściami wygenerowanymi in silico (zgodnie z opisem w kroku 3.1). Zapisz listę przejść w pliku metody MRM, używając co najmniej 2 najbardziej intensywnych przejść na jon prekursorowy. Uwzględnij 2 przejścia: 1 dla oznaczania ilościowego i 1 dla potwierdzenia w końcowym teście.
    UWAGA: Niektórzy producenci MS mają funkcję (np. Waters Intellistart) do automatycznej optymalizacji analizy MRM lub SRM. Jeśli to możliwe, podawaj peptydy z połączonymi fazami ruchomymi przy 50 - 70% ACN i 0,1% FA.

4. Rozwój metody LC-MRM

UWAGA: Analizuj mieszaninę syntetycznych peptydów za pomocą systemu ultra wydajnej chromatografii cieczowej (UPLC) sprzężonego z potrójnym kwadrupolowym spektrometrem masowym. Upewnij się, że źródło jest czyste. Rozpuszczalnik A to ddH20 z 0,1% FA; Rozpuszczalnik B to ACN z 0,1% FA.

  1. Użyj systemu LC-MS wyposażonego w kolumnę UPLC wypełnioną fazą C-18 (średnica 1,6 μm, 90 porów A, długość 2,1 mm x 50 mm) i podłączona do kolumny wstępnej tej samej fazy.
  2. Rozmrażanie płynu płynu płynnego trawi na lodzie, odwirowywanie przy 16 000 g przez 10 minut i przeniesienie 60 μl do fiolek ze szklaną wkładką o pojemności 300 μl, a resztę przechowuj z powrotem w temperaturze -20oC.
  3. Wstrzyknąć najwyższe stężenie ze standardowego punktu krzywej, stosując 10 min 1 - 40% gradientu liniowego ACN (patrz Tabela 1, aby zapoznać się z ustawieniami gradientu)
  4. Otwórz wynikowy chromatogram i zwróć uwagę na czas retencji, a następnie na wierzch dwóch najbardziej intensywnych (ilościowych) przejść na peptyd ze wszystkimi przejściami utworzonymi w kroku 3.
  5. Na podstawie tych informacji zaktualizuj 10-minutową metodę MRM (utworzoną w kroku 3.6) z kanałami czasowymi do pomiaru peptydów (patrz rysunek 2 dla przykładu). Aby zachować czułość, utrzymuj każdy kanał z punktami na pik większymi niż 8 i czasem przebywania dłuższym niż 0,01 sekundy dla co najmniej jednego przejścia dla każdego peptydu.
  6. Do metody MRM należy uwzględnić "opóźnienia w działaniu rozpuszczalnika": jedno na początku do 10 sekund przed pierwszą elucją, a drugie na końcu metody, 20 sekund po ostatniej elucji piku. W tym celu należy wybrać opcję "opóźnienia rozpuszczalnika" w zdarzeniach metody w pliku metody MS.
  7. Przeprowadź krzywą standardową przez metodę MRM z czasem i upewnij się, że nie ma zakłócających niespecyficznych pików z przejściami (wygenerowanych w kroku 3.6), sprawdzając liniowość.
  8. Określ, czy peptydy są wykrywalne, przeprowadzając za pomocą tej metody niewzbogaconą zbiorczą kontrolę i płyn mózgowo-rdzeniowy choroby.
  9. Usunąć z testu peptydy, które znajdują się poniżej granicy wykrywalności.

figure-protocol-2
Rysunek 2. Przykład dynamicznej metody MRM MS. Kanały czasowe przejść peptydowych można pogrupować zgodnie z ustalonymi czasami retencji. Umożliwienie włączania MRM w sposób czasowy, gdy wybrane peptydy markerowe eluują się z kolumny chromatograficznej, minimalizuje liczbę przejść w danym okresie czasu i zwiększa czułość testu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

5. Dodawanie wewnętrznych standardów

UWAGA: Jak opisano wcześniej10, do testu można włączyć wzorce wewnętrzne znakowane stabilnymi izotopami. Ze względu na koszt tych standardów zaleca się najpierw ocenę peptydów w matrycy.

  1. Określ idealne peptydy zoptymalizowane do wykrywania w płynie mózgowo-rdzeniowym: wybierz peptydy, które są najbardziej powtarzalne, o największej intensywności i bez pików interferencyjnych.
  2. Zaprojektuj odpowiednie peptydy tak, aby zawierały ciężkie etykiety aminokwasów 13C 15N, które zwiększają masę peptydu o co najmniej 6 Da w stosunku do peptydu endogennego. Dodaj również znacznik 4-6 dodatkowych aminokwasów do N- lub C-końca ciężkiego peptydu, aby kontrolować trawienie tryptyczne
    3. .
  3. Rozcieńczyć wzorce wewnętrzne znakowane stabilnymi izotopami w buforze do wytrawiania (patrz krok 2.4). Określ idealną ilość stabilnego wzorca wewnętrznego znakowanego izotopem, który zostanie wzbogacony w płynie mózgowo-rdzeniowym poprzez zwiększenie na różnych poziomach, w zależności od obfitości zaobserwowanych wcześniej podczas rozwoju. Dążenie do osiągnięcia stosunku około 1:1 stabilnego wzorca znakowanego izotopem do endogennego peptydu.
    UWAGA: Wzorce wewnętrzne znakowane stabilnymi izotopami mogą być syntetyzowane przez różne firmy handlowe.

6. Test LC-MRM próbek pacjentów z płynu mózgowo-rdzeniowego

  1. Zoptymalizuj ilość stabilnych wzorców znakowanych izotopami do 100 μl płynu mózgowo-rdzeniowego i liofilizuj mieszaninę.
  2. Zawiesić płyn mózgowo-rdzeniowy w 20 μl buforu do wytrawiania i przeprowadzić mineralizację zgodnie z opisem w pkt 2.7 - 2.10.
  3. Analizuj próbki przy użyciu metody LC-MRM opracowanej w kroku 4.
  4. Do analizy ilościowej uruchom standardowe peptydy w stężeniach 0 -15 pmol w krzywej standardowej. Patrz krok 2.5, aby zapoznać się z przygotowaniem krzywej standardowej.

7. Analiza danych

UWAGA: Dane ilościowe opierają się na współczynniku intensywności podstawowych wzorców wewnętrznych pików (ciężkie peptydy znakowane). Szczegółowe informacje dotyczące analizy danych SRM/MRM zostały opisane wcześniej10. Dane dotyczące współczynników można następnie wykorzystać w krzywej standardowej do wyznaczenia poziomów bezwzględnych lub obliczenia ich na podstawie dodanego stężenia peptydu znakowanego ciężko.

  1. Analizuj dane LC-MRM za pomocą standardowego oprogramowania producentów spektrometrów mas10. Alternatywnie użyj oprogramowania Skyline do analizy ilościowych danych MRM10.
  2. Sprawdź czułość serii, sprawdzając reakcję wzorca wewnętrznego, takiego jak enolaza drożdżowa z dodatkiem drożdży lub stabilny wzorzec znakowany izotopem w każdym przebiegu. Upewnij się, że współczynnik zmienności (CV) nie jest większy niż 25%.
  3. Ręcznie przejrzyj adnotację danych, aby upewnić się, że jest ona dokładna. Przeanalizuj każdy peptyd i stosunek do odpowiedniego stabilnego wzorca wewnętrznego znakowanego izotopem, tj. użyj stabilnej wersji peptydu znakowanej izotopem, jeśli jest dostępna.
  4. Aby uzyskać wartości bezwzględne pmol na 100 μl płynu mózgowo-rdzeniowego, należy przepuścić dane dotyczące współczynnika przez odpowiednie krzywe standardowe, które zostały uruchomione w tym samym czasie.
  5. Obliczyć współczynnik zmienności (CV). CV dla każdego peptydu powinno wynosić poniżej 25% i poniżej 15% dla peptydów o wysokiej obfitości.
    UWAGA: Wartość bezwzględna pmol na 100 μl wartości płynu mózgowo-rdzeniowego może być wykorzystana w późniejszej analizie statystycznej.

8. Status izoformy apolipoproteiny E

UWAGA: Aby określić status izoformy ApoE, można sprawdzić obecność odpowiednich peptydów, określając obecność każdej izoformy.

  1. Rozważ ApoE w 100 μl progu płynu mózgowo-rdzeniowego wynoszącego > 1,000 sygnał do szumu jako dodatni dla tego peptydu. Na rycinie 5 przedstawiono peptydy wymagane/nieobecne do określenia statusu izoformy pacjenta. Określ wyrażenie alleli, obliczając % każdej izoformy do całkowitej ekspresji ApoE.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z metody opisanej powyżej, opracowano wysokoprzepustowy, 10-minutowy test multipleksowy, składający się z 74 peptydów z 54 białek, jako test dla markerów zaburzeń neurodegeneracyjnych choroby Alzheimera i otępienia z ciałami Lewy'ego (LBD)8. Rysunek 3 przedstawia chromatogram multipleksowy opublikowany wcześniejdla 8 istotnych markerów peptydowych z testu. Peptydy wchodzące w skład testu i ich przejścia ilościowe podano w tabeli 2...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podobnie jak w przypadku wszystkich testów opartych na stwardnieniu rozsianym, krytycznymi etapami metody jest określenie odpowiednich i dokładnych ilości wzorców wewnętrznych. Jeśli stosowana jest bezwzględna ocena ilościowa, kluczowe znaczenie mają również prawidłowe ilości peptydów wzbogaconych w krzywej wzorcowej.

Nasz test nie wymaga wytrącania płynu mózgowo-rdzeniowego ani stosowania żadnych etapów oczyszczania lub odsalania przed analizą MS - jest to całkowicie jednoetapowa metoda reakc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została sfinansowana i ułatwiona dzięki inicjatywie badawczej GOSomics przez National Institute for Health Research, Centrum Badań Biomedycznych w Great Ormond Street Hospital oraz Centrum Biologicznej Spektrometrii Mas UCL w Instytucie Zdrowia Dziecka UCL dzięki darowiznom od Fundacji Szeban Peto. Centrum Badań nad Demencją jest ośrodkiem koordynującym badania nad chorobą Alzheimera w Wielkiej Brytanii. Autorzy dziękują za wsparcie ze strony Alzheimer's Research UK, NIHR Queen Square Dementia Biomedical Research Unit, UCL/H Biomedical Research Centre oraz Leonard Wolfson Experimental Neurology Centre.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Acetonitryl (ACN), klasa LC-MS FisherA955-1
Kwas mrówkowy, klasa LC-MS,FisherA117-50
Ditiothreitol (DTT)Sigma D5545 - 5 g
Kwas solny, 37% w/wVWR BDH3028 - 2,5 LG
Jodoacetamid   Sigma I1149 - 5 g
Wodorotlenek sodu (NaOH)FisherS318-500
Trypsyna, stopień sekwencjonowania, modyfikowanyPromegaV5113
Kwas trifluorooctowy (TFA), klasa LC-MSFisherA116-50
MocznikSigmaU0631- 500 g
Woda, LC-MS ULTRA ChromasolvFluka14263
Niestandardowe syntetyzowane peptydy odsolone 1-4 mgGenscriptniestandardowy
ciężki znakowany aminokwas [13C; 15N] niestandardowe peptydyGenscriptniestandardowe
ASB 14Merck Millipore182750 - 25 g
TiomocznikSigmaT7875 - 500 g
Baza TrisSigmaT6066
Kolumna wstępna VanGuardWody186007125
Cortecs UPLC C18 + 1.6 μ m  Kolumna 2,1 x 50 mmWody186007114
Drożdże Enolaza SigmaE6126
300 μ l przezroczyste szklane fiolki z zakrętkąFisher scientific03-FISV
Y nakrętki szczelinowe Fisher scientific9SCK-(B)-ST1X
LiofilizatorEdwards Mudulyo Mudulyo
Koncentrator/Próżnia prędkościEppendof koncentrator  plus 5301
Xevo -TQ-S spektrometr masowyWaters
Acquity UPLC systemWaters
System

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Prince, P. M., Guerchet, D. M., Prina, D. M., et al. Policy Brief: The Global Impact of Dementia 2013-2050. , Alzheimers Disease International. Available from: http://www.alz.co.uk/research/G8-policy-brief (2013).
  2. Hirtz, C., et al. Development of new quantitative mass spectrometry and semi-automatic isofocusing methods for the determination of Apolipoprotein E typing. Clin Chim Acta. 454, 33-38 (2015).
  3. Marx, V. Targeted proteomics. Nat Methods. 10 (1), 19-22 (2013).
  4. Heywood, W., et al. The development of a peptide SRM-based tandem mass spectrometry assay for prenatal screening of Down syndrome. J Proteomics. 75 (11), 3248-3257 (2012).
  5. Heywood, W. E., et al. Proteomic Discovery and Development of a Multiplexed Targeted MRM-LC-MS/MS Assay for Urine Biomarkers of Extracellular Matrix Disruption in Mucopolysaccharidoses I, II, and VI. Anal Chem. , (2015).
  6. Manwaring, V., et al. The identification of new biomarkers for identifying and monitoring kidney disease and their translation into a rapid mass spectrometry-based test: evidence of presymptomatic kidney disease in pediatric Fabry and type-I diabetic patients. J Proteome Res. 12 (5), 2013-2021 (2013).
  7. Moat, S. J., et al. Newborn blood spot screening for sickle cell disease by using tandem mass spectrometry: implementation of a protocol to identify only the disease states of sickle cell disease. Clin Chem. 60 (2), 373-380 (2014).
  8. Heywood, W. E., et al. Identification of novel CSF biomarkers for neurodegeneration and their validation by a high-throughput multiplexed targeted proteomic assay. Mol Neurodegener. 10, 64(2015).
  9. MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).
  10. Manes, N. P., Mann, J. M., Nita-Lazar, A. Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification. J Vis Exp. (102), e52959(2015).
  11. Craig-Schapiro, R., et al. YKL-40: a novel prognostic fluid biomarker for preclinical Alzheimer's disease. Biol Psychiatry. 68 (10), 903-912 (2010).
  12. Perrin, R. J., et al. Identification and validation of novel cerebrospinal fluid biomarkers for staging early Alzheimer's disease. PLoS One. 6 (1), e16032(2011).
  13. Liguori, C., et al. Orexinergic system dysregulation, sleep impairment, and cognitive decline in Alzheimer disease. JAMA Neurol. 71 (12), 1498-1505 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Targeted ProteomicsMRM LC MS MSCerebrospinal FluidStable Isotope Labeled StandardsMultiple Reaction MonitoringLiquid ChromatographyTandem Mass SpectrometryHigh Throughput Assay

Powiązane artykuły