Opisujemy wysokoprzepustowy, multipleksowy i celowany test proteomicznego płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF), opracowany z potencjałem do klinicznego tłumaczenia. Test może określić ilościowo potencjalne markery i czynniki ryzyka neurodegeneracji, takie jak warianty apolipoproteiny E (E2, E3 i E4), oraz zmierzyć ich ekspresję alleli.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wysokoprzepustowy, multipleksowany i ukierunkowany test proteomiczny, płyn mózgowo-rdzeniowy do ilościowego określania biomarkerów neurodegeneracyjnych i statusu izoform apolipoproteiny E
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wiele chorób neurodegeneracyjnych wciąż nie ma skuteczne leczenie. Wiarygodne biomarkery do identyfikacji i klasyfikacji tych chorób będą miały istotne znaczenie dla rozwoju przyszłych nowych terapii. Często potencjalne nowe biomarkery nie trafiają do kliniki ze względu na ograniczenia w ich opracowywaniu i wysokie koszty. Jednak ukierunkowana proteomika wykorzystująca chromatografię cieczową z monitorowaniem wielu reakcji - tandem/spektrometria mas (MRM LC-MS / MS), w szczególności przy użyciu spektrometrów mas z potrójnym kwadrupolem, jest jedną z metod, którą można wykorzystać do szybkiej oceny i walidacji biomarkerów do klinicznego przeniesienia do laboratoriów diagnostycznych. Tradycyjnie platforma ta była szeroko wykorzystywana do pomiaru małych cząsteczek w laboratoriach klinicznych, ale to potencjał do analizy białek sprawia, że jest atrakcyjną alternatywą dla metod opartych na testach ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay). Opisujemy tutaj, w jaki sposób ukierunkowana proteomika może być wykorzystana do pomiaru multipleksowanych markerów demencji, w tym do wykrywania i ilościowego oznaczania znanego czynnika ryzyka apolipoproteiny E izoformy 4 (ApoE4).
Aby test nadawał się do translacji, został zaprojektowany tak, aby był szybki, prosty, wysoce szczegółowy i opłacalny. Aby to osiągnąć, każdy etap rozwoju testu musi być zoptymalizowany pod kątem poszczególnych białek i tkanek, w których są analizowane. Ta metoda opisuje typowy przepływ pracy, w tym różne wskazówki i porady dotyczące opracowania ukierunkowanego proteomiki MRM LC-MS/MS do translacji.
Rozwój metody jest optymalizowany przy użyciu niestandardowych syntetyzowanych wersji tryptycznych peptydów kwantypotypowych, które kalibrują MS do wykrywania, a następnie są wprowadzane do płynu mózgowo-rdzeniowego w celu określenia poprawnej identyfikacji endogennego peptydu w separacji chromatograficznej przed analizą w MS. Aby uzyskać bezwzględną ocenę ilościową, do testu włącza się stabilne, znakowane izotopowo wersje wzorców wewnętrznych peptydów z krótkimi znacznikami sekwencji aminokwasów i zawierające miejsce rozszczepienia trypsyny.
Wprowadzenie
Rosnący wpływ chorób neurodegeneracyjnych, takich jak choroba Alzheimera, otępienie z ciałami Lewy'ego i choroba Parkinsona, staje się problemem społeczno-ekonomicznym w wielu krajach1. Istnieje zapotrzebowanie na dodatkowe biomarkery, które można wykorzystać do identyfikacji i klasyfikacji pacjentów we wczesnych stadiach choroby oraz do monitorowania wszelkich potencjalnych nowych metod leczenia. Ogólnym celem tej metody jest stworzenie ogólnego potoku dla usprawnionego, ekonomicznego i szybszego sposobu walidacji potencjalnych markerów neurodegeneracji płynu mózgowo-rdzeniowego. Uzasadnieniem jest wykorzystanie ukierunkowanej proteomiki lub peptydu MRM LC-MS/MS jako łatwej do modyfikacji metody oceny wielu potencjalnych biomarkerów białkowych z eksperymentów odkrywczych. Można je następnie multipleksować w szybkim rozdzielaniu chromatograficznym (<10 min) i oceniać. W tym multipleksowym badaniu przesiewowym dla biomarkerów neurodegeneracyjnych uwzględniliśmy znany czynnik ryzyka demencji izoformę E4 apolipoproteiny (ApoE4), dzięki czemu możemy jednocześnie określić jej status i poziom ekspresji, eliminując w ten sposób potrzebę oddzielnych testów genotypowania2. LC MS/MS jest rutynowo stosowana jako metoda z wyboru do dokładnego oznaczania ilościowego małych cząsteczek w porównaniu z innymi metodami, takimi jak ELISA lub test radioimmunologiczny (RIA). Ta zmiana w wykorzystaniu technologii SM do analizy białek była napędzana głównie przez problemy z technologiami opartymi na odporności. Należą do nich specyficzność krzyżowa, zmienność między partiami, ograniczony okres trwałości i wysokie koszty. W związku z tym proteomika celowana szybko staje się coraz większą alternatywą dla metod opartych na przeciwciałach, takich jak Western blotting, RIA i ELISA. Jednak zdolność do multipleksowania wielu markerów w jednym teście jest główną przewagą tej techniki nad metodami opartymi na immunologii3. Technika ta ma zastosowanie do wielu tkanek i została wykorzystana jako strategia walidacji w wielu badaniach proteomicznych, w tym w osoczu4 i moczu5,6.
Technika może być zastosowana w każdym laboratorium, które ma dostęp i doświadczenie w korzystaniu z potrójnych kwadrupolowych spektrometrów masowych. Projektowanie peptydów jest stosunkowo proste przy rosnącym wykorzystaniu baz danych typu open source. Konkurencyjny rynek syntezy niestandardowych peptydów sprawia, że są one znacznie bardziej przystępne cenowo. Ciężkie peptydy są jednak drogie i dlatego markery powinny być oceniane na małej kohorcie przed przejściem do większej skali. Istnieje rosnący potencjał wykorzystania tej techniki w klinicznych warunkach diagnostycznych, przy czym większość dużych szpitali posiada platformy oparte na potrójnym kwadrupolu, które można łatwo dostosować do przeprowadzania ukierunkowanych testów proteomicznych. Jednym z takich zastosowań tej metody, które stają się rutynowym ustawieniem diagnostycznym, jest jej niedawne zastosowanie w badaniach przesiewowych kropli krwi u noworodków w kierunku niedokrwistości sierpowatokrwinkowej7.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
UWAGA: Schemat całego opisanego tutaj protokołu przedstawiono na Rys. 1. Wszystkie próbki wykorzystane do opracowania tej metody są nadmiarowymi próbkami diagnostyki klinicznej i posiadają zgodę etyczną komisji etyki London Bloomsbury.
Rysunek 1. Schemat przedstawiający ogólny proces tworzenia celowanego testu MRM LC-MS/MS dla płynu mózgowo-rdzeniowego. Peptydy kandydatów na markery do oceny są wybierane z białek docelowych. Dzięki zastosowaniu peptydów syntetyzowanych na zamówienie opracowywana jest celowana, multipleksowa metoda LC-MS/MS. Po walidacji test ten może być wykorzystany do oceny skuteczności potencjalnych markerów neurodegeneracji.
1. Wybór i projektowanie peptydów
UWAGA: Kryteria dla peptydów markerowych wymagają, aby były one unikalne (proteotypowe) i reprezentowały ilościową obfitość białka (kwantotypowe). W celu ustalenia, czy dany peptyd jest unikalny, można skorzystać z narzędzia wyszukiwania „blast” na stronie internetowej Uniprot (http://www.uniprot.org/blast/).
- Zdefiniuj listę białek docelowych (markerów), t. j., ApoE (patrz Tabela 2).
UWAGA: Jeśli marker został zidentyfikowany w poprzednich eksperymentach profilowania proteomicznego8następnie z tego zestawu danych należy wybrać peptyd, który daje najlepszą odpowiedź. - Jeśli te informacje są niedostępne, należy skorzystać z witryn typu open source, takich jak in silico trawienie trypsyną białek docelowych przy użyciu narzędzia programistycznego, takiego jak MS-Digest.
- Wybierz peptyd, który jest produktem trawienia trypsyną i nie jest podatny na modyfikacje potranslacyjne.
UWAGA: Informacje te można zweryfikować na stronie internetowej Uniprot pod adresem www.uniprot.org. Należy unikać peptydów podatnych na modyfikacje chemiczne podczas przygotowania próbek do analizy LC-MS. - Zamów syntezę niestandardową wybranych peptydów.
UWAGA: Peptydy markerowe mogą być syntetyzowane na zamówienie przez różne firmy komercyjne. W przypadku ApoE ustalono, że peptydem kwantotypowym używanym do pomiaru całkowitego poziomu ApoE jest AATVGSLAGQPLQER. Sekwencje peptydów proteotypowych używanych do określenia wariantów E2 i E4 to odpowiednio peptydy tryptyczne dla pozycji 158 (RLAVYQAGAR i CLAVYQAGAR) oraz pozycji 112 (LGADMEDVCGR i LGADMEDVR).
2. Przygotowanie peptydów wzorcowych
UWAGA: Aby wybrać najlepsze przejścia ilościowe, konieczna jest optymalizacja detekcji macierzy (CSF). Najskuteczniejszym sposobem optymalizacji peptydów w analizie multipleksowej jest stworzenie pul peptydów o znanych stężeniach. Pule te mogą następnie zostać wykorzystane do opracowania metody oraz stworzenia krzywych wzorcowych.
- Resuspendować syntetyczne peptydy (szczegóły dotyczące peptydów podano w Tabeli 2) do stężenia zapasu 1 mg/ml zgodnie z instrukcjami producenta. Domyślnie, w przypadku braku instrukcji, resuspendować peptydy w mieszaninie acetonitrylu (ACN)/H2O w stosunku 50:50 (v/v).
- Przygotować rozcieńczenia peptydów 1:10 ze stężenia zapasu i połączyć 1 000 pmol każdego peptydu w probówce do mikrocentryfugi o niskim wiązaniu. Końcową mieszaninę odparować w koncentratorze SpeedVac i przechowywać w temperaturze -20 °C. Przygotować kilka takich mieszanin do przyszłego użycia.
- Rozdzielić CSF w ilości 100 µl do probówek o niskim wiązaniu. Liofilizować CSF.
- Resuspendować alikwot połączonych 1 000 pmol peptydów w buforze do trawienia (100 mM Tris HCl, pH 7.8, 6 M mocznika, 2 M tiomocznika, 2% ASB14), aby uzyskać stężenia 10 i 1 pmol/µl.
- Dodać połączone peptydy do liofilizowanych alikwotów 100 µl CSF w stężeniach 0, 1, 2, 5, 10 i 15 pM. Dodać 20 ng nienaruszonego, niepowiązanego białka, takiego jak enolaza drożdżowa, aby pełniło funkcję standardu wewnętrznego i kontroli wydajności trawienia trypsyną.
- Uzupełnić alikwoty CSF buforem do trawienia do końcowej objętości 20 µl. Wymieszać w wirówce typu vortex.
- Dodać 1,5 µl ditiotreitolu (30 mg w 1 ml 100 mM Tris HCl, pH 7.8) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 h, wytrząsając.
- Dodać 3 µl jodooctanu (35 mg w 1 ml 100 mM Tris HCl, pH 7.8) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 45 min w ciemności, wytrząsając.
- Dodać 165 µl ddH2O.
- Dodać 10 µl roztworu modyfikowanej trypsyny klasy sekwencyjnej o stężeniu 0,1 µg/µl, resuspendowanej w 50 mM buforze wodorowęglanu amonu, pH 7.8. Inkubować w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C przez noc (O/N) i zatrzymać trawienie poprzez zamrożenie próbek. Przechowywać produkty trawienia w temperaturze -20 °C do czasu analizy.
3. Optymalizacja detekcji peptydów metodą MS
- Skopiuj i wklej sekwencję optymalizowanego peptydu do odpowiedniego oprogramowania, np. Sylwetka miasta9Kliknij sekwencję peptydową, aby uzyskać informacje o oczekiwanej masie jonu prekursorowego i jonach produktowych.
- Rozcieńczyć peptydy z roztworu stokowego (patrz sekcja 2.1) do stężenia 1 ng/ml w celu optymalizacji metody MS.
- Wprowadź peptydy bezpośrednio do spektrometru mas z optymalnym przepływem (zazwyczaj 0,1–0,8 ml/min) i przy energii kolizyjnej od 0 do 5%.
- Należy zebrać widmo MS w celu identyfikacji eksperymentalnych prekursorów jonów wielokrotnie naładowanych8Wybierz jon prekursorowy (m/z), który daje największą intensywność (zaleca się wybór jonów prekursorowych dwukrotnie lub trzykrotnie naładowanych).
- Ponownie wprowadź peptyd i zastosuj energię kolizyjną w celu fragmentacji peptydu poprzez dysocjację indukowaną zderzeniowo (CID). Zoptymalizuj energię stożka oraz energię kolizyjną, aby uzyskać najlepszy wzór fragmentacji (zaleca się uzyskanie jonów fragmentacyjnych jednokrotnie lub dwukrotnie naładowanych, a masa jonu fragmentacyjnego powinna być najlepiej większa niż masa jonu prekursorowego).
- Należy zweryfikować, czy przejścia uzyskane eksperymentalnie są zgodne z przejściami wygenerowanymi in silico (zgodnie z opisem w kroku 3.1). Zapisz listę przejść w pliku metody MRM, uwzględniając co najmniej 2 najintensywniejsze przejścia na jon prekursorowy. W końcowym badaniu uwzględnij 2 przejścia: jedno do oznaczania ilościowego i jedno do potwierdzenia.
UWAGA: Niektórzy producenci spektrometrów masowych posiadają funkcję (t. j., Waters Intellistart) do zautomatyzowanej optymalizacji analizy MRM lub SRM. Jeśli to możliwe, należy przeprowadzić infuzję peptydów w zmieszanych fazach ruchomych zawierających 50–70% ACN z 0,1% FA.
4. Optymalizacja metody LC-MRM
UWAGA: Mieszaninę syntetycznych peptydów należy przeanalizować za pomocą systemu ultraszybkiej chromatografii cieczowej (UPLC) sprzężonego z potrójnym spektrometrem mas kwadrupolowym. Należy upewnić się, że źródło jest czyste. Rozpuszczalnik A to ddH20 z 0,1% FA; rozpuszczalnik B to ACN z 0,1% FA.
- Należy użyć systemu LC-MS wyposażonego w kolumnę UPLC wypełnioną fazą C-18 (średnica 1.6 µm, pory 90 Å, 2.1 mm x 50 mm długości) połączoną z przedkolumną tej samej fazy.
- Rozmrozić hydrolizaty CSF na lodzie, odwirować przy 16,000 g przez 10 min, przenieść 60 µl do szklanych fiolek z wkładkami o pojemności 300 µl, a pozostałą część przechowywać ponownie w temperaturze -20oC.
- Wstrzyknąć najwyższe stężenie z punktu krzywej wzorcowej, stosując 10 min liniowy gradient ACN 1 - 40% (ustawienia gradientu znajdują się w Tabeli 1).
- Otworzyć otrzymany chromatogram i odnotować czas retencji oraz dwa najbardziej intensywne przejścia (ilościowe) dla każdego peptydu ze wszystkich przejść utworzonych w kroku 3.
- Na podstawie tych informacji zaktualizować 10 min metodę MRM (utworzoną w kroku 3.6) za pomocą kanałów czasowych do pomiaru peptydów (przykład przedstawiono na Rysunku 2). Aby zachować czułość, należy utrzymywać w każdym kanale liczbę punktów na pik powyżej 8 oraz czas dwell powyżej 0.01 sec dla co najmniej jednego przejścia dla każdego peptydu.
- W metodzie MRM należy uwzględnić „solvent delays” (opóźnienia rozpuszczalnika): jedno na początku, do 10 sec przed elucją pierwszego piku, oraz drugie na końcu metody, 20 sec po elucji ostatniego piku. Należy to zrobić, wybierając „solvent delays” w zdarzeniach metody (method events) w pliku metody MS.
- Przeprowadzić analizę krzywej wzorcowej za pomocą czasowej metody MRM i upewnić się, że nie występują zakłócające piki nieswoiste z przejściami (wygenerowanymi w kroku 3.6), sprawdzając liniowość.
- Ustalić, czy peptydy są wykrywalne, przepuszczając przez metodę nieposiewaną połączoną próbkę kontrolną oraz CSF z chorobą.
- Usunąć z analizy peptydy, które znajdują się poniżej granicy wykrywalności.
Rysunek 2. Przykład dynamicznej metody MRM MS. Kanały przejść peptydowych z określonym czasem mogą być grupowane zgodnie z ustalonymi czasami retencji. Umożliwienie wprowadzania przejść MRM w sposób zsynchronizowany z czasem elucji wybranych peptydów markerowych z kolumny chromatograficznej minimalizuje liczbę przejść w danym przedziale czasowym i zwiększa czułość analizy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
5. Dodanie standardów wewnętrznych
UWAGA: Jak opisano wcześniej10, w analizie można zastosować wewnętrzne standardy znakowane stabilnymi izotopami. Ze względu na wysoki koszt tych standardów zaleca się, aby w pierwszej kolejności ocenić zawartość peptydów w matrycy.
- Wyznaczyć optymalne peptydy do detekcji w CSF: wybrać peptydy najczęściej występujące, o najwyższej intensywności i bez pików interferencyjnych.
- Zaprojektować odpowiadające im peptydy zawierające ciężkie znaczniki aminokwasowe 13C 15N, które zwiększą masę peptydy o co najmniej 6 Da w stosunku do peptydy endogennego. Dodatkowo, do końca N- lub C-końca ciężkiego peptydy dodać znacznik w postaci 4–6 dodatkowych aminokwasów w celu kontroli trawienia trypsyną.
- Rozcieńczyć wewnętrzne standardy znakowane stabilnymi izotopami w buforze do trawienia (patrz krok 2.4). Wyznaczyć optymalną ilość wewnętrznego standardu znakowanego stabilnymi izotopami do dodania do CSF, wprowadzając różne poziomy w zależności od obfitości zaobserwowanej wcześniej podczas etapu opracowywania metody. Należy dążyć do osiągnięcia przybliżonego stosunku 1:1 standardu znakowanego stabilnymi izotopami do peptydy endogennego.
UWAGA: Wewnętrzne standardy znakowane stabilnymi izotopami mogą być syntetyzowane przez różne firmy komercyjne.
6. Analiza LC-MRM próbek płynu mózgowo-rdzeniowego pacjentów
- Dodaj zoptymalizowaną ilość standardów znakowanych stabilnymi izotopami do 100 µl płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF), a następnie liofilizuj mieszaninę.
- Resuspenduj CSF w 20 µl buforu do trawienia i przeprowadź trawienie zgodnie z opisem w punktach 2.7 - 2.10.
- Przeanalizuj próbki przy użyciu metody LC-MRM opracowanej w kroku 4.
- Do analizy ilościowej przeprowadź pomiary peptydów standardowych w stężeniach 0 -15 pmol w celu stworzenia krzywej wzorcowej. Przygotowanie krzywej wzorcowej opisano w kroku 2.5.
7. Analiza danych
UWAGA: Dane ilościowe opierają się na stosunku intensywności szczytów linii bazowej standardów wewnętrznych (peptydów znakowanych ciężko). Szczegółowe informacje dotyczące analizy danych SRM/MRM zostały opisane wcześniej10. Dane dotyczące stosunku mogą być następnie wykorzystane w krzywej wzorcowej do określenia poziomów bezwzględnych lub obliczenia ich na podstawie dodanego stężenia peptydów znakowanych ciężko.
- Przeanalizuj dane LC-MRM przy użyciu standardowego oprogramowania producenta spektrometrów masowych10. Alternatywnie można użyć oprogramowania Skyline do analizy ilościowych danych MRM10.
- Sprawdź czułość analizy, weryfikując odpowiedź standardu wewnętrznego, takiego jak dodana enolaza drożdżowa lub standard znakowany stabilnymi izotopami w każdym pomiarze. Upewnij się, że współczynnik zmienności (CV) nie przekracza 25%.
- Ręcznie zweryfikuj adnotacje danych, aby zapewnić ich dokładność. Przeanalizuj każdy peptyd i oblicz stosunek do odpowiedniego standardu wewnętrznego znakowanego stabilnymi izotopami, t.j. użyj wersji peptydu znakowanej stabilnymi izotopami, jeśli jest dostępna.
- Aby uzyskać wartości bezwzględne w pmol na 100 µl płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF), wprowadź dane dotyczące stosunków do odpowiednich krzywych wzorcowych, które zostały wyznaczone w tym samym czasie.
- Oblicz współczynnik zmienności (CV). CV dla każdego peptydu powinno być niższe niż 25%, a dla peptydów o wysokiej zawartości niższe niż 15%.
UWAGA: Bezwzględne wartości w pmol na 100 µl CSF mogą być wykorzystane w późniejszych analizach statystycznych.
8. Status izoform apolipoproteiny E
UWAGA: Aby określić status izoform ApoE, można przeprowadzić analizę obecności odpowiadających im peptydów poprzez wykazanie obecności każdej izoformy.
- Przyjmij próg sygnału do szumu > 1 000 dla ApoE w 100 µl CSF jako wynik dodatni dla tego peptydu. Patrz Rysunek 5 w celu sprawdzenia peptydów wymaganych lub ich braku do określenia statusu izoformy pacjenta. Określ ekspresję alleliczną, obliczając % każdej izoformy w stosunku do całkowitej ekspresji ApoE.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Wykorzystując opisaną powyżej metodę, opracowano wysokoprzepustowy, 10-minutowy test multipleksowy obejmujący 74 peptydy z 54 białek, służący do oznaczania markerów schorzeń neurodegeneracyjnych, takich jak choroba Alzheimera i otępienie z ciałami Lewy'ego (LBD)8. Na Rysunku 3 przedstawiono opublikowany wcześniej8 chromatogram multipleksowy istotnych markerów peptydowych z tego testu. Peptydy uwzględnione w badaniu oraz ich przejścia ilościowe podano...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Podobnie jak w przypadku wszystkich testów opartych na stwardnieniu rozsianym, krytycznymi etapami metody jest określenie odpowiednich i dokładnych ilości wzorców wewnętrznych. Jeśli stosowana jest bezwzględna ocena ilościowa, kluczowe znaczenie mają również prawidłowe ilości peptydów wzbogaconych w krzywej wzorcowej.
Nasz test nie wymaga wytrącania płynu mózgowo-rdzeniowego ani stosowania żadnych etapów oczyszczania lub odsalania przed analizą MS - jest to całkowicie jednoetapowa metoda reakc...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca została sfinansowana i ułatwiona dzięki inicjatywie badawczej GOSomics przez National Institute for Health Research, Centrum Badań Biomedycznych w Great Ormond Street Hospital oraz Centrum Biologicznej Spektrometrii Mas UCL w Instytucie Zdrowia Dziecka UCL dzięki darowiznom od Fundacji Szeban Peto. Centrum Badań nad Demencją jest ośrodkiem koordynującym badania nad chorobą Alzheimera w Wielkiej Brytanii. Autorzy dziękują za wsparcie ze strony Alzheimer's Research UK, NIHR Queen Square Dementia Biomedical Research Unit, UCL/H Biomedical Research Centre oraz Leonard Wolfson Experimental Neurology Centre.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Acetonitryl (ACN), klasa LC-MS | Fisher | A955-1 | |
| Kwas mrówkowy, klasa LC-MS, | Fisher | A117-50 | |
| Ditiothreitol (DTT) | Sigma | D5545 - 5 g | |
| Kwas solny, 37% w/w | VWR | BDH3028 - 2,5 LG | |
| Jodoacetamid | Sigma | I1149 - 5 g | |
| Wodorotlenek sodu (NaOH) | Fisher | S318-500 | |
| Trypsyna, stopień sekwencjonowania, modyfikowany | Promega | V5113 | |
| Kwas trifluorooctowy (TFA), klasa LC-MS | Fisher | A116-50 | |
| Mocznik | Sigma | U0631- 500 g | |
| Woda, LC-MS ULTRA Chromasolv | Fluka | 14263 | |
| Niestandardowe syntetyzowane peptydy odsolone 1-4 mg | Genscript | niestandardowy | |
| ciężki znakowany aminokwas [13C; 15N] niestandardowe peptydy | Genscript | niestandardowe | |
| ASB 14 | Merck Millipore | 182750 - 25 g | |
| Tiomocznik | Sigma | T7875 - 500 g | |
| Baza Tris | Sigma | T6066 | |
| Kolumna wstępna VanGuard | Wody | 186007125 | |
| Cortecs UPLC C18 + 1.6 μ m Kolumna 2,1 x 50 mm | Wody | 186007114 | |
| Drożdże Enolaza | Sigma | E6126 | |
| 300 μ l przezroczyste szklane fiolki z zakrętką | Fisher scientific | 03-FISV | |
| Y nakrętki szczelinowe | Fisher scientific | 9SCK-(B)-ST1X | |
| Liofilizator | Edwards Mudulyo | Mudulyo | |
| Koncentrator/Próżnia prędkości | Eppendof | koncentrator plus 5301 | |
| Xevo -TQ-S spektrometr masowy | Waters | ||
| Acquity UPLC system | Waters |
Bibliografia
- Prince, P. M., Guerchet, D. M., Prina, D. M., et al. Policy Brief: The Global Impact of Dementia 2013-2050. , Alzheimers Disease International. Available from: http://www.alz.co.uk/research/G8-policy-brief (2013).
- Hirtz, C., et al. Development of new quantitative mass spectrometry and semi-automatic isofocusing methods for the determination of Apolipoprotein E typing. Clin Chim Acta. 454, 33-38 (2015).
- Marx, V. Targeted proteomics. Nat Methods. 10 (1), 19-22 (2013).
- Heywood, W., et al. The development of a peptide SRM-based tandem mass spectrometry assay for prenatal screening of Down syndrome. J Proteomics. 75 (11), 3248-3257 (2012).
- Heywood, W. E., et al. Proteomic Discovery and Development of a Multiplexed Targeted MRM-LC-MS/MS Assay for Urine Biomarkers of Extracellular Matrix Disruption in Mucopolysaccharidoses I, II, and VI. Anal Chem. , (2015).
- Manwaring, V., et al. The identification of new biomarkers for identifying and monitoring kidney disease and their translation into a rapid mass spectrometry-based test: evidence of presymptomatic kidney disease in pediatric Fabry and type-I diabetic patients. J Proteome Res. 12 (5), 2013-2021 (2013).
- Moat, S. J., et al. Newborn blood spot screening for sickle cell disease by using tandem mass spectrometry: implementation of a protocol to identify only the disease states of sickle cell disease. Clin Chem. 60 (2), 373-380 (2014).
- Heywood, W. E., et al. Identification of novel CSF biomarkers for neurodegeneration and their validation by a high-throughput multiplexed targeted proteomic assay. Mol Neurodegener. 10, 64(2015).
- MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).
- Manes, N. P., Mann, J. M., Nita-Lazar, A. Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification. J Vis Exp. (102), e52959(2015).
- Craig-Schapiro, R., et al. YKL-40: a novel prognostic fluid biomarker for preclinical Alzheimer's disease. Biol Psychiatry. 68 (10), 903-912 (2010).
- Perrin, R. J., et al. Identification and validation of novel cerebrospinal fluid biomarkers for staging early Alzheimer's disease. PLoS One. 6 (1), e16032(2011).
- Liguori, C., et al. Orexinergic system dysregulation, sleep impairment, and cognitive decline in Alzheimer disease. JAMA Neurol. 71 (12), 1498-1505 (2014).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
