Adsorpcja peptydów na plastikowych naczyniach podczas tradycyjnych seryjnych rozcieńczeń na bazie końcówek może znacząco wpłynąć na określenie siły działania i zakłócić zrozumienie zależności struktura-aktywność używanych do identyfikacji ołowiu i optymalizacji ołowiu w fazach odkrywania leków. W tym miejscu opisano metody automatycznego akustycznego bezkontaktowego seryjnego rozcieńczania próbek peptydów.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Zautomatyzowane dozowanie akustyczne do seryjnego rozcieńczania agonistów peptydów w testach oznaczania siły działania
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Podobnie jak w przypadku odkrywania leków małocząsteczkowych, badania przesiewowe w kierunku agonistów peptydów wymagają seryjnego rozcieńczania peptydów w celu uzyskania krzywych stężenie-odpowiedź. Peptydy przesiewowe zapewniają dodatkową warstwę złożoności, ponieważ konwencjonalne metody obsługi próbek oparte na końcówkach wystawiają peptydy na dużą powierzchnię wyrobów z tworzyw sztucznych, zapewniając zwiększoną możliwość utraty peptydów w wyniku adsorpcji. Zapobieganie nadmiernemu narażeniu na wyroby z tworzyw sztucznych zmniejsza utratę peptydów poprzez przyleganie do tworzyw sztucznych, a tym samym minimalizuje niedokładności w przewidywaniu siły działania, a wcześniej opisaliśmy korzyści płynące z bezdotykowego dozowania akustycznego w wysokoprzepustowych badaniach przesiewowych agonistów peptydów in vitro 1. W tym miejscu omawiamy w pełni zintegrowane rozwiązanie automatyzacji do bezdotykowego akustycznego przygotowania seryjnych rozcieńczeń peptydów na płytkach mikromiareczkowych, wykorzystując przykład badań przesiewowych w kierunku agonistów peptydów w mysim receptorze glukagonopodobnego peptydu-1 (GLP-1R). Nasze metody pozwalają na wysokoprzepustowe testy komórkowe do badań przesiewowych w kierunku agonistów i są łatwo skalowalne w celu zwiększenia przepustowości próbek lub umożliwienia zwiększenia liczby kopii płytek testowych (np. w przypadku panelu większej liczby docelowych linii komórkowych).
Wprowadzenie
GLP-1R jest uznanym celem leku w leczeniu cukrzycy typu 22. Natywny agonista peptydowy tego receptora, GLP-1, ma okres półtrwania in vivo wynoszący 2-3minuty 3. Wiązanie GLP-1 z receptorem docelowym sprzężonym z białkiem G powoduje dalszą produkcję drugiego przekaźnika cAMP poprzez natywne sprzężenie białka G z aktywacją cyklazy adenylowej. Pomiar skumulowanego cAMP zapewnia solidny test do monitorowania aktywacji receptora i badań przesiewowych pod kątem aktywnych analogów GLP-1 o preferowanych właściwościach fizykochemicznych. Takie badanie wymaga seryjnego rozcieńczania badanych próbek w celu skonstruowania krzywych stężenie-odpowiedź, a jest to szczególnie skomplikowane w przypadku przekazywania próbek peptydów. Potencjalne błędy wynikające z przygotowania seryjnego rozcieńczania na podstawie końcówki zostały opisane wcześniej1,4,5. Peptydy będą adsorbować się na wyrobach z tworzyw sztucznych, co skutkuje niewiarygodnymi szacunkami mocy. Utratę peptydów można zminimalizować poprzez włączenie albuminy surowicy bydlęcej (BSA) do i zastosowanie silikonowanych wyrobów z tworzyw sztucznych, jednak wiązanie białek pozostaje nieprzewidywalne. W szczególności opisano zmienność wiązania GLP-1 z pojemnikami eksperymentalnymi6. Kolejną komplikacją jest to, że środki stabilizujące stosowane w laboratoryjnych naczyniach z tworzyw sztucznych mogą wypłukiwać się z końcówek i płytek do mikromiareczkowania do wodnych testowych i zakłócać funkcję białka7, 8. Dlatego metody zmniejszające narażenie na wyroby z tworzyw sztucznych są niezbędne do zwiększenia dokładności pomiarów.
Akustyczne dozowniki cieczy skupiają sygnał akustyczny o wysokiej częstotliwości na powierzchni próbki płynu, co powoduje wyrzucenie precyzyjnych kropelek nanolitrowych na sąsiednią płytkę testową9. Zastosowanie wyrzutu akustycznego jest standardem w przemyśle farmaceutycznym do przygotowywania i badania przesiewowego dużych bibliotek związków syntetycznych, a technologia ta została dobrze zwalidowana dla małych cząsteczek10. Zgodnie z naszą wiedzą, jesteśmy pierwszą grupą, która opisała dozowanie akustyczne do przygotowania peptydów rekombinowanych i syntetycznych, a wcześniej informowaliśmy o poprawie dokładności w porównaniu z konwencjonalnymi metodami opartymi na końcówkach1.
Ten artykuł opisuje integrację przygotowania seryjnych i bezpośrednich rozcieńczeń peptydów za pomocą bezkontaktowego transferu akustycznego do w pełni zautomatyzowanego systemu robotyki do obsługi płyt. Szereg metod obejmujących akustyczny transfer próbek został opisany wcześniej11. Stosujemy dwuetapową metodę do przygotowania pośrednich stężeń podstawowych i seryjnego rozcieńczania analogów peptydów w celu wygenerowania pełnej krzywej dawka-odpowiedź. Przygotowane peptydy są inkubowane z komórkami wyrażającymi docelowy mysz GLP-1R, a my używamy komercyjnie dostępnego testu jednorodnej fluorescencji rozdzielczej w czasie (HTRF) do pomiaru akumulacji cAMP w tych komórkach jako odczytu aktywności agonisty peptydu. Test jest solidny i podatny na wysokoprzepustowy format 384-dołkowy i jest rutynowo stosowany zarówno w opracowywaniu testów, jak i w projektach badań przesiewowych leków12.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Seryjne rozcieńczanie peptydów
- Przygotować bufor do oznaczania: buforowany roztwór soli Hanksa (HBSS) uzupełniony 25 mM HEPES, 0,1% BSA i 0,5 mM 3-izobutylo-1-metyloksantyny (IBMX), pH 7,4.
- Użyj dozownika odczynników luzem, aby systematycznie dodawać 5 μl buforu testowego do każdej studzienki z pięciu 384-dołkowych płytek testowych o małej objętości.
- Użyj wewnętrznego oprogramowania, aby utworzyć program dozowania do dodawania objętości 5 μl do każdego dołka płytki 384-dołkowej zgodnie z instrukcjami producenta.
- Zanurz rurki kasety dozującej w buforze testowym i płynie podstawowym.
- Umieścić 384-dołkową płytkę do oznaczania małej objętości na nośniku płyty.
- Naciśnij start.
- Rozcieńczyć wszystkie próbki peptydów, niezależnie od nośnika do przechowywania, w buforze testowym, aby uzyskać 100-krotny zapas peptydów.
UWAGA: Peptydy wymagające badań przesiewowych mogą być dostarczane w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) lub dimetylosulfotlenku (DMSO), jeśli zostanie to uznane za właściwe (np. DMSO będzie miało szkodliwy wpływ na peptydy z wtórnymi modyfikacjami, takimi jak pegylacja). - Dozuj 25 μl 100x peptydów do kolumn 1-5 akustycznie kwalifikowanej 384-dołkowej mikropłytki polipropylenowej. Tabliczka ta jest oznaczona jako "tablica źródłowa A". Upewnij się, że płyty źródłowe, ale nie płyty docelowe, są płaskodenne i spełniają określone tolerancje akustyczne określone przez producenta instrumentów akustycznych.
- Dozować 25 μl 100x kontrolki referencyjnej do studzienek A23 i A24 na płytce źródłowej A.
- Dozować 10 μl buforu do oznaczania do kolumn 11-15 i 30 μl buforu do oznaczania do kolumn 21-22 na płytce źródłowej A.
- Dozować 10 μl buforu do oznaczania do kolumn 6-10 i kolumn 16-20 drugiej, akustycznie kwalifikowanej 384-dołkowej mikropłytki polipropylenowej. Tabliczka ta jest oznaczona jako "tablica źródłowa B".
- Odwirować płytki źródłowe A i B przy 300 x g przez 1 min. Dołączyć odpowiednią płytkę równoważącą.
- Użyj akustycznych dozowników płynów zintegrowanych ze zautomatyzowanym systemem robotycznym, aby przygotować trzy sekwencyjne rozcieńczenia pośrednie w skali 1:100 (w buforze testowym) 100-krotnych zapasów peptydów z kolumny 1 w źródle A.
UWAGA: Programowanie wymaga oprogramowania do ponownego formatowania płytki i reagowania na dawkę (dostarczonego przez producenta dozownika płynu akustycznego), aby umożliwić trzy transfery akustyczne między źródłem A a źródłem B (patrz rysunek 1 dla układów płytek). Krok 1.9 szczegółowo opisuje zastosowanie dozowników płynów używanych w tym laboratorium pod zautomatyzowanym sterowaniem robota (patrz Tabela Materiałów):- Załaduj płytki źródłowe i płytki testowe do sekcji hotelowej robotyki.
- Otwórz zautomatyzowane oprogramowanie robotyczne i protokoły ponownego formatowania płyt obciążeniowych i rozszerzania programu odpowiedzi na dawkę. Kliknij 'Uruchom'.
UWAGA: Automatyzacja instruuje akustyczny dozownik płynu, aby przeniósł 250 nl z kolumn 1-5 płytki źródłowej A do kolumn 6-10 płytki źródłowej B, a drugi akustyczny dozownik płynu zdolny do obsługi większych objętości płynów w celu wypełnienia 15 μl buforu testowego do wymieszania. Następnie automatyka przenosi płytkę źródłową B do zintegrowanej wirówki i wiruje przy 300 x g przez 1 minutę (odpowiednia płyta równoważąca jest dołączona do wszystkich etapów wirowania). Płytka źródłowa B jest zawracana do dozownika płynu akustycznego w celu przeniesienia 250 nl z kolumn 6-10 płytki źródłowej B do kolumn 11-15 płytki źródłowej A i zasypania 15 μl buforem do oznaczania w celu wymieszania. Automatyzacja przenosi płytkę źródłową A do zintegrowanej wirówki i wirówek przy 300 x g przez 1 min. Płytka źródłowa A jest następnie zawracana do dozownika płynu akustycznego w celu przeniesienia 250 nl z kolumn 11-15 płytki źródłowej A do kolumn 16-20 płytki źródłowej B i zasypania 15 μl buforem do oznaczania w celu wymieszania. Następnie automatyzacja przenosi płytkę źródłową B do zintegrowanej wirówki i wiruje przy 300 x g przez 1 min.
UWAGA: Wreszcie, protokół odpowiedź na dawkę kieruje dozowanie akustyczne w celu przeniesienia wymaganej objętości z każdej z 4 stopniowo rozcieńczonych studzienek na płytkę źródłową (zarówno na płytce źródłowej A, jak i na płytce źródłowej B) w celu skonstruowania pełnej 11-punktowej krzywej w dwóch egzemplarzach na płytkach testowych (wstępnie wypełnionych buforem do oznaczania 5 μl w kroku 1.2 powyżej). Automatyzacja przenosi płytkę testową do zintegrowanej wirówki i wirówek przy 300 x g przez 1 min.
2. Przygotowanie komórek
- Rozmrozić kriokonserwowane komórki jajnika chomika chińskiego (CHO) szybko eksprymujące docelowy receptor GLP-1 myszy w łaźni wodnej o temperaturze 37 ºC i ponownie zawiesić w 20 ml buforu do oznaczania.
- Zawiesinę komórek wirować przez 5 minut przy 200 x g w temperaturze pokojowej (RT). Uwzględnij odpowiednią równowagę.
- Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 10 ml buforze do oznaczania.
- Rozcieńczyć zapas komórek w stosunku 1:1 w błękitu trypanowym i określić gęstość żywotnych komórek za pomocą automatycznego licznika komórek. Ponownie zawiesić komórki w buforze testowym przy 1,6 x 106 komórek na ml (co odpowiada 8 000 komórek na studzienkę płytek testowych).
- Użyć dozownika odczynników luzem, aby dodać 5 μl zawiesiny komórek do każdego dołka na płytkach testowych (zawierających seryjnie rozcieńczone peptydy w buforze do oznaczania 5 μl) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
3. Test detekcji HTRF cAMP
- Przynieś zestaw testowy HTRF cAMP do RT na 30 minut przed użyciem.
- Przygotować każdy odczynnik HTRF (kryptat i d2) oddzielnie w rozcieńczeniu 1:20 w buforze do lizy (zastrzeżony preparat, dostarczony przez producenta testu wykrywania cAMP).
UWAGA: UWAGA: Bufor do lizy zawiera fluorek potasu (KF), który jest toksyczny i teratogen13. W celu usunięcia, płytki testowe zawierające KF powinny być zapieczętowane i spalone, a wszelkie odpady płynne należy rozcieńczyć wodą do <1 mmol/l przed usunięciem do zlewu. - Użyj dozownika odczynników luzem, aby dodać 5 μl odczynnika krywatu do wszystkich dołków na płytkach testowych.
- Użyj dozownika odczynników luzem, aby dodać 5 μl odczynnika d2 do kolumn 1-22 płytek testowych.
- Natychmiast ręcznie odpipetować 5 μl buforu do lizy do studzienek A23-D24 z płytek testowych, aby uzyskać studzienki kontrolne z niespecyficznym wiązaniem (NSB), a następnie 5 μl odczynnika d2 do studzienek E23-P24.
- Odwirować płytki testowe przez 1 minutę przy 200 x g w temperaturze pokojowej w celu wymieszania studzienek.
- Przykryj płytki testowe, aby zminimalizować parowanie i fotobielenie, a następnie inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
- Pomiar sygnału transferu energii rezonansu fluorescencyjnego (FRET) za pomocą wzbudzenia przy 320 nm i emisji przy 620 nm i 665 nm za pomocą czytnika płytek.
4. Analiza danych
- Użyj średniej NSB, aby odjąć tło od wszystkich studzienek.
- Obliczyć % Delta F ze stosunku 665 nm/620 nm w następujący sposób:
Stosunek = (A665nm/A620nm) x 104
Delta F = ((Stosunek próbki - StosunekNSB)/StosunekNSB)) x 100
gdzie StosunekNSB = studzienki bez odczynnika d2. - Obliczyć % aktywacji między komórkami niestymulowanymi a komórkami stymulowanymi maksymalnym ligandem GLP-1 w następujący sposób:
% aktywacji = (%Delta Fsample - %Komórki stymulowane przez Delta)/(%Komórki stymulowane DeltaFGLP-1 - %Komórki niestymulowane DeltaF) x 100 - Analizuj krzywe stężenie-odpowiedź za pomocą 4-parametrowej analizy logistycznej i przedstawiaj wykres jako % aktywacji, zgodnie z definicją kontrolną1.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W rutynowych badaniach stosujemy dwuetapową metodę rozcieńczania peptydów za pomocą transferu akustycznego. W pierwszym etapie, do przygotowania czterech pośrednich rozcieńczeń roztworów zapasowych peptydów w dwóch płytkach źródłowych, wykorzystuje się dozownik akustyczny zintegrowany z systemem automatyzacji (Ryc. 1a, b). W drugim etapie używamy dozownika akustycznego do dalszego rozcieńczania roztworów z płytek źródłowych A i B w celu utworzenia 11-punk...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Protokół ten opisuje udane zastosowanie automatycznego dozowania akustycznego do seryjnie rozcieńczanych próbek peptydów w zakresie stężeń 3 x 106 wymagających mniej niż 1 μl próbki. Główną zaletą tej metody jest poprawa jakości danych poprzez zminimalizowanie adsorpcji peptydów na wyrobach z tworzyw sztucznych poprzez zmniejszenie narażenia próbek na eksperymentalne pojemniki i naczynia z tworzyw sztucznych (takie jak końcówki do pipet), które są zwykle wymagane do przenoszenia i mieszania odczynników. Chocia...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Hanksa' Zrównoważony roztwór soli | Sigma-Aldrich | H8264 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Albumina surowicy bydlęcej | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| 3-izobutylo-1-metyloksantyna | Sigma-Aldrich | I7018 | Przygotowany jako 0,5 M w DMSO |
| GLP-1 (7-36) amid | Bachem | H-6795 | Przygotowany jako zapas 1 mg/ml w PBS, określany jako "100x kontrola referencyjna" |
| Peptydy testowe | Produkowane we własnym zakresie w MedImmune | Dostarczane w różnych stężeniach w DMSO lub PBS, w zależności od potrzeb | |
| 100x zapas peptydów | Wyprodukowane we własnym zakresie w MedImmune | Peptyd testowy rozcieńczony w buforze testowym do 100x wymaganego stężenia | |
| końcowego Roztwór błękitu trypanowego, 0,4% | Thermo Fisher Scientific | 15250-061 | |
| Analizator komórek Cedex XS | Innovatis | ||
| Corning 384-dołkowe płytki, mała objętość | Sigma-Aldrich | 4514 | |
| Echo Qualified 384-dołkowa mikropłytka polipropylenowa | Labcyte Inc. | P-05525 | |
| Zbiornik z kwalifikacją Echo | Labcyte Inc. | ER-0055 | |
| Echo 550 Ładowarka do cieczy | Labcyte Inc. | Objętości transferu kropelek w krokach co 2,5 nl | |
| Echo 525 Liquid Handler | Labcyte Inc. | Objętości transferu kropel w krokach co 25 nl | |
| ACell Benchtop Automation | HighRes Biosolutions | MC522 | |
| Cellario Lab Automation Oprogramowanie do planowania dla robotyki w naukach przyrodniczych | HighRes Biosolutions | ||
| MultidropCombi Dozownik odczynników | ThermFisher Scientific | 5840300 | Określany jako "dozownik odczynników luzem" |
| Zestaw HTRF cAMP Dynamic 2 | Cisbio Bioassays | 62AM4PEJ | |
| Czytnik Multilabel EnVision | PerkinElmer |
Bibliografia
- Naylor, J., Rossi, A., Hornigold, D. C. Acoustic Dispensing Preserves the Potency of Therapeutic Peptides throughout the Entire Drug Discovery Workflow. J.Lab.Autom. 21 (1), 90-96 (2016).
- Campbell, J. E., Drucker, D. J. Pharmacology, physiology, and mechanisms of incretin hormone action. Cell.Metab. 17 (6), 819-837 (2013).
- Hui, H., Farilla, L., Merkel, P., Perfetti, R. The short half-life of glucagon-like peptide-1 in plasma does not reflect its long-lasting beneficial effects. Eur.J.Endocrinol. 146 (6), 863-869 (2002).
- Harris, D., Olechno, J., Datwani, S., Ellson, R. Gradient, contact-free volume transfers minimize compound loss in dose-response experiments. J.Biomol.Screen. 15 (1), 86-94 (2010).
- Ekins, S., Olechno, J., Williams, A. J. Dispensing Processes Impact Apparent Biological Activity as Determined by Computational and Statistical Analyses. PLoS ONE. 8 (5), 62325(2013).
- Goebel-Stengel, M., Stengel, A., Tache, Y., Reeve, J. R. The importance of using the optimal plasticware and glassware in studies involving peptides. Anal.Biochem. 414 (1), 38-46 (2011).
- McDonald, G. R., et al. Bioactive Contaminants Leach from Disposable Laboratory Plasticware. Science. 322 (5903), 917(2008).
- Belaiche, C., Holt, A., Saada, A. Nonylphenol ethoxylate plastic additives inhibit mitochondrial respiratory chain complex I. Clin Chem. 55 (10), 1883-1884 (2009).
- Sackmann, E. K., et al. Technologies That Enable Accurate and Precise Nano- to Milliliter-Scale Liquid Dispensing of Aqueous Reagents Using Acoustic Droplet Ejection. J.Lab.Autom. 21 (1), 166-177 (2016).
- Grant, R. J., et al. Achieving accurate compound concentration in cell-based screening: validation of acoustic droplet ejection technology. J.Biomol.Screen. 14 (5), 452-459 (2009).
- Turmel, M., Itkin, Z., Liu, D., Nie, D. An Innovative Way to Create Assay Ready Plates for Concentration Response Testing Using Acoustic Technology. J.Lab.Autom. 15 (4), 297-305 (2010).
- Butler, R., et al. Use of the site-specific retargeting jump-in platform cell line to support biologic drug discovery. J.Biomol.Screen. 20 (4), 528-535 (2015).
- Panchal, S., Verma, R. J. Effect of sodium fluoride in maternal and offspring rats and its amelioration. Asian Pac.J.Reprod. 3 (1), 71-76 (2014).
- Hanson, S. M., Ekins, S., Chodera, J. D. Modeling error in experimental assays using the bootstrap principle: understanding discrepancies between assays using different dispensing technologies. J.Comput. Aided Mol.Des. 29 (12), 1073-1086 (2015).
- Harris, D., Olechno, J., Datwani, S., Ellson, R. Gradient, Contact-Free Volume Transfers Minimize Compound Loss in Dose-Response Experiments. J.Biomol. Screen. 15 (1), 86-94 (2010).
- Chan, G. K. Y., Wilson, S., Schmidt, S., Moffat, J. G. Unlocking the potential of high-throughput drug combination assays using acoustic dispensing. J.Lab.Autom. 21 (1), 125-132 (2016).
- Roberts, K., et al. Implementation and challenges of direct acoustic dosing into cell-based assays. J.Lab.Autom. 21 (1), 76-89 (2016).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
