Artykuł metodologiczny

Generacja dwukolorowych mikromacierzy antygenowych do jednoczesnego wykrywania autoprzeciwciał IgG i IgM

DOI:

10.3791/54543

⸱

15 września 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Multi-Organ Transplant Program, University Health Network, 2Institute of Medical Science, University of Toronto, 3Divison of Neurosurgery, University Health Network, 4Division of Cardiac Surgery, University Health Network

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy tutaj metodę generowania konfigurowalnych mikromacierzy antygenowych, które mogą być używane do jednoczesnego wykrywania autoprzeciwciał IgG i IgM w surowicy od ludzi i myszy. Macierze te pozwalają na wysokoprzepustowe i ilościowe wykrywanie przeciwciał przeciwko dowolnemu antygenom lub epitopom.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autoprzeciwciała, które są przeciwciałami przeciwko własnym antygenom, są obecne w wielu stanach chorobowych i mogą służyć jako markery aktywności choroby. Poziomy autoprzeciwciał przeciwko określonym antygenom są zwykle wykrywane za pomocą techniki testu immunoenzymatycznego (ELISA). Jednak badania przesiewowe w kierunku wielu autoprzeciwciał za pomocą testu ELISA mogą być czasochłonne i wymagają dużej ilości próbki pacjenta. Technika mikromacierzy antygenowej jest alternatywną metodą, którą można wykorzystać do badań przesiewowych w kierunku autoprzeciwciał w sposób multipleksowy. W tej technice antygeny są umieszczane na specjalnie powlekanych szkiełkach mikroskopowych za pomocą zrobotyzowanej mikromacierzy. Szkiełka są badane próbkami surowicy pacjenta, a następnie dodaje się znakowane fluorescencyjnie przeciwciała drugorzędowe w celu wykrycia wiązania autoprzeciwciał w surowicy z antygenami. Reaktywności autoprzeciwciał są ujawniane i określane ilościowo poprzez skanowanie szkiełek za pomocą skanera, który może wykrywać sygnały fluorescencyjne. W tym miejscu opisano metody generowania niestandardowych mikromacierzy antygenowych. Nasze obecne tablice są drukowane z 9 solidnymi pinami i mogą zawierać do 162 antygenów wykrytych w dwóch egzemplarzach. Matryce można łatwo dostosować, zmieniając antygeny w płytce źródłowej, która jest używana przez mikromacierz. Opracowaliśmy dwukolorowy schemat wykrywania przeciwciał wtórnych, który może rozróżnić reaktywności IgG i IgM na tej samej powierzchni szkiełka. System detekcji został zoptymalizowany pod kątem badania wiązania autoprzeciwciał ludzkich i mysich.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autoprzeciwciała są obecne w wielu stanach chorobowych i często mogą mieć bezpośrednią aktywność patogenną1. Identyfikacja autoprzeciwciał jest ważna w diagnostyce niektórych chorób, dla rokowania w wyniku choroby oraz dla klasyfikacji pacjentów, którzy mogą odnieść korzyści z określonych terapii2. Autoprzeciwciała są zwykle identyfikowane w surowicy pacjenta przy użyciu techniki ELISA; Jednak badania przesiewowe na obecność wielu antygenów za pomocą tej techniki są pracochłonne i pochłaniają dużą ilość próbki pacjenta. Potrzebne są zatem nowe technologie, które umożliwią profilowanie autoprzeciwciał na większą skalę.

Technika mikromacierzy antygenowej to technologia proteomiczna, która pozwala na profilowanie autoprzeciwciał w sposób multipleksowy3. W pierwszym etapie tego procesu biblioteka antygenów jest umieszczana na powierzchni szkiełka za pomocą zrobotyzowanej mikromacierzy. Szkiełka są badane rozcieńczoną surowicą, a następnie dodaje się przeciwciała drugorzędowe znakowane fluorescencyjnie. Reaktywności przeciwciał są wizualizowane poprzez skanowanie szkiełek za pomocą skanera mikromacierzowego i oznaczane ilościowo za pomocą intensywności fluorescencji. Mikromacierze antygenowe mają wiele zalet w porównaniu z techniką ELISA w badaniach przesiewowych pod kątem autoprzeciwciał: 1) wymagają tylko mikrolitrów surowicy do profilowania autoprzeciwciał przeciwko wielu antygenom jednocześnie, 2) używają antygenu oszczędnie, ponieważ na tablicach wykrywane są tylko nanolitry antygenu, 3) mają zwiększoną czułość3 w porównaniu z ELISA i 4) pozwalają na jednoczesne, ale oddzielne wykrywanie więcej niż jednego izotypu przeciwciała. Mikromacierze antygenowe zostały wykorzystane do profilowania autoprzeciwciał w chorobach autoimmunologicznych, takich jak reumatoidalne zapalenie stawów, stwardnienie rozsiane i toczeń rumieniowatyukładowy 4-6. We wszystkich tych trzech chorobach uzyskano nowe informacje na temat patogenezy choroby dzięki profilowaniu autoprzeciwciał na dużą skalę za pomocą macierzy.

Tutaj opisujemy protokół generowania mikromacierzy antygenowych za pomocą szkiełek pokrytych nitrocelulozą. Za pomocą tej techniki można ułożyć na szkiełkach różne antygeny, w tym białka, peptydy i lizaty komórkowe. Tablice można łatwo dostosować, umieszczając interesujące antygeny na płytce źródłowej, która zawiera bibliotekę antygenów. Ponadto pokazujemy, w jaki sposób można wykorzystać parę przeciwciał drugorzędowych do rozdzielenia reaktywności IgG i IgM na tej samej powierzchni szkiełka. Teraz zoptymalizowaliśmy tę technikę, aby mierzyć autoprzeciwciała zarówno u ludzi, jak i myszy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Rozcieńczanie antygenów i generowanie mikromacierzy antygenów

  1. Rozcieńczyć antygeny w PBS do końcowego stężenia 0,2 mg/ml. Wydrukuj do 162 unikalnych antygenów w dwóch egzemplarzach za pomocą konfiguracji mikromacierzy z 9 pinami. Uwzględnij antygeny IgG i IgM w bibliotece antygenów jako kontrole pozytywne. Włączyć PBS tylko jako kontrolę ujemną.
  2. Dodać 20 μl każdego antygenu do płytki źródłowej 384 dołków. Dodaj antygeny do płyty źródłowej w grupach, które odzwierciedlają konfigurację głowicy drukującej (np. ułóż antygeny w grupach po 9, gdy do drukowania używanych jest 9 pinów).
  3. Przykryj płytę źródłową folią i zamroź w temperaturze -80 °C do momentu, aż będą gotowe do drukowania matryc.
  4. Oczyść stałe piny mikromacierzy, inkubując je w kąpieli sonizacyjnej z wodą dejonizowaną przez 3 x 1 min. Umieść piny w stojaku do wyschnięcia, a następnie ułóż piny w głowicy drukującej z mikromatrycą. W przypadku 9 pinów użyj konfiguracji 3 x 3.
  5. Zaprogramuj mikromacierz do drukowania, ustawiając liczbę pinów na głowicy drukującej, liczbę slajdów do wydrukowania, liczbę pól lutowniczych na każdym slajdzie i liczbę miejsc replik dla każdego antygenu. Zazwyczaj używa się 9 szpilek, 70 szkiełek, 2 padów/szkiełko i 2 miejsca replikacji dla każdego antygenu. Zaprogramuj mikromacierz do sonizacji pinów w wodzie między różnymi grupami antygenów.
  6. Rozmrozić płytkę źródłową, a następnie odwirować płytkę przez 1 minutę przy 100 x g. Umieścić płytkę źródłową w wyznaczonym miejscu w mikroukładzie. Usuń fragment folii, który zakrywa pierwszą grupę antygenów do wydrukowania.
  7. Ułóż niezadrukowane slajdy na powierzchni tablicy i uruchom program drukowania. Drukuj slajdy w temperaturze RT z wilgotnością ustawioną na matrycy na 55 - 60% za pomocą wbudowanego nawilżacza urządzenia matrycowego.
  8. Po wydrukowaniu każdej grupy antygenów na wszystkich szkiełkach zatrzymaj mikromacierz. Przykryj antygeny, które właśnie zostały wydrukowane, folią (aby zapobiec parowaniu) i odkryj następną grupę antygenów do wydrukowania. Kontynuuj program drukowania.
  9. Po wydrukowaniu wszystkich antygenów przykryj płytkę źródłową nowym kawałkiem folii i zamroź w temperaturze -80 °C. Umieść wydrukowane preparaty w pudełku na szkiełka i zamknij próżniowo. Ze slajdów można korzystać następnego dnia lub do miesiąca później.

2. Sondowanie mikromacierzy antygenowych z rozcieńczonymi surowicami

  1. Umieść szkiełka w ramkach za pomocą komór inkubacyjnych. Dodać 700 μl buforu blokującego (2,5% [vol/vol] surowicy cielęcej płodu (FCS), 0,1% [vol/vol] Tween 20 w PBS) do każdej powierzchni matrycy.
  2. Umieść folię samoprzylepną na ramie i umieść w szczelnie zamkniętym pojemniku z kawałkiem mokrej chusteczki. Inkubować O/N w temperaturze 4 °C na bujaku.
  3. Rozcieńczyć próbki surowicy w stosunku 1:100 w buforze blokującym. Odessać roztwór blokujący z matryc i dodać 500 μl rozcieńczonej próbki do każdej powierzchni matrycy.
  4. Przykryj folią samoprzylepną i inkubuj przez 1 godzinę w temperaturze 4°C z kołysaniem.
  5. Rozcieńczyć przeciwciała drugorzędowe w buforze blokującym. W przypadku badań na ludziach rozcieńczyć kozie przeciwciało anty-ludzkie IgG znakowane Cy3 do 0,33 μg/ml i kozie przeciwciało anty-ludzkie IgM znakowane Cy5 do 0,25 μg/ml. W przypadku badań na myszach należy rozcieńczyć kozie przeciwciało anty-mysie IgG znakowane Cy3 do 0,38 μg/ml i kozie przeciwciało anty-mysie IgM znakowane Cy5 do 0,7 μg/ml.
  6. Odessać próbki z matryc i przepłukać powierzchnie matrycy 4 razy za pomocą buforu płuczącego (0,1% Tween 20 w PBS). Wlej bufor na szkiełka i szybko strzepnij.
  7. Dodać 700 μl buforu blokującego, aby przemyć każdą powierzchnię matrycy i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej z kołysaniem. Powtórz krok prania jeszcze dwa razy.
  8. Dodać 500 μl rozcieńczonego przeciwciała drugorzędowego do każdej powierzchni szkiełka i przykryć folią klejącą. Inkubować 45 minut w temperaturze 4°C z kołysaniem.
  9. Odessać mieszaninę przeciwciał wtórnych ze szkiełek i spłukać 4 razy, jak powyżej. Przemyć szkiełka 3 razy 700 μl buforu blokującego/rozcieńczającego, jak wyżej.
  10. Wyjmij slajdy z ram i umieść w metalowym stojaku na slajdy, który jest zanurzony w PBS. Inkubować 20 minut w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem orbitalnym. Umieścić w nowym pojemniku PBS i inkubować kolejne 20 minut z wytrząsaniem.
  11. Umieść stojak na szkiełka w pojemniku z wodą dejonizowaną na 15 sekund. Umieść stojak w nowym pojemniku z wodą i inkubuj kolejne 15 sekund.
  12. Aby wysuszyć szkiełka, umieść stojak na szkiełka na adapterze płytki ELISA w wirówce i wiruj z prędkością 220 x g przez 5 minut w temperaturze suchej masy.
  13. Umieść szkiełka w szczelnym pudełku, aż będą gotowe do skanowania.

3. Skanowanie mikromacierzy antygenowych i eksportowanie danych

  1. Skanuj szkiełka za pomocą skanera z mikromacierzą, który może wykrywać sygnały fluorescencyjne Cy3 i Cy5. Aby dostosować poziomy fotopowielacza (PMT) skanera, należy wstępnie zeskanować szkiełko, które było sondowane tylko za pomocą przeciwciał drugorzędowych.
    Uwaga: Na tym slajdzie powinna być wydrukowana pełna biblioteka antygenów, w tym kontrole dodatnie (IgG i IgM) oraz ujemne (PBS). Skanowanie wstępne to skanowanie w niskiej rozdzielczości, które pozwala użytkownikowi szybko znaleźć optymalne ustawienia PMT.
  2. Ustaw wartości PMT tak, aby cechy ludzkiej IgG (na kanale Cy3) i cechy ludzkiej IgM (na kanale Cy5) miały podobną medianę intensywności fluorescencji minus tło (MFI-B) (zwykle 40 000). Poziomy PMT ustawia się poprzez naciśnięcie przycisku "sprzęt". Po ustawieniu utrzymuj te ustawienia PMT na stałym poziomie.
  3. Zeskanuj eksperymentalne slajdy na dwóch kanałach, naciskając przycisk "skanuj". Zapisz obrazy slajdów (oba kanały) po każdym skanowaniu.
  4. Załaduj szkiełko do analizy do oprogramowania mikromacierzy za pomocą przycisku "plik".
  5. Załaduj plik z listą macierzy genów (GAL) za pomocą przycisku "plik". Plik GAL zawiera układ tablicy z tożsamościami funkcji tablicy.
  6. Umieść szablon tablicy na zeskanowanym obrazie tak, aby cechy tablic były jak najbardziej zgodne z szablonem.
  7. Wyrównaj elementy we wszystkich blokach z szablonem, naciskając przycisk "wyrównaj". Program zazwyczaj znajdzie kontur okrągłych elementów, ale mogą być konieczne pewne ręczne korekty. Regulacji tych można dokonać, przechodząc do trybu funkcji. Następnie oprogramowanie obliczy MFI-B dla każdego z antygenów.
  8. Użyj przycisku "plik", aby wyeksportować te wyniki jako plik tekstowy.

4. Analiza danych tablicowych z analizą istotności mikrotablic (SAM)

  1. Załaduj poszczególne pliki tekstowe do programu Excel i zidentyfikuj kolumny, które mają MFI-B dla kanałów Cy3 i Cy5.
  2. Oblicz średnią dla zduplikowanych obiektów.
  3. W przypadku dowolnej ujemnej MFI-B zastąp liczbę ujemną liczbą 10. Przekształć dane, dzieląc nieprzetworzoną MFI-B przez 100, a następnie obliczając podstawę logarytmu 2.
  4. Analizowanie danych przekształconych w dziennik za pomocą analizy istotności mikrotablic (SAM) zgodnie z wcześniejszym opisem7.
  5. W przypadku badania z udziałem dwóch grup (np. zdrowa grupa kontrolna kontra pacjenci), oznacz jedną grupę jako "1", a grupę jako "2". Użyj dwuklasowej, niesparowanej analizy w SAM, aby zidentyfikować reaktywności antygenów, które znacznie różnią się między dwiema grupami (wartość q < 0,05).
  6. Użyj oprogramowania do tworzenia klastrów i map cieplnych, aby tworzyć obrazy do prezentacji8.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Antygeny są umieszczane na płytce 384-dołkowej i drukowane na szkiełkach za pomocą zrobotyzowanej mikromatrycy, jak pokazano na rysunku 1. Rysunek 2 przedstawia preparaty umieszczone w ramce z komorami inkubacyjnymi oraz zeskanowany szkiełko po obróbce. Na rys. 3 przedstawiono slajdy kontroli dodatniej i ujemnej. Ujemny slajd jest badany tylko za pomocą przeciwciał wtórnych, a szkiełko kontroli pozytywnej jest sondowane surowicą od pacjen...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany tutaj protokół pozwala na ilościowe określenie autoprzeciwciał przy użyciu techniki mikromacierzy antygenowej. Mikromacierze antygenowe mają kilka zalet w porównaniu z konwencjonalnym testem ELISA w badaniach przesiewowych na obecność autoprzeciwciał. Przede wszystkim różne antygeny, w tym kwasy nukleinowe, białka, peptydy i lizaty komórkowe, można ułożyć na szkiełkach pokrytych nitrocelulozą, co pozwala na multipleksowane badania przesiewowe autoprzeciwciał. Ponadto do wygenerowania macierzy potrzebne są tylko m...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A.C. był wspierany przez stypendium podoktorskie z Heart and Stroke Foundation of Canada oraz Program Szkoleniowy w Medycynie Regeneracyjnej (Canadian Institutes of Health Research). F.Y.Y.H. był wspierany przez Program Szkoleniowy w Medycynie Regeneracyjnej. Praca ta została sfinansowana z grantu Astellas Pharma Canada. Chcielibyśmy również podziękować dr Markowi Menenghini (University of Toronto) za korzystanie z jego skanera Axon Microarray Scanner.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Rybosomalny P0Diarect14100rozcieńczony do 0,2 mg/ml w PBS
ludzki IgGJackson Immuno009-000-003rozcieńczony do 0,2 mg/ml w PBS
ludzki IgMJackson Immuno009-000-012rozcieńczony do 0,2 mg/ml w PBS
mysi IgGSigma-AldrichI5381rozcieńczony do 0,2 mg/ml w PBS
mysi IgMBiolegend401601rozcieńczyć do 0,2 mg/ml w
dwuniciowym DNASigma-AldrichD1626rozcieńczyć do 0,2 mg/ml w
PBS jednoniciowym DNASigma-AldrichD8899rozcieńczyć do 0,2 mg/ml w
mikromacierzyVirtekVersArray Chipwriter Prowiele typów tablic jest odpowiednich
solidnych kołków drukarskichArrayit CorporationSSP015
oprogramowanie do mikromacierzy robotycznejVirtekChipwriter Pro 
Prowadnice FAST (2 Pad)GVS Northa America10485317
ramka FAST KomoryGVS Northa America10486001
FAST (2 Pad)Płytki GVS Northa America10486242
384 dołki ZgrzewarkiWhatman7701-5101
Pokrywy
VWR60941-124
Tween-20Fisher ScientificBP337-500
Surowica cielęca płoduInvitrogen12483020
Cy3 koza anty-ludzka IgGJackson Immuno109-165-096użyj materiału roboczego w 50% glyercol
Cy5 koza anty-ludzka IgMJackson Immuno109-175-129użyj materiału roboczego w 50% kozy glyercol
Cy3 anty-mysie IgGJackson Immuno115-165-071użyj zapasu roboczego w 50% glyercol
Cy5 koza anty-mysia IgMJackson Immuno115-175-075użyj zapasu roboczego w 50% glyercol
Skaner mikromacierzyUrządzenia molekularneAxon 4200A
Urządzenia molekularneGenepix 6.1
Oprogramowanie do klastrowaniaeisenlab.orgCluster 3.0
eisenlab.orgTreeview 1.60
Oprogramowanie statystyczne do mikromacierzyUniwersytet StanfordaSAM 4.0 (analiza istotności mikromacierzy)
PBS PBS inkubacyjne do płytek płyt foliowych VWR 60941-062 Oprogramowanie Microarray Oprogramowanie do tworzenia map cieplnych

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Naparstek, Y., Plotz, P. H. The role of autoantibodies in autoimmune disease. Annu Rev Immunol. 11, 79-104 (1993).
  2. Damoiseaux, J., Andrade, L. E., Fritzler, M. J., Shoenfeld, Y. Autoantibodies 2015: From diagnostic biomarkers toward prediction, prognosis and prevention. Autoimmun Rev. 14, 555-563 (2015).
  3. Robinson, W. H., et al. Autoantigen microarrays for multiplex characterization of autoantibody responses. Nature. medicine. 8, 295-301 (2002).
  4. Quintana, F. J., et al. Antigen microarrays identify unique serum autoantibody signatures in clinical and pathologic subtypes of multiple sclerosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 18889-18894 (2008).
  5. Hueber, W., et al. Antigen microarray profiling of autoantibodies in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 52, 2645-2655 (2005).
  6. Price, J. V., et al. Protein microarray analysis reveals BAFF-binding autoantibodies in systemic lupus erythematosus. J. Clin. Invest. 123, 5135-5145 (2013).
  7. Tusher, V. G., Tibshirani, R., Chu, G. Significance analysis of microarrays applied to the ionizing radiation response. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98, 5116-5121 (2001).
  8. Eisen, M. B., Spellman, P. T., Brown, P. O., Botstein, D. Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 14863-14868 (1998).
  9. Chruscinski, A., et al. Generation of Antigen Microarrays to Screen for Autoantibodies in Heart Failure and Heart Transplantation. PloS one. 11, e0151224(2016).
  10. Price, J. V., et al. Characterization of influenza vaccine immunogenicity using influenza antigen microarrays. PloS one. 8, e64555(2013).
  11. Singh, H., et al. Reactivity profiles of broadly neutralizing anti-HIV-1 antibodies are distinct from those of pathogenic autoantibodies. Aids. 25, 1247-1257 (2011).
  12. Porcheray, F., et al. Chronic humoral rejection of human kidney allografts associates with broad autoantibody responses. Transplantation. 89, 1239-1246 (2010).
  13. Haddon, D. J., et al. Mapping epitopes of U1-70K autoantibodies at single-amino acid resolution. Autoimmunity. 48, 513-523 (2015).
  14. Schroeder, H. W. Jr, Cavacini, L. Structure and function of immunoglobulins. J Allergy Clin Immunol. 125, S41-S52 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Antigen MicroarrayAutoantibody DetectionTwo color DetectionIgG IgM DetectionMicroarray PrintingSerum ProbingFluorescent ScanningPBS BlockingSecondary AntibodySlide Alignment

Powiązane artykuły