Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Metody badania gruczołu limfatycznego i hemocytów u larw Drosophila

12.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54544

⸱

28 listopada 2016

 , 
1The Graduate School of Biomedical Sciences, The Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Department of Oncological Sciences, The Icahn School of Medicine at Mount Sinai

W tym artykule

Podsumowanie

Drosophila i systemy krwiotwórcze ssaków mają wiele wspólnych cech, co czyni Drosophila atrakcyjnym modelem genetycznym do badania hematopoezy. Tutaj pokazujemy rozwarstwienie i montaż głównego larwalnego narządu krwiotwórczego do immunohistochemii. Opisano również metody oznaczania różnych larwalnych przedziałów krwiotwórczych, w tym krążących hemocytów i siedzących komórek krystalicznych.

Streszczenie

Istnieje wiele podobieństw między Drosophila a układami krwiotwórczymi ssaków, mimo że Drosophila nie posiada linii limfoidalnej, która charakteryzuje adaptacyjną odporność ssaków. Drosophila i hematopoeza ssaków występują w przestrzennie i czasowo odrębnych fazach, tworząc kilka linii komórek krwi. Oba systemy utrzymują rezerwuary komórek progenitorowych krwi, którymi można się rozwijać lub zastępować dojrzałe linie. Układ krwiotwórczy pozwala Drosophila i ssakom reagować i przystosowywać się do wyzwań immunologicznych. Co ważne, regulatory transkrypcji i szlaki sygnałowe, które kontrolują wytwarzanie, utrzymanie i funkcję układu krwiotwórczego, są zachowane od much do ssaków. Te podobieństwa pozwalają na wykorzystanie Drosophila do genetycznego modelowania rozwoju i chorób układu krwiotwórczego.

Tutaj szczegółowo opisujemy testy do badania układu krwiotwórczego larw Drosophila. W szczególności przedstawiamy metody pomiaru liczby i stężenia krwinek, wizualizacji określonej dojrzałej linii in vivo oraz przeprowadzania immunohistochemii na komórkach krwi w krążeniu i w narządzie krwiotwórczym. Testy te mogą ujawnić zmiany w ekspresji genów i procesach komórkowych, w tym sygnalizacji, przeżyciu, proliferacji i różnicowaniu, i mogą być wykorzystane do zbadania różnych pytań dotyczących hematopoezy. W połączeniu z narzędziami genetycznymi dostępnymi w Drosophila, testy te mogą być wykorzystywane do oceny układu krwiotwórczego po określonych zmianach genetycznych. Chociaż nie zostało to tutaj szczegółowo opisane, testy te można również wykorzystać do zbadania wpływu zmian środowiskowych, takich jak infekcja lub dieta, na układ krwiotwórczy.

Wprowadzenie

Skomplikowane mechanizmy regulujące czynniki transkrypcyjne i szlaki sygnałowe, które koordynują rozwój układu krwiotwórczego i które powodują nieprawidłowe działanie chorób hematologicznych, pozostają słabo poznane. Te czynniki transkrypcyjne i szlaki sygnałowe, a także ich regulacja, są wysoce konserwatywne między Drosophila a hematopoezą ssaków1-5. Tak więc układ krwiotwórczy Drosophila stanowi doskonały model genetyczny do zdefiniowania mechanizmów molekularnych kontrolujących hematopoezę i leżące u jej podstaw choroby hematologiczne

.

Podobnie jak ssaki, Drosophila wytwarzają komórki krwi, zwane hemocytami, w przestrzennie i czasowo odrębnych fazach hematopoezy. Tradycyjnie uważano, że hematopoeza Drosophila jest ograniczona do faz w mezodermie embrionalnej i w larwalnym gruczole limfatycznym. Ostatnie badania dostarczają dowodów na to, że hematopoeza występuje również w skupiskach larw siedzących i w dorosłym brzuchu6-8. Wszystkie fazy krwiotwórcze wytwarzają dwa rodzaje dojrzałych hemocytów: plazmatocyty i komórki krystaliczne. Plazmatocyty to komórki podobne do makrofagów biorące udział w fagocytozie, wrodzonej odporności i gojeniu się ran. Komórki krystaliczne zawierają pro-fenolooksydazy wymagane do melanizacji, reakcji stosowanej w odpowiedziach immunologicznych owadów i gojeniu się ran. Hematopoeza larw może generować trzeci dojrzały typ hemocytu, zwany blaszkocytem, w odpowiedzi na pewne wyzwania immunologiczne, takie jak zakażenie pasożytniczą osą9,10. Blaszocyty to duże, przylegające komórki, które działają w połączeniu z plazmatocytami i komórkami krystalicznymi w celu kapsułkowania i neutralizacji jaj os składanych w larwach Drosophila. W przypadku braku pasożytowania lamellocyty nie występują w larwach typu dzikiego. Masy melanotyczne przypominają melanizowane, zamknięte w kapsułkach jaja os; wiele zmutowanych szczepów Drosophila rozwija masy melanotyczne przy braku pasożytowania. Obecność blaszek i/lub mas melanotycznych może wskazywać na nieprawidłowości krwiotwórcze. W rzeczywistości fenotyp masy melanotycznej został wykorzystany do identyfikacji genów i szlaków zaangażowanych w hematopoezę11-14.

Larwalny układ krwiotwórczy jest najobszerniej zbadany do tej pory. Składa się z hemocytów krążących w hemolimfie, siedzących klastrów hemocytów wzorowanych pod naskórkiem i hemocytów znajdujących się w gruczole limfatycznym. Gruczoł limfatyczny to szereg obustronnych płatów przyczepionych do naczynia grzbietowego. Każdy płat pierwotny gruczołu limfatycznego jest podzielony na trzy główne strefy. Najbardziej zewnętrzna strefa jest znana jako strefa korowa i zawiera dojrzewające hemocyty. Najbardziej wewnętrzna strefa nazywana jest strefą rdzeniastą i składa się ze spoczynkowych prekursorów hemocytu. Trzecia strefa, tylne centrum sygnalizacyjne, to niewielka grupa komórek u podstawy gruczołu limfatycznego, które działają jak nisza przypominająca komórki macierzyste. Wczesne prace ustaliły krytyczne funkcje aktywności Notch15-18, Hedgehog19,20, JAK-STAT18 i Wingless21 w celu regulacji rozwoju larw gruczołów chłonnych. Nowsze badania wykazały, że sygnalizacja BMP22, FGF-Ras23 i Hippo24,25 działa również w gruczole limfatycznym larw.

Cztery opisane tutaj testy hematopoetyczne larw opisują: 1) pomiar stężenia krążących hemocytów, zdefiniowanego jako liczba komórek na jednostkę objętości, 2) izolowanie i utrwalanie krążących hemocytów do immunohistochemii, 3) wizualizację komórek krystalicznych in vivo, oraz 4) preparowanie, naprawianie i montowanie gruczołów limfatycznych do immunohistochemii. Testy te mogą być wykorzystywane jako odczyty hematopoetyczne do oceny funkcji i regulacji szlaków sygnałowych w układzie krwiotwórczym larw. Chociaż metody te były już wcześniej stosowane w tej dziedzinie, dokumentacja wizualna tych testów rozpoczęła się dopieroniedawno 8,26-30. Kilka cytowanych tu publikacji jest pomocnymi źródłami opisującymi podobne metody i markery krwiotwórcze26,31-33. Dodatkowo Trol i Viking są użytecznymi markerami błony podstawnej gruczołów limfatycznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Stężenie hemocytu w krążeniu

  1. Aby uzyskać larwy o mniej więcej tym samym etapie rozwoju dla tego testu, należy ograniczyć zbieranie jaj, pozwalając samicom na składanie jaj przez określony czas 2 - 6 godzin.
  2. Zebrać larwy w dołkach preparacyjnych wypełnionych 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS, Tabela 1).
  3. Dla każdej larwy umieścić 10 μl 1x PBS w probówce do mikrowirówki na lodzie i 10 μl 1x PBS na czystej podkładce preparucyjnej. Umieść podkładkę sekcyjną na podświetlanej podstawie mikroskopu stereoskopowego.
  4. Osusz pojedynczą larwę, umieszczając ją na chusteczce higienicznej przed przeniesieniem jej do kropli PBS na podkładce do sekcji.
  5. Za pomocą kleszczy delikatnie rozerwij i ostrożnie odwróć naskórek, aby uwolnić hemolimfę.
    UWAGA: Uważaj, aby nie zeskrobać ani nie dźgnąć naskórka, ponieważ może to potencjalnie uwolnić siedzące hemocyty29.
  6. Za pomocą pipety zbierz hemolimfę z podkładki preparacyjnej. Unikaj zbierania resztek larw, takich jak ciało tłuszczowe.
  7. Dodaj hemolimfę do probówki do mikrowirówki i mieszaj, pipetując w górę iw dół.
    UWAGA: Można pobrać kilka próbek jednocześnie i przechowywać je na lodzie przez okres do godziny.
  8. Opcjonalnie: Wymieszaj błękit trypanowy z próbką hemolimfy w równych częściach, aby zabarwić i wykluczyć martwe komórki. Policz komórki w ciągu 3 minut od dodania błękitu trypanowego, ponieważ jest on toksyczny dla komórek.
  9. Wymieszać próbkę, pipetując w górę i w dół, a następnie umieścić 10 μl w komorze hemocytometru.
  10. Jeśli używasz automatycznego licznika komórek, ustaw odpowiednie parametry dla rozmiaru komórki i obiegu. Na przykład ustaw minimalny rozmiar komórki 2 μm, maksymalny rozmiar komórki 22 μm i okrągłość 75 - 80%, aby wykryć normalne, okrągłe hemocyty34. Eksperymentuj z różnymi parametrami, aby wykryć większe i wrzecionowate hemocyty, takie jak lamellocyty. Alternatywnie użyj hemocytometru do ręcznego liczenia hemocytów.

2. Immunohistochemia krążących hemocytów

  1. Aby uzyskać larwy o mniej więcej tym samym etapie rozwoju dla tego testu, należy ograniczyć zbieranie jaj, pozwalając samicom na składanie jaj przez określony czas 2 - 6 godzin.
  2. Umieścić jedno szkiełko nakrywkowe w każdym dołku płytki 6- lub 12-dołkowej.
    UWAGA: Kwadratowe szkiełka nakrywkowe (22 mm) pasują do płytek 6-dołkowych, a okrągłe szkiełka nakrywkowe (o średnicy 18 mm) pasują do płytek 12-dołkowych.
  3. Zbieraj larwy w dołkach preparacyjnych wypełnionych 1x PBS.
  4. Umieść 5 μl 1x PBS na środku każdego szkiełka nakrywkowego.
  5. Umieść płytkę na podświetlanej podstawie mikroskopu stereoskopowego.
  6. Osusz pojedynczą larwę na chusteczce higienicznej, a następnie umieść ją w PBS na szkiełku nakrywkowym.
  7. Za pomocą kleszczy delikatnie oderwij i ostrożnie odwróć naskórek. Przed usunięciem tuszy larwalnej należy za jej pomocą równomiernie rozprowadzić hemolimfę.
    UWAGA: Uważaj, aby nie zeskrobać ani nie dźgnąć naskórka, ponieważ może to potencjalnie uwolnić siedzące hemocyty29.
  8. Powtórz tę czynność dla wszystkich larw, zbierając hemolimfę z jednej larwy na szkiełko nakrywkowe. Pozostawić hemocyty do przylegania do szkiełek nakrywkowych przez 5 - 8 minut w temperaturze pokojowej RT. Nie przekraczać 30 minut przed utrwaleniem.
  9. Utrwal hemocyty, dodając 5 μl 7,5% formaldehydu (Tabela 1) do każdego szkiełka nakrywkowego przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
  10. Umyj szkiełka nakrywkowe trzy razy za pomocą 1x PBS. Przechyl płytkę i odessaj PBS po każdym praniu. Aby zapobiec spływaniu roztworu przepuszczalnego w następnym kroku, należy użyć aspiratora do usunięcia nadmiaru PBS z obwodu szkiełek nakrywkowych.
  11. Dodać 100 μl roztworu przepuszczalnego (Tabela 1) do każdego szkiełka nakrywkowego przez 20 minut w temperaturze suchej masy.
  12. Przechyl i delikatnie postukaj w płytkę, aby zassać roztwór przepuszczalny.
  13. Rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe roztworem przeciwciała (Tabela 1) zgodnie ze specyfikacją dostawcy. Dodać co najmniej 500 μl roztworu przeciwciała pierwszorzędowego do szkiełek nakrywkowych na płytkach 12-dołkowych. Dodać co najmniej 1,5 ml do płytek 6-dołkowych. Inkubować w temperaturze 4 °C przez noc.
  14. Usunąć roztwór przeciwciała pierwotnego i przemyć szkiełka nakrywkowe 1x PBS przez 10 minut na wytrząsarce orbitalnej, trzy razy.
  15. Rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe roztworem przeciwciała zgodnie ze specyfikacją dostawcy. Dodać co najmniej 500 μl roztworu przeciwciał drugorzędowych do szkiełek nakrywkowych na płytkach 12-dołkowych. Dodać co najmniej 1,5 ml w przypadku płytek 6-dołkowych. Inkubować przez co najmniej 2 godziny w temperaturze pokojowej.
  16. Usunąć roztwór przeciwciał wtórnych i przemywać szkiełka nakrywkowe 1x PBS przez 10 minut na wytrząsarce orbitalnej, jak w kroku 2.10, trzy razy.
  17. Podczas etapów mycia wyczyść szklane szkiełka mikroskopowe 70% etanolem (Tabela 1) za pomocą chusteczek higienicznych. Dla każdego szkiełka nakrywkowego umieścić 5 μl bufora montażowego (tabela 1) na szkiełku podstawowym.
    UWAGA: Na jednym szkiełku mieszczą się dwa szkiełka nakrywkowe.
  18. Zassać końcowe płukanie PBS.
  19. Za pomocą kleszczyków ostrożnie usuń szkiełka nakrywkowe z płytek i umieść je odwrócone na buforze montażowym.
    Uwaga: Preparaty mikroskopowe można przechowywać w temperaturze 4 °C przed obrazowaniem. Maksymalny czas przechowywania zależy od stabilności zastosowanych przeciwciał. Płytki 6- i 12-dołkowe można płukać i ponownie używać.

3. Melanizacja komórek krystalicznych in vivo

  1. Aby uzyskać larwy o mniej więcej tym samym etapie rozwoju dla tego testu, należy ograniczyć zbieranie jaj, pozwalając samicom na składanie jaj przez określony czas 2-6 godzin.
  2. Przed rozpoczęciem ustaw źródło ciepła na 60 °C.
    UWAGA: Najlepiej sprawdza się program termocyklera o temperaturze 60 °C przez 10 minut (a następnie utrzymanie w temperaturze 25 °C), ale wystarczy łaźnia wodna lub inne źródło ciepła, o ile ciepło jest równomiernie i równomiernie rozprowadzane po każdej larwie.
  3. Zebrać larwy w dołkach preparacyjnych wypełnionych 1x PBS (Tabela 1).
  4. Pojedynczo osusz larwę na chusteczce higienicznej i umieść na dnie probówki do PCR. Umieść każdą larwę w osobnej probówce do PCR. (Patrz rysunek 3A.)
  5. Aby uzyskać spójne wyniki, należy upewnić się, że larwy pozostają na dnie probówek do PCR, schładzając larwy w probówkach w temperaturze 4 °C przez 10-15 minut i/lub delikatnie stukając w probówki przed podgrzaniem.
  6. Umieść probówki PCR w termocyklerze (lub łaźni wodnej). Podgrzewać w temperaturze 60 °C przez 10 min.
  7. Ostrożnie wyjmij larwy z probówek PCR do dołków preparacyjnych wypełnionych świeżym 1x PBS.
  8. Wysuszyć larwy na chusteczce higienicznej i ułożyć na płaskiej powierzchni do obrazowania pod mikroskopem stereoskopowym.
  9. Oceniaj obrazy larw na ślepo przez wiele osobników.

4. Immunohistochemia larwalnych gruczołów chłonnych

UWAGA: Gruczoł limfatyczny znajduje się około jednej trzeciej długości od przedniego końca larwy nieco poniżej mózgu po stronie grzbietowej. (Patrz strzałka na rysunku 3B.) Gruczoł limfatyczny flankuje naczynie grzbietowe i najłatwiej go rozciąć przyczepiając do haczyków gębowych lub do mózgu. Gruczoły limfatyczne typu dzikiego w trzecim stadium chorobowym są bardzo małymi strukturami; Płaty pierwotne mają długość około 100 - 200 μm. (Patrz rysunek 4A.)

  1. Aby uzyskać larwy o mniej więcej tym samym etapie rozwoju dla tego testu, należy ograniczyć zbieranie jaj, pozwalając samicom na składanie jaj przez określony czas 2 - 6 godzin.
  2. Rozwarstwienie gruczołów chłonnych
    1. Dla każdego warunku doświadczalnego dodać 1 ml 1x PBS (Tabela 1) do jednego dołka na płytce 24-dołkowej.
    2. Dodać 1 kroplę 0,1% PBST (Tabela 1) do każdej studzienki za pomocą jednorazowej pipety transferowej.
      UWAGA: Detergent, taki jak Tween 20, jest dodawany w celu obniżenia napięcia powierzchniowego, dzięki czemu chusteczka opada na dno studzienki.
    3. Połóż talerz płasko na lodzie.
    4. Zbieraj larwy w dołkach preparacyjnych wypełnionych 1x PBS.
    5. Umieść czystą podkładkę sekcyjną na oświetlonej podstawie mikroskopu stereoskopowego. Za pomocą jednorazowej pipety transferowej umieść małe krople 0,01% PBST (Tabela 1) na podkładce. Przenieś jedną larwę do kropli PBST w celu rozwarstwienia.
    6. Trzymaj larwę jedną parą kleszczy około jednej czwartej długości od tylnego końca, grzbietem do góry.
    7. Użyj innej pary kleszczy, aby chwycić naskórek bezpośrednio przed kleszczami, które trzymają larwę. Delikatnie pociągnij naskórek w kierunku przedniego końca, aż haczyki do ust zostaną odsłonięte.
      UWAGA: Celem jest złuszczenie naskórka bez naruszania jakichkolwiek struktur wewnętrznych.
    8. Zwolnij naskórek i użyj obu kleszczy, aby przeciąć larwę na pół. Usuń tylny koniec z kropli PBST.
      UWAGA: Jeśli naskórek nie złuszcza się aż do haczyków gębowych, przetnij larwę na dwie części i usuń tylny koniec. Użyj jednej pary kleszczy, aby przytrzymać krawędź naskórka, a drugiej pary kleszczy, aby wepchnąć haczyki do ust przez otwór. Spowoduje to odwrócenie naskórka i odsłonięcie haczyków do ust. Może to być również stosowane jako alternatywna metoda sekcji.
    9. Użyj jednej pary kleszczy, aby przygwoździć naskórek (naskórek brzuszny, płat naskórka grzbietowego lub oba), aby uzyskać stabilność.
    10. Użyj innej pary kleszczy, aby chwycić odsłonięte haczyki na usta i delikatnie je wyciągnij.
      UWAGA: Spowoduje to oddzielenie naskórka od struktur wewnętrznych. Idealnie byłoby, gdyby krążki imaginalne oka/czułka, mózg, gruczoł pierścieniowy i gruczoł limfatyczny otaczający naczynie grzbietowe pozostały przyczepione do haczyków ustnych.
    11. Trzymając haczyki do ust, ostrożnie usuń niechciane struktury, takie jak gruczoły ślinowe, ciało tłuszczowe i jelita.
      UWAGA: Jeśli mózg oddzieli się od haczyków w jamie ustnej, gruczoł limfatyczny może nadal być przyczepiony do mózgu i zebrany wraz z nim. W takim przypadku trzymaj brzuszny rdzeń nerwowy zamiast haczyków ustnych.
    12. Używając haczyków ustnych lub brzusznego rdzenia nerwowego jako uchwytu, przenieś wypreparowany kompleks zawierający gruczoł limfatyczny do studni na lodzie. Nie należy przekraczać 30 minut przed utrwaleniem.
  3. Utrwalenie i immunohistochemia
    1. Umieść 24-dołkową płytkę na podstawie mikroskopu stereoskopowego.
    2. Użyj pipety p200, aby ostrożnie usunąć PBST z dołka.
      UWAGA: Puste, sąsiednie studnie są przydatne do tymczasowego składowania odpadów.
    3. Delikatnie dodaj 200 μl 3,7% formaldehydu (Tabela 1) z boku studzienki i zakręć płytką, aby upewnić się, że wypreparowane tkanki są całkowicie zanurzone.
    4. Włóż płytkę z powrotem do lodu na 30 minut. Jeśli gruczoły limfatyczne wyrażają białka fluorescencyjne, przykryj płytkę, aby zapobiec fotowybielaniu.
    5. Użyj pipety p200, aby ostrożnie usunąć utrwalacz.
    6. Przemyć, dodając 200 μl 1x PBS do studzienki i umieszczając płytkę na wytrząsarce orbitalnej na 5 minut w temperaturze pokojowej. Użyj pipety p200, aby ostrożnie wyjąć PBS.
      UWAGA: Stałe gruczoły limfatyczne można pozostawić na lodzie w PBS, dopóki gruczoły limfatyczne dla wszystkich warunków eksperymentalnych nie zostaną wypreparowane i naprawione.
    7. Powtórz kroki prania jeszcze dwa razy.
    8. Dodać 200 μl roztworu przepuszczalnego (tabela 1) do studzienki. Ustaw płytkę na wytrząsarce orbitalnej na 45 minut w RT.
      UWAGA: 45 minut to "złoty standard" przepuszczalności gruczołów limfatycznych, ale autorzy odnoszą sukces już po 20 minutach.
    9. Usunąć roztwór za pomocą pipety p200.
    10. Rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe roztworem przeciwciała (Tabela 1) zgodnie ze specyfikacją dostawcy. Dodać 300 μl roztworu przeciwciał pierwszorzędowych do studzienki i upewnić się, że wypreparowane tkanki są całkowicie zanurzone. Inkubować w temperaturze 4 °C przez noc.
    11. Użyj pipety p200, aby usunąć przeciwciało pierwotne.
    12. Przemyć, dodając 200 μl 1x PBS do studzienki i umieszczając płytkę na wytrząsarce orbitalnej na 10 minut w temperaturze pokojowej. Użyj pipety p200, aby ostrożnie wyjąć PBS.
    13. Powtórz kroki prania jeszcze dwa razy.
    14. Rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe roztworem przeciwciała zgodnie ze specyfikacją dostawcy. Dodać 300 μl roztworu przeciwciał wtórnych do studzienki i upewnić się, że wypreparowane tkanki są całkowicie zanurzone. Inkubować na wytrząsarce orbitalnej przez co najmniej 2 godziny w temperaturze pokojowej.
    15. Użyj pipety p200, aby usunąć przeciwciało wtórne i przemyć zgodnie z opisem w krokach 4.3.12 i 4.3.13. Nie wyjmuj PBS po ostatnim praniu.
  4. Montaż gruczołów limfatycznych
    1. Wyczyść szklane szkiełka mikroskopowe za pomocą 70% etanolu (Tabela 1) i chusteczek do tkanek.
    2. Dla każdego warunku doświadczalnego umieścić jedną kroplę bufora montażowego (Tabela 1) na szkiełku podstawowym.
      UWAGA: Na jednym slajdzie mieszczą się dwa warunki. Objętość bufora montażowego zależy od liczby gruczołów limfatycznych, które mają być zamontowane. Użyj 2 μl dla około 18 - 20 gruczołów limfatycznych, 1 μl dla 10 - 12 i 0,5 μl dla 5 lub mniej.
    3. Umieść szkiełko mikroskopowe na podświetlanej podstawie mikroskopu stereoskopowego.
    4. W maksymalnie dwóch warunkach jednocześnie przenieś wszystkie gruczoły limfatyczne ze studzienki do bufora montażowego za pomocą kleszczy, używając haczyków ustnych lub brzusznego rdzenia nerwowego jako uchwytu.
    5. Rozmieść wypreparowane tkanki równomiernie w okrągłym lub prostokątnym kształcie, rozprowadzając przy tym bufor montażowy.
    6. Dla każdej z wypreparowanych tkanek, indywidualnie, wsuń jeden szczypiec kleszczyków pod naczynie grzbietowe i delikatnie pociągnij w kierunku obwodu bufora montażowego.
      UWAGA: Spowoduje to wyciągnięcie gruczołu limfatycznego z reszty wypreparowanych tkanek i spłaszczenie gruczołu limfatycznego na szkle.
    7. Za pomocą jednego szczypiec kleszczowych i ruchu piłowania przeciąć naczynie grzbietowe między gruczołem limfatycznym a mózgiem.
    8. Przenieść resztę wypreparowanych tkanek na przeciwną stronę gruczołu chłonnego, na najbardziej zewnętrzną krawędź buforu.
      UWAGA: Niechciane wypreparowane tkanki ostatecznie utworzą obwód wokół gruczołów limfatycznych i posłużą jako podpora, na której spocznie szkiełko nakrywkowe.
    9. Powtarzaj, aż wszystkie gruczoły limfatyczne zostaną oddzielone od wypreparowanych tkanek, zachowując jedną z niechcianych wypreparowanych tkanek do umieszczenia w środku.
    10. Weź szkiełko nakrywkowe między dwoma palcami. Sprawdź, czy szkiełko nakrywkowe jest wolne od kurzu i odcisków palców. W razie potrzeby użyj chusteczki higienicznej i 70% etanolu, aby wyczyścić szkiełko nakrywkowe.
    11. Upewniając się, że krawędź szkiełka nakrywkowego jest równoległa do krawędzi szkiełka nakrywkowego, ostrożnie opuść szkiełko nakrywkowe na zderzak montażowy.
      UWAGA: Szkiełka mikroskopowe można przechowywać w temperaturze 4 °C przed obrazowaniem. Maksymalny czas przechowywania zależy od stabilności zastosowanych przeciwciał. Płytki 24-dołkowe można wypłukać i ponownie użyć.

5. Obrazowanie

  1. Obraz utrwalonych hemocytów i zamontowanych gruczołów limfatycznych na odpowiednim standardowym mikroskopie fluorescencyjnym lub konfokalnym przy powiększeniu 20X lub większym zgodnie z instrukcją obsługi producenta. Obraz całych larw na standardowym mikroskopie stereoskopowym przy 2-krotnym powiększeniu zgodnie z instrukcją obsługi producenta.
  2. W razie potrzeby postępuj zgodnie z instrukcjami dostawcy oprogramowania dotyczącymi dekonwolucji.
rozwiązaniekompozycjaskładowanieKomentarze
1x PBS200 mg/L chlorek potasutemperatura pokojowa
200 mg/L fosforan potasu jednozasadowy
8 000 mg/l chlorku sodu
1,150 mg/L sodu fosforan dwuzasadowy
dH2O
Utrwalacz3,7% lub 7,5% formaldehydu w 1x PBSTemperatura pokojowa w ciemnościFormaldehyd jest toksyczny.
Roztwór przepuszczalny/rozcieńczalnik przeciwciał0,4% Tryton4 °CStandardowa formuła używa 0,4% Triton, ale autorzy używają 0,1% Tween 20 z powodzeniem. Służy do rozcieńczania przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych zgodnie ze stężeniami zalecanymi przez dostawców.
5% albumina surowicy bydlęcej, normalna surowica kozia lub normalna surowica osła
1x PBS (Biblioteka PBS)
70% etanolu70% 200-procentowy etanol w dH2OTemperatura pokojowa
Bufor montażowy0,5% galusan N-propylu4 °C w ciemnościGalusan N-propylu jest szkodliwy. DAPI jest mutagenem.
80% glicerol
Opcjonalnie: 1 μg/ml DAPI (4',6-diamidyn-2-fenyloindol)
1x PBS (Biblioteka PBS)
0,1% PBST0,1% Animacja 20 w 1x PBSTemperatura pokojowa
0,01% PBSTRozcieńczenie 1:10 0,1% PBSTTemperatura pokojowa

Tabela 1. Rozwiązania zastosowane w niniejszym Protokole.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Stężenie krążących hemocytów

Liczba hemocytów wzrasta w miarę rozwoju larwalnego35. Aby zilustrować, że metoda ta wykrywa różnice w liczbie i stężeniu hemocytów, niezależnie od przyczyny biologicznej, zmierzono stężenia hemocytów u larw z opóźnionym i prawidłowym rozwojem. Utrata hormonu protorakikotropowego (ptth) poprzez genetyczną ablację neuronów produkujących ptth (ptth>grim) powoduje opóźnienie rozwoju larwalneg...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W przypadku zmian genetycznych lub środowiskowych cztery opisane tutaj metody mogą być stosowane pojedynczo lub w połączeniu do analizy różnych procesów podczas hematopoezy, takich jak sygnalizacja, przeżycie, proliferacja i różnicowanie. Hematopoeza Drosophila jest procesem dynamicznym; Liczba hemocytów na zwierzę wzrasta35, a struktura i ekspresja genów gruczołu limfatycznego zmienia się32 podczas rozwoju. Dlatego przed wykonaniem tych testów bardzo ważne jest, aby ograniczyć pobieranie ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają żadnych konkurencyjnych interesów ani interesów finansowych.

Podziękowania

Dziękujemy Matthew O'Connellowi, Maryam Jahanshahi i Andreasowi Jenny'emu za pomoc. Dziękujemy Istvánowi Andó za przeciwciała specyficzne dla plazmatocytów, Utpalowi Banerjee za muchom kopułkowo-mezo-EBFP2, Julianowi Martinezowi-Agosto za muchom antp>GFP oraz Michaelowi O'Connorowi za muchy ptth i ptth>grim. Metody te zostały opracowane przy wsparciu Fundacji Kimmel, Towarzystwa Białaczki i Chłoniaka, NIH/NCI R01CA140451, NSF 1257939, DOD/NFRP W81XWH-14-1-0059 i NIH/NCI T32CA078207.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Tabletki PBSMP Biomedicals2810305
naczynie preparacyjneCorning7220-85
probówka do mikrowirówekDenvilleC2170
silikonowa podkładka preparacyjna, wykonana z zestawu Sylgard 184Krayden (dystrybuowany przez Fisher)NC9644388 (numer katalogowy Fisher)Wykonany na szalce Petriego poprzez zmieszanie składników zestawu elastomeru Sylgard zgodnie z instrukcjami producenta.
stereoskopowyMorrell Instruments (dystrybutor firmy Nikon)mna42000, mma36300Modele Nikon SMZ1000 i SMZ645
chusteczki do tkanekKleszcze VWR82003-820
Mikroskopia elektronowa Sciences72700-DZ
pipeta p200Eppendorf3120000054
Countess Automatyczny licznik komórekInvitrogenC10227
Szkiełka komory zliczania komórek hrabinyHemocytometr InvitrogenC10283
Hausser Scientific3200
trypanowa niebieska plamaTechnologiesT10282
formaldehydFisherBP531-500
TritonFisherBP151-500
Tween 20FisherBP337-500
albumina surowicy bydlęcejRocky Mountain BiologicalsBSA-BSH-01K
normalna surowica koziaSigmaG9023-10ML
normalna surowica osłaSigmaD9663-10ML
200 proof etanolVWRV1001
galusan N-propyluMP Biomedicals102747
glicerolVWREM-4750
DAPI (4',6-diamidyno-2-fenyloindol)Fisher62248
Płytka 6-dołkowaCorning351146
12-dołkowa SzkłoCorning
, kwadrat 22 mmSzkło12-544-10
, okrągłe 18 mmFisher12-545-100
szklane szkiełka mikroskopoweTermocykler Fisher22-034-980
EppendorfE950010037Mastercycler EP Gradient S
probówki PCRUSA Scientific1402-2700
24-dołkowa płytkaCorning351147
jednorazowa pipeta transferowaFisher13-711-9AM
fluorescencja mikroskopZeissAxio Imager.Z1
mikroskop Life pokrywowe mikroskopu 351143 nakrywkowe mikroskopu Fisher

Bibliografia

  1. Evans, C. J., Hartenstein, V., Banerjee, U. Thicker than blood: conserved mechanisms in Drosophila and vertebrate hematopoiesis. Dev Cell. 5 (5), 673-690 (2003).
  2. Crozatier, M., Meister, M. Drosophila haematopoiesis. Cell Microbiol. 9 (5), 1117-1126 (2007).
  3. Crozatier, M., Vincent, A. Drosophila: a model for studying genetic and molecular aspects of haematopoiesis and associated leukaemias. Dis Model Mech. 4 (4), 439-445 (2011).
  4. Gold, K. S., Bruckner, K. Drosophila as a model for the two myeloid blood cell systems in vertebrates. Exp Hematol. 42 (8), 717-727 (2014).
  5. Hartenstein, V. Blood cells and blood cell development in the animal kingdom. Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 677-712 (2006).
  6. Ghosh, S., Singh, A., Mandal, S., Mandal, L. Active hematopoietic hubs in Drosophila adults generate hemocytes and contribute to immune response. Dev Cell. 33 (4), 478-488 (2015).
  7. Leitao, A. B., Sucena, E. Drosophila sessile hemocyte clusters are true hematopoietic tissues that regulate larval blood cell differentiation. Elife. 4, (2015).
  8. Makhijani, K., Alexander, B., Tanaka, T., Rulifson, E., Bruckner, K. The peripheral nervous system supports blood cell homing and survival in the Drosophila larva. Development. 138 (24), 5379-5391 (2011).
  9. Crozatier, M., Ubeda, J. M., Vincent, A., Meister, M. Cellular immune response to parasitization in Drosophila requires the EBF orthologue collier. PLoS Biol. 2 (8), 196(2004).
  10. Markus, R., et al. Sessile hemocytes as a hematopoietic compartment in Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (12), 4805-4809 (2009).
  11. Minakhina, S., Steward, R. Melanotic mutants in Drosophila: pathways and phenotypes. Genetics. 174 (1), 253-263 (2006).
  12. Bina, S., Wright, V. M., Fisher, K. H., Milo, M., Zeidler, M. P. Transcriptional targets of Drosophila JAK/STAT pathway signalling as effectors of haematopoietic tumour formation. EMBO Rep. 11 (3), 201-207 (2010).
  13. Avet-Rochex, A., et al. An in vivo RNA interference screen identifies gene networks controlling Drosophila melanogaster blood cell homeostasis. BMC Dev Biol. 10, 65(2010).
  14. Rodriguez, A., et al. Identification of immune system and response genes, and novel mutations causing melanotic tumor formation in Drosophila melanogaster. Genetics. 143 (2), 929-940 (1996).
  15. Mandal, L., Banerjee, U., Hartenstein, V. Evidence for a fruit fly hemangioblast and similarities between lymph-gland hematopoiesis in fruit fly and mammal aorta-gonadal-mesonephros mesoderm. Nat Genet. 36 (9), 1019-1023 (2004).
  16. Grigorian, M., Mandal, L., Hakimi, M., Ortiz, I., Hartenstein, V. The convergence of Notch and MAPK signaling specifies the blood progenitor fate in the Drosophila mesoderm. Dev Biol. 353 (1), 105-118 (2011).
  17. Lebestky, T., Jung, S. H., Banerjee, U. A Serrate-expressing signaling center controls Drosophila hematopoiesis. Genes Dev. 17 (3), 348-353 (2003).
  18. Krzemien, J., et al. Control of blood cell homeostasis in Drosophila larvae by the posterior signalling centre. Nature. 446 (7133), 325-328 (2007).
  19. Mandal, L., Martinez-Agosto, J. A., Evans, C. J., Hartenstein, V., Banerjee, U. A Hedgehog- and Antennapedia-dependent niche maintains Drosophila haematopoietic precursors. Nature. 446 (7133), 320-324 (2007).
  20. Benmimoun, B., Polesello, C., Haenlin, M., Waltzer, L. The EBF transcription factor Collier directly promotes Drosophila blood cell progenitor maintenance independently of the niche. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (29), 9052-9057 (2015).
  21. Sinenko, S. A., Mandal, L., Martinez-Agosto, J. A., Banerjee, U. Dual role of wingless signaling in stem-like hematopoietic precursor maintenance in Drosophila. Dev Cell. 16 (5), 756-763 (2009).
  22. Pennetier, D., et al. Size control of the Drosophila hematopoietic niche by bone morphogenetic protein signaling reveals parallels with mammals. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (9), 3389-3394 (2012).
  23. Dragojlovic-Munther, M., Martinez-Agosto, J. A. Extracellular matrix-modulated Heartless signaling in Drosophila blood progenitors regulates their differentiation via a Ras/ETS/FOG pathway and target of rapamycin function. Dev Biol. 384 (2), 313-330 (2013).
  24. Ferguson, G. B., Martinez-Agosto, J. A. Yorkie and Scalloped signaling regulates Notch-dependent lineage specification during Drosophila hematopoiesis. Curr Biol. 24 (22), 2665-2672 (2014).
  25. Milton, C. C., et al. The Hippo pathway regulates hematopoiesis in Drosophila melanogaster. Curr Biol. 24 (22), 2673-2680 (2014).
  26. Evans, C. J., Liu, T., Banerjee, U. Drosophila hematopoiesis: Markers and methods for molecular genetic analysis. Methods. 68 (1), 242-251 (2014).
  27. Neyen, C., Bretscher, A. J., Binggeli, O., Lemaitre, B. Methods to study Drosophila immunity. Methods. 68 (1), 116-128 (2014).
  28. Small, C., Paddibhatla, I., Rajwani, R., Govind, S. An introduction to parasitic wasps of Drosophila and the antiparasite immune response. J Vis Exp. (63), e3347(2012).
  29. Petraki, S., Alexander, B., Bruckner, K. Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva. J Vis Exp. (105), (2015).
  30. Rizki, M. T. M., Rizki, R. M. Functional significance of the crystal cells in the larva of Drosophila mekmogaster. Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 5, 235-240 (1959).
  31. Kurucz, E., et al. Definition of Drosophila hemocyte subsets by cell-type specific antigens. Acta Biol Hung. 58, Suppl 95-111 (2007).
  32. Jung, S. H., Evans, C. J., Uemura, C., Banerjee, U. The Drosophila lymph gland as a developmental model of hematopoiesis. Development. 132 (11), 2521-2533 (2005).
  33. Krzemien, J., Crozatier, M., Vincent, A. Ontogeny of the Drosophila larval hematopoietic organ, hemocyte homeostasis and the dedicated cellular immune response to parasitism. Int J Dev Biol. 54 (6-7), 1117-1125 (2010).
  34. Rizki, T. M., Rizki, R. M. Properties of the Larval Hemocytes of Drosophila-Melanogaster. Experientia. 36 (10), 1223-1226 (1980).
  35. Lanot, R., Zachary, D., Holder, F., Meister, M. Postembryonic hematopoiesis in Drosophila. Dev Biol. 230 (2), 243-257 (2001).
  36. McBrayer, Z., et al. Prothoracicotropic hormone regulates developmental timing and body size in Drosophila. Dev Cell. 13 (6), 857-871 (2007).
  37. Reimels, T. A., Pfleger, C. M. Drosophila Rabex-5 restricts Notch activity in hematopoietic cells and maintains hematopoietic homeostasis. J Cell Sci. 128 (24), 4512-4525 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Układ krwiotwórczy Drosophilawypreparowanie gruczołu chłonnegopobieranie hemolimfyzagęszczanie hemocytówprotokół immunohistochemicznykrążące hemocytymontowanie gruczołu chłonnegoinkubacja z przeciwciałem pierwotnymprzemywanie przeciwciał wtórnychekspresja białek fluorescencyjnych
Metody badania gruczołu limfatycznego i hemocytów u larw Drosophila
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.