Artykuł metodologiczny

Znakowanie przeciwciał barwnikami fluorescencyjnymi przy użyciu magnetycznych kulek białka A i białka G

11.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54545

⸱

15 września 2016

 ,  , 
1Promega Corporation

W tym artykule

Podsumowanie

Metoda znakowania przeciwciał na koralikach z małymi cząsteczkami umożliwia znakowanie niewielkiej ilości przeciwciał bezpośrednio z pożywki komórkowej. Metoda ta jest kompatybilna z chemią amin i tioli i może obsługiwać wiele próbek równolegle, ręcznie lub przy użyciu zautomatyzowanych platform.

Streszczenie

Przeciwciała oznaczone małymi cząsteczkami, takimi jak barwniki fluorescencyjne, leki cytotoksyczne i radioaktywne znaczniki, są niezbędnymi narzędziami w badaniach biomedycznych, immunodiagnostyce, a ostatnio także jako środki terapeutyczne. Tradycyjne metody znakowania przeciwciał małymi cząsteczkami wymagają oczyszczonych przeciwciał o stosunkowo wysokim stężeniu, obejmują wiele etapów dializy i mają ograniczoną przepustowość. Jednak w kilku zastosowaniach, w tym w dziedzinie koniugatów przeciwciał i leków (ADC), nowe metody, które umożliwią znakowanie przeciwciał bezpośrednio z pożywki komórkowej, skorzystają na tym fakcie. Takie metody mogą pozwolić na badanie przesiewowe przeciwciał w testach istotnych biologicznie, na przykład w teście internalizacji przeciwciał za pośrednictwem receptora w przypadku ADC. W tym miejscu opisujemy metodę (metoda na kulkach), która umożliwia znakowanie niewielkich ilości przeciwciał bezpośrednio z pożywki komórkowej. Podejście to wykorzystuje magnetyczne kulki powinowactwa do białek A i G o dużej pojemności do wychwytywania przeciwciał z pożywki komórkowej, a następnie znakowania małymi cząsteczkami przy użyciu chemii aminowej lub tiolowej, a następnie elucji znakowanych przeciwciał. Biorąc barwniki fluorescencyjne jako substytuty małych cząsteczek, demonstrujemy znakowanie na kulkach trzech różnych mysich przeciwciał bezpośrednio z pożywki komórkowej przy użyciu chemii znakowania aminowego i tiolowego. Wysokie powinowactwo wiązania przeciwciał do białka A i białka G zapewnia wysoki odzysk, a także wysoką czystość znakowanych przeciwciał. Ponadto zastosowanie kulek magnetycznych umożliwia ręczną obsługę wielu próbek, co znacznie poprawia wydajność etykietowania.

Wprowadzenie

Przeciwciała znakowane małymi cząsteczkami są prawdopodobnie najczęściej używanymi odczynnikami w biologii1,2. Przeciwciała znakowane barwnikami fluorescencyjnymi i biotyną są szeroko stosowane między innymi w obrazowaniu, testach immunologicznych, cytometrii przepływowej, plamach zachodnich i immunoprecypitacji3-6. Przeciwciała znakowane radioizotopowo3,7 znajdują szerokie zastosowanie w obrazowaniu i terapii, przeciwciała znakowane lekami cytotoksycznymi (ADC) oferują nowe możliwości leczenia nowotworów, a dwa ADC zostały już zatwierdzone do użytku terapeutycznego8. Pomimo ich szerokiego zastosowania, metody znakowania przeciwciał pozostały zaskakująco niezmienione i zazwyczaj obejmują wiele reakcji i etapów odsalania9-12. Metody roztworów działają bardzo dobrze w przypadkach, gdy tylko kilka przeciwciał musi być znakowanych i są dostępne w postaci wysoce oczyszczonej, w wysokim stężeniu i w wystarczających ilościach. Jednak w przypadku nowszych zastosowań, takich jak ADC, istnieje potrzeba znakowania przeciwciał na wczesnym etapie hybrydomy, aby można je było przebadać pod kątem biologicznie istotnych właściwości, na przykład internalizacji przeciwciał za pośrednictwem receptora13-16. Na etapie hybrydoma objętość próbek jest ograniczona, przeciwciała ulegają ekspresji w niskich stężeniach, a liczba próbek jest duża, dlatego metody znakowania oparte na roztworach nie są odpowiednie.

Aby uprościć i poprawić wydajność tradycyjnych metod znakowania przeciwciał, zaproponowano kilka alternatywnych podejść17,18. Jednym ze sposobów jest użycie niemagnetycznych kulek powinowactwa do białka A upakowanych w małe kolumny w celu wychwycenia przeciwciał, a następnie reakcji znakowania i elucji znakowanego i oczyszczonego białka. Metoda ta może być stosowana do znakowania przeciwciał bezpośrednio z pożywki komórkowej, jednak użycie kolumn może być pracochłonne. Niedawno doniesiono o metodzie opartej na kulkach magnetycznych19 , która eliminuje użycie kolumn i poprawia przepustowość, ale ze względu na ograniczoną zdolność wiązania przeciwciał przez kulki, można było znakować tylko nanogramy do małych mikrogramów przeciwciał

.

Niedawno opracowaliśmy i użyliśmy magnetycznych kulek białka A i G o dużej pojemności (>20 mg ludzkiej IgG/ml osadzonych kulek) do oznaczania przeciwciał obecnych w pożywkach komórkowych małymi cząsteczkami>20. Duża pojemność kulek pozwala na wygodne znakowanie dziesiątek do setek mikrogramów przeciwciał, a szybka reakcja magnetyczna kulek upraszcza obsługę i przetwarzanie dużej liczby próbek równolegle. Używając barwników fluorescencyjnych jako substytutów małych cząsteczek, pokazujemy, że metoda jest kompatybilna z chemią znakowania amin i tioli oraz oferuje wysoki odzysk znakowanych i bardzo czystych przeciwciał.

Ten protokół i towarzyszący mu film opisują znakowanie na koralikach mysich przeciwciał obecnych w pożywkach komórkowych za pomocą magnetycznych kulek białka A i białka G. Protokół jest podzielony na cztery sekcje: Sekcja 1 opisuje wychwytywanie przeciwciał na kulce z próbek biologicznych. Po wychwyceniu, znakowanie przeciwciał barwnikiem fluorescencyjnym przy użyciu chemii aminowej lub chemii tiolowej opisano odpowiednio w sekcjach 2 i 3. Wreszcie w sekcji 4 opisano metodę obliczania stężenia przeciwciał i stosunku barwnika do przeciwciał

.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Wychwytywanie przeciwciał na magnetycznych kulkach białka A o dużej pojemności lub magnetycznych kulek białkowych G

  1. Równomiernie ponownie zawiesić koraliki magnetyczne poprzez delikatne potrząsanie. Utrzymuj jednolitą zawiesinę podczas porcjowania koralików.
  2. Dodać 50 μl zawiesiny perełkowej do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Umieść w podstawce magnetycznej na 10 sekund. Ostrożnie wyjmij bufor pamięci masowej.
  3. Dodać 250 μl buforu wiążącego przeciwciała.
  4. Wymieszaj i umieść w podstawce magnetycznej na 10 sekund. Ostrożnie wyjmij bufor wiążący.
  5. Dodać 1,0 ml próbki zawierającej 50-100 μg przeciwciała do kulek. Próbki mogą być oczyszczonymi przeciwciałami lub przeciwciałami w pożywkach komórkowych.
  6. Mieszaj próbkę przez 60 minut w temperaturze pokojowej za pomocą mieszalnika wirowego lub mieszalnika typu end-over-end.
  7. Umieść probówkę w stojaku magnetycznym na 10 sekund i usuń supernatant.
  8. Dodać 250 μl buforu wiążącego/przemłudzającego przeciwciała i wymieszać. Umieść w podstawce magnetycznej na 10 sekund i wyjmij bufor wiążący/myjący. Powtórz ten krok, aby uzyskać łącznie dwa prania.
  9. Przejdź do sekcji 2, aby znakować przeciwciała przy użyciu chemii aminowej lub do sekcji 3, aby znakować przeciwciała przy użyciu chemii tiolowej.

2. Znakowanie przeciwciał za pomocą chemii aminowej

  1. Przeciwciało sprzężone
    1. Dodać 100 μl buforu koniugacyjnego amin do kulek.
    2. Rozpuścić aminowo-reagujące barwniki fluorescencyjne (AlexaFluor 532-SE) w stężeniu 10 mg/ml, dodając 100 μl dimetylosulfotlenku (DMSO) do 1,0 mg barwnika. Wymieszaj przez wirowanie. Przygotuj to rozwiązanie tuż przed użyciem.
    3. Dodać 2,5 μl barwnika reagującego aminami na 100 μg przeciwciała.
      Uwaga: Zazwyczaj zalecany jest 5-20 molowy nadmiar barwnika reaktywnego. Jednak ilość reaktywnego barwnika dodawanego do reakcji musi być empirycznie zoptymalizowana w zależności od pożądanego stosunku barwnika do przeciwciała i wewnętrznych właściwości przeciwciał.
    4. Mieszaj próbkę przez 60 minut w temperaturze pokojowej za pomocą mieszalnika wirowego lub mieszalnika typu end-over-end. Upewnij się, że koraliki pozostają w zawieszeniu.
    5. Umieść probówkę w stojaku magnetycznym na 10 sekund i usuń supernatant.
    6. Dodać 250 μl buforu wiążącego/przemłudzającego przeciwciała i wymieszać. Umieść w podstawce magnetycznej na 10 sekund. Usuń i wyrzuć bufor wiążący/myjący. Powtórz ten krok, aby uzyskać łącznie dwa prania.
  2. Odzyskiwanie przeciwciał
    1. Dodać 50 μl buforu elucyjnego do kulek.
    2. Mieszaj przez 5 minut w temperaturze pokojowej za pomocą miksera wirowego lub miksera typu end-over-end. Upewnij się, że koraliki pozostają w zawieszeniu.
    3. Umieść probówkę w stojaku magnetycznym na 10 sekund. Usuń eluowaną próbkę i przenieś do nowej probówki do mikrowirówki zawierającej 5 μl buforu neutralizacyjnego.
    4. Powtórzyć proces jeszcze raz i połączyć eluowane próbki.
    5. Określić ilościowo stężenie przeciwciał i stosunek barwnika do przeciwciała, jak opisano w sekcji 4.

3. Znakowanie przeciwciał za pomocą chemii tiolowej

  1. Redukcja przeciwciał
    1. Dodać 250 μl tiolowego buforu koniugacyjnego i wymieszać. Umieść rurkę w stojaku magnetycznym na 10 sekund. Usuń i wyrzuć bufor. Powtórz ten krok dwukrotnie.
    2. Dodać 100 μl tiolowego buforu koniugacyjnego.
    3. Dodać ditiotreitol (DTT) do końcowego stężenia 2,5 mM.
    4. Mieszaj próbkę przez 60 minut w temperaturze pokojowej za pomocą mieszalnika wirowego lub mieszalnika typu end-over-end. Upewnij się, że koraliki pozostają w zawieszeniu.
    5. Umieść probówkę w stojaku magnetycznym na 10 sekund i wyrzuć bufor.
    6. Dodać 250 μl tiolowego buforu koniugacyjnego i wymieszać. Umieść rurkę w stojaku magnetycznym na 10 sekund. Usuń i wyrzuć bufor. Powtórz ten krok, aby uzyskać łącznie dwa prania.
    7. Dodać 100 μl tiolowego buforu koniugacyjnego.
  2. Przeciwciało sprzężone
    1. Rozpuścić barwnik reagujący z tiolem w stężeniu 10 mg/ml, dodając 100 μl DMSO do 1,0 mg barwnika. Wymieszaj przez wirowanie. Przygotuj to rozwiązanie tuż przed użyciem.
    2. Dodać 2,5 μl barwnika reagującego z tiolem na 100 μg przeciwciała.
      Uwaga: Zazwyczaj zalecany jest 5-20 molowy nadmiar barwnika reaktywnego. Jednak ilość reaktywnego barwnika dodawanego do reakcji musi być empirycznie zoptymalizowana w zależności od pożądanego stosunku barwnika do przeciwciała i wewnętrznych właściwości przeciwciał.
    3. Mieszaj próbkę przez 60 minut w temperaturze pokojowej za pomocą mieszalnika wirowego lub mieszalnika typu end-over-end. Upewnij się, że koraliki pozostają w zawieszeniu.
    4. Umieść probówkę w stojaku magnetycznym na 10 sekund i usuń supernatant.
    5. Dodać 250 μl tiolowego buforu koniugacyjnego i wymieszać. Umieść w podstawce magnetycznej na 10 sekund i wyjmij bufor. Powtórz ten krok, aby uzyskać łącznie dwa prania.
  3. Przeciwciało Elute
    1. Dodać 50 μl buforu elucyjnego do kulek.
    2. Mieszaj przez 5 minut w temperaturze pokojowej za pomocą miksera wirowego lub miksera typu end-over-end. Upewnij się, że koraliki pozostają w zawieszeniu.
    3. Umieść probówkę w stojaku magnetycznym na 10 sekund. Usuń eluowaną próbkę i przenieś do nowej probówki do mikrowirówki zawierającej 5 μl buforu neutralizacyjnego.
    4. Powtórzyć proces jeszcze raz i połączyć eluowane próbki.
    5. Określić ilościowo stężenie przeciwciał i stosunek barwnika do przeciwciała, jak opisano w sekcji 4.

4. Oblicz stosunek barwnika do przeciwciała

  1. Zmierzyć absorbancję koniugatu przeciwciało-barwnik przy 280 nm (A280) i przy λmax dla barwnika (Amax).
  2. Oblicz stężenie przeciwciał:
    Stężenie przeciwciał (mg / ml) = A280 - (Amax × CF) / 1,4
    gdzie CF = współczynnik korekcyjny barwnika (dostarczony przez producenta).
  3. Oblicz stosunek barwnika do przeciwciał:
    Stosunek barwnika do przeciwciał (DAR) = (Amax × 150 000)/Stężenie Ab (mg/ml) × εbarwnik
    gdzie, εbarwnik = współczynnik ekstynkcji barwnika przy jego maksymalnej absorbancji i masie cząsteczkowej przeciwciała = 150 000 Da.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Schemat znakowania przeciwciał małymi cząsteczkami przy użyciu magnetycznych kulek Protein A i Protein G o wysokiej pojemności przedstawiono na Rysunku 1. Przeciwciała uchwycone na magnetycznych kulkach Protein G mogą być znakowane małymi cząsteczkami, na przykład barwnikami fluorescencyjnymi, wykorzystując albo chemię aminową, która znakuje grupy aminowe aminokwasów lizyny, albo chemię tiolową, która znakuje zredukowane grupy tiolowe w regionie zawiasowym przeciwciał. Po...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Celem tego badania było opracowanie metody znakowania przeciwciał, obecnych w pożywkach komórkowych w niskich stężeniach, różnymi małymi cząsteczkami. Taka metoda pozwoli na znakowanie dużej liczby przeciwciał na wczesnych etapach odkrywania przeciwciał małymi cząsteczkami i przeprowadzanie badań przesiewowych przy użyciu testu o znaczeniu biologicznym. Jednym z takich testów jest test internalizacji przeciwciał za pośrednictwem receptora, w którym internalizacja może się różnić między przeciwciałami, nawet przy podobnym...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy są pracownikami korporacji Promega.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kulki białka Magne APromega Corporation  G8781
Kulki białkowe MagneG Promega Corporation   G7471
AlexaFluor 532-SE (ester sukcynimidylu)Life TechnologiesA20001
AlexaFluor 532-ME (Malemide)Life TechnologiesA10255
AlexaFluor 647-ME (Maleimid)Life TechnologiesA20347
Fluoresceina-ME (Maleimid)Life TechnologiesF-150
Stojak magnetycznyPromegaZ5332
powiedział:

Bibliografia

  1. Colwill, K., Graslund, S. Renewable Binder Working Group. A roadmap to generate renewable protein binders to the human proteome. Nat Methods. 8 (7), 551-558 (2011).
  2. Silverstein, A. M. Labeled antigens and antibodies: the evolution of magic markers and magic bullets. Nat Immunol. 5 (12), 1211-1217 (2004).
  3. Day, J. J., et al. Chemically modified antibodies as diagnostic imaging agents. Curr Opin Chem Biol. 14 (6), 803-809 (2010).
  4. Cunningham, R. E. Overview of flow cytometry and fluorescent probes for flow cytometry. Methods Mol Biol. 588, 319-326 (2010).
  5. Eaton, S. L., et al. A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies. J Vis Exp. (93), e52099(2014).
  6. Dundas, C. M., Demonte, D., Park, S. Streptavidin-biotin technology: improvements and innovations in chemical and biological applications. Appl Microbiol Biotechnol. 97 (21), 9343-9353 (2013).
  7. Kraeber-Bodere, F., et al. Radioimmunoconjugates for the treatment of cancer. Semin Oncol. 41 (5), 613-622 (2014).
  8. Leal, M., et al. Antibody-drug conjugates: an emerging modality for the treatment of cancer. Ann N Y Acad Sci. 1321, 41-54 (2014).
  9. Drachman, J. G., Senter, P. D. Antibody-drug conjugates: the chemistry behind empowering antibodies to fight cancer. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2013, 306-310 (2013).
  10. Hermanson, G. T. Bioconjugate Techniques. , Academic Press. 380-382 (1996).
  11. Shrestha, D., Bagosi, A., Szollosi, J., Jenei, A. Comparative study of the three different fluorophore antibody conjugation strategies. Anal Bioanal Chem. 404 (5), 1449-1463 (2012).
  12. Vira, S., Mekhedov, E., Humphrey, G., Blank, P. S. Fluorescent-labeled antibodies: Balancing functionality and degree of labeling. Anal Biochem. 402 (2), 146-150 (2010).
  13. Isa, M., et al. High-throughput screening system to identify small molecules that induce internalization and degradation of HER2. ACS Chem Biol. 9 (10), 2237-2241 (2014).
  14. Liao-Chan, S., et al. Quantitative assessment of antibody internalization with novel monoclonal antibodies against Alexa fluorophores. PLoS One. 10 (4), e0124708(2015).
  15. Riedl, T., van Boxtel, E., Bosch, M., Parren, P. W., Gerritsen, A. F. High-Throughput Screening for Internalizing Antibodies by Homogeneous Fluorescence Imaging of a pH-Activated Probe. J Biomol Screen. 21 (1), 12-23 (2016).
  16. Nath, N., et al. Homogeneous plate based antibody internalization assay using pH sensor fluorescent dye. J Immunol Methods. 431, 11-21 (2016).
  17. Lundberg, E., Sundberg, M., Graslund, T., Uhlen, M., Svahn, H. A. A novel method for reproducible fluorescent labeling of small amounts of antibodies on solid phase. J Immunol Methods. 322 (1-2), 40-49 (2007).
  18. Strachan, E., et al. Solid-phase biotinylation of antibodies. J Mol Recognit. 17 (3), 268-276 (2004).
  19. Dezfouli, M., et al. Magnetic bead assisted labeling of antibodies at nanogram scale. Proteomics. 14 (1), 14-18 (2014).
  20. Nath, N., Godat, B., Benink, H., Urh, M. On-bead antibody-small molecule conjugation using high-capacity magnetic beads. J Immunol Methods. 426, 95-103 (2015).
  21. Lund, L. N., et al. Exploring variation in binding of Protein A and Protein G to immunoglobulin type G by isothermal titration calorimetry. J Mol Recognit. 24 (6), 945-952 (2011).
  22. Safarik, I., Safarikova, M. Magnetic techniques for the isolation and purification of proteins and peptides. Biomagn Res Technol. 2 (1), 7(2004).
  23. Flygare, J. A., Pillow, T. H., Aristoff, P. Antibody-drug conjugates for the treatment of cancer. Chem Biol Drug Des. 81 (1), 113-121 (2013).
  24. Shen, B. Q., et al. Conjugation site modulates the in vivo stability and therapeutic activity of antibody-drug conjugates. Nat Biotechnol. 30 (2), 184-189 (2012).
  25. Acchione, M., Kwon, H., Jochheim, C. M., Atkins, W. M. Impact of linker and conjugation chemistry on antigen binding, Fc receptor binding and thermal stability of model antibody-drug conjugates. MAbs. 4 (3), 362-372 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Kuleczki magnetycznekulki z bia kiem Achemia aminowachemia tiolowapo ywka kom rkowaoczyszczanie przeciwciaelucja z kuleczek

Powiązane artykuły