Artykuł metodologiczny

Kolorymetryczne wykrywanie bakterii za pomocą papierka lakmusowego

DOI:

10.3791/54546

⸱

17 września 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Biomedical Sciences, McMaster University, 2Department of Chemistry and Chemical Biology, McMaster University, 3Department of Medicine, McMaster University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy protokół kolorymetrycznego wykrywania E. coli za pomocą zmodyfikowanego testu lakmusowego, który wykorzystuje DNA rozszczepiające RNA, ureazę i kulki magnetyczne.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rośnie zapotrzebowanie na proste, ale wciąż skuteczne metody, które mogą być używane do wykrywania określonych patogenów w miejscach opieki nad pacjentem lub w terenie. Takie metody muszą być przyjazne dla użytkownika i dawać wiarygodne wyniki, które mogą być łatwo interpretowane zarówno przez specjalistów, jak i nieprofesjonalistów. Test lakmusowy pH jest prosty, szybki i skuteczny, ponieważ informuje o pH badanej próbki poprzez prostą zmianę koloru. Opracowaliśmy podejście wykorzystujące papierek lakmusowy do wykrywania bakterii. Metoda wykorzystuje specyficzny dla bakterii DNAzyme rozszczepiający RNA w celu osiągnięcia dwóch funkcji: rozpoznania interesującej bakterii i zapewnienia mechanizmu kontroli aktywności ureazy. Dzięki zastosowaniu kulek magnetycznych unieruchomionych koniugatem DNAzyme-ureaza, obecność bakterii w badanej próbce jest przekazywana do uwalniania ureazy z kulek do roztworu. Uwolniona ureaza jest przenoszona do roztworu testowego w celu hydrolizy mocznika do amoniaku, co powoduje wzrost pH, który można zobrazować za pomocą klasycznego papierka lakmusowego.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Patogeny bakteryjne są jedną z głównych przyczyn globalnej zachorowalności i śmiertelności. Ogniska zakażeń szpitalnych, patogenów przenoszonych przez żywność i zanieczyszczeń bakteryjnych w środowisku stanowią poważne i ciągłe zagrożenia dla zdrowia i bezpieczeństwa publicznego. Aby zapobiec tym epidemiom, potrzebne są skuteczne narzędzia, które pozwolą na wykrywanie patogenów w odpowiednim czasie w różnych warunkach. Proste, ale nadal skuteczne testy, które są przenośne i opłacalne, są bardzo pożądane, zwłaszcza w regionach, które są podatne na wybuchy epidemii, ale nie mogą sobie pozwolić na drogie urządzenia testowe. 1-3 Chociaż istnieje wiele metod wykrywania bakterii, wiele z nich nie nadaje się jako narzędzia przesiewowe lub testowe na miejscu, ponieważ wymagają długiego czasu testowania, drogich przyrządów i skomplikowanych procedur testowych.

Testy kolorymetryczne są szczególnie atrakcyjne dla zastosowań w miejscu opieki nad pacjentem lub w terenie, ponieważ zmiany koloru można łatwo wykryć gołym okiem. Papierek lakmusowy pH jest prosty, szybki i skuteczny. Chociaż jest to bardzo stara technologia, nadal jest szeroko stosowana ze względu na swoją prostotę i skuteczność. Co zaskakujące, ten prosty test nigdy nie był modyfikowany w celu wykrycia innych analitów, zanim niedawno opracowaliśmy podejście polegające na modyfikowaniu tego testu do testów na obecność E. coli. 4

Rozszerzony test lakmusowy dla E. coli wykorzystuje trzy dodatkowe komponenty: aktywowany przez E. coli DNAzyme rozszczepiający RNA (EC1), 5 ureazy i kulki magnetyczne. DNAzymy odnoszą się do syntetycznych jednoniciowych cząsteczek DNA o aktywności katalitycznej. 6 Można je wyizolować z pul DNA o losowej sekwencji za pomocą selekcji in vitro. 7,8 Są bardzo stabilne i mogą być wytwarzane w sposób ekonomiczny przy użyciu wysokowydajnej zautomatyzowanej syntezy DNA. 9 Z tych powodów DNAzymy, a w szczególności DNAzymy rozszczepiające RNA, były szeroko badane pod kątem zastosowań biosensorycznych. 6,10,11 Czujniki DNA rozszczepiające RNA zostały opracowane do wykrywania jonów metali, 12-16 małych cząsteczek,17,18 patogenów bakteryjnych5,19-21 i komórek rakowych. 22 Biorąc pod uwagę dużą dostępność indukowanych przez cel DNAzymów rozszczepiających RNA, każdy test wykorzystujący DNAzyme może być potencjalnie rozszerzony w celu wykrycia różnorodnego zakresu analitów.

Ureaza została wybrana ze względu na jej zdolność do hydrolizy mocznika do amoniaku,23,24 powodując wzrost pH. Ureaza jest również wysoce wydajna, stabilna i podatna na koniugację z innymi biomolekułami. Dlatego postulowaliśmy, że koniugat DNAzymu rozszczepienia RNA z ureazą pozwoliłby na użycie papierka lakmusowego do wykrywania innych celów. 5

Działanie DNAzymu rozszczepiającego RNA jest przekazywane do wzrostu pH za pośrednictwem ureazy za pomocą kulek magnetycznych, które są unieruchomione za pomocą koniugatu DNAzyme-ureaza. Ponieważ aktywność badanego DNAzymu jest ściśle zależna od E. coli, obecność tej bakterii w roztworze testowym spowoduje uwolnienie ureazy z kulek magnetycznych do roztworu, który jest następnie pobierany i wykorzystywany do hydrolizy mocznika w roztworze reporterowym zawierającym barwnik wrażliwy na pH. Końcowym wynikiem tej procedury jest zmiana koloru, którą można wygodnie zgłosić za pomocą barwnika lub bibuły pH.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie odczynników i

  1. 0,5 M Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)
    1. W zlewce o pojemności 2 litrów dodać 186,1 g EDTA do 800 ml dejonizowanej wody destylowanej (ddH2O). Dostosuj pH roztworu do 8,0 za pomocą granulek NaOH. Dodać ddH2O do końcowej objętości 1,0 l i przenieść roztwór do szklanej butelki nadającej się do sterylizacji w autoklawie i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  2. 10× Trójboran EDTA (10x TBE)
    1. Do końcowej objętości 4 l plastikowej zlewki dodać 432 g Tris-Base, 200 g kwasu borowego, 80 ml 0,5 M EDTA (pH 8,0) i ddH2O do końcowej objętości 4 l. Mieszać za pomocą mieszadła, aż wszystkie składniki się rozpuszczą. Przenieść roztwór do szklanych butelek o pojemności 1 l w celu sterylizacji w autoklawie i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  3. 10% denaturacji poliakryloamidu
    1. Do plastikowej zlewki o pojemności 4 l dodać 1681,7 g mocznika, 400 ml 10x TBE, 1 l 40% roztworu akryloamidu/bisakryloamidu (29:1) iddH2O, aż końcowa objętość wyniesie 4 l. Mieszać za pomocą mieszadła, aż mocznik się rozpuści. Przenieść roztwór do butelek ze szkła oranżowego o pojemności 1 l i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  4. 2x Bufor ładujący żel (2x GLB)
    1. Do szklanej zlewki o pojemności 200 ml dodać 44 g mocznika, 8 g sacharozy, 10 mg błękitu bromofenolowego, 10 mg cyjanolu ksylenu FF, 400 μl 10% dodecylosiarczanu sodu i 4 ml 10× TBE. Dodać ddH2O do końcowej objętości 40 ml i rozpuścić składniki przez łagodne ogrzewanie w temperaturze 50 °C, mieszając za pomocą mieszadła magnetycznego. Przenieść 1 ml porcji do probówek do mikrofug o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Wcześniejsze użycie wymaga krótkiego podgrzania w temperaturze 90 °C w celu ponownego rozpuszczenia ciał stałych.
  5. 1 M chlorowodorek trisu (Tris-HCl) (pH 7,5)
    1. Do szklanej butelki dodać 12,1 g Tris-base i 70 ml ddH2O i mieszać aż do rozpuszczenia ciała stałego. Doprowadzić pH do 7,5 za pomocą 1 M kwasu solnego (HCl). Dodać ddH2O do końcowej objętości 100 ml, umieścić w autoklawie i przechowywać w temperaturze 4 °C
  6. 5 M chlorek sodu (NaCl)
    1. W szklanej butelce rozpuścić 58,4 g NaCl w 150 ml ddH2O. Zwiększyć objętość do 200 ml za pomocą ddH2O. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
  7. Bufor elucyjny DNA
    1. W szklanej butelce wymieszaj 2,0 ml 1 M Tris-HCl (pH 7,5), 8,0 ml 5 M NaCl i 0,4 ml 0,5 M EDTA (pH 8,0). Ustawić objętość do 200 ml za pomocą ddH2O, przelać do autoklawu i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  8. 1 M kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy (HEPES) (pH 7,4)
    1. W szklanej butelce rozpuścić 2,38 g HEPES w 80 ml ddH2O. Doprowadzić pH do 7,4 za pomocą 5 N NaOH i dodać ddH2O do końcowej objętości 100 ml.
  9. 1 M chlorek magnezu (MgCl2)
    1. Do szklanej butelki dodać 2,03 g MgCl 2-6H2O i doprowadzićobjętość do 100 ml za pomocąddH2O.
  10. Bufor reakcyjny (RB)
    1. W stożkowej probówce o pojemności 50 ml dodać 50 μl 1 M HEPES (pH 7,4), 1,5 ml 5 M NaCl, 0,75 ml 1 M MgCl2 i 5 μl Tween-20. Dodać ddH2O do końcowej objętości 50 ml. Wymieszać roztwór i przefiltrować do innej stożkowej rurki za pomocą filtra napędzanego strzykawką (0,22 μm) i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
  11. Bufor wiążący (BB)
    1. Do stożkowej probówki o pojemności 50 ml dodać 500 μl 1 M Tris-HCl (pH 7,5), 8,8 g NaCl, 50 μl 1 M MgCl2 i 5 μl Tween 20. Dodać ddH2O do końcowej objętości 50 ml. Wymieszać roztwór i przefiltrować do innej stożkowej rurki za pomocą filtra napędzanego strzykawką (0,22 μm) i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
  12. Roztwór podłoża (SS)
    1. Do stożkowej probówki o pojemności 50 ml dodać 5,8 g NaCl, 3 ml 1 M MgCl2, 1,5 g mocznika i 40 ml ddH2O. Dostosować pH roztworu do 5,0 za pomocą 10 mM HCl. Ponieważ roztwór nie jest buforowany, należy ostrożnie dostosować pH za pomocą HCl poprzez dodanie małych podwielokrotności HCl. Dodać ddH2O do końcowej objętości 50 ml.
    2. Wymieszać roztwór i przefiltrować do innej stożkowej rurki za pomocą filtra napędzanego strzykawką (0,22 μm) i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
  13. Rosół Luria Bertani (LB)
    1. W zlewce rozpuścić 20,0 g proszku LB w 1 l ddH2O. Przenieść do szklanej butelki, autoklawu i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  14. 1,5% agar LB
    1. W kolbie o pojemności 250 ml dodać 1,5 g agaru i 100 ml bulionu LB. Autoklaw i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  15. Płytki agarowe
    1. Ponownie rozpuść agar LB w kuchence mikrofalowej i schłodzić roztwór do ~50 °C. Wlej roztwór do szalek Petriego, tworząc ~5 płytek i pozwól im zestalić się.

2. Synteza i oczyszczanie DNAzymu EC1 reagującego na E. coli

  1. Synteza EC1 przez ligację enzymatyczną za pośrednictwem matrycy
    1. Oczyść komercyjnie zsyntetyzowane oligonukleotydy BS1, DE1 i T1 (sekwencje podane w tabeli 1) przez 10% denaturację elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (dPAGE) zgodnie ze standardowymi protokołami.
    2. Przygotuj zapas 100 μM BS1, DE1 i T1. Przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu użycia.
    3. W probówce do mikrofuge o pojemności 1,5 ml dodaj 38,5 μl ddH2O, 5 μl DE1 i 5 μl 10x buforu reakcyjnego kinazy polinukleotydowej T4 dostarczonego przez dostawcę enzymu (500 mM Tris-HCl (pH 7,6), 100 mM MgCl2, 50 mM ditiotreitol (DTT), 1,0 mM spermidyna).
    4. Dodać 1 μl trifosforanu adenozyny (ATP) (100 mM). Dodać 5 jednostek kinazy polinukleotydowej T4 (10 U/μl). Wymieszać, ostrożnie pipetując mieszaninę reakcyjną.
    5. Inkubować reakcję w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
    6. Ugasić reakcję przez ogrzewanie do temperatury 90 °C przez 5 minut.
    7. Dodać 118 μl ddH2O, 5 μl BS1 i 5 μl T1. Podgrzewać reakcję do 90 °C przez 2 minuty, a następnie schłodzić do temperatury pokojowej przez 10 minut.
    8. Dodać 20 μl 10× buforu reakcyjnego ligazy DNA T4 dostarczonego przez dostawcę enzymu (400 mM Tris-HCl (pH 7,8), 100 mM MgCl2, 100 mM DTT, 5 mM ATP). Dodać 10 jednostek ligazy DNA T4 (5 U/μl) i ostrożnie wymieszać pipetując.
    9. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.
    10. Dodać 20 μl 3 M octanu sodu (NaOAc) (pH 5,2), 500 μl zimnego 100% etanolu. Wymieszaj roztwór przez wirowanie i umieść probówkę w zamrażarce o temperaturze -20 °C na 30 minut.
    11. Odwirować mikroosad o stężeniu 20 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie usunąć supernatant przez pipetowanie.
    12. Przemyć granulat zimnym 70% etanolem i ponownie odwirować przy 20 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Ponownie usunąć supernatant i wysuszyć osad w próżni przez 10 minut.
    13. Ponownie zawiesić DNA za pomocą 15 μl ddH2O, a następnie dodać 15 μl 2x GLB.
    14. Energicznie wirować i podgrzewać do 90 °C przez 2 minuty. Oczyść DNA na całej długości o 10% dPAGE, jak opisano poniżej.
  2. Ustawianie 10% dPAGE
    1. Wyczyść dwie szklane płytki (jedną pełną i jedną z karbem), dwie przekładki o grubości 0.75 mm i 12-dołkowy grzebień. Połóż jedną szklaną płytkę na płaskiej powierzchni z dwoma przekładkami z każdej strony i karbowaną płytką na górze. Zesfnij ze sobą dwie płyty za pomocą czterech klipsów dostarczonych przez dostawcę.
    2. Do plastikowej zlewki o pojemności 150 ml wlej 40 ml 10% dPAGE, 40 μl tetrametyloetylenodiaminy (TEMED) i 400 μl 10% nadsiarczanu amonu (APS). Wymieszaj składniki i powoli wlej roztwór między płytki.
    3. Włóż grzebień, a następnie pozwól żelowi polimeryzować przez 10 minut. Po polimeryzacji żelu powoli wyjmij grzebień i przepłucz studzienki ddH2O.
    4. Zamontuj płytki na aparacie do elektroforezy żelowej. Użyj metalowej płytki, aby rozproszyć wytworzone ciepło, aby zapobiec przegrzaniu.
    5. Wlej 1x TBE na górną i dolną komorę i upewnij się, że studzienki są dobrze zanurzone w buforze. Przepłukać studzienki 1x TBE za pomocą pipety lub strzykawki.
    6. Ustawić aparaturę tak, aby pracowała przy natężeniu 35 mA i uruchamiać ją wstępnie przez 15 minut przed załadowaniem próbek.
  3. Elucja ligowanego EC1 od 10% dPAGE
    1. Postępując zgodnie z krokiem 2.2.6, uruchom żel pod ciśnieniem 35 mA, aż dolny barwnik (błękit bromofenolowy) dotrze do dna szklanej płytki. Powinno to zająć około 1,5 godziny. Wyłącz zasilanie i wyjmij płytki z urządzenia.
    2. Połóż talerze na kilku arkuszach ręczników papierowych i ostrożnie usuń przekładki ze szklanych płytek. Ostrożnie zdejmij górną szklaną płytkę i owiń żel folią.
    3. Odwróć żel, aby usunąć drugą szklaną płytkę i ponownie przykryj folią. Uważaj, aby uniknąć zagnieceń folii.
    4. Wizualizacja ligowanego produktu za pomocą cieniowania UV (260 nm), które wytworzy 4 odrębne prążki DNA (w pełni ligowane EC1, DE1, BS1 i T1).
    5. Wyciąć górny pasek (EC1) sterylną żyletką i przenieść do probówki o pojemności 1,5 ml. Rozdrobnij żel sterylną końcówką pipety (końcówka o pojemności 200 μl), aż zamieni się w delikatną pastę. Dodać 550 μl buforu elucyjnego DNA, przykryć probówkę folią aluminiową w celu ochrony osadzonego fluoroforu i wstrząsać przez 15 minut.
    6. Odwirować roztwór żelu o stężeniu 20 000 x g przez 5 minut i ostrożnie przenieść 400 μl supernatantu do kolejnej probówki o pojemności 1,5 ml. Należy unikać pobierania kawałków żelu podczas pipetowania.
    7. Do probówki do mikrodyminacji z przeniesionym supernatantem dodać 40 μl 3 M NaOAc (pH 5,2) i 1,0 ml zimnego 100% etanolu. Wymieszaj roztwór przez wirowanie i umieść probówkę w zamrażarce o temperaturze -20 °C na 30 minut.
    8. Odwirować mikroosad o stężeniu 20 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie usunąć supernatant przez pipetowanie.
    9. Przemyć granulat zimnym 70% etanolem i ponownie odwirować przy 20 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Ponownie usunąć supernatant i wysuszyć osad w próżni przez 10 minut.
    10. Oznaczyć stężenie EC1, mierząc absorbancję promieniowania UV przy 260 nm. Sporządzić zapas o wielkości 10 μM i przechowywać próbkę w temperaturze -20 °C do czasu użycia.

3. Koniugacja ureazy z DNA

  1. Przygotowanie 4-(N-maleimimimetylo)cykloheksano-1-karboksylanu sukcynimidylu (SMCC) Zapas
    1. Rozpuścić 1 mg SMCC w 676 μl DMSO. Wiruj i umieść na lodzie do użycia.
  2. Przygotowanie bulionu ureazy
    1. Rozpuścić 1 mg ureazy w 1 ml 1× PBS (bez Mg2+ lub Ca2+). Układać na lodzie do czasu użycia.
      UWAGA: Skrystalizowana ureaza rozpuszcza się powoli i konieczne jest delikatne mieszanie, aby uniknąć denaturacji.
  3. Synteza ureazy-DNA (UrDNA)
    1. Dodać 10 μl 100 μM LD1 do probówki do mikrofuge o pojemności 2,5 ml. Dodaj 140 μl ddH2O, 40 μl 10x PBS i wiruj.
    2. Dodać 80,5 μl bulionu SMCC, 159,5 μl DMSO, wirować i krótko odwirować za pomocą wirówki stołowej.
    3. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 60 minut. Unikać kondensacji pary wodnej pod nakrętką do mikrofuge.
    4. Dodać 200 μl 1x PBS, 60 μl 3 M NaOAc (pH 5,2) i 1,5 ml zimnego 100% etanolu. Wymieszać roztwór przez wirowanie i inkubować w temperaturze -20 °C przez 30 minut.
    5. Odwirować roztwór o stężeniu 20 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i wysuszyć osad w próżni. Unikaj przesuszenia.
    6. Do wysuszonego osadu dodać 400 μl bulazy ureazy i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 godzin.
    7. Przenieść 200 μl surowego koniugatu do wstępnie umytej kolumny filtra odśrodkowego o mocy 100 tys. MWCO. Odwirować kolumnę przy 14 000 x g przez 5 minut.
    8. Pozostałe 200 μl surowego koniugatu przenieść do kolumny i odwirować przy 14 000 x g przez 5 minut. Wyjąć kolumnę i umieścić ją do góry nogami w nowej probówce do mikrofugowania o pojemności 2,0 ml ("probówka zbiorcza").
    9. Odwirować probówkę zbiorczą (z odwróconą kolumną) o sile 1 000 x g przez 2 minuty. Wyjąć probówkę zbiorczą i dodać 30 μl 1x PBS do kolumny odśrodkowej w celu przepłukania membrany w celu dodatkowego odzysku koniugatów.
    10. Ponownie odwróć kolumnę i umieść ją z powrotem w probówce zbiorczej. Odwirować probówkę zbiorczą (z odwróconą kolumną) o masie 1 000 x g przez 2 minuty. Usuń kolumnę i wyrzuć ją.
    11. Przechowywać UrDNA w temperaturze 4 °C do czasu użycia.

4. Montaż EC1 i UrDNA na koralikach magnetycznych

  1. Dobrze wymieszaj bulion z kulkami magnetycznymi (MB) i przenieś 100 μl zawiesiny MB do probówki do mikrofugi o pojemności 1,5 ml. Umieść probówkę do mikrofuge na magnetycznym uchwycie stojaka w celu odizolowania MB.
  2. Usunąć supernatant przez pipetowanie i dodać 150 μl buforu wiążącego (BB) do probówki. Wyjąć probówkę z uchwytu i ostrożnie postukać w nią, aby zawiesić MB do jednorodnego roztworu. Unikaj rozpryskiwania zawieszenia na górną część rurki lub nasadki. Jeśli tak się stanie, użyj wirówki stołowej, aby na krótko odwirować pozostałość z powrotem do zawiesiny.
  3. Powtórz krok 4.2 jeszcze dwa razy.
  4. Do tej zawiesiny dodać 10 μl 10 μM EC1. Ostrożnie wymieszaj, stukając w rurkę.
  5. Inkubować roztwór, lekko wstrząsając przez 30 minut. Postukaj w probówkę co 2-3 minuty, aby uniknąć wytrącania się MB.
  6. Umieść probówkę do mikrofuge z powrotem na stojaku magnetycznym, aby odizolować MB i usunąć supernatant przez pipetowanie. Umyj MB trzykrotnie 150 μl BB (zgodnie z opisem w kroku 4.2).
  7. Po zakończeniu prania zawiesić MB w sumie 150 μl kulki. Do tego roztworu dodać 15 μl UrDNA i podgrzewać roztwór do 45 °C przez 2 minuty. Schłodzić roztwór do temperatury pokojowej i inkubować przez 2 godziny.
  8. Umieść probówkę do mikrofuge z powrotem na stojaku magnetycznym, aby odizolować MB i usunąć supernatant przez pipetowanie.
  9. Dodać 100 μl buforu reakcyjnego (RB). Wyjmij rurkę do mikrofuge ze stojaka magnetycznego i ostrożnie ponownie zawieś MB.
  10. Umyj MB jeszcze trzy razy, powtarzając krok 4.9.
    UWAGA: Przemyty supernatant można szybko przetestować w celu ustalenia, czy niezhybrydyzowany UrDNA jest nadal obecny, co może skutkować fałszywie dodatnim sygnałem. Test można przeprowadzić, dodając do roztworu myjącego 10 μl 50 mM mocznika i 10 μl 0,04% czerwieni fenolowej. Kontynuuj mycie MB, aż roztwór myjący nie spowoduje zmiany koloru. Zawiesinę o objętości 100 μl przechowuje się w temperaturze 4 °C do czasu użycia.

5. Przygotowanie komórek bakteryjnych20

  1. Hodowla E. coli z zapasów
    1. Płytkę E. coli K12 (MG1655) na płytkach agarowych LB z glicerolu pod płomieniem lub w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
    2. Używając sterylnej końcówki pipety, delikatnie dotknij bulionu glicerolowego i delikatnie rozprowadź smugi na powierzchni płytki agarowej, aby uniknąć przebicia agaru LB.
    3. Odwrócić płytkę z prążkami i inkubować w temperaturze 37 °C przez 14 godzin.
    4. Uszczelnić płytkę preparatem Parafilm i przechowywać w temperaturze 4 °C przez maksymalnie 3 tygodnie.
  2. Hodowla E. coli do liczenia komórek
    1. W sterylnej probówce hodowlanej o pojemności 14 ml wlej 2 ml bulionu LB.
    2. Używając sterylnej końcówki pipety, wybierz pojedynczą kolonię z płytki agarowej z prążkami przygotowanej w kroku 5.1 i przenieś ją do probówki hodowlanej.
    3. Inkubować kulturę w temperaturze 37 °C i wstrząsać z prędkością 230 obr./min przez 14 godzin.
    4. Seryjnie rozcieńczać kulturę bakteryjną w 10-krotnych odstępach czasu.
    5. Dla każdej rozcieńczonej próbki równomiernie ułożyć pięć podwielokrotności 100 μl na oddzielnych płytkach agarowych LB. Odwrócić płytki i inkubować w temperaturze 37 °C przez 14 godzin.
    6. Policz komórki w każdej próbce, aby uzyskać średnie stężenie komórek w każdym rozcieńczeniu.
      UWAGA: 107 komórek jest często używanych do skonfigurowania referencyjnego testu lakmusowego dla E. coli, ponieważ ten poziom E. coli może wywołać szybką zmianę koloru. Jednak prawidłowo wykonany test lakmusowy może wykryć zaledwie 500 komórek, jak omówiono w sekcji Wyniki.
  3. Przygotowanie komórek E. coli do badania
    1. Aby uzyskać pożądaną zawiesinę komórek, przenieś 1 ml bulionu hodowlanego do probówki do mikrofuge o pojemności 1,5 ml.
    2. Odwirować komórki przy 6 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie usunąć supernatant, nie naruszając osadu komórkowego.
    3. Dodać 10 μl buforu reakcyjnego do osadu komórkowego i ponownie zawiesić komórki. Sonikować zawiesinę komórek przez 5 minut. Przenieść zawiesinę komórek do pojemnika na lód na 5 minut.
    4. Sonikować zawiesinę komórek przez kolejne 5 minut.
    5. Odwirować zawiesinę komórek o sile 13 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Do badania użyć supernatantu (10 μl).

6. Test lakmusowy

  1. W probówce do mikrofugi o pojemności 1,5 ml umyj wstępnie probówkę, dodając i wirując 100 μl buforu reakcyjnego (RB) w probówce do mikrofugi i wyrzucając bufor.
  2. Przenieść 15 μl zmontowanego EC1 (protokół 4) do umytej probówki do mikrofuge.
  3. Umyj kulki magnetyczne, umieszczając rurkę do mikrofuge na stojaku magnetycznym. Usunąć szwadron przez pipetowanie. Wyjmij probówkę do mikrofuge ze stojaka, dodaj 100 μl RB i ostrożnie ponownie zawieś kulki magnetyczne.
  4. Umyj płytę główną komputera jeszcze dwa razy, powtarzając krok 6.3.
  5. Umieścić probówkę do mikrofuge z powrotem na stojaku magnetycznym, usunąć supernatant i dodać 10 μl próbki E. coli przygotowanej z kroku 5.3.
  6. Ostrożnie wymieszaj próbkę i kulki magnetyczne, delikatnie stukając w probówkę do mikrofuge.
  7. Inkubować reakcję w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
  8. Do reakcji dodać 90 μl ddH2O i umieścić probówkę do mikrofuge na stojaku magnetycznym.
  9. Po około 3 minutach separacji magnetycznej ostrożnie przenieść 85 μl supernatantu do probówki o pojemności 0,5 ml. Nadmiar należy powoli odciągać, aby uniknąć gromadzenia się kulek magnetycznych.
  10. Do powyższej probówki do mikrofuge dodaj 15 μl 0,04% czerwieni fenolowej i 100 μl roztworu substratu.
  11. Rób zdjęcie w określonych odstępach czasu, aby zarejestrować zmianę kolorów.
    UWAGA: Zmianę pH można również monitorować za pomocą pH-metru z mikroelektrodą. Początkowe pH powinno wynosić około 5,2-5,5 (roztwór jest żółty). Jeśli nie, roztwór można dostosować, dodając 1 mM bufor octanowy pH 5,0).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zasada działania bakteryjnego testu lakmusowego została wyjaśniona na Rysunku 1. W teście wykorzystuje się trzy kluczowe materiały: rozcinający RNA DNAzym, który jest aktywowany przez konkretną bakterię, ureazę oraz kuleczki magnetyczne. DNAzym służy jako element molekularnego rozpoznawania, aby uzyskać wysoką specyficzność wykrywania interesującej bakterii. Ureaza i kuleczki magnetyczne służą do transdukcji sygnału aktywności rozcinania RNA przez DNAzym. Proces ten poleg...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przełożenie działania aktywności rozszczepienia RNA DNAzymu reagującego na bakterie na test lakmusowy jest możliwe dzięki zastosowaniu ureazy i separacji magnetycznej, jak pokazano na rysunku 1. Chociaż demonstracja zmodyfikowanego testu lakmusowego do wykrywania bakterii odbywa się za pomocą DNAzymu zależnego od E. coli rozszczepiającego RNA,5,19,20 projekt można ogólnie rozszerzyć dla dowolnego DNAzymu rozszczepiającego RNA. Biorąc pod uwagę dużą dostępność DNAzymów rozszczepiającyc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Finansowanie tego projektu badawczego zostało zapewnione przez Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) poprzez Discovery Grant dla YL.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)VWR AMRESCO0105
Granulki wodorotlenku sodu (NaOH)BIO BASIC CANADA INC.SB6789
Tris-baseVWR AMRESCO0497
Kwas borowyAMRESCO0588
MocznikVWR AMRESCOM123
40% roztwór akrylamidu/bisakryloamidu (29:1)BIO BASIC CANADA INC.A0007
SacharozaBioshop Kanada inc.SUC507
Błękit bromofenolowyBioshop Kanada inc.BRO777
Xylenecyanol FFSIGMA-ALDRICHX-4126
10% dodecylosiarczan soduBioshop Canada inc.SDS001
Kwas solny (HCl)CALEDON LABORATORIES LTD6026
Chlorek sodu (NaCl)Bioshop Canada inc.SOD001
Kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy (HEPES)Bioshop Canada inc.HEP001
Chlorek magnezu (II) sześciowodnyVWR AMRESCO0288
Tween 20Bioshop Canada inc.TW508
Adenozynotrifosforan (ATP)AMRESCO0220
Octan sodu trójwodny (NaOAc)SIGMA-ALDRICHS8625
Alkohole etyloweP016EAAN
Tetrametylenowodorodiamina (TEMED)AMRESCO0761
10% nadsiarczan amonu (APS)BIO BASIC CANADA INC.AB0072
Sukcynimidyl 4-(N-maleimidometylo)cykloheksano-1-karboksylan (SMCC)ThermoFisher SCIENTIFIC22360
Dimetylosulfotlenek (DMSO)CALEDON LABORATORIES803540
UreazaSIGMA-ALDRICHU0251
1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)ThermoFisher SCIENTIFIC70011-069
0,04% Czerwień fenolowaSIGMA-ALDRICHP3532
10x bufor reakcyjny kinazy polinukleotydowejT4 Lucigen30061-1
10x bufor reakcyjny ligazy DNA T4Bio Basics CanadaB1122-B
Ligaza DNA T4 (5 U/μ l)Thermo Fischer ScientificB1122
Luria Bertani (LB) BulionAMRESCOJ106
AgarAMRESCOJ637
Kinaza polinukleotydowa T4 (10 U/μ l)Lucigen30061-1
E. coli K12 (MG1655)ATCCATCC700926
WirówkaBeckman Coulter, Inc.
Płytki szklaneCBS scientificngp-250nr
grubości 0,75 mm przekładkiCBS scientificVGS-0725r
12-dołkowy grzebieńCBS scientificVGC-7512
Lampa UVUVP95-0017-09
Spektrofotometr (NanoVue)GE HealthcareN/A
Metalowa płytaCBS naukowyCPA165-250
VortexVWR International58816-123
Aparatura do elektroforezy żelowejCBS scientificASG-250
Szalki PetriegoVWR International25384-342
100 kDa Filtry odśrodkowe MWCOEMD MilliporeUFC510024
Magnetic Bead (BioMag)Bangs Laboratories IncBM568
Magnetyczny stojak separacyjnyNew England BioLabsS1506S
Rurki do mikrofugSarstedt72.69
Filtr strzykawkowy (0,22 i #956; m)VWR International28145-501
14 ml probówka hodowlanaVWR International60818-725
Inkubator do hodowli komórkowychEppendorf ScientificM13520000
Branson Myjka ultradźwiękowaBransonN/A
Camera (Canon Powershot G11)CanonN/A
50 ml rurka stożkowaVWR InternationalNumer katalogowy: 89004-364
handlowe 392187 o

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Daar, A. S., et al. Top ten biotechnologies for improving health in developing countries. Nat. Genet. 32, 229-232 (2002).
  2. Newman, J. D., Turner, A. P. Home blood glucose biosensors: a commercial perspective. Biosens. Bioelectron. 20, 2435-2453 (2005).
  3. Turner, A. P. Biosensors: sense and sensibility. Chem. Soc. Rev. 42, 3184-3196 (2013).
  4. Tram, K., Kanda, P., Salena, B. J., Huan, S. Y., Li, Y. F. Translating Bacterial Detection by DNAzymes into a Litmus Test. Angew. Chem. Int. Ed. 53, 12799-12802 (2014).
  5. Ali, M. M., Aguirre, S. D., Lazim, H., Li, Y. Fluorogenic DNAzyme probes as bacterial indicators. Angew. Chem. Int. Ed. 50, 3751-3754 (2011).
  6. Schlosser, K., Li, Y. Biologically inspired synthetic enzymes made from DNA. Chem. Biol. 16, 311-322 (2009).
  7. Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligand by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249, 505-510 (1990).
  8. Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346, 818-822 (1990).
  9. Breaker, R. R. Making catalytic DNAs. Science. 290, 2095-2096 (2000).
  10. Liu, J., Cao, Z., Lu, Y. Functional nucleic acid sensors. Chem. Rev. 109, 1948-1998 (2009).
  11. Navani, N. K., Li, Y. Nucleic acid aptamers and enzymes as sensors. Curr. Opin. Chem. Biol. 10, 272-281 (2006).
  12. Li, J., Lu, Y. A highly sensitive and selective catalytic DNA biosensor for lead ions. J. Am. Chem. Soc. 122, 10466-10467 (2000).
  13. Liu, J., Lu, Y. A colorimetric lead biosensor using DNAzyme-directed assembly of gold nanoparticles. J. Am. Chem. Soc. 125, 6642-6643 (2003).
  14. Liu, Z., Mei, S. H. J., Brennan, J. D., Li, Y. Assemblage of signaling DNA enzymes with intriguing metal specificity and pH dependence. J. Am. Chem. Soc. 125, 7539-7545 (2003).
  15. Liu, J., et al. A catalytic beacon sensor for uranium with parts-per-trillion sensitivity and millionfold selectivity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 2056-2061 (2007).
  16. Huang, P. J., Vazin, M., Liu, J. In vitro selection of a new lanthanide-dependent DNAzyme for ratiometric sensing lanthanides. Anal. Chem. 86, 9993-9999 (2014).
  17. Chiuman, W., Li, Y. Simple fluorescent sensors engineered with catalytic DNA 'MgZ' based on a non-classic allosteric design. PLoS One. 2, e1224(2007).
  18. Xiang, Y., Lu, Y. Using personal glucose meters and functional DNA sensors to quantify a variety of analytical targets. Nat. Chem. 3, 697-703 (2011).
  19. Aguirre, S. D., Ali, M. M., Salena, B. J., Li, Y. A sensitive DNA enzyme-based fluorescent assay for bacterial detection. Biomolecules. 3, 563-577 (2013).
  20. Aguirre, S. D., Ali, M. M., Kanda, P., Li, Y. F. Detection of Bacteria Using Fluorogenic DNAzymes. J. Vis. Exp. (63), e3961(2012).
  21. Shen, Z., et al. A catalytic DNA activated by a specific strain of bacterial pathogen. Angew. Chem. Int. Ed. 54, (2015).
  22. He, S., et al. Highly specific recognition of breast tumors by an RNA-cleaving fluorogenic DNAzyme probe. Anal. Chem. 87, 569-577 (2015).
  23. Sumner, J. B., Hand, D. B. Isoelectric point of crystalline urease. J. Am. Chem. Soc. 51, 1255-1260 (1929).
  24. Karplus, P. A., Pearson, M., Hausinger, R. P. 70 Years of crystalline urease: What have we learned. Acc. Chem. Res. 30, 330-337 (1997).
  25. Omiccioli, E., Amagliani, G., Brandi, G., Magnani, M. A new platform for Real-Time PCR detection of Salmonella spp., Listeria monocytogenes and Escherichia coli O157 in milk. Food Microbiol. 26, 615-622 (2009).
  26. Cui, S., Schroeder, C. M., Zhang, D. Y., Meng, J. Rapid sample preparation method for PCR-based detection of Escherichia coli O157:H7 in ground beef. J. Appl. Microbiol. 95, 129-134 (2003).
  27. Ibekwe, A. M., Watt, P. M., Grieve, C. M., Sharma, V. K., Lyons, S. R. Multiplex fluorogenic real-time PCR for detection and quantification of Escherichia coli O157:H7 in dairy wastewater wetlands. Appl. Environ. Microbiol. 68, 4853-4862 (2002).
  28. Strachan, N. J., Ogden, I. D. A sensitive microsphere coagulation ELISA for Escherichia coli O157:H7 using Russell's viper venom. FEMS Microbiol Lett. 186, 79-84 (2000).
  29. de Boer, E., Beumer, R. R. Methodology for detection and typing of foodborne microorganisms. Int. J. Food Microbiol. 50, 119-130 (1999).
  30. Gracias, K. S., McKillip, J. L. A review of conventional detection and enumeration methods for pathogenic bacteria in food. Can. J. Microbiol. 50, 883-890 (2004).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Kolorymetryczna detekcja bakteriirozcinaj cy RNA DNAzymaktywno ureazykulki magnetycznedetekcja E coliwska nik pHhydroliza mocznikadetekcja patogen wbadanie w d rodowiskowych

Powiązane artykuły