Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Eksperymentalne zakażenie Listeria monocytogenes jako model do badania odpowiedzi na interferon-γ gospodarza

12.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54554

⸱

16 listopada 2016

 ,  ,  ,  , 
1Department of Immunology, University of Toronto, 2Toronto General Research Institute, University Health Network, 3Women's College Research Institute

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje, jak zaszczepić myszy C57BL/6J szczepem EGD Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) i zmierzyć odpowiedzi interferonu γ (IFN-γ) przez komórki NK (natural killer), limfocyty T (NKT) i adaptacyjne limfocyty T po zakażeniu. Protokół ten opisuje również, w jaki sposób przeprowadzać badania przeżycia u myszy po zakażeniu zmodyfikowaną dawką LD50 patogenu.

Streszczenie

L. monocytogenes to bakteria Gram-dodatnia, która jest przyczyną chorób przenoszonych przez żywność u ludzi. Eksperymentalne zakażenie myszy tym patogenem dostarczyło wielu informacji na temat roli wrodzonych i nabytych komórek odpornościowych oraz specyficznych cytokin w odporności gospodarza przeciwko patogenom wewnątrzkomórkowym. Wytwarzanie IFN-γ przez komórki wrodzone podczas subletalnego zakażenia L. monocytogenes jest ważne dla aktywacji makrofagów i wczesnej kontroli patogenu1-3. Ponadto wytwarzanie IFN-γ przez adaptacyjne limfocyty pamięci jest ważne dla pobudzania aktywacji komórek wrodzonych po ponownym zakażeniu4. Model zakażenia L. monocytogenes służy zatem jako doskonałe narzędzie do zbadania, czy nowe terapie, które mają na celu zwiększenie produkcji IFN-γ, mają wpływ na odpowiedzi IFN-γ in vivo i mają produktywne efekty biologiczne, takie jak zwiększenie klirensu bakteryjnego lub poprawa przeżywalności myszy po zakażeniu. Opisano tutaj podstawowy protokół przeprowadzania zakażeń wewnątrzotrzewnowych myszy C57BL / 6J szczepem EGD L. monocytogenes oraz pomiaru produkcji IFN-γ przez komórki NK, komórki NKT i limfocyty adaptacyjne za pomocą cytometrii przepływowej. Ponadto opisano procedury mające na celu: (1) wyhodowanie i przygotowanie bakterii do zaszczepienia, (2) pomiar obciążenia bakteryjnego w śledzionie i wątrobie oraz (3) pomiar przeżywalności zwierząt do punktów końcowych. Przedstawiono również reprezentatywne dane w celu zilustrowania, w jaki sposób ten model infekcji może być wykorzystany do testowania wpływu określonych czynników na odpowiedzi IFN-γ na L. monocytogenes i przeżywalność myszy z tej infekcji.

Wprowadzenie

IFN-γ to cytokina, która jest kluczowa dla pośredniczenia w odporności przeciwko wewnątrzkomórkowym patogenom i kontrolowania wzrostu guza5. Znaczenie tej cytokiny w oporności bakterii jest widoczne w obserwacji, że ludzie z mutacjami w szlaku sygnałowym IFN-γ są bardzo podatni na zakażenie prątkami i salmonellami6. Podobnie myszy z niedoborem IFN-γ lub receptora IFN-γ wykazują defekty w odporności na prątki7-9 i inne patogeny wewnątrzkomórkowe, w tym L. monocytogenes10,11, Leishmania major12, Salmonella typhimurium13 i niektóre wirusy11. Oprócz zwalczania patogenów, IFN-γ odgrywa kluczową rolę w obronie gospodarza przed nowotworami14. Chociaż wyższa produkcja IFN-γ jest korzystna w kontekście infekcji lub raka, przedłużona produkcja tej cytokiny została powiązana z rozwojem autoimmunizacji układowej15-17 i przyspieszeniem cukrzycy typu I w nieotyłym modelu myszy z cukrzycą18.

Głównymi źródłami IFN-γ są komórki NK, komórki NKT, limfocyty T γδ, limfocyty T pomocnicze 1 (Th1) oraz cytotoksyczne limfocyty T (CTL)5,19,20. IFN-γ wzmacnia zarówno odporność wrodzoną, jak i nabytą poprzez: (1) regulację w górę ekspresji głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC) klasy I i II, (2) zwiększenie ekspresji cząsteczek kostymulujących na komórkach prezentujących antygen, (3) zwiększenie fagocytozy makrofagów oraz produkcji cytokin prozapalnych i czynników bakteriobójczych (np. tlenku azotu i reaktywnych form tlenu), (4) promowanie różnicowania naiwnych CD4+ Limfocyty T do komórek efektorowych Th1, (5) promowanie przełączania klasy przeciwciał na immunoglobulinę (Ig) 2a i IgG3 (u myszy), (6) indukowanie produkcji chemokin w celu rekrutacji komórek odpornościowych do miejsc infekcji oraz (7) wzmacnianie odpowiedzi komórek NK i CTL5,19. Biorąc pod uwagę kluczowe znaczenie IFN-γ w odpowiedzi gospodarza na patogeny i nowotwory, rekombinowany IFN-γ został przetestowany w leczeniu różnych infekcji i nowotworów złośliwych (przegląd w19). Ponieważ jednak ogólnoustrojowe podawanie IFN-γ lub interleukiny promującej Th1 (IL-12) wiąże się ze skutkami ubocznymi i toksycznością zalekomą zaleukinową19,21, istnieje zainteresowanie opracowaniem alternatywnych strategii zwiększenia produkcji IFN-γ przez komórki odpornościowe. Opracowanie nowych leków biologicznych i małych cząsteczek wymaga narzędzi do badań przesiewowych in vivo, aby sprawdzić, czy takie środki zwiększają produkcję IFN-γ podczas odpowiedzi immunologicznej i czy przekłada się to na znaczące efekty biologiczne, takie jak wzrost przeżywalności zwierząt.

Eksperymentalne zakażenie myszy bakterią Gram-dodatnią L. monocytogenes było instrumentalnym modelem do rozszyfrowania roli IFN-γ w odporności gospodarza na patogeny wewnątrzkomórkowe1,22. Zakażenie myszy patogenem dożylnie lub dootrzewnowo (i.p.) prowadzi do szybkiego rozprzestrzeniania się bakterii do śledziony i wątroby, gdzie zostają one zinternalizowane przez rezydujące makrofagi i hepatocyty, a szczytowe obciążenie bakteryjne w śledzionie występuje między 3 a 4 dniami po zakażeniu1,3,22. Wytwarzanie IFN-γ przez komórki NK jest ważne dla aktywacji makrofagów i wczesnej odporności na patogen3; jednak przy wysokich dawkach zakaźnych produkcja IFN-γ może być również szkodliwa dla usuwania patogenów23. Komórki NKT są również źródłem IFN-γ w śledzionie i wątrobie podczas wczesnej kontroli patogenów2,24 i wykazano, że produkcja ta zwiększa produkcję IFN-γ przez inne typy komórek, w tym komórki NK2. Z drugiej strony, później działające adaptacyjne limfocyty T, w szczególności limfocyty T CD8 +, są ważne dla pośredniczenia w usuwaniu patogenu i zapewniania ochrony przed ponownym zakażeniem1,4,22.

Ten model infekcji był atrakcyjny dla badaczy z wielu powodów (omówionych w1). Po pierwsze, zakażenie patogenem jest wysoce powtarzalne i indukuje silną odpowiedź immunologiczną Th1 i komórkową. Po drugie, podczas infekcji subletalnej obciążenie bakteryjne koncentruje się w wątrobie i śledzionie, gdzie można je łatwo zmierzyć. Po trzecie, patogen może być bezpiecznie obsługiwany w warunkach poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL2). Po czwarte, organizm i generowana przez niego odpowiedź immunologiczna zostały szeroko scharakteryzowane. Wreszcie, opracowano wiele zmutowanych i genetycznie zmodyfikowanych szczepów, które są dostępne do użytku.

Opisany tutaj jest podstawowy protokół inokulacji myszy C57BL/6J szczepem EGD L. monocytogenes25 oraz pomiaru odpowiedzi IFN γ przez NK, NKT i limfocyty adaptacyjne po zakażeniu. Opisano również, w jaki sposób mierzyć obciążenie bakteryjne śledziony i wątroby po zakażeniu subletalnym oraz przeprowadzać badania przeżycia po zakażeniu zmodyfikowaną dawką LD50 patogenu. Na koniec przedstawiono reprezentatywne dane dotyczące tego, w jaki sposób protokół ten może być wykorzystany do badań przesiewowych wpływu nowych metod leczenia na odpowiedzi IFN-γ i przeżywalność myszy po zakażeniu L. monocytogenes.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Oświadczenie o bezpieczeństwie

Ten protokół opisuje zakażenie myszy żywym L. monocytogenes. Patogen jest bezpiecznie obsługiwany w warunkach BSL2 przez przeszkolony personel, który nie ma obniżonej odporności. Osoby z obniżoną odpornością to kobiety w ciąży, osoby starsze oraz osoby zakażone wirusem HIV lub cierpiące na choroby przewlekłe wymagające leczenia immunosupresyjnego. Podczas pracy z zakażonymi próbkami personel powinien założyć fartuch lub fartuch laboratoryjny, rękawice, maskę i okulary ochronne. Praca opisana w niniejszym dokumencie została wykonana w warunkach BSL2 na podstawie certyfikatu (#32876) wydanego przez biuro ds. bezpieczeństwa biologicznego University Health Network (UHN). Zwłoki zakażonych myszy lub wszelkie niewykorzystane tkanki zostały podwójnie zapakowane i wyrzucone do odpadów stanowiących zagrożenie biologiczne. Klatki od zakażonych myszy zostały również odkażone przez autoklawowanie.

Oświadczenie etyczne

Myszy były utrzymywane i zarażane w pomieszczeniu kwarantanny w obiektach dla zwierząt UHN i były pod opieką zgodnie z wytycznymi ustalonymi przez Kanadyjską Radę ds. Opieki nad Zwierzętami. Wszystkie procedury na myszach zostały przeprowadzone zgodnie z protokołem użytkowania zwierząt #3214, który został zatwierdzony przez komitet ds. opieki nad zwierzętami UHN. Ze względów etycznych śmierć nie była wykorzystywana jako punkt końcowy w badaniach dotyczących przeżycia. Zmodyfikowana dawka LD50 opisana tutaj dla zakażenia L. monocytogenes została określona jako dawka, przy której 50% myszy osiągnęło określone punkty końcowe, które polegały na 20% utracie masy ciała lub wykazaniu co najmniej dwóch z następujących objawów klinicznych: letarg, potargana sierść, zgarbiona postawa, ciężki oddech, matowe lub zapadnięte oczy. Myszy zostały poddane eutanazji, gdy osiągnęły punkty końcowe poprzez ekspozycję na dwutlenek węgla (CO2) zgodnie z wytycznymi zakładu UHN.

1. Przygotowanie zapasów glicerolu do długoterminowego przechowywania

UWAGA: Ta procedura opisuje, w jaki sposób zapasy glicerolu szczepu EGD L. monocytogenes są przygotowywane z oryginalnego zapasu glicerolu. Czynności, które mogą potencjalnie generować aerozole, powinny być wykonywane w certyfikowanej komorze bezpieczeństwa biologicznego (BSC).

  1. Przygotuj płytki agarowe do infuzji mózgu i serca (BHI) do rozwoju bakterii. W tym celu dodać 3,8% (w/v) bulionu BHI i 1,5% (w/v) agaru do podwójnie destylowanego H2O (ddH2O). Płyn do autoklawu. Gdy agar ostygnie do 50 °C, rozlej płyn na bakteryjne szalki Petriego (25 ml / naczynie) i pozostaw płytki do wyschnięcia (odkryte) w BSC przez 1 godz.
    nuta: Po autoklawowaniu przenieść agar BHI do łaźni wodnej o temperaturze 50 °C, aby uniknąć zestalenia się przed nalewaniem płytek. Przechowuj płytki BHI w temperaturze 4 °C do góry nogami (stroną z nośnikiem na górze), aż będą gotowe do użycia.
  2. Przygotuj płynne podłoże BHI. W tym celu wymieszaj 3,8% (w/v) bulionu BHI w ddH2O. Autoklawie.
  3. Wyjąć zamrożony zapas glicerolu szczepu L. monocytogenes EGD z zamrażarki w temperaturze -80 °C i rozmrozić do temperatury pokojowej.
  4. Zanurz sterylną końcówkę pipety w rozmrożonym bulionie glicerolowym i natychmiast przetrzyj końcówką w przód iw tył po części płytki BHI. To jest podstawowa passa.
  5. Obrócić płytkę o 90 °C i za pomocą świeżej końcówki pipety przeciągnąć przez pierwszą smugę i rozprowadzić ją na następną 1/4 płytki (jest to smuga wtórna). Powtórz jeszcze raz, aby uzyskać trzeciorzędową smugę.
  6. Obrócić płytkę do góry dnem i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc. Pojedyncze jednolite kolonie powinny być uzyskane w ostatnim zestawie smug i widoczne między 16 a 24 godziną.
  7. Wlej 10 ml sterylnego bulionu BHI do sterylnej, wentylowanej probówki o pojemności 50 ml. Za pomocą sterylnej końcówki pipety należy pobrać jedną kolonię L. monocytogenes z płytki i zaszczepić bulion. Inkubować kulturę w inkubatorze z wytrząsaniem orbitalnym o temperaturze 37 °C przez noc lub do momentu, gdy OD600 = 1,0 z ustawieniami na 225 obrotów na minutę (obr./min).
    nuta: Szklane lub jednorazowe plastikowe kolby Erlenmeyera mogą być również używane do hodowli bakterii. Niezależnie od rodzaju użytego pojemnika, należy upewnić się, że jest on sterylny, wentylowany oraz aby objętość kultury nie przekraczała 20% całkowitej objętości pojemnika, aby zapewnić odpowiednie napowietrzenie bakterii.
  8. Przygotuj zapasy glicerolu, mieszając sterylny 100% glicerol z nocną kulturą bakteryjną w płynie w stosunku 1:1. Rozprowadzić mieszaninę bakterii i glicerolu do 2 ml fiolek kriogenicznych (500 μl/fiolkę) i przenieść fiolki do zamrażarki o temperaturze -80 °C w celu przechowywania.
    nuta: Metody bulionów mogą być również stosowane zamiast glicerolu do przechowywania bakterii. Dzięki tej metodzie porowate mikrogranulki są zaszczepiane czystą kulturą L. monocytogenes i przechowywane w temperaturze -80 °C. Każdy koralik może być użyty do zaszczepienia świeżej kultury w razie potrzeby. Więcej informacji można znaleźć na liście materiałów.

2. Wyznaczanie krzywej wzrostu L. monocytogenes w hodowli dziennej

UWAGA: Ta procedura opisuje, jak wygenerować krzywą wzrostu dla L. monocytogenes, która jest używana do oszacowania jednostek tworzących kolonie (CFU) do badań infekcji. Wszystkie kroki, które mogą potencjalnie generować aerozole, powinny być wykonywane w certyfikowanym BSC.

  1. Pobrać 100 μl nocnej kultury wytworzonej w kroku 1,7 do 10 ml pożywki BHI w wentylowanej probówce o pojemności 50 ml i hodować w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wytrząsaniem (225 obr./min, nachylonym pod kątem 45°). Użyj niezaszczepionej probówki jako kontroli.
  2. Pobieraj 0,5 ml próbek kultury w odstępach godzinowych (1, 2, 3, 4, 5, 6 godzin itd.). Rozcieńczyć każdą podwielokrotność w stosunku 1:1 (v/v) pożywką BHI w plastikowej kuwecie. Pipetować w górę i w dół, aby wymieszać. Zmierzyć gęstość optyczną (OD) przy 600 nm (OD600) za pomocą spektrometru. Kontynuuj hodowlę bakterii do OD600=1.
  3. W tym samym czasie pobrać próbkę kultury o objętości 100 μl i rozcieńczyć 900 μl pożywki BHI w sterylnej probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml (jest to rozcieńczenie 10-1). Odwirować bakterie w stężeniu 6 000 x g przez 5 minut i odessać supernatant.
  4. Bakterie należy przemyć dwukrotnie, ponownie zawieszając osad w 1 ml pożywki BHI, odwirowując przez 5 minut przy 6 000 x g, a następnie odsysając supernatant. Zawiesić osad w 1 ml pożywki BHI. Przygotować serię 10-krotnych rozcieńczeń tej próbki w pożywkach BHI (10-2 do 10-9). Rozprowadzić 100 μl każdego rozcieńczalnika na oddzielnych płytkach agarowych BHI. Inkubować płytki przez noc w temperaturze 37 °C w inkubatorze.
  5. Następnego dnia wybierz talerze, które mają od 30 do 300 kolonii. Wyrzuć resztę. Policz kolonie na tych talerzach. Tabela 1 przedstawia przykład zliczeń uzyskanych w podwielokrotności, która została pobrana, gdy OD600 = 0,84. W tym przykładzie jedna z płytek (tj. rozcieńczenie 10-6) miała liczbę kolonii między 30 a 300 i została użyta do obliczenia CFU/ml.
    nuta: Płytki z więcej niż 300 koloniami nie są używane, ponieważ przeludnienie może utrudniać rozwój bakterii, a także utrudnia rozpoznanie i zliczenie poszczególnych kolonii. Płytki z liczbą < 30 również nie są używane, ponieważ małe błędy w technice rozcieńczania lub obecność zanieczyszczeń mogą mieć duży wpływ na precyzję zliczeń na dolnym końcu zakresu.
  6. Podzielić liczbę kolonii przez objętość posianej, a następnie pomnożyć przez współczynnik rozcieńczenia, aby uzyskać wartość jtk/ml dla danego rozcieńczenia. W przykładzie w tabeli 1 liczba przy rozcieńczeniu 10-6 wynosiła 70. Podziel tę wartość przez 0,1 ml, aby uzyskać wartość jtk/ml dla rozcieńczonej kultury. Następnie pomnożyć tę wartość przez współczynnik rozcieńczenia (106), aby uzyskać wartość jtk/ml nierozcieńczonej kultury (7,0 x 108).
  7. Wykreśl OD600 (oś y) w funkcji czasu w h (oś x), aby określić logarytmiczną fazę wzrostu26,
    nuta: Ta krzywa wzrostu zapewnia oszacowanie jtk/ml kultury dziennej po wyhodowaniu do określonego odczytu OD. Wybierz odczyt OD600, który znajduje się w logarytmicznej fazie wzrostu, który może być użyty jako docelowy OD600 dla rosnących kultur dziennych. Dane te mogą być obecnie wykorzystane do oszacowania CFU w kulturze w celu przygotowania inokulum (Procedura 3).

3. Przygotowanie inokulum do eksperymentalnego zakażenia L. monocytogenes

UWAGA: Procedura ta opisuje przygotowanie inokulum zakaźnego z hodowli dziennej, która rozpoczęła się od hodowli nocnej (przygotowanej w Procedurze 2). Wszystkie te kroki są wykonywane w BSC, chyba że wskazano inaczej.

  1. Oblicz liczbę CFU wymaganą do infekcji na podstawie liczby myszy i eksperymentalnego projektu badania. Dodać odpowiednią objętość pożywki BHI do sterylnej, wentylowanej kolby Erlenmeyera lub probówki hodowlanej.
    nuta: CFU przygotowanych bakterii będzie zależała od rodzaju przeprowadzonego eksperymentu. W celu zbadania odpowiedzi komórek NK i NKT podczas infekcji, każda mysz jest zaszczepiana 105 CFU bakterii (Procedura 6). W przypadku badania adaptacyjnych odpowiedzi limfocytów T na infekcję lub pomiaru obciążenia bakteryjnego, każda mysz jest zaszczepiana bakteriami 2 x 104 CFU (Procedura 8). W przypadku badania przeżycia do punktów końcowych, każda mysz jest inokulowana dawką LD50 patogenu (która wynosi 105 CFU dla samców i 1,5 x10 5 CFU dla samic, patrz Procedura 9).
  2. Zaszczepić probówkę zawierającą pożywkę BHI 100 μl nocnej hodowli. Inkubować kulturę w inkubatorze z wytrząsaniem orbitalnym o temperaturze 37 °C (225 obr./min) aż do osiągnięcia docelowej średnicy zewnętrznej600. Przenieść zawartość kultury do sterylnej probówki wirówkowej.
  3. Odwirować bakterie w postaci osadu przez 5 minut przy 6 000 x g za pomocą wirówki. Odessać supernatant za pomocą podciśnienia przymocowanego do kolby pułapkowej zawierającej wybielacz.
  4. Przepłukać granulat dwukrotnie 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), odwirować (5 minut przy 6 000 x g) w międzyczasie.
  5. Odessać drugie płukanie i rozcieńczyć bakterie w odpowiednim stężeniu w 1x PBS, aby dostarczyć jtk interesujący dla każdej myszy w objętości 200 μl.
    nuta: Najlepiej jest używać komercyjnego źródła sterylnego 1x PBS do mycia bakterii i do przygotowania inokulum, ponieważ szkło laboratoryjne może wprowadzać zanieczyszczenia immunologiczne, takie jak lipopolisacharyd.

4. Eksperymentalne zakażenie myszy L. monocytogenes

UWAGA: Ta procedura opisuje, jak zakażać myszy inokulum przygotowanym w Procedurze 3 i jak zweryfikować CFU dostarczony do inokulum. Obchodzenie się z myszami i wstrzykiwanie odbywa się w BSC.

  1. Zamów wystarczającą liczbę samców lub samic myszy C57BL/6J do swojego eksperymentu. Zamów również, aby myszy służyły jako niezainfekowane grupy kontrolne.
  2. Pozwól myszom zaaklimatyzować się przez 1 tydzień przed inokulacją bakteryjną.
    nuta: Dzieje się tak, ponieważ stres związany z transportem zwierząt może wywołać przejściowy wzrost produkcji hormonu stresu i limfopenii27,28.
  3. W dniu zaszczepienia należy uzyskać wyjściową masę ciała dla każdej myszy i zapisać ją w zeszycie laboratoryjnym.
  4. W BSC wymieszać zawiesinę bakteryjną w górę i w dół za pomocą sterylnej pipety, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie bakterii, a następnie pobrać 200 μl inokulum do bezpiecznej strzykawki o pojemności 1 ml wyposażonej w igłę 25 G.
  5. Wstrzyknąć myszemu i.p. 200 μl przygotowanego inokulum (np. 105 CFU w przypadku zakażenia komórkami NK, Procedura 6). W tej procedurze należy potrząsnąć myszami mniej dominującą ręką, chwytając luźną skórę wokół ramion myszy. Po upewnieniu się, że mysz jest dobrze unieruchomiona, wstrzyknij jej w dolną ćwiartkę brzucha, tuż obok linii środkowej, aby uniknąć pęcherza.
  6. Igłę i strzykawkę należy wyrzucić do pojemnika na ostre przedmioty stanowiące zagrożenie biologiczne.
  7. Powtarzaj kroki 4.3 - 4.6, aż wszystkie myszy zostaną wstrzyknięte. Wykonaj podobne kroki z 1x myszami, którym wstrzyknięto PBS (niezainfekowane kontrole).
    nuta: Ponieważ CFU jest oszacowaniem opartym na krzywej wzrostu, dobrą praktyką jest również sprawdzenie rzeczywistej CFU w inokulum. W tym celu należy przygotować 3 - 4 różne rozcieńczenia przygotowanego inokulum (przy użyciu 10-krotnej serii rozcieńczeń), które, jak się spodziewasz, spowodują powstanie policzalnych kolonii. Rozprowadzić 100 μl każdego rozcieńczalnika na płytce agarowej BHI i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C. Policzyć kolonie i obliczyć rzeczywistą jtk/ml zgodnie z opisem w procedurze 2.

5. Przygotowanie L. monocytogenes zabitych termicznie do badań immunologicznych

UWAGA: Wszystkie kroki, które mogą generować aerozole, są wykonywane w BSC.

  1. Kultura w ciągu dnia wzrostu, aż zostaną osiągnięte wartości OD600, które mieszczą się w fazie logarytmicznej. Dozować kultury do probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
  2. Inkubować probówki w temperaturze 70 °C w łaźni wodnej przez 1 godzinę w celu zabicia bakterii.
  3. Umyj bakterie dwukrotnie za pomocą 1x PBS, jak w krokach 3.3 i 3.4. Zawiesić w sterylnej, kompletnej pożywce RPMI zawierającej płodową surowicę cielęcą (FCS) (przepis znajduje się w pliku uzupełniającym 1) w stężeniu 4 x 106/ml. Podwielokrotność roztworu zatruła bakterie w 2 ml sterylnych fiolkach kriogenicznych i przechowywała w temperaturze -80 °C.
  4. Potwierdzić śmierć bakterii, rozprowadzając 100 μl preparatu bakteryjnego z zabicia termicznego na płytkach agarowych BHI i inkubując przez noc w temperaturze 37 °C.
    nuta: Te zabite termicznie bakterie powinny być gotowe do stymulacji limfocytów w hodowli w procedurze 8. Jeśli na płytce agarowej BHI rosną jakieś kolonie, powtórz procedurę zabijania termicznego.

6. Pomiar odpowiedzi IFN-γ przez komórki NK i NKT podczas infekcji

UWAGA: Ta procedura opisuje, jak mierzyć odpowiedzi IFN-γ przez komórki NK i NKT u myszy po 24 godzinach od zakażenia 105 CFU L. monocytogenes. Dawka ta jest stosowana, ponieważ indukuje silną odpowiedź IFN-γ przez komórki NK i NKT w śledzionie24. Wykonaj wszystkie kroki w BSC. Aby pomóc w utrzymaniu żywotności komórek, utrzymuj je na lodzie, gdy tylko jest to możliwe, i używaj lodowatych.

  1. Zaszczepić myszy zgodnie z opisem w procedurze 4 za pomocą 105 jtk L. monocytogenes. W tym samym czasie wstrzyknij niezakażonym myszom kontrolnym i.p. równą objętość 1x PBS.
  2. Eutanazja myszy po 24 godzinach od inokulacji przez wdychanie CO2 zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.
  3. Połóż każdą mysz na prawym boku i zwilż skórę 70% etanolem za pomocą wyciskanej butelki.
  4. Używając aseptycznych lub sterylnych kleszczyków i twardych nożyczek, naciąć skórę tuż pod dnem klatki piersiowej.
  5. Spryskaj odsłoniętą warstwę mięśniową 70% etanolem. Śledziona powinna być widoczna pod warstwą mięśniową (otwarty grot strzałki na rysunku 1).
  6. Za pomocą aseptycznych lub sterylnych kleszczy i cienkich nożyczek naciąć warstwę mięśniową, aby odsłonić śledzionę. Delikatnie chwyć śledzionę kleszczami i cienkimi nożyczkami odetnij śledzionę od otaczającej tkanki łącznej.
  7. Umieścić śledzionę w stożkowej probówce o pojemności 15 ml zawierającej sterylny 1x PBS.
  8. Sterylne szalki Petriego wypełnione do połowy sterylnymi 1x PBS. Oddzielić śledzionę przez sitko z komórek nylonowych o średnicy 70 μm na szalkę Petriego za pomocą płaskiego końca sterylnej strzykawki o pojemności 3 ml.
  9. Przenieść zawiesinę splenocytów do czystej, sterylnej stożkowej probówki o pojemności 15 ml za pomocą sterylnej pipety serologicznej o pojemności 10 ml.
  10. Odwirować próbki o masie 335 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  11. Odessać supernatant do kolby pułapkowej zawierającej wybielacz. Poluzuj osad komórkowy, przesuwając rurkę palcem lub przeciągając dolną rurkę w przód iw tył po pofałdowanej powierzchni (np. odpowietrznik przepływu powietrza w BSC).
  12. Lizować czerwone krwinki, dodając 1,5 ml buforu do lizy chlorku amonu i potasu (ACK) (przepis znajduje się w pliku uzupełniającym 1). Dokładnie po 1 minutach i 15 sekundach napełnij probówkę 1x PBS, aby zatrzymać lizę komórek.
  13. Odwirować komórki zgodnie z opisem w kroku 6.10. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 10 ml buforu do sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS) (sterylny 1x PBS zawierający 2% FCS).
  14. Policz komórki za pomocą hemocytometru. W tym celu weź dwie porcje zawiesiny komórkowej do policzenia. Dodać 15 μl zawiesiny każdej komórki do równej objętości błękitu trypanowego (0,04%, otrzymanego przez rozcieńczenie 0,4% roztworu błękitu trypanowego wddH2O). Załadować 15 μl każdej zawiesiny komórki/błękitu trypanowego do komory hemocytometru (tj. jeden do górnej komory, jeden do dolnej komory).
  15. Za pomocą mikroskopu policz wszystkie inne niż niebieskie komórki w pięciu dużych kwadratach centralnej siatki w każdej komorze (ryc. 2). Weź tę liczbę i podziel ją przez 10, aby uzyskać liczbę komórek w 106 / ml. W przykładzie na rysunku 2 liczba wynosi 215 komórek w 5 kwadratach; Dlatego stężenie komórek wynosi 21,5 x 106 / ml. Uśrednić stężenia komórek uzyskane z dwóch próbek.
  16. Zasiew 1 x 106 komórek na dołek / plamę w 96-dołkowej płytce z okrągłym dnem do barwienia cytometrią przepływową. Upewnij się również, że wysiałeś komórki do kontroli niebarwionych i fluorescencyjnych minus jeden (FMO). Patrz zalecany panel barwienia cytometrii przepływowej w tabeli 2.
    nuta: Na kolejnych etapach zaleca się trzymanie komórek na lodzie lub w temperaturze 4 °C i ochronę komórek przed światłem folią, gdy obecne są fluorochromy. Pipeta wielokanałowa może być używana do dozowania płynów do 96-dołkowych płytek barwiących w celu przyspieszenia przetwarzania. Należy uważać, aby nie naruszyć osadu komórkowego podczas zasysania supernatantu z odwirowanej płytki. Barwienie można również wykonać w probówkach FACS, jeśli wirówka nie jest wyposażona w adaptery płytek. Od tego momentu wszystkie etapy wirowania są wykonywane przy 456 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  17. Odwirować płytkę, a następnie dwukrotnie przemyć komórki buforem FACS. Jedno płukanie wykonuje się poprzez dodanie 200 μl buforu FACS do każdej studzienki, odwirowanie płytki, a następnie zasysanie supernatantu.
  18. Wykonaj etap blokowania, dodając 50 μl/studzienkę buforu FACS zawierającego anty-mysie CD16/CD32 (oczyszczony blok Fc) (0,5 μg). Inkubować komórki w temperaturze 4 °C przez 15 minut. Umyj komórki raz na 1x PBS, jak opisano powyżej.
  19. Dodaj 100 μl barwnika żywotności (możliwy do utrwalenia barwnik żywotności rozcieńczony 1:1,000 w 1x PBS) do komórek. Zabarwiać komórki w temperaturze 4 °C w ciemności (w lodówce) przez 30 min. Umyj komórki dwukrotnie w buforze FACS, jak opisano powyżej.
  20. Po drugim przemyciu dodać 100 μl przeciwciał lub tetramerów powierzchniowych komórek do odpowiednich studzienek zgodnie z panelem barwiącym opisanym w tabeli 2. Zabarwiać komórki w temperaturze 4 °C w ciemności (w lodówce) przez 30 min. W tym czasie dodaj również przeciwciała do barwienia pojedynczych dodatnich i kontrolnych FMO.
    nuta: Jeśli chodzi o pojedyncze kontrole dodatnie, zaleca się stosowanie splenocytów, które są barwione różnymi wersjami fluorochromowymi przeciwciała CD4, lub komercyjnych kulek kompensacyjnych, które są barwione przeciwciałami zastosowanymi w panelu. Przed przeprowadzeniem tej procedury barwienia wszystkie przeciwciała FACS powinny zostać dodane do miareczkowania w badaniach testowych w celu określenia optymalnych stężeń do barwienia.
  21. Umyj komórki dwukrotnie w buforze FACS, jak opisano powyżej, a następnie utrwal komórki, ponownie zawieszając je w 50 μl 4% paraformaldehydu (16% zapasu paraformaldehydu rozcieńczonego w ddH2O) i inkubując przez 10 minut w temperaturze pokojowej. ostrożność: Paraformaldehyd jest toksyczny i należy z nim obchodzić się wyłącznie pod wyciągiem.
  22. Umyj komórki dwukrotnie w buforze FACS, odwirowując w międzyczasie. Zawieś ponownie komórki w buforze FACS. Przejdź do następnego kroku lub przechowuj komórki w lodówce chronionej przed światłem przez okres do trzech dni.
  23. Odwirować komórki, usunąć supernatant i dwukrotnie przemyć komórki 150 μl 1x buforu permeabilizacyjnego/płuczącego (bufor Perm/Wash), odwirowując pomiędzy. Bufor do trwałej ondulacji/płukania przygotowuje się z 10-krotnego wywaru przez rozcieńczenie w stosunku 1:9 (v/v) w ddH2O.
  24. Po drugim przemyciu ponownie zawiesić komórki w 150 μl buforu do trwałej ondulacji/przemywania i inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C w ciemności.
  25. Ponownie odwirować komórki, a następnie odessać supernatant. Zawiesić komórki w 50 μl 1x buforu do trwałej ondulacji/płukania zawierającego anty-IFN-γ i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C w ciemności.
  26. Umyj komórki dwukrotnie 1x buforem Perm/Wash, odwirowując w międzyczasie. Ponownie zawiesić komórki w 250 μl buforu FACS, a następnie przenieść komórki do probówek FACS.
  27. Przystąpić do akwizycji cytometrii przepływowej za pomocą cytometru przepływowego, który ma odpowiednią konfigurację lasera i zestaw filtrów do rozróżniania fluorochromów używanych w panelu barwienia opisanym w tabeli 229. Zbierz co najmniej 200 000 zdarzeń na próbkę i 10 000 zdarzeń na potrzeby kontrolek kompensacji.
  28. Zastosuj macierz kompensacji i analizuj dane za pomocą oprogramowania do analizy cytometrii przepływowej30.

7. Pomiar obciążenia bakteryjnego w śledzionie i wątrobie w momencie szczytu infekcji

UWAGA: Wszystkie kroki są wykonywane w BSC, chyba że zaznaczono inaczej.

  1. Zaszczepić myszy i.p. 2 x 104 CFU patogenu, stosując procedury opisane w Procedurze 4.
  2. W 3 dniu po zakażeniu przygotuj sterylne probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml, z których każda zawiera 500 μl lodowato zimnego 0,1% Triton X-100 w 1x PBS i 0,2 - 0,3 g sterylnych kulek szklanych o średnicy 1,5 - 2 mm, płukanych kwasem. Zważ każdą probówkę.
    nuta: Szklane kulki myje się kwasem przez inkubację w 10% kwasie octowym w zlewce na mieszadle magnetycznym przez 1 godzinę. Kulki te są następnie intensywnie myte ddH2O w celu usunięcia kwasu, są suszone na powietrzu, a następnie sterylizowane w autoklawie przed użyciem.
  3. Poddaj myszy eutanazji przez narażenie na CO2 .
  4. W celu wypreparowania narządów połóż zwierzę na plecach na desce preparacyjnej i przypnij kończyny myszy do deski za pomocą igieł 25 G. Zdezynfekuj skórę, zwilżając ją 70% etanolem.
  5. Używając sterylnych, twardych nożyczek, wykonaj nacięcie w linii środkowej skóry od pachwiny do środkowej części klatki piersiowej, a następnie od środkowej pachwiny w kierunku każdego kolana i od środkowej części klatki piersiowej w kierunku każdego łokcia. Tępo rozetnij i odbij skórę z powrotem, rozpinając ją za pomocą igieł 25 G.
  6. Zdezynfekuj warstwę mięśniową, zwilżając ją 70% etanolem, a następnie za pomocą sterylnych cienkich nożyczek wykonaj nacięcie w linii środkowej w ścianie otrzewnej. Chwyć wyrostek mieczykowaty za pomocą kleszczy. Następnie, używając tych samych cienkich nożyczek, wykonaj nacięcia w ścianie otrzewnej od wyrostka mieczykowatego bocznie z każdej strony, wzdłuż klatki piersiowej, tuż pod przeponą, aby odsłonić wątrobę.
  7. Wytnij kawałek wątroby ~100 mg (użyj tego samego płata dla wszystkich myszy) za pomocą sterylnych nożyczek i umieść go w wstępnie zważonej probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
  8. Użyj kleszczy, aby delikatnie odepchnąć narządy po lewej stronie jamy otrzewnej, aby uwidocznić śledzionę. Delikatnie chwyć śledzionę kleszczami i uwolnij ją z jamy otrzewnej, odcinając otaczającą tkankę łączną.
  9. Umieścić śledzionę w wstępnie zważonej probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml zawierającej kulki. Tkanki należy transportować do laboratorium w szczelnym pojemniku zawierającym lód. Ponownie zważyć probówki zawierające narządy, aby określić masę tkanek w mg.
  10. Homogenizować tkanki, potrząsając probówkami za pomocą homogenizatora perełkowego przez 3 minuty z częstotliwością 30 Hz.
    nuta: Metoda młyna perełkowego jest preferowana do homogenizacji, ponieważ jest podatna na przetwarzanie dużej liczby próbek i powoduje mniej bałaganu i potencjalnego narażenia na patogen. Alternatywą mogą być jednak homogenizatory automatyczne lub autoklawowane ręczne homogenizatory tkanek szklanych o pojemności 2 ml.
  11. Przygotować 10-krotną serię rozcieńczeń homogenatów w 0,1% Triton-X-100 w 1x PBS, w zakresie od (od nierozcieńczonego do 10-7).
  12. Rozprowadzić 100 μl każdego rozcieńczonego homogenatu na płytce z agarem BHI (w dwóch egzemplarzach) za pomocą sterylnego rozsiewacza. Przenieść płytki do inkubatora o temperaturze 37 °C i inkubować przez noc.
  13. Zachowaj płytki, które zawierają od 30 do 300 kolonii/talerz, wyrzuć resztę. Policz kolonie na każdej płycie i określ średnią liczbę kolonii dla zduplikowanych spreadów.
  14. Oblicz jtk / mg zgodnie z następującym równaniem:
    jtk/mg = jtk/ml w homogenacie, pomnożone przez ml przygotowanego homogenatu, podzielone przez mg masy homogenizowanej tkanki.
    nuta: Na przykład, jeśli po posianiu 100 μl rozcieńczonego homogenatu w 10-2 przygotowanym z kawałka wątroby o stężeniu 120 mg, który został zhomogenizowany w 0,5 ml, obliczenia byłyby następujące:
    CFU/ml = 30 kolonii x 100 (współczynnik rozcieńczenia) / 0,1 ml (rozpiętość objętościowa) = 30 000 CFU/ml.
    jtk/mg = 30 000 jtk/ml x 0,5 ml homogenatu / 120 mg tkanki = 125 jtk/mg.

8. Wpływ L. monocytogenes na odpowiedzi IFN-γ przez komórki CD4+ i CD8+

UWAGA: Ta procedura opisuje, jak mierzyć wytwarzanie IFN-γ przez komórki efektorowe T CD4 + i CD8 + śledziony pobrane w czasie szczytu adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej (~ 7 d po zakażeniu) przy użyciu dwóch metod: (1) cytometrii przepływowej do pomiaru IFN-γ przez komórki CD4 + i CD8 + przez barwienie cytokin wewnątrzkomórkowych oraz (2) ELISA do pomiaru całkowitych poziomów IFN-γ wytwarzanych przez splenocyty (obejmuje wszystkie limfocyty T). Zabiegi wykonywane są w ramach BSC.

  1. Zakażone myszy należy poprzez wstrzyknięcie i.p. 2 x 104 CFU patogenu przy użyciu procedur opisanych w Procedurze 4.
  2. W 7 dniu po zakażeniu należy poddać myszy eutanazji przez wdychanie CO2 zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.
  3. Wyciąć śledzionę (jak opisano powyżej) i umieścić w stożkowej probówce o pojemności 15 ml zawierającej sterylny 1x PBS. Rurki należy przetransportować do laboratorium w szczelnym pojemniku zawierającym lód.
  4. Przetworzyć śledzionę na zawiesinę jednokomórkową, poddać lizie czerwone krwinki zgodnie z opisem w punkcie 6, a następnie ponownie zawiesić komórki w kompletnych pożywkach RPMI zawierających 10% FCS. Policz komórki za pomocą hemocytometru.
  5. Skonfiguruj kultury do pomiaru odpowiedzi IFN-γ. W tym celu należy dozować komórki (4 x 106 w 1 ml / basenik) do 24-dołkowych płytek razem z równą liczbą (4 x 106 lub 1 ml / basenik) rozmrożonych L. monocytogenes (przygotowanych w procedurze 5). Przenieść komórki do inkubatora o temperaturze 37 °C.
  6. Po 20 godzinach inkubacji dodać 0,66 μl/ml inhibitora transportu białek do studzienek i kontynuować inkubację.
  7. Cztery godziny później przenieść płytkę do BSC i zebrać 500 μl supernatantu hodowlanego i zamrozić (w temperaturze -80 °C) w celu późniejszego pomiaru poziomów IFN-γ przy użyciu komercyjnego zestawu do testu immunoenzymatycznego (ELISA)31. Następnie zbierz komórki do sterylnej probówki o pojemności 15 ml. Umyj studzienki 1x PBS i połącz ten płyn razem z zebranymi komórkami.
  8. Przeprowadzić barwienie powierzchni komórki i barwienie wewnątrzkomórkowe dla IFN-γ na komórkach CD4+ i CD8+ zgodnie z opisem w procedurze 6, z wyjątkiem użycia panelu barwienia opisanego w Tabeli 3. Przejdź do akwizycji cytometru przepływowego (zebranie 200 000 zdarzeń na próbkę) i przeanalizuj dane29 za pomocą oprogramowania do analizy cytometrii przepływowej30.

9. Pomiar przeżywalności myszy do punktów końcowych po zakażeniu L. monocytogenes

UWAGA: Ta procedura opisuje wpływ czynnika na przeżywalność myszy do punktów końcowych po zakażeniu zmodyfikowaną dawką LD50 patogenu. Wszystkie te procedury są przeprowadzane w BSC w pomieszczeniu dla zwierząt.

  1. Wstrzyknąć myszom i.p. zmodyfikowaną dawkę LD50 L. monocytogenes, jak opisano w procedurze 4. Ustalono to na 105 CFU (dla mężczyzn) lub 1,5 x 105 CFU (dla kobiet)31.
  2. Obserwuj myszy dwa razy dziennie pod kątem objawów klinicznych i zapisuj te objawy oraz masę ciała zwierząt w zeszycie laboratoryjnym. Poddaj eutanazji myszy, jeśli wykazują 20% utratę masy ciała lub dwa kliniczne objawy listeriozy (letarg, potargana sierść, zgarbiona postawa, ciężki oddech, matowe lub zapadnięte oczy).
  3. Po 14 dniach poddać eutanazji myszy, które przeżyły, poprzez wdychanie CO2 .
  4. Przygotuj wykresy Kaplana-Meiera danych, wykreślając procentowy wskaźnik przeżycia każdej grupy w czasie32,
    nuta: Jeśli myszy ulegną infekcji (osiągną punkty końcowe opisane w Oświadczeniu etycznym), zwykle następuje to do 5 dnia po zakażeniu (ryc. 7).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rysunek 3 przedstawia typowe wyniki barwienia cytometrycznego IFN-γ w komórkach NK i NKT śledziony 24 h po zakażeniu dawką 105 CFU patogenu. Rysunek ten ilustruje również strategię bramkowania dla panelu barwień opisanego w Tabeli 2. Rysunek 4 przedstawia reprezentatywne dane uzyskane w jednym doświadczeniu, w którym samce myszy otrzymywały antagonistę PPARα IS001 lub kontrolę nośnikiem, zostały zakażone dawką 105 CF...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym miejscu opisujemy protokół przeprowadzenia podstawowego eksperymentalnego zakażenia szczepem EGD L. monocytogenes25 u samców lub samic myszy C57BL/6J. Protokół ten został opracowany w celu zbadania wpływu nowej małej cząsteczki IS001 na wytwarzanie IFN-γ przez wrodzone i adaptacyjne limfocyty in vivo31. Monitorując klirens bakteryjny i przeżywalność po zakażeniu, uzyskano wgląd w to, w jaki sposób te zmiany w IFN-γ wpłynęły na zdolność gospodarza do kontrolowania infekcji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Brak konfliktów interesów do ujawnienia.

Podziękowania

Rozwój tego protokołu był wspierany przez grant operacyjny od CIHR (MOP97807) dla SED.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Rosół z naparu serca mózgu, modyfikowanyBD299070każda marka powinna być odpowiednia
AgarBD214010każda marka powinna być odpowiednia
Triton X-100Sigma-AldrichX100każda marka powinna być odpowiednia
1x PBSSigmaD8537każda marka powinna być odpowiednia
TissueLyser IIQiagen85300każda marka powinna być odpowiednia
Chlorek amonu (NH3Cl)każda marka powinna być odpowiednia
KHCO3każda marka powinna być odpowiednia
Na2EDTAkażda marka powinna być odpowiednia
RPMI 1640Gibco22400089każda marka powinna być odpowiednia
Surowica bydlęca płodu Gibco12483Przed użyciem inaktywować termicznie w temperaturze 56 & C przez 30 min
L-glutaminaGibco25030każda marka powinna być
odpowiednia Aminokwasy endogenneGibco11140każda marka powinna być odpowiednia
Penicylina/StreptomycynaGibco15140każda marka powinna być odpowiednia
Inhibitor transportu białek GolgiStop (zawierający Monenzynę)BD554724Użyj 4 μ l w 6 ml hodowli komórkowej
16% ParaformaldehyeMikroskopia elektronowa Sciences15710Rozcieńczyć do 4% PFA w ddH2O lub 1x PBS
10x bufor do trwałej ondulacji/praniaBD554723Rozcieńczyć 1x w bloku ddH2O
Fc, Anti-Mouse CD16/CD32 OczyszczonyeBioscience14-0161Rozcieńczony 1:50
Możliwy do utrwalenia barwnik żywotności eFluor 506eBioscience65-0866Rozcieńczyć 1:1,000 (użyliśmy również barwników żywotności z sond molekularnych)
anty-mysz CD4-PE-Cy5 (GK1.5)eBioscience15-0041Producent zaleca określoną wielkość testu, jednak należy ją miareczkować przed użyciem.
anti-Mouse CD8-FITC (53-6.7)eBioscience11-0081Producent zaleca pewną wielkość testu, jednak przed użyciem należy go miareczkować.
PBS57/mCD1d tetramer-APCNIH Tetramer Core FacilityN/AOtrzymany w prezencie od placówki
anty-Mouse TCRβ-PE-Cy7 (H56-597)eBioscience25-5961Producent zaleca określoną wielkość testu, jednak należy ją miareczkować przed użyciem.
anty-Mouse NKp46-APC-eFluor780 (29A1.4)eBioscience47-3351Producent zaleca określoną wielkość testu, jednak przed użyciem należy ją miareczkować.
anty-mysz CD45 PE-Cyjanina7 (30-F11)eBioscience25-0451Producent zaleca określoną wielkość testu, jednak przed użyciem należy go miareczkować.
anty-mysz IFN gamma-PE (XMG1.2)eBioscience12-7311Producent zaleca określoną wielkość testu, jednak przed użyciem należy ją miareczkować.
OneComp eBeadseBioscience01-1111Użyj jednej kropli na plamę
Mysz IFN gamma Zestaw ELISAeBioscience88-7314Służy do pomiaru interferonu gamma w hodowli Supernatant
50 ml wentylowane probówki do hodowliUżywany do hodowli bakterii, każda marka powinna być odpowiednia
mikrowirówek 1,5 mlkażda marka powinna być odpowiednia
bakteryjne szalkikażda marka powinna być odpowiednia
2 ml cyrovials każda markapowinna być odpowiednia
spektrometrkażda marka powinna być odpowiednia
bezpieczne igłykażda marka powinna być odpowiednia
C57BL/6JJackson laboratoriesStock#000664Zamów dla przyjazd za 7 tygodni
WybielaczDo odkażania
70% etanoluDo odkażania
Koralikidowolnej marki powinny być odpowiednie
Wirnik wirówki, wiadra, pokrywy wiader.
Mikrowirówkadowolnej marki powinna być odpowiednia
Sterylny gliceroldowolnej marki powinien być odpowiedni
Końcówkidowolnej marki powinny być odpowiednie
Pipetadowolnej marki powinna być odpowiednia
Narzędziadowolnej marki powinny być odpowiednie
70 mikronów sitkadowolnej marki powinny być odpowiednie
Strzykawka 3 ml Każda markapowinna być odpowiednia
do pipetKażda marka powinna być odpowiednia
JednostkiKażda marka powinna być odpowiednia
BłękitRozcieńczyć od 1 do 9 w ddH2O, każda marka powinna być odpowiednia
Hemocytometrdowolnej marki powinien być odpowiedni
z okrągłym dnemkażda marka powinna być odpowiednia
Rurki FACFisher Scientific14-959-5
BD LSR IIBDDo akwizycji można użyć dowolnego cytometru przepływowego, który ma odpowiednią konfigurację lasera i zestaw filtrów do rozróżniania fluorochormów
Flowjo oprogramowanieTreestarSłuży do analizy danych. Inne rodzaje oprogramowania do analizy danych również będą odpowiednie
Pipetor wielokanałowy (0 - 300 &mikro; l)EppendorfSłuży do mycia komórek i dodawania przeciwciał podczas barwienia cytometrią przepływową
KwasUżywany do mycia szklanych kulek, każda marka powinna być odpowiednia
System ochrony bakterii w mikrobankuDiagnostykaStosowany jako alternatywa dla zapasów glicerolu do długotrwałego przechowywania bakterii
Probówki do Petriego UV inżynieryjne szklane do pipet chirurgiczne Pistolet filtrujące trypanowy Płytki octowy Pro-lab

Bibliografia

  1. Pamer, E. G. Immune responses to Listeria monocytogenes. Nat Rev Immunol. 4 (10), 812-823 (2004).
  2. Ranson, T., et al. Invariant V alpha 14+ NKT cells participate in the early response to enteric Listeria monocytogenes infection. J Immunol. 175 (2), 1137-1144 (2005).
  3. Bancroft, G. J., Schreiber, R. D., Unanue, E. R. Natural immunity: a T-cell-independent pathway of macrophage activation, defined in the scid mouse. Immunol Rev. 124, 5-24 (1991).
  4. Soudja, S. M., et al. Memory-T-cell-derived interferon-gamma instructs potent innate cell activation for protective immunity. Immunity. 40 (6), 974-988 (2014).
  5. Schoenborn, J. R., Wilson, C. B. Regulation of interferon-gamma during innate and adaptive immune responses. Adv Immunol. 96, 41-101 (2007).
  6. Filipe-Santos, O., et al. Inborn errors of IL-12/23- and IFN-gamma-mediated immunity: molecular, cellular, and clinical features. Semin Immunol. 18 (6), 347-361 (2006).
  7. Flynn, J. L., et al. An essential role for interferon gamma in resistance to Mycobacterium tuberculosis infection. J Exp Med. 178 (6), 2249-2254 (1993).
  8. Cooper, A. M., et al. Disseminated tuberculosis in interferon gamma gene-disrupted mice. J Exp Med. 178 (6), 2243-2247 (1993).
  9. Dalton, D. K., et al. Multiple defects of immune cell function in mice with disrupted interferon-gamma genes. Science. 259 (5102), 1739-1742 (1993).
  10. Harty, J. T., Bevan, M. J. Specific immunity to Listeria monocytogenes in the absence of IFN gamma. Immunity. 3 (1), 109-117 (1995).
  11. Huang, S., et al. Immune response in mice that lack the interferon-gamma receptor. Science. 259 (5102), 1742-1745 (1993).
  12. Wang, Z. E., Reiner, S. L., Zheng, S., Dalton, D. K., Locksley, R. M. CD4+ effector cells default to the Th2 pathway in interferon gamma-deficient mice infected with Leishmania major. J Exp Med. 179 (4), 1367-1371 (1994).
  13. Hess, J., Ladel, C., Miko, D., Kaufmann, S. H. Salmonella typhimurium aroA- infection in gene-targeted immunodeficient mice: major role of CD4+ TCR-alpha beta cells and IFN-gamma in bacterial clearance independent of intracellular location. J Immunol. 156 (9), 3321-3326 (1996).
  14. Ikeda, H., Old, L. J., Schreiber, R. D. The roles of IFN gamma in protection against tumor development and cancer immunoediting. Cytokine Growth Factor Rev. 13 (2), 95-109 (2002).
  15. Hodge, D. L., et al. IFN-gamma AU-rich element removal promotes chronic IFN-gamma expression and autoimmunity in mice. J Autoimmun. 53, 33-45 (2014).
  16. Seery, J. P., Carroll, J. M., Cattell, V., Watt, F. M. Antinuclear autoantibodies and lupus nephritis in transgenic mice expressing interferon gamma in the epidermis. J Exp Med. 186 (9), 1451-1459 (1997).
  17. Peng, S. L., Moslehi, J., Craft, J. Roles of interferon-gamma and interleukin-4 in murine lupus. J Clin Invest. 99 (8), 1936-1946 (1997).
  18. Savinov, A. Y., Wong, F. S., Chervonsky, A. V. IFN-gamma affects homing of diabetogenic T cells. J Immunol. 167 (11), 6637-6643 (2001).
  19. Miller, C. H., Maher, S. G., Young, H. A. Clinical Use of Interferon-gamma. Ann N Y Acad Sci. 1182, 69-79 (2009).
  20. Paget, C., Chow, M. T., Duret, H., Mattarollo, S. R., Smyth, M. J. Role of gammadelta T cells in alpha-galactosylceramide-mediated immunity. J Immunol. 188 (8), 3928-3939 (2012).
  21. Leonard, J. P., et al. Effects of single-dose interleukin-12 exposure on interleukin-12-associated toxicity and interferon-gamma production. Blood. 90 (7), 2541-2548 (1997).
  22. Zenewicz, L. A., Shen, H. Innate and adaptive immune responses to Listeria monocytogenes: a short overview. Microbes Infect. 9 (10), 1208-1215 (2007).
  23. Viegas, N., et al. IFN-gamma production by CD27(+) NK cells exacerbates Listeria monocytogenes infection in mice by inhibiting granulocyte mobilization. Eur J Immunol. 43 (10), 2626-2637 (2013).
  24. Selvanantham, T., et al. Nod1 and Nod2 enhance TLR-mediated invariant NKT cell activation during bacterial infection. J Immunol. 191 (11), 5646-5654 (2013).
  25. Becavin, C., et al. Comparison of widely used Listeria monocytogenes strains EGD, 10403S, and EGD-e highlights genomic variations underlying differences in pathogenicity. MBio. 5 (2), e00969-e00914 (2014).
  26. Jones, G. S., D'Orazio, S. E. F. Unit 9B.2 Listeria monocytogenes: cultivation and laboratory maintenance, Chapter 31B. Curr Protoc Microbiol. , (2013).
  27. Conour, L. A., Murray, K. A., Brown, M. J. Preparation of animals for research--issues to consider for rodents and rabbits. ILAR J. 47 (4), 283-293 (2006).
  28. Obernier, J. A., Baldwin, R. L. Establishing an appropriate period of acclimatization following transportation of laboratory animals. ILAR J. 47 (4), 364-369 (2006).
  29. BD LSR II User's Guide. , download from bdbiosciences.com. http://flowcytometry.sysbio.med.harvard.edu/documents/BD%20LSRII%20User's%20Guide.pdf (2007).
  30. Flowjo Tutorial. , download from bdbiosciences.com. http://www.flowjo.com/tutorials (2016).
  31. Zhang, M. A., Ahn, J. J., Zhao, F. L., Selvanantham, T., Mallevaey, T., Stock, N., Correa, L., Clark, R., Spaner, D., Dunn, S. E. Antagonizing peroxisome proliferator-activated receptor alpha (PPARalpha) activity enhances Th1 immunity in male mice. J. Immunol. , (2015).
  32. Kaplan, E. L., Meier, P. Nonparametric estimation from incomplete observations. J Amer Stat Assoc. 53, 457-481 (1958).
  33. Brown, D. R., et al. Limited role of CD28-mediated signals in T helper subset differentiation. J Exp Med. 184 (3), 803-810 (1996).
  34. Czuprynski, C. J., Brown, J. F. The relative difference in anti-Listeria resistance of C57BL/6 and A/J mice is not eliminated by active immunization or by transfer of Listeria-immune T cells. Immunology. 58 (3), 437-443 (1986).
  35. Busch, D. H., Vijh, S., Pamer, E. G. Animal model for infection with Listeria monocytogenes, Chapter 19. Curr Protoc Immunol. , (2001).
  36. Mekada, K., et al. Genetic differences among C57BL/6 substrains. Exp Anim. 58 (2), 141-149 (2009).
  37. Ivanov, I. I., et al. Specific microbiota direct the differentiation of IL-17-producing T-helper cells in the mucosa of the small intestine. Cell Host Microbe. 4 (4), 337-349 (2008).
  38. Bou Ghanem, N. E., Myers-Morales, T., Jones, G. S., D'Orazio, S. E. Oral transmission of Listeria monocytogenes in mice via ingestion of contaminated food. J Vis Exp. (75), e50381(2013).
  39. Lecuit, M., Dramsi, S., Gottardi, C., Fedor-Chaiken, M., Gumbiner, B., Cossart, P. A single amino acid in E-cadherin responsible for host specificity towards the human pathogen Listeria monocytogenes. Embo J. 18 (14), 3956-3963 (1999).
  40. Wollert, T., et al. Extending the host range of Listeria monocytogenes by rational protein design. Cell. 129 (5), 891-902 (2007).
  41. Brunt, L. M., Portnoy, D. A., Unanue, E. R. Presentation of Listeria monocytogenes to CD8+ T cells requires secretion of hemolysin and intracellular bacterial growth. J Immunol. 145 (11), 3540-3546 (1990).
  42. Muraille, E., et al. Distinct in vivo dendritic cell activation by live versus killed Listeria monocytogenes. Eur J Immunol. 35 (5), 1463-1471 (2005).
  43. Datta, S. K., et al. Vaccination with irradiated Listeria induces protective T cell immunity. Immunity. 25 (1), 143-152 (2006).
  44. Geginat, G., Schenk, S., Skoberne, M., Goebel, W., Hof, H. A novel approach of direct ex vivo epitope mapping identifies dominant and subdominant CD4 and CD8 T cell epitopes from Listeria monocytogenes. J Immunol. 166 (3), 1877-1884 (2001).
  45. Shen, H., et al. Recombinant Listeria monocytogenes as a live vaccine vehicle for the induction of protective anti-viral cell-mediated immunity. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (9), 3987-3991 (1995).
  46. Foulds, K. E., et al. Cutting edge: CD4 and CD8 T cells are intrinsically different in their proliferative responses. J Immunol. 168 (4), 1528-1532 (2002).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Interferon gammazakażenie myszycytometria przepływowamiano bakteriiśledziona wątrobaodpowiedzi IFN-gammapatogeny wewnątrzkomórkoweodporność gospodarzatest przeżywalności
Eksperymentalne zakażenie Listeria monocytogenes jako model do badania odpowiedzi na interferon-γ gospodarza
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.