Adenofekcja: metoda badania roli molekularnych białek opiekuńczych w morfodynamice komórkowej za pomocą eksperymentów depletion-rescue

Margit Fuchs; Marie-Chloé Boulanger; Herman Lambert; Jacques Landry; Josée N. Lavoie

doi:10.3791/54557

Artykuł metodologiczny

Adenofekcja: metoda badania roli molekularnych białek opiekuńczych w morfodynamice komórkowej za pomocą eksperymentów depletion-rescue

DOI:

10.3791/54557

⸱

16 września 2016

Margit Fuchs¹^,² , Marie-Chloé Boulanger³^,⁴ , Herman Lambert¹^,² , Jacques Landry¹^,² , Josée N. Lavoie¹^,²

¹Département de biologie moléculaire, biochimie médicale et pathologie, Faculté de médecine, Centre de recherche sur le cancer de l'Université Laval, ²Oncology, Centre de recherche du CHU de Québec, Université Laval, ³Laboratoire d'études moléculaires des valvulopathies (LEMV), Groupe de recherche en valvulopathies (GRV), Quebec Heart and Lung Institute/Research Center, ⁴Department of Surgery, Université Laval

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy metodę eksperymentów ratujących zubożenie, która zachowuje integralność komórkową i homeostazę białek. Adenofection umożliwia analizę funkcjonalną białek w procesach biologicznych, które opierają się na precyzyjnie dostrojonej dynamice opartej na aktynie, takiej jak mitotyczny podział komórek i miogeneza, na poziomie pojedynczej komórki.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Procesy komórkowe, takie jak mitoza i różnicowanie komórek, są regulowane przez zmiany w kształcie komórki, które w dużej mierze polegają na prawidłowym przemodelowaniu struktur cytoszkieletu komórki. Wiąże się to z składaniem-demontażem struktur makromolekularnych wyższego rzędu w określonym czasie i miejscu, procesem, który jest szczególnie wrażliwy na zaburzenia spowodowane nadekspresją białek. Metody, które mogą zachować homeostazę białek i utrzymać prawie normalną morfologię komórkową, są wysoce pożądane w celu określenia funkcjonalnego wkładu białka będącego przedmiotem zainteresowania w szerokim zakresie procesów komórkowych. Eksperymenty ratowania w stanie przejściowym oparte na interferencji RNA są potężnymi metodami analizy funkcji białek i wymagań strukturalnych. Jednak ponowne wprowadzenie docelowego białka przy minimalnym odchyleniu od jego fizjologicznego poziomu jest prawdziwym wyzwaniem. Tutaj opisujemy metodę zwaną adenofekcją, która została opracowana w celu zbadania roli molekularnych białek opiekuńczych i partnerów w normalnym działaniu dzielących się komórek i związku z przebudową aktyny. Komórki HeLa zostały pozbawione BAG3 za pomocą dupleksów siRNA ukierunkowanych na region 3'UTR. Białka BAG3 znakowane GFP zostały ponownie wprowadzone jednocześnie do >75% komórek przy użyciu rekombinowanych adenowirusów sprzężonych z odczynnikami do transfekcji. Adenofekcja umożliwiła ekspresję białek BAG3-GFP na poziomie zbliżonym do fizjologicznego w komórkach HeLa pozbawionych BAG3, przy braku reakcji na stres. Nie zaobserwowano wpływu na poziom endogennych białek opiekuńczych szoku cieplnego, głównych regulatorów homeostazy białek indukowanych stresem. Ponadto, dodając bakulowirusy napędzające ekspresję markerów fluorescencyjnych w czasie transdukcji-transfekcji komórek, mogliśmy przeanalizować dynamikę komórek mitotycznych za pomocą poklatkowych analiz mikroskopowych przy minimalnych zaburzeniach normalnej progresji mitotycznej. Adenofekcja ma również zastosowanie do trudnych do zakażenia komórek myszy i nadaje się do analiz funkcjonalnych różnicowania mioblastów w miotuby. W związku z tym adenofekcja zapewnia wszechstronną metodę przeprowadzania analiz strukturalno-funkcjonalnych białek zaangażowanych we wrażliwe procesy biologiczne, które opierają się na dynamice cytoszkieletu wyższego rzędu.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Funkcjonalna inaktywacja ekspresji genów w komórkach ssaków jest złotym standardem w analizie funkcji białek. Nowo opracowane technologie edycji genomu oparte na wykorzystaniu nukleaz specyficznych dla miejsca, takich jak nukleazy palców cynkowych i zgrupowane, regularnie rozmieszczone krótkie powtórzenia palindromiczne (CRISPR)/CAS9, pozwalają obecnie na generowanie linii komórkowych z ukierunkowaną delecją genu i mutacją^1,2. Te nowatorskie podejścia powinny zrewolucjonizować sposób, w jaki badamy funkcję białek i nasze zrozumienie genetyki chorób ludzkich. Jednak w niektórych przypadkach długotrwały lub całkowity nokaut genów nie jest pożądany i może wywo....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie pożywki i roztworów (wszystkie sterylne przefiltrowane)

C2C12 mysie komórki mięśniowe (badania różnicowania)
1. Przygotuj 500 ml pożywki wzrostowej do utrzymania hodowli komórkowej C2C12: DMEM o wysokiej zawartości glukozy uzupełnionej 10% FBS i 2mM L-glutaminą.
2. Przygotuj 100 ml pożywki różnicującej (DM) do różnicowania C2C12: DMEM o wysokiej zawartości glukozy uzupełnionej 2% surowicą końską.
Komórki HeLa (badania na komórkach mitotycznych)
1. Przygotuj 500 ml αMEM do konserwacji i eksperymentów w hodowli komórkowej HeLa RFP-H2B: αMEM uzupełniony 10% FB....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transfekcja plazmidowego DNA BAG3-GFP przy użyciu kationowych lipidów wiązała się z niejednorodną ekspresją w komórkach HeLa, niektóre komórki wykazywały ledwo wykrywalny poziom białka, a inne miały bardzo wysoki poziom BAG3 (Rysunek 2A). W tych komórkach utrata homeostazy białek została udowodniona przez akumulację BAG3-GFP w agregatach okołojądrowych (Figura 2A, strzałki). W przeciwieństwie do tego, transdukcja komórkowa z adenowirusami przenoszącymi BA.......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym miejscu opisano metodę umożliwiającą przeprowadzenie eksperymentów depletion-rescue, która ma zastosowanie w analizach funkcjonalnych procesów biologicznych komórek, które są szczególnie wrażliwe na nadekspresję białek wpływających na stechiometrię i dynamikę kompleksów białkowych i struktur makromolekularnych. Podział komórki mitotycznej jest ekstremalnym przykładem precyzyjnie dostrojonej morfodynamiki komórki, która obejmuje najbardziej dramatyczne i spektakularne zmiany w ogólnej strukturze komórki. Stosując ad.......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Kanadyjskie Instytuty Badań nad Zdrowiem (Grant nr 7077) oraz przez Fundację Belliniego i Roby Fondazione.

....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
C2C12 Mysie mioblasty	ATCC	CRL-1772
Adenovirus niestandardowy projekt	Welgen	Niestandardowy projekt
Chlorek wapnia	Fisher Scientific	C79-500
CellLight® Actin-GFP, BacMam 2.0	Thermo Fisher	C10582
CellLight® Tubulin-RFP, BacMam 2.0	Thermo Fisher	C10614
Dulbecco" s zmodyfikowany Orzeł" s medium (DMEM), Termo Fisher o wysokiej zawartości glukozy		11965-092
EDTA	Sigma	E5134
Płodowa surowica bydlęca (FBS)	Thermo Fisher	12483-020
Fibronectin	Sigma	F1141
Naczynia ze szklanym dnem, 35 mm	MatTek Corperation	P35G-1.5-20-C Case
HeLa-RFP-H2B	Uprzejmy prezent od dr Sabine Elowe, Qué bec, Kanada		Klebig C et al. 2009
HEPES	Fisher Scientific	BP310-1
Serum dla koni, Nowa Zelandia	Thermo Fisher	16050-122
KCl	Fisher Scientific	BP366-500
L-Glutamina	Thermo Fisher	25030081
Lipofectamina® Odczynnik do transfekcji RNAiMAX	Thermo Fisher	13778-150
Minimal Essential Medium (MEM) Alpha	Bisent	310-101-CL
Minimal Essential Medium (MEM) Alpha bez Desoxyribonuleosides/Rybonukleozydów	Thermo Fisher	12000-022
Minimal Essential Medium (MEM) Alpha bez Phenol Red	Thermo Fisher	41061-029
Na₂HPO₄	Biobasic	S0404
NaCl	Fisher Scientific	BP358-10
OptiMEM	Thermo Fisher	11058-021
rAV^CMV-LifeAct-TagGFP2	IBIDI	60121
dupleksy siRNA	Dharmacon	Niestandardowy projekt
Tymidyna	Sigma	T9250
Trypsyna 2,5%	Thermo Fisher	15090-046

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nat Rev Genet. 11 (9), 636-646 (2010).
Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Adenofection Depletion Rescue Molecular Chaperones Cellular Morphodynamics BAG3 Protein siRNA Transduction Adenovirus Expression GFP Tagging Mitotic Analysis Live Cell Imaging

Adenofekcja: metoda badania roli molekularnych białek opiekuńczych w morfodynamice komórkowej za pomocą eksperymentów depletion-rescue

W tym artykule

Podsumowanie

Streszczenie

Wprowadzenie

Protokół

Wyniki

Dyskusja

Oświadczenia

Podziękowania

Materiały

Bibliografia

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Powiązane artykuły