Artykuł metodologiczny

Adenofekcja: metoda badania roli molekularnych białek opiekuńczych w morfodynamice komórkowej za pomocą eksperymentów depletion-rescue

DOI:

10.3791/54557

⸱

16 września 2016

 ,  ,  ,  , 
1Département de biologie moléculaire, biochimie médicale et pathologie, Faculté de médecine, Centre de recherche sur le cancer de l'Université Laval, 2Oncology, Centre de recherche du CHU de Québec, Université Laval, 3Laboratoire d'études moléculaires des valvulopathies (LEMV), Groupe de recherche en valvulopathies (GRV), Quebec Heart and Lung Institute/Research Center, 4Department of Surgery, Université Laval

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy metodę eksperymentów ratujących zubożenie, która zachowuje integralność komórkową i homeostazę białek. Adenofection umożliwia analizę funkcjonalną białek w procesach biologicznych, które opierają się na precyzyjnie dostrojonej dynamice opartej na aktynie, takiej jak mitotyczny podział komórek i miogeneza, na poziomie pojedynczej komórki.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Procesy komórkowe, takie jak mitoza i różnicowanie komórek, są regulowane przez zmiany w kształcie komórki, które w dużej mierze polegają na prawidłowym przemodelowaniu struktur cytoszkieletu komórki. Wiąże się to z składaniem-demontażem struktur makromolekularnych wyższego rzędu w określonym czasie i miejscu, procesem, który jest szczególnie wrażliwy na zaburzenia spowodowane nadekspresją białek. Metody, które mogą zachować homeostazę białek i utrzymać prawie normalną morfologię komórkową, są wysoce pożądane w celu określenia funkcjonalnego wkładu białka będącego przedmiotem zainteresowania w szerokim zakresie procesów komórkowych. Eksperymenty ratowania w stanie przejściowym oparte na interferencji RNA są potężnymi metodami analizy funkcji białek i wymagań strukturalnych. Jednak ponowne wprowadzenie docelowego białka przy minimalnym odchyleniu od jego fizjologicznego poziomu jest prawdziwym wyzwaniem. Tutaj opisujemy metodę zwaną adenofekcją, która została opracowana w celu zbadania roli molekularnych białek opiekuńczych i partnerów w normalnym działaniu dzielących się komórek i związku z przebudową aktyny. Komórki HeLa zostały pozbawione BAG3 za pomocą dupleksów siRNA ukierunkowanych na region 3'UTR. Białka BAG3 znakowane GFP zostały ponownie wprowadzone jednocześnie do >75% komórek przy użyciu rekombinowanych adenowirusów sprzężonych z odczynnikami do transfekcji. Adenofekcja umożliwiła ekspresję białek BAG3-GFP na poziomie zbliżonym do fizjologicznego w komórkach HeLa pozbawionych BAG3, przy braku reakcji na stres. Nie zaobserwowano wpływu na poziom endogennych białek opiekuńczych szoku cieplnego, głównych regulatorów homeostazy białek indukowanych stresem. Ponadto, dodając bakulowirusy napędzające ekspresję markerów fluorescencyjnych w czasie transdukcji-transfekcji komórek, mogliśmy przeanalizować dynamikę komórek mitotycznych za pomocą poklatkowych analiz mikroskopowych przy minimalnych zaburzeniach normalnej progresji mitotycznej. Adenofekcja ma również zastosowanie do trudnych do zakażenia komórek myszy i nadaje się do analiz funkcjonalnych różnicowania mioblastów w miotuby. W związku z tym adenofekcja zapewnia wszechstronną metodę przeprowadzania analiz strukturalno-funkcjonalnych białek zaangażowanych we wrażliwe procesy biologiczne, które opierają się na dynamice cytoszkieletu wyższego rzędu.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Funkcjonalna inaktywacja ekspresji genów w komórkach ssaków jest złotym standardem w analizie funkcji białek. Nowo opracowane technologie edycji genomu oparte na wykorzystaniu nukleaz specyficznych dla miejsca, takich jak nukleazy palców cynkowych i zgrupowane, regularnie rozmieszczone krótkie powtórzenia palindromiczne (CRISPR)/CAS9, pozwalają obecnie na generowanie linii komórkowych z ukierunkowaną delecją genu i mutacją1,2. Te nowatorskie podejścia powinny zrewolucjonizować sposób, w jaki badamy funkcję białek i nasze zrozumienie genetyki chorób ludzkich. Jednak w niektórych przypadkach długotrwały lub całkowity nokaut genów nie jest pożądany i może wywołać wtórne mechanizmy kompensacji komórek. Wytwarzanie genetycznie zmodyfikowanych linii komórkowych może być również ograniczające, gdy mamy do czynienia z pierwotnymi hodowlami komórkowymi o ograniczonej zdolności proliferacji lub gdy dąży się do badań przesiewowych dużego zestawu mutacji w różnych typach komórek. Jest to często wymagane do określenia zależności procesu biologicznego komórki od wymagań strukturalnych białka. W tym celu, odwracalne knockdown przez interferencję RNA, który umożliwia przejściowe eksperymenty ratowania zubożenia w różnych tłach komórkowych, nadal pozostaje prostym i skutecznym podejściem do przeprowadzania analiz strukturalno-funkcjonalnych białka będącego przedmiotem zainteresowania3. Jednak główną wadą tego podejścia jest trudność w osiągnięciu skutecznego wyciszenia i ponownym wprowadzeniu interesującego białka lub jego wariantów na poziomie zbliżonym do fizjologicznego w większości populacji komórek. Ma to kluczowe znaczenie dla umożliwienia kompleksowych badań, które próbują skorelować efekty funkcjonalne obserwowane na poziomie pojedynczych komórek (fenotyp hipomorficzny) z efektami obserwowanymi w testach opartych na populacji komórek, na przykład w zakresie interakcji białko-białko.

Korzystając z klasycznych metod transfekcji, trudno jest osiągnąć jednorodną i niską ekspresję białek egzogennych w dużej populacji komórek. Transdukcja komórek za pomocą rekombinowanych wirusów, takich jak adenowirusy, często umożliwia bardziej znormalizowaną ekspresję białek egzogennych. Jednak wychwyt adenowirusa jest ograniczony przez receptor CAR, który jest nieobecny w komórkach innych niż ludzkie lub ulega słabej ekspresji w niektórych typach komórek ludzkich. Ponadto wnikanie adenowirusów do komórek aktywuje szlaki sygnałowe, które regulują kształt i adhezję komórek4-6. Nie jest to oczywiście pożądane podczas badania mechanizmów regulacyjnych morfodynamiki komórki. Stanęliśmy przed tym problemem, gdy podjęliśmy analizy funkcjonalne kompleksu opiekuńczego, BAG3-HSPB8, w zakresie podziału komórek i dynamiki aktyny. Pionierskie prace opisały rolę tego kompleksu opiekuńczego w kontroli jakości białka i autofagii podczas stresu7,8. Większość z tych badań opierała się jednak na nadekspresji białek, zakładając, że białka opiekuńcze są normalnie regulowane w górę podczas stresu. Pozostawiło to otwarte pytanie, czy BAG3, w połączeniu z HSPB8, może przyczyniać się do normalnego działania dzielących się komórek wykazujących ekspresję tych białek opiekuńczych, jak wiele typów komórek rakowych9. W szczególności to, czy kompleks opiekuńczy przyczynia się do przebudowy struktur opartych na aktynie, które kontrolują progresję mitotyczną, było bardzo interesujące, biorąc pod uwagę pojawiające się powiązania między białkami opiekuńczymi HSPB a dynamiką cytoszkieletu10. Aby rozwiązać ten problem, staraliśmy się opracować skuteczną metodę eksperymentów ratujących zubożenie, która nie zakłócałaby progresji mitotycznej ani morfologii komórkowej i która zachowałaby homeostazę białek, aby uniknąć wtórnych zaburzeń dynamiki kompleksów makromolekularnych regulujących zmiany kształtu komórki. W związku z tym idealnie byłoby, gdyby zubożenie-dodanie genu będącego przedmiotem zainteresowania było wykonywane jednocześnie.

Opisano użycie kompleksów adenowirusa z kationowym polimerem lub lipidami w celu promowania transferu genów in vitro i in vivo11,12. Na przykład wydaje się, że fosforan wapnia (CaPi) tworzy osad z adenowirusem, który zwiększa wiązanie wirusa przez niezależną od CAR ścieżkę13. Rzeczywiście, odkryliśmy, że połączenie transdukcji i transfekcji komórkowej opartej na adenowirusie ze związkami kationowymi może zwiększyć skuteczność eksperymentów ratowania zubożenia. Pozwoliło nam to obniżyć ilość wirusa od 3 do 20 razy, w zależności od linii komórkowej i genu będącego przedmiotem zainteresowania, a także skorzystać z szerszego okna w celu dostosowania ekspresji białek egzogennych na poziomie zbliżonym do endogennego w większości populacji komórek będących przedmiotem zainteresowania przy minimalnym wpływie na morfologię komórki. W takich warunkach udało nam się również osiągnąć wysoką skuteczność knockdown endogennej ekspresji białek (>75%). Niniejszym opisujemy metodę krok po kroku i przedstawiamy dowody na to, że homeostaza białek nie jest znacząco zaburzona, jak ocenia się na podstawie niezmienionych poziomów białek opiekuńczych wywołanych stresem z rodziny białek szoku cieplnego, co czyni metodę odpowiednią do funkcjonalnych analiz fizjologicznej roli molekularnych białek opiekuńczych za pomocą poklatkowej mikroskopii wideo. Protokół jest podatny na procedury synchronizacji komórek i wykorzystanie dostępnych na rynku bakulowirusów do koekspresji niskich poziomów markerów fluorescencyjnych, przy minimalnej interferencji z normalną dynamiką opartą na aktynie i wrzecionie podczas progresji mitotycznej. Ponadto pokazujemy wszechstronność metody, która ma zastosowanie do "trudnych do transdukcji" mysich komórek C2C12, bez znaczącego wpływu na różnicowanie mioblastów do miotub in vitro.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie pożywki i roztworów (wszystkie sterylne przefiltrowane)

  1. C2C12 mysie komórki mięśniowe (badania różnicowania)
    1. Przygotuj 500 ml pożywki wzrostowej do utrzymania hodowli komórkowej C2C12: DMEM o wysokiej zawartości glukozy uzupełnionej 10% FBS i 2mM L-glutaminą.
    2. Przygotuj 100 ml pożywki różnicującej (DM) do różnicowania C2C12: DMEM o wysokiej zawartości glukozy uzupełnionej 2% surowicą końską.
  2. Komórki HeLa (badania na komórkach mitotycznych)
    1. Przygotuj 500 ml αMEM do konserwacji i eksperymentów w hodowli komórkowej HeLa RFP-H2B: αMEM uzupełniony 10% FBS i 2 mM L-Glutamina (αMEM10%).
    2. Przygotuj 500 ml αMEM-minus (bez deoksyrybonukleozydów/rybonukleozydów) do synchronizacji komórek HeLa RFP-H2B: αMEM-minus uzupełniony 10% FBS i 2 mM L-Glutamina (αMEM-minus10%).
    3. Przygotuj 20 ml αMEM bez czerwieni fenolowej do akwizycji żywych komórek HeLa-RFP-H2B: αMEM bez czerwieni fenolowej uzupełnionej 10% FBS i 2 mM L-glutaminy.
    4. Przygotować 100 mM tymidyny: rozpuścić 24,2 mg w 1 mlH2Ow temperaturze 37 °C przez wirowanie. Przefiltrować, wysterylizować i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  3. Typowe rozwiązania
    1. Przygotuj 0,05% trypsyny/EDTA: 0,05% trypsyny, 0,625 mM EDTA w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Przefiltrować, wysterylizować i przechowywać podwielokrotności w temperaturze -20 °C. Po rozmrożeniu przechowywać porcję w temperaturze 4 °C.
    2. Przygotuj HBS2x: 280 mM NaCl, 50 mM HEPES, 1,5 mM Na2HPO4. Dokładnie dostosować pH w zakresie 7,01-7,05 za pomocą 10 N NaOH. Filtrować w sterylny sposób i przechowywać w temperaturze 4 °C.

2. Powlekanie płytek do hodowli komórkowych fibronektyną i powlekanie komórek HeLa-RFP-H2B

UWAGA: Przed eksperymentem, każdy manipulator powinien ustawić optymalne warunki do powlekania komórek, aby osiągnąć odpowiednią gęstość komórek, ponieważ mogą wystąpić różnice między każdym manipulatorem a każdą inną linią komórkową.

  1. Dzień przed eksperymentem rozwiń komórki HeLa-RFP-H2B, aby upewnić się, że znajdują się w wykładniczej fazie wzrostu w dniu posiewu. Wykonaj 2 kolejne rozcieńczenia 1/3 w 10 cm płytkach, zaczynając od 80% zlewającej się płytki 1x10 cm.
    UWAGA: Zaplanuj liczbę płytek na potrzeby eksperymentu. Oblicz każdy warunek jako duplikaty, jeden dla krótkoterminowego obrazowania żywych komórek, a drugi dla ekstraktów białkowych, aby określić skuteczność knockdownu i ekspresji białek egzogennych za pomocą analizy Western blot. Zaplanuj jedną dodatkową płytkę, aby określić liczbę komórek przed transdukcją wirusa.
  2. Przed posiewem komórek pokryj szklane naczynia dolne 10 μg/ml fibronektyny. Dodać 1 ml fibronektyny (rozcieńczonej w sterylnym 1x PBS) w rozcieńczeniu 1:100 na szalkę o średnicy 35 mm, aby dobrze pokryć całą powierzchnię i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
  3. Podczas inkubacji wstępnie ogrzany αMEM uzupełniony 10% FBS (αMEM10%) i 0,05% trypsyny/EDTA w temperaturze 37 °C.
  4. Po 45 minutach inkubacji przystąp do przygotowania roztworu komórkowego. W sterylnym kapturze odessać pożywkę z płytki o średnicy 10 cm, delikatnie spłukać dwukrotnie 1,5 ml 0,05% Trypsyny/EDTA i pozostawić 0,5 ml Trypsyny/EDTA w ostatnim zasysaniu.
  5. Inkubować komórki przez 2-3 minuty w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Delikatnie stukając w płytkę i obserwując pod mikroskopem, sprawdź, czy wszystkie komórki zostały odłączone. Dodać 10 ml αMEM10% i delikatnie odpipetować kilka razy, aby rozdzielić komórki. Odliczyć 10 μl próbki zawiesiny komórek za pomocą hemocytometru.
  6. Odessać roztwór fibronektyny z naczyń ze szklanym dnem. Nie dopuścić do wyschnięcia fibronektyny przed posiewem komórek.
  7. Płytka 1,5x105 komórek na szalkę 35 mm w 2 ml αMEM10% i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Po 30-45 minutach pod mikroskopem sprawdź, czy komórki są dobrze oddzielone, ponieważ mają tendencję do gromadzenia się w środku płytki.
  8. W razie potrzeby delikatnie porusz płytki w poprzek, aby ponownie rozprowadzić komórki. Umieścić jedną płytkę o średnicy 35 mm dodatkowo do liczby warunków w celu zliczenia liczby komórek przed transdukcją wirusa.
  9. Hoduj komórki do następnego dnia, aby osiągnąć gęstość komórek co najmniej 50%. Gęstość komórek mniejsza niż 50% powoduje znaczny spadek wydajności transdukcji wirusa, zwiększone wahania ekspresji białek na komórkę i zwiększoną toksyczność komórek.
    UWAGA: Powlekanie szklanych naczyń fibronektyną poprawia wzrost i morfologię komórek oraz sprzyja prawidłowemu postępowi komórek poprzez mitozę. Generalnie można go zastąpić dostępną w handlu żelatyną, która jest tańsza.

3. Transdukcja adenowirusa i eliminacja endogennego białka przez transfekcję siRNA w komórkach HeLa-RFP-H2B przy użyciu osadów CaPi

Uwaga! Praca z wirusami wymaga specjalnych środków ostrożności i odpowiedniej utylizacji wszystkich materiałów, które miały kontakt z wirusem.

Uwaga! W naszych rękach osady CaPi często mają bardziej niepożądane skutki, na przykład na procesy biologiczne związane z transportem pęcherzyków (np. autofagia). W związku z tym zaleca się użycie kationowego odczynnika do transfekcji lipidów (patrz poniżej) i odczekanie co najmniej 48 godzin przed analizą.

UWAGA: Adenowirus kontrolny posiadający niepowiązany gen (np. LacZ) lub brak genu jest używany do osiągnięcia minimalnego MOI we wszystkich Adenofekcjach (10-20 pfu/komórkę) przy użyciu najmniejszej ilości rekombinowanego adenowirusa przenoszącego interesujący nas gen.

UWAGA: Wykazano, że ta procedura pomaga w normalizacji ekspresji na komórkę w dużej populacji komórek.

  1. Jednego dnia po posiewie komórek policz liczbę komórek z dodatkowej płytki platerowanej. Odessać pożywkę i spłukać raz 1 ml 0,05% trypsyny/EDTA. Dodać ponownie 1 ml 0,05% trypsyny/EDTA i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 aż do odłączenia wszystkich komórek. Dobrze oddziel komórki za pomocą pipety o pojemności 1 ml i policz liczbę komórek na ml za pomocą hemocytometru.
  2. Określ ilość wirusa potrzebną do transdukcji komórek przy wielokrotności infekcji (MOI) wynoszącej 2 jednostki tworzące blaszki (PFU) białka będącego przedmiotem zainteresowania (POI) na komórkę na komórkę i 18 PFU na komórkę pustego wektora (np. LacZ), aby uzyskać w sumie 20 PFU na komórkę. W tym samym czasie transdukuj 4 PFU każdego bakulowirusa (aktyna i αtubulina, GFP i znakowane RFP). Transdukuj komórki przy użyciu następującego protokołu adenofekcji. Wirusy użyto zgodnie z opisem w Fuchs et al. 14
  3. Przygotuj w sterylnym kapturze plastikową tubkę o pojemności 1,5 ml na każdy warunek i dodaj 400 μl ciepłego αMEM-minus10%.
  4. Powoli rozmrażać podwielokrotność wirusów na lodzie i, jeśli to konieczne, rozcieńczyć zapas wirusa w celu odpipetowania objętości większej niż 1 μl w celu zminimalizowania błędów pipetowania.
  5. Do każdej plastikowej probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 400 μl αMEM-minus10% dodać obliczoną ilość wirusa dla każdego warunku i delikatnie wymieszać pipetując. Natychmiast umieścić zapas wirusa z powrotem w temperaturze -80 °C, aby utrzymać jego aktywność.
  6. Odessać pożywkę z komórek i delikatnie pipetować mieszaninę wirusów kroplami. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i ostrożnie mieszać płytki pod sterylnym kapturem co 15 minut przez 1 godzinę, aby dobrze pokryć komórki wirusem. Użycie niewielkiej ilości pożywki ułatwia kontakt wirusa z komórkami.
  7. Po inkubacji delikatnie odpipetować 1,6 ml αMEM-minus10% na każdą płytkę, aby uzyskać całkowitą objętość 2 ml, rozpocząć synchronizację komórek przez dodanie 2 mM tymidyny i inkubować komórki przez kolejne 2 godziny w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
  8. W międzyczasie przygotuj mieszaninę transfekcji siRNA zgodnie z metodą transfekcji CaPi (patrz rysunek 1). Jeśli siRNA nie jest konieczne, zastąp ilość siRNA sterylną wodą, aby wykonać pustą transfekcję.
  9. Oblicz 200 μl mieszanki dla każdego warunku, co daje 400 μl na duplikat. Poniższy przykład jest podany dla końcowego stężenia siRNA wynoszącego 50 nM i musi być dostosowany do każdego białka będącego przedmiotem zainteresowania. W plastikowej probówce o pojemności 1,5 ml odpipetować 50 μl 1 M CaCl2 i 11 μl 20 μM siRNA do 139 μl sterylnegoH2Oi wymieszać przez wirowanie. Po szybkim odwirowaniu ostrożnie dodaj kroplami 200 μl HBS2x (280 mM NaCl, 50 mM HEPES, 1,5 mM Na2HPO4, pH 7,01-7,05).
    UWAGA: Im mniejsze krople, tym mniejsze są osady, co skutkuje lepszą wydajnością transfekcji. Delikatnie wymieszać trzykrotnie przez wstrzyknięcie powietrza za pomocą pipety 200 μl.
  10. Inkubować mieszaninę przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Dodawać powoli, kroplami, 200 μl mieszanki transfekcyjnej do każdej płytki i mieszać krzyżowo. Przenieść płytki w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 16 godzin.
  11. Następnego dnia dwukrotnie przepłucz komórki 2 ml ciepłego HEPESU (6,7 mM KCl, 150 mM NaCl, 10 mM HEPES, pH 7,3) i dodaj 2 ml αMEM-minus10%. Nie należy używać więcej niż czterech płytek komórkowych na raz, ponieważ zmiany temperatury wpływają na długość cyklu komórkowego.
  12. Wizualizacja skuteczności infekcji pod odwróconym mikroskopem fluorescencyjnym przy powiększeniu 20-40x (powietrze) i uzyskanie trzech reprezentatywnych obrazów dla każdego stanu zarówno w kanale fluorescencyjnym, jak i transmisyjnym w celu dokumentacji. Siedem godzin później dodać 2 mM tymidyny i inkubować przez kolejne 16 godzin w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
  13. Następnego dnia, 48 godzin po transfekcji siRNA i zakażeniu wirusem, przepłukać komórki dwukrotnie 2 ml ciepłego buforu fosforanowego soli fizjologicznej (PBS) i uwolnić na 7 godzin w 2 ml αMEM10% w/o czerwieni fenolowej do obrazowania żywych komórek lub czerwieni fenolowej do ekstrakcji białek.
  14. Zbieraj komórki dla każdego stanu 48 godzin po transfekcji w celu przygotowania ekstraktów białkowych i analizy Western blot w celu określenia skuteczności knockdownu i ekspresji endogennego białka15,
    UWAGA: Stosować przeciwciała przeciwko białku będącemu przedmiotem zainteresowania, a także odpowiednie przeciwciała służące jako kontrola obciążenia. Skuteczność knockdownu powinna być określona przez ładowanie zmniejszających się ilości lizatów komórek kontrolnych (transfekowanych kontrolnym siRNA), aby uzyskać krzywą miareczkowania (tj. 1, 1/2, 1/4, 1/8).

4. Transdukcja adenowirusa i eliminacja endogennego białka przez transfekcję siRNA w komórkach HeLa przy użyciu kationowego odczynnika do transfekcji lipidów

UWAGA: Tutaj prezentujemy protokół, który został dostosowany do eksperymentów, które nie obejmują synchronizacji komórek i/lub gdy transfekcja siRNA nie może być przeprowadzona metodą CaPi, na przykład, aby uniknąć niepożądanych efektów toksycznych w niektórych liniach komórkowych. Protokół ten obejmuje również etap ponownego powlekania komórek po adenofekcji w celu pracy przy odpowiedniej gęstości komórek. Przetestowaliśmy tylko kationowy odczynnik do transfekcji lipidów.

Uwaga! Praca z wirusami wymaga specjalnych środków ostrożności i odpowiedniej utylizacji wszystkich materiałów, które miały kontakt z wirusem.

  1. Płytka 1,75 x 105 komórek na szalkę 35 mm w 2,5 ml αMEM10% i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Umieścić jedną płytkę o średnicy 35 mm dodatkowo do liczby warunków w celu zliczenia liczby komórek przed transdukcją wirusa.
  2. Hoduj komórki do następnego dnia, aby osiągnąć gęstość komórek co najmniej 50%. Gęstość komórek mniejsza niż 50% powoduje znaczny spadek wydajności transdukcji wirusa, zwiększone zmiany ekspresji białek na komórkę i zwiększoną toksyczność komórek.
  3. Jednego dnia po posiewie komórek policz liczbę komórek z dodatkowej płytki platerowanej. Odessać pożywkę i spłukać raz 1 ml 0,05% trypsyny/EDTA. Dodać ponownie 1 ml 0,05% trypsyny/EDTA i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 aż do odłączenia wszystkich komórek. Dobrze oddzielić komórki za pomocą pipety o pojemności 1 ml i policzyć liczbę komórek w ml.
  4. Określ ilość wirusa potrzebną do transdukcji wielokrotności infekcji (MOI) 20-40 jednostek tworzących blaszki (PFU) białka będącego przedmiotem zainteresowania (POI) na komórkę i 0-20 PFU na komórkę pustego wektora (np. LacZ), aby uzyskać łącznie 40 PFU na komórkę.
  5. Przygotuj w sterylnym kapturze plastikową tubkę o pojemności 1,5 ml dla każdego schorzenia i dodaj 400 μl ciepłego αMEM10%.
  6. Powoli rozmrażać podwielokrotność wirusów na lodzie i, jeśli to konieczne, rozcieńczyć zapas wirusa w celu odpipetowania objętości większej niż 1 μl w celu zminimalizowania błędów pipetowania.
  7. Do każdej plastikowej probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 400 μl αMEM10% dodać obliczoną ilość wirusa dla każdego stanu i delikatnie wymieszać pipetując. Natychmiast umieścić zapas wirusa z powrotem w temperaturze -80 °C, aby utrzymać jego aktywność.
  8. Odessać pożywkę z komórek i delikatnie pipetować mieszaninę wirusów kroplami. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i ostrożnie mieszać płytki pod sterylnym kapturem co 15 minut przez 1 godzinę, aby dobrze pokryć komórki rozcieńczeniem wirusa. Użycie niewielkiej ilości pożywki ułatwia kontakt wirusa z komórkami.
  9. W międzyczasie przygotuj mieszaninę transfekcji siRNA zgodnie z metodą transfekcji. Jeśli siRNA nie jest konieczne, zastąp ilość siRNA pożywką bez surowicy, aby wykonać pustą transfekcję.
    1. Poniższy przykład jest podany dla końcowego stężenia siRNA wynoszącego 50 nM i musi być dostosowany do każdego białka będącego przedmiotem zainteresowania. Dla każdej pożywki należy przygotować jedną probówkę z tworzywa sztucznego o pojemności 1,5 ml zawierającą 416 nM siRNA w 150 μl pożywki bez surowicy (np. 6,25 μl 20 μM siRNA + 144 μl pożywki bez surowicy) i jedną probówkę z tworzywa sztucznego o pojemności 1,5 ml zawierającą 6,25 μl odczynnika do transfekcji lipidów kationowych + 144 μl pożywki bez surowicy.
    2. Wymieszaj zawartość każdej plastikowej probówki, pipetując kilkakrotnie w górę i w dół za pomocą pipety o pojemności 200 μl. Połączyć zawartość obu probówek i wymieszać, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół za pomocą pipety o pojemności 200 μl. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  10. Po inkubacji z wirusem delikatnie odpipetować 1,8 ml αMEM10% do każdej płytki, aby uzyskać całkowitą objętość 2,2 ml i natychmiast powoli dodawać kroplami mieszaninę do transfekcji siRNA do każdej płytki i mieszać krzyżowo. Przenieść płytki w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 24 godziny.
  11. Następnego dnia ponownie pokryć komórki z każdej płytki 35 mm na czterech nowych płytkach 35 mm w 2,5 ml αMEM10% każda i inkubować przez dodatkowe 24 godziny w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
  12. Następnego dnia, 48 godzin po transfekcji siRNA i zakażeniu wirusem, należy pobrać komórki z jednej płytki dla każdego warunku w celu przygotowania ekstraktów białkowych i analizy Western blot w celu określenia skuteczności knockdownu i ekspresji endogennego białka15,
    UWAGA: Z pozostałymi płytkami przystąp do utrwalania komórek, stosując wybrany protokół i poddaj próbki analizie immunofluorescencyjnej z interesującymi przeciwciałami14.

5. Obrazowanie komórek mitotycznych na żywo i analiza danych

  1. Wykonuj krótkoterminowe eksperymenty obrazowania żywych komórek na komórkach mitotycznych za pomocą odwróconego mikroskopu wyposażonego w nawilżoną komorę / 5% CO2 / regulowaną termicznie.
    UWAGA: W tym badaniu użyto mikroskopu konfokalnego z wirującym dyskiem (40X, 0,75 NA), wyposażonego w chłodzoną EMCCD kamerę ze sprzężeniem ładunkowym w temperaturze -50 °C.
  2. Przed pobraniem sprawdź, czy komora osiągnęła odpowiednią temperaturę 37 °C.
    UWAGA: Może to potrwać kilka godzin, w zależności od systemu mikroskopowego.
  3. Umieść szalki hodowlane w komorze mikroskopu na 1 godzinę przed pobraniem, aby umożliwić prawidłową równowagę pożywki i uniknąć dryfowania ostrości z powodu zmian temperatury. Monitoruj stan mitotyczny komórek. W tym momencie 10-15% komórek powinno znajdować się we wczesnych stadiach mitozy (profaza-prometafaza).
  4. W czasie równowagi ustaw parametry akwizycji określone we wcześniejszych eksperymentach. Zazwyczaj czas naświetlania dla obu kanałów (488 i 594) wynoszący .2-3 s przy natężeniu lasera 100% i czułości 121-130 są odpowiednimi parametrami w naszych rękach.
    UWAGA: Najpierw należy wykonać testy w celu określenia minimalnej intensywności lasera i czasu/interwału akwizycji, które skutkują odpowiednią rozdzielczością przy minimalnym fotowybielaniu, które powoduje uszkodzenia komórek i zaburza progresję mitotyczną.
  5. Wybierz kilka pól dla każdego warunku, aby uzyskać znaczną liczbę komórek do przeanalizowania bez przekraczania interwału pozyskiwania. Korzystając z systemu konfokalnego z wirującym dyskiem, typowa konfiguracja będzie obejmować cztery różne warunki, 7 pól na płytę i 2 kanały kolorów (488 i 594) z odstępem 1,5-2 minut w okresie 75 minut.
  6. Wybierz komórki, które znajdują się w punkcie wejścia mitotycznego, ponownie ustaw fokus po wybraniu wszystkich pól i rozpocznij akwizycję tak szybko, jak to możliwe.
  7. Monitoruj stabilność systemu przez co najmniej trzy punkty czasowe i w razie potrzeby ponownie ustaw ostrość.
  8. Po pierwszym krótkoterminowym obrazowaniu żywych komórek trwającym 75 minut, można wybrać nowe pola komórek mitotycznych w celu uzyskania drugiego zestawu filmów w celu zwiększenia liczby analizowanych komórek.
  9. Określ dobrze zdefiniowane kryteria analizy mitotycznych fenotypów komórek, które będą zależeć od użytych markerów fluorescencyjnych. Wady mitozy mogą obejmować wydłużony czas spędzony w mitozie (od rozpadu jądra do anafazy), niewspółosiowość chromosomów, kołysanie wrzeciona i pęcherzenie kory14.

6. Transdukcja adenowirusa LifeAct-TagGFP2 w różnicowaniu mioblastów myszy C2C12

UWAGA: Protokół adenofekcji ma również zastosowanie do trudnych do zainfekowania mysich mioblastów C2C12 ulegających różnicowaniu.

  1. Płytka 2 x 105 komórek C2C12 w szalkach hodowlanych 35 mm w pożywce wzrostowej na plastiku lub na wybranym podłożu.
    UWAGA: Różnicowanie komórek poprawia się na naczyniach pokrytych żelatyną lub matryżelem. Zaplanuj jedną dodatkową płytkę, aby określić liczbę komórek przed transdukcją wirusa.
  2. Następnego dnia komórki powinny osiągnąć 80% konfluencji. Indukuj różnicowanie mioblastów poprzez dwukrotne przemycie komórek ciepłym PBS i dodanie 2 ml pożywki różnicującej (DM).
  3. Następnego dnia, oznaczonego jako dzień 1 (D1) różnicowania, transdukuj miocyty za pomocą adenowirusa LifeAct-TagGFP2, aby uwidocznić cytoszkielet aktynowy w żywych komórkach. Policz numer komórki z dodatkowej tabliczki, jak opisano w ppkt 3.2. Obliczyć 5 PFU/komórkę adenowirusa LifeAct-TagGFP2 i 45 PFU/komórkę AdLacZ zgodnie z przykładem opisanym w tabeli 1. Całkowita ilość wirusa wynosi 50 PFU/komórkę. Wirusy użyto zgodnie z opisem14
  4. Przygotuj w sterylnym kapturze plastikową tubkę o pojemności 1,5 ml na każdy warunek i dodaj 400 μl ciepłej masy.
  5. Powoli rozmrażać podwielokrotność wirusów na lodzie i, jeśli to konieczne, rozcieńczyć zapas wirusa w celu odpipetowania objętości większej niż 1 μl w celu zminimalizowania błędów pipetowania.
  6. Do każdej plastikowej probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 400 μl s.m. dodać odpowiednią ilość cząsteczek wirusa na stan i delikatnie wymieszać pipetując. Natychmiast umieścić zapas wirusa z powrotem w temperaturze -80 °C, aby utrzymać jego aktywność.
  7. Odessać pożywkę z szalek i delikatnie odpipetować mieszaninę wirusów kroplami. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i ostrożnie mieszać płytki pod sterylnym kapturem co 15 minut, w sumie przez 1 godzinę, aby dobrze pokryć komórki wirusem.
  8. Po inkubacji delikatnie odpipetować 1,6 ml s.m. na każdą płytkę i kontynuować inkubację przez dodatkowe 2 godziny w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
  9. W międzyczasie przygotuj pustą mieszankę transfekcyjną zgodnie z metodą transfekcji CaPi. Oblicz 200 μl mieszanki dla każdego warunku. Użyj poniższego przykładu, aby uzyskać całkowitą objętość mieszanki 400 μl.
    1. W plastikowej probówce o pojemności 1,5 ml odpipetować pipetę 50 μl 1 M CaCl2 do 150 μl sterylnegoH2Oi wymieszać przez wirowanie. Po szybkim odwirowaniu ostrożnie dodaj kroplami 200 μl HBS2x (280 mM NaCl, 50 mM HEPES, 1,5 mM Na2HPO4, pH 7,01-7,05). Delikatnie wymieszać trzykrotnie przez wstrzyknięcie powietrza za pomocą pipety o pojemności 200 μl.
  10. Inkubować mieszaninę przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Dodawać powoli, kroplami, 200 μl mieszanki transfekcyjnej do każdej płytki i mieszać krzyżowo. Przenieść płytki w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 16 godzin.
  11. Następnego dnia przepłucz komórki dwukrotnie 2 ml ciepłego HEPES-u (6,7 mM KCl, 150 mM NaCl, 10 mM HEPES, pH 7,3) i dodaj 2 ml s.m. Zwizualizuj skuteczność infekcji pod odwróconym mikroskopem fluorescencyjnym przy powiększeniu 20-40X (powietrze) i uzyskaj trzy reprezentatywne obrazy dla każdego stanu zarówno w kanałach fluorescencyjnych, jak i transmisyjnych w celu dokumentacji.
  12. W zależności od pożądanej konfiguracji eksperymentu, śledź różnicowanie do miotub przez kilka dni. Komórki można utrwalić, a następnie poddać analizie immunofluorescencyjnej lub przeprowadzić badania obrazowania żywych komórek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transfekcja plazmidowego DNA BAG3-GFP przy użyciu kationowych lipidów wiązała się z niejednorodną ekspresją w komórkach HeLa, niektóre komórki wykazywały ledwo wykrywalny poziom białka, a inne miały bardzo wysoki poziom BAG3 (Rysunek 2A). W tych komórkach utrata homeostazy białek została udowodniona przez akumulację BAG3-GFP w agregatach okołojądrowych (Figura 2A, strzałki). W przeciwieństwie do tego, transdukcja komórkowa z adenowirusami przenoszącymi BA...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym miejscu opisano metodę umożliwiającą przeprowadzenie eksperymentów depletion-rescue, która ma zastosowanie w analizach funkcjonalnych procesów biologicznych komórek, które są szczególnie wrażliwe na nadekspresję białek wpływających na stechiometrię i dynamikę kompleksów białkowych i struktur makromolekularnych. Podział komórki mitotycznej jest ekstremalnym przykładem precyzyjnie dostrojonej morfodynamiki komórki, która obejmuje najbardziej dramatyczne i spektakularne zmiany w ogólnej strukturze komórki. Stosując ad...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Kanadyjskie Instytuty Badań nad Zdrowiem (Grant nr 7077) oraz przez Fundację Belliniego i Roby Fondazione.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
C2C12 Mysie mioblastyATCCCRL-1772
Adenovirus niestandardowy projektWelgenNiestandardowy projekt
Chlorek wapniaFisher ScientificC79-500
CellLight® Actin-GFP, BacMam 2.0Thermo FisherC10582
CellLight® Tubulin-RFP, BacMam 2.0Thermo FisherC10614
Dulbecco" s zmodyfikowany Orzeł" s medium (DMEM), Termo Fisher o wysokiej zawartości glukozy11965-092
EDTASigmaE5134
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Thermo Fisher12483-020
FibronectinSigmaF1141
Naczynia ze szklanym dnem, 35 mmMatTek CorperationP35G-1.5-20-C Case
HeLa-RFP-H2BUprzejmy prezent od dr Sabine Elowe, Qué bec, KanadaKlebig C et al. 2009
HEPESFisher ScientificBP310-1
Serum dla koni, Nowa ZelandiaThermo Fisher16050-122
KClFisher ScientificBP366-500
L-GlutaminaThermo Fisher25030081
Lipofectamina® Odczynnik do transfekcji RNAiMAXThermo Fisher13778-150
Minimal Essential Medium (MEM) AlphaBisent310-101-CL
Minimal Essential Medium (MEM) Alpha bez Desoxyribonuleosides/RybonukleozydówThermo Fisher12000-022
Minimal Essential Medium (MEM) Alpha bez Phenol RedThermo Fisher41061-029
Na2HPO4BiobasicS0404
NaClFisher ScientificBP358-10
OptiMEMThermo Fisher11058-021
rAVCMV-LifeAct-TagGFP2IBIDI60121
dupleksy siRNADharmaconNiestandardowy projekt
TymidynaSigmaT9250
Trypsyna 2,5%Thermo Fisher15090-046

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nat Rev Genet. 11 (9), 636-646 (2010).
  2. Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
  3. Boettcher, M., McManus, M. T. Choosing the Right Tool for the Job: RNAi, TALEN, or CRISPR. Mol Cell. 58 (4), 575-585 (2015).
  4. Natarajan, K., Rajala, M. S., Chodosh, J. Corneal IL-8 expression following adenovirus infection is mediated by c-Src activation in human corneal fibroblasts. J Immunol. 170 (12), 6234-6243 (2003).
  5. Yousuf, M. A., et al. Caveolin-1 associated adenovirus entry into human corneal cells. PLoS One. 8 (10), e77462(2013).
  6. Morton, P. E., Hicks, A., Nastos, T., Santis, G., Parsons, M. CAR regulates epithelial cell junction stability through control of E-cadherin trafficking. Sci Rep. 3, 2889(2013).
  7. Carra, S., Seguin, S. J., Lambert, H., Landry, J. HspB8 chaperone activity toward poly(Q)-containing proteins depends on its association with Bag3, a stimulator of macroautophagy. J Biol Chem. 283 (3), 1437-1444 (2008).
  8. Fuchs, M., et al. Identification of the key structural motifs involved in HspB8/HspB6-Bag3 interaction. Biochem J. 425 (1), 245-255 (2010).
  9. Rosati, A., Graziano, V., De Laurenzi, V., Pascale, M., Turco, M. C. BAG3: a multifaceted protein that regulates major cell pathways. Cell Death Dis. 2, e141(2011).
  10. Guilbert, S. M., et al. The Big Book of Small Heat Shock Proteins. Tanguay, R. M., Hightower, L. E. , Springer International Publishing AG. 435-456 (2015).
  11. Fasbender, A., et al. Complexes of adenovirus with polycationic polymers and cationic lipids increase the efficiency of gene transfer in vitro and in vivo. J Biol Chem. 272 (10), 6479-6489 (1997).
  12. Toyoda, K., et al. Cationic polymer and lipids enhance adenovirus-mediated gene transfer to rabbit carotid artery. Stroke. 29 (10), 2181-2188 (1998).
  13. Fasbender, A., et al. Incorporation of adenovirus in calcium phosphate precipitates enhances gene transfer to airway epithelia in vitro and in vivo. J Clin Invest. 102 (1), 184-193 (1998).
  14. Fuchs, M., et al. A Role for the Chaperone Complex BAG3-HSPB8 in Actin Dynamics, Spindle Orientation and Proper Chromosome Segregation during Mitosis. PLoS Genetics. 11 (10), e1005582(2015).
  15. Champagne, C., Landry, M. C., Gingras, M. C., Lavoie, J. N. Activation of adenovirus type 2 early region 4 ORF4 cytoplasmic death function by direct binding to Src kinase domain. J Biol Chem. 279 (24), 25905-25915 (2004).
  16. Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nat Methods. 5 (7), 605-607 (2008).
  17. Takahashi, A., et al. Myogenic Akt signaling regulates blood vessel recruitment during myofiber growth. Mol Cell Biol. 22 (13), 4803-4814 (2002).
  18. Murray, T. V., et al. A non-apoptotic role for caspase-9 in muscle differentiation. J Cell Sci. 121 (Pt 22), 3786-3793 (2008).
  19. Terada, K., Misao, S., Katase, N., Nishimatsu, S., Nohno, T. Interaction of Wnt Signaling with BMP/Smad Signaling during the Transition from Cell Proliferation to Myogenic Differentiation in Mouse Myoblast-Derived Cells). Int J Cell Biol. 2013, 616294(2013).
  20. Hindi, S. M., Tajrishi, M. M., Kumar, A. Signaling mechanisms in mammalian myoblast fusion. Sci Signal. 6 (272), re2(2013).
  21. Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition). Autophagy. 12 (1), 1-222 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

AdenofectionDepletion RescueMolecular ChaperonesCellular MorphodynamicsBAG3 ProteinsiRNA TransductionAdenovirus ExpressionGFP TaggingMitotic AnalysisLive Cell Imaging

Powiązane artykuły