Artykuł metodologiczny

Pomiar aktywności integracyjnej in vitro kompleksów przedintegracyjnych HIV-1

DOI:

10.3791/54581

⸱

22 lutego 2017

 ,  ,  ,  , 
1Center for AIDS Health Disparities Research, Meharry Medical College, 2Department of Biochemistry and Cancer Biology, Meharry Medical College, 3School of Graduate Studies and Research, Meharry Medical College, 4Department of Microbiology and Immunology, Meharry Medical College, 5Tennessee Center for AIDS Research (TN-CFAR), Meharry Medical College

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten raport opisuje test in vitro do pomiaru aktywności integracyjnej ludzkiego wirusa niedoboru odporności typu 1 (HIV-1) związanego z kompleksem preintegracji () w ekstraktach cytoplazmatycznych ostro zakażonych komórek. Integracja DNA HIV-1 związanego z z heterologicznym docelowym DNA jest określana ilościowo przy użyciu zagnieżdżonej strategii reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Białka otoczki HIV-1 angażują pokrewne receptory na powierzchni komórki docelowej, co prowadzi do fuzji błony komórkowej wirusa, a następnie uwolnienia rdzenia kapsydu wirusa (CA) do cytoplazmy. Następnie wirusowa odwrotna transkryptaza (RT), jako część kompleksu nukleoproteinowego o nazwie zwanego kompleksem odwrotnej transkrypcji (RTC), przekształca jednoniciowy genom wirusa RNA w dwuniciową kopię DNA (vDNA). Prowadzi to do biogenezy innego kompleksu nukleoproteinowego, zwanego kompleksem preintegracyjnym (), składającego się z vDNA i powiązanych białek wirusa oraz czynników gospodarza. Integraza wirusowa (IN) związana z koordynuje integrację vDNA z chromosomalnym DNA gospodarza w dwuetapowym procesie regulowanym czasowo i przestrzennie. Po pierwsze, IN przetwarza końce 3' vDNA w cytoplazmie, a po drugie, po tym, jak przejdzie do jądra, pośredniczy w integracji przetworzonego vDNA z chromosomalnym DNA. wyizolowane z komórek docelowych ostro zakażonych HIV-1 są funkcjonalne in vitro, ponieważ są zdolne do integracji powiązanego vDNA z egzogennie dodanym heterologicznym docelowym DNA. Takie testy integracji in vitro oparte na znacząco przyczyniły się do nakreślenia mechanistycznych szczegółów integracji retrowirusowej i odkrycia inhibitorów IN. W tym raporcie omawiamy zaktualizowany test HIV-1, który wykorzystuje zagnieżdżoną ilościową strategię opartą na reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR) w czasie rzeczywistym do pomiaru aktywności integracyjnej in vitro izolowanych natywnych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Replikacja HIV-1 w komórce docelowej składa się z wielu etapów, podzielonych na dwie fazy: wczesne i późne zdarzenia. Wczesne zdarzenia rozpoczynają się, gdy HIV-1 sekwencyjnie wiąże się z receptorem na powierzchni komórki docelowej CD4 i jednym z dwóch koreceptorów (CCR5 lub CXCR4)1. W konsekwencji błony komórkowe wirusa łączą się, a rdzeń kapsydu wirusa (CA) jest uwalniany do cytoplazmy2. Rdzeń CA zawiera jednoniciowy RNA genomu wirusa (ssRNA) i kilka białek, zarówno pochodzenia wirusowego, jak i komórkowego. Białka wirusowe związane z CA obejmują odwrotną transkryptazę (RT) i integrazę (IN), dwa enzymy, które pośredniczą w krytycznych etapach podczas wczesnych zdarzeń replikacji wirusa. Funkcja RT i IN w kontekście kompleksów nukleoproteinowych, a mianowicie odpowiednio kompleksu odwrotnej transkrypcji (RTC) i kompleksu pre-integracji ()3,4,5,6. Końce wirusowego genomu ssRNA zawierają końcowe elementy powtórzeń (R) sąsiadujące z unikalnymi sekwencjami U5 (na końcu 5') i U3 (na końcu 3'). RTC przekształca genom wirusa ssRNA w dwuniciową (ds) kopię DNA (vDNA). Ten proces odwrotnej transkrypcji powoduje również duplikację sekwencji U5 i U3, generując w ten sposób długie powtórzenia końcowe (LTR) na obu końcach vDNA7,8. Następnie IN związany z katalizuje dwie sekwencyjne reakcje biochemiczne, które umożliwiają integrację vDNA z chromosomem gospodarza9,10,11. Po pierwsze, w cytoplazmie, multimery IN angażują oba LTRs12 i rozszczepiają dinukleotyd z każdego z 3'-końcowych końców. To przetwarzanie końca 3' generuje grupę hydroksylową na każdym końcu 3' (CAOH) vDNA. Następnie przemieszcza się do jądra, w którym IN wykorzystuje vDNA CAOH jako nukleofil do przecięcia obu nici chromosomalnego DNA w sposób rozłożony. Jednocześnie IN koordynuje oba końce vDNA z powstałymi wiązaniami fosfodiestrowymi na przeciwległych niciach chromosomalnego DNA. Po tym etapie przenoszenia nici maszyneria komórki gospodarza usuwa dwa niesparowane nukleotydy na końcach 5' vDNA i naprawia powstałe jednoniciowe luki na styku miejsca integracji. Kulminacją wczesnych wydarzeń jest zatem ustanowienie zintegrowanej kopii DNA (prowirusa) genomu HIV-1. Prowirus zapewnia odpowiednie środowisko dla efektywnej ekspresji genów wirusa, która inicjuje późniejsze zdarzenia, w tym ekspresję białek kodowanych przez wirusa; gromadzenie się niedojrzałego wirusa; oraz pączkowanie, uwalnianie i dojrzewanie do zakaźnych wirionów13.

Oczyszczony rekombinowany retrowirusowy IN jest kompetentny do przeprowadzania, in vitro, zarówno przetwarzania końca 3', jak i przenoszenia nici na egzogennie dostarczonym substramencie podobnym do LTR DNA. Badania biochemiczne z użyciem tak oczyszczonego rekombinantu IN ujawniły krytyczne aspekty integracji vDNA14,15,16,17. Jednak w przeciwieństwie do naturalnej infekcji, ta reakcja biochemiczna in vitro nie wspiera skoordynowanej integracji obu końców substratowego DNA z docelowym DNA. W przeciwieństwie do tego, retrowirusowe wyizolowane z ostro zakażonych komórek zgodnie integrują oba końce endogennego vDNA z heterologicznym docelowym DNA. Doprowadziło to do powszechnego przyjęcia i późniejszego udoskonalenia testów integracji invitro (IVI) z wykorzystaniem izolowanych natywnych.

W pierwszym opisanym retrowirusowym teście IVI, ekstrakty cytoplazmatyczne z komórek zakażonych rekombinowanym wirusem białaczki mysiej (MLV) zawierającym gen E. coli supF w swoim LTR służyły jako źródło aktywności IN, a DNA zmutowanego faga lambda z defektem wzrostu litycznego było egzogennie dostarczane jako docelowe DNA. Udana integracja kopii rekombinowanego DNA MLV z DNA faga i wynikająca z tego ekspresja supF doprowadziły do przywrócenia zdolności rekombinowanych fagów do tworzenia płytek miażdżycowych. Jednak ta eksperymentalna strategia jest pracochłonna i mierzy integrację w sposób pośredni. Aby rozwiązać takie zastrzeżenia, opracowano test pośredniego znakowania końcowego oparty na Southern blot, który określa ilościowo aktywność IVI związaną z jako miarę endogennego vDNA zintegrowanego z egzogennym linearyzowanym DNA bakteriofaga phiX174, 6,7,18. Chociaż metoda ta zapewnia bezpośredni pomiar wydarzeń integracyjnych, wymagane są stosunkowo duże ilości przygotowania, co pozostaje technicznie trudnym przedsięwzięciem. Aby obejść ten problem, opracowano zagnieżdżone testy oparte na PCR, wymagające jedynie niewielkiej ilości4,5,19.

W tym raporcie opisujemy zaktualizowaną wersję zagnieżdżonej metody in vitro opartej na PCR, opracowanej w celu podsumowania aktywności integracyjnej HIV-1 za pośrednictwem występującej podczas naturalnej infekcji. Metoda ta wykorzystuje ekstrakty cytoplazmatyczne z komórek docelowych zakażonych wirusem HIV-1 jako źródło endogennej aktywności, która jest mierzona za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR) w czasie rzeczywistym. Procedury izolowania i pomiaru ich działań integracyjnych są zaadaptowane, z modyfikacjami, na podstawie protokołów opublikowanych przez laboratorium Engelmana20. W tej metodzie aktywność integracyjna związana z jest inicjowana przez dostarczenie egzogennego liniowego docelowego DNA21, a produkty DNA powstałe w wyniku tej reakcji integracji są oczyszczane i wykorzystywane jako materiał wyjściowy do późniejszej kwantyfikacji opartej na PCR. W pierwszej rundzie konwencjonalnej PCR połączenia DNA wirus-cel są amplifikowane przy użyciu odpowiednich starterów. W drugiej rundzie qPCR startery specyficzne dla LTR są używane do specyficznego wzbogacenia populacji vDNA z produktów pierwszej rundy PCR. Zapoznaj się z sekcją dotyczącą protokołu, aby uzyskać szczegółowy opis tej metody.

Badania in vitro z retrowirusowymi doprowadziły do znacznego postępu w naszym zrozumieniu mechanizmu integracji retrowirusowego DNA oraz w rozwoju inhibitorów IN. Opierając się na niedawnym zwiększonym nacisku na mapowanie miejsc integracji HIV-1, określanie roli czynników wirusa i gospodarza w integracji HIV-1 oraz opracowywanie nowych leków przeciwwirusowych w celu zwalczania oporności na leki, przewidujemy zwiększone zainteresowanie i powszechne stosowanie testów IVI, takich jak te opisane w niniejszym raporcie. To z kolei doprowadzi do przyszłych udoskonaleń metody, a tym samym zróżnicowania zakresu jej zastosowań.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Produkcja wirusów

UWAGA: Aby wygenerować wysokie miana zakaźnego HIV-1, przetransfekuj linię komórkową 293T ludzkiej embrionalnej nerki (HEK) zakaźnym klonem molekularnym HIV-1 za pomocą odczynnika do transfekcji na bazie aktywowanego dendrymeru. Zaobserwowano, że metoda transfekcji fosforanu wapnia daje porównywalne wyniki.

  1. W laboratorium o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL2) wysiewaj 3 x 106 komórek 293T na 10 cm naczynie w 8 ml zmodyfikowanego podłoża Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionego 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), penicyliną i streptomycyną. Hodować komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5%CO2 O/N.
  2. Następnego dnia, w celu transfekcji komórek w każdym 10-centymetrowym naczyniu, rozcieńczyć 8 μg plazmidowego DNA pNL4-3 (patrz Tabela Materiałów) do końcowej objętości 300 μL DMEM bez surowicy i antybiotyków. Dodać 80 μl odczynnika do transfekcji, dobrze wymieszać przez pipetowanie i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 - 10 minut w celu utworzenia kompleksu transfekcji.
  3. Usuń pożywkę z szalek przez aspirację i dodaj 7 ml na naczynie świeżego DMEM zawierającego surowicę i antybiotyki.
  4. Dodać 1 ml DMEM zawierającego surowicę i antybiotyki do kompleksu transfekcyjnego, wymieszać pipetując i dodać tę mieszaninę do komórek. Delikatnie zamieszaj naczynie, aby ułatwić równomierne rozprowadzenie kompleksów transfekcyjnych.
  5. Natychmiast przenieść komórki do laboratorium BSL3, umieścić w inkubatorze ustawionym w temperaturze 37 °C i 5% CO2 i hodować komórki przez 48 godzin.
  6. Zebrać supernatant kultury tkankowej zawierający wirusa za pomocą pipety, a następnie przenieść go do probówki wirówkowej. Wirować przy 300 x g przez 5 minut, aby osadzać komórki i zanieczyszczenia, a następnie przefiltrować supernatant przez filtr strzykawkowy o wielkości porów 0,45 μm.
  7. Aby wyeliminować wszelkie przeniesione plazmidowe DNA w tym bezkomórkowym preparacie wirusa, należy traktować DNazą 1 (20 μg/ml) w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
  8. Aby określić ilościowo miano wirusa HIV-1, należy użyć testu immunoenzymatycznego (ELISA) specyficznego dla p24, ponieważ jest to szybka i łatwa metoda do rutynowego stosowania22.
    UWAGA: Należy zauważyć, że test ELISA p24 mierzy miano fizyczne (liczbę cząstek wirusa). Alternatywnie, pomiar aktywności RT związanej z wirusem (egzogenny test RT) lub zakaźności wirusa (testy zakaźności oparte na linii komórkowej wskaźnikowej TZM-bl) zapewni wyłączny odczyt zakaźnych cząstek wirusa.

2. Infekcja wirusowa komórek Sup-T1 (BSL3 Lab)

  1. W laboratorium BSL2 utrzymuj komórki Sup-T1 między 1,0 x 106 a 2,0 x 106 komórek/ml w pożywce Roswell Park Memorial Institute (RPMI) uzupełnionej 10% inaktywowanym termicznie FBS, penicyliną i streptomycyną (stosunek podziału 1:2 co 2-3 dni). Zebrać komórki Sup-T1 z kolb hodowlanych, dobrze wymieszać przez pipetowanie i określić liczbę żywotnych komórek za pomocą hemocytometru i metody barwienia wykluczającego błękit trypanowy.
    1. Przygotować wymaganą liczbę podwielokrotności 80 x 106 komórek (na infekcję wirusową) w stożkowych probówkach wirówkowych o pojemności 50 ml.
    2. Odwirować komórki w wirniku z wahliwym kubełkiem o ciśnieniu 500 x g i temperaturze 25 °C przez 5 minut. Nie usuwając pożywki do hodowli komórkowych, przenieś probówki zawierające granulowane komórki do laboratorium BSL3 w celu dalszego przetwarzania. Ostrożnie odessać pożywkę do hodowli komórkowych z probówki, nie naruszając osadu komórkowego.
  2. Dodać odpowiednią ilość inokulum wirusa poddanego działaniu DNazy I do komórek w probówce i dobrze wymieszać przez delikatne pipetowanie. W przypadku komórek 80 x 106 użyj 30 ml wirusa potraktowanego DNazą I (50 μg wirusa równoważnego p24).
    UWAGA: Izolacja funkcjonalnych wymaga zakażenia komórek docelowych bardzo dużą wielokrotnością infekcji (MOI).
  3. Rozprowadzić mieszaninę równomiernie między dwiema 6-dołkowymi płytkami do hodowli tkankowej (tj. 12 x 2,5 ml podwielokrotności; użyć 2 płytek na zakażenie).
  4. W celu spinokulacji umieścić płytki hodowlane w nośnikach płytek i odwirować za pomocą obracającego się wirnika kubełkowego o sile 480 x g i temperaturze 25 °C przez 2 godziny.
  5. Inkubować komórki kolczaste w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 5 godzin.

3. Pobieranie i liza zainfekowanych komórek (BSL3 lab)

  1. Połącz komórki odpowiadające każdej infekcji z płytek hodowlanych w stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml (łącznie ~30 ml).
  2. Zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze 300 x g i temperaturze 25 °C przez 10 minut. Ostrożnie odessać supernatant z probówki (alternatywnie użyć pipety).
  3. Aby usunąć wszelkie pozostałości cząstek wirusa, przemyć każdą komórkę, dodając 2 ml buforu K-/- (150 mM KCl, 20 mM HEPES, pH 7,6, 5 mM MgCl2) i odwirowując próbkę w temperaturze 300 x g i 25 °C przez 10 minut. Następnie, nie naruszając osadu, ostrożnie usunąć supernatant przez aspirację lub za pomocą pipety.
  4. Powtórz krok 3.3.
  5. Ostrożnie usunąć resztki buforu za pomocą mikropipety. Zawiesić każdą komórkę w 2 ml lodowatego buforu do lizy K+/+ (bufor K-/- uzupełniony 0,025% digitoniny, 1 mM DTT, 20 μg/ml aprotyniny), wymieszać zawartość przez delikatne pipetowanie i przenieść do probówki mikrowirówkowej o pojemności 2 ml.

4. Przygotowanie cytoplazmatycznych (laboratorium BSL3)

  1. Wstrząsaj próbkami na wytrząsarce obrotowej w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
  2. Odwirować próbki, z wirnikiem wstępnie schłodzonym do temperatury 4 °C, przy 1 500 x g i 4 °C przez 4 minuty.
  3. Nie naruszając osadu, ostrożnie przenieść supernatant do świeżej probówki do mikrowirówki i wirować w temperaturze 16 000 x g i 4 °C przez 1 min.
  4. Ostrożnie przenieść supernatant do świeżej probówki do mikrowirówki. Dodać RNazę A (20 mg/ml) do końcowego stężenia 20 μg/ml (2 μl na 2 ml) i inkubować zawartość w temperaturze pokojowej przez 30 minut (bez kołysania).
  5. Dodać sacharozę (60% w/v w buforze K-/-) do końcowego stężenia 7% i dobrze wymieszać przez delikatne pipetowanie. Przygotować podwielokrotności (np. 200 μl) w probówkach do mikrowirówek, błyskawicznie zamrozić w ciekłym azocie i umieścić w zamrażarce o temperaturze -80 °C w celu długotrwałego przechowywania.

5. Testy integracji in vitro (IVI) z wykorzystaniem HIV-1

  1. Przygotuj docelowe DNA użyte w teście IVI, amplifikując region 2,0 kb z plazmidowego DNA phiX174 za pomocą PCR przy użyciu niestandardowych starterów, phiX174-F i phiX174-R.
    1. Zmontuj mieszaninę PCR zgodnie z opisem w tabeli 1. Przeprowadzić PCR w termocyklerze, stosując warunki cykli termicznych zalecane w Tabeli 2. Produkt PCR należy oczyścić żelem za pomocą zestawu do oczyszczania żelu (zgodnie z protokołem zalecanym przez producenta) i przechowywać oczyszczone docelowe DNA w postaci podwielokrotności w temperaturze -80 °C do momentu użycia.
  2. Dodać 600 ng docelowego DNA do 200 μl podwielokrotności, dobrze wymieszać i inkubować w temperaturze 37 °C przez 45 min.
    Uwaga: Reakcje dożylne z pominięciem docelowego DNA lub zawierające inhibitor integrazy (np. Raltegravir) są zalecanymi reakcjami kontrolnymi.
  3. Zatrzymaj reakcję IVI, dodając SDS, EDTA i proteinazę K do końcowych stężeń odpowiednio 0,5%, 8 mM i 0,5 mg / ml. Dokładnie wymieszać zawartość reakcyjną i inkubować przez noc w temperaturze 56 °C.
  4. Następnego dnia oczyść całkowite DNA z reakcji IVI przez ekstrakcję fenolem/chloroformem i wytrącanie etanolu. Przeprowadzić wszystkie etapy wirowania przy 16 000 x g i RT.
  5. Dodać równą objętość fenolu do odbiałkozczałej próbki, energicznie wymieszać przez wirowanie i odwirować przez 2 minuty. Ostrożnie usunąć górną fazę wodną i przenieść ją do świeżej probówki.
  6. Powtórz krok 5.5. Przenieś górną fazę wodną do świeżej probówki.
  7. Dodać równą objętość mieszaniny fenolu i chloroformu w stosunku 1:1, energicznie wymieszać przez wirowanie i odwirować przez 2 minuty. Przenieść górną fazę wodną do świeżej probówki.
  8. Dodać równą objętość chloroformu, energicznie wymieszać przez wirowanie i odwirować przez 2 minuty. Przenieść górną fazę wodną do świeżej probówki.
  9. Aby wytrącić DNA, dodaj glikogen do końcowego stężenia 0,1 μg/μl, 3 M octanu sodu do końcowego stężenia 0,3 M i 2,5 objętości 100% etanolu (lodowaty). Zmieszać wirowo, krótko odwirować w celu zebrania zawartości i umieścić probówkę w temperaturze -80 °C O/N.
  10. Następnego dnia odwirować próbkę przez 30 minut w temperaturze 16 000 x g i w temperaturze 4 °C przez 30 minut. Ostrożnie usunąć supernatant, nie naruszając osadu.
  11. Dodać 500 μl 80% etanolu (lodowatego) do osadu i odwirować przy 16 000 x g i 4 °C przez 10 min. Wysuszyć na powietrzu osad DNA w temperaturze pokojowej i dokładnie zawiesić w 50 μl wody wolnej od nukleaz. Przechowywać próbki DNA w temperaturze -20 °C.

6. Testy PCR do ilościowego określania aktywności

UWAGA: Liczba kopii DNA HIV-1 zintegrowanego z docelowym DNA jest określana ilościowo za pomocą zagnieżdżonej strategii PCR, która wykorzystuje 2 zestawy starterów i 2 sekwencyjne rundy PCR.

  1. Wykonaj pierwszą rundę konwencjonalnego PCR przy użyciu starterów ukierunkowanych na wirusowy LTR i DNA phiX174 (odpowiednio startery LTR i phiX174) w celu amplifikacji połączeń zintegrowanego DNA HIV-1.
    1. Zebrać mieszaninę PCR pierwszej rundy zgodnie z opisem w tabeli 3. Zebrać główną mieszankę wszystkich składników z wyjątkiem matrycy DNA, dozować 45 μl porcji do oddzielnych probówek do PCR i dodać 5 μl matrycy DNA lub wody wolnej od nukleaz (kontrola).
    2. Przeprowadzić PCR w termocyklerze, stosując warunki cykli termicznych zalecane w Tabeli 4.
  2. Wykonaj drugą rundę qPCR przy użyciu starterów, które otaczają krótki region wirusowego LTR (startery LTR-R i LTR-U) w celu selektywnej amplifikacji zintegrowanych sekwencji vDNA z produktów pierwszej rundy PCR. Aby określić liczbę zintegrowanych kopii vDNA, wygeneruj krzywą standardową, używając 10-krotnych seryjnych rozcieńczeń znanych liczb kopii (np. 100 - 108) klonu molekularnego HIV-1.
    1. Zebrać mieszaninę qPCR drugiej rundy zgodnie z opisem w tabeli 5. Zebrać główną mieszankę wszystkich składników z wyjątkiem matrycy DNA, ostrożnie dozować 25 μl podwielokrotności do odpowiedniej liczby dołków na 96-dołkowej płytce reakcyjnej PCR, a następnie dodać 5 μl nieoczyszczonych produktów pierwszej rundy PCR lub wody wolnej od nukleaz (kontrola). Przeprowadzić wszystkie reakcje qPCR w trzech powtórzeniach.
    2. Załaduj płytkę PCR do urządzenia do PCR w czasie rzeczywistym i wykonaj qPCR w warunkach cyklicznych zalecanych w Tabeli 6.
    3. Analizuj dane za pomocą odpowiedniego oprogramowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Izolacja HIV-1

Schemat protokołu używanego do izolacji HIV-1 od ostro zakażonych komórek Sup-T1 jest przedstawiony na rysunku 1. Protokół ten wywodzi się z metod opisanych przez Engelmana i wsp. 19,20. HIV-1 to kompleksy nukleoproteinowe, które są składane w zakażonych komórkach i składają się z odwrotnie transkrybowanego vDNA, ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analizy biochemiczne retrowirusowych dostarczyły kluczowych informacji na temat mechanizmu integracji retrowirusowego DNA. Pomiar aktywności integracyjnej retrowirusowych można osiągnąć za pomocą testu tworzenia blaszek miażdżycowych, analizy Southern blot i zagnieżdżonego qPCR. Eksperymentalna strategia oznaczania płytki nazębnej jest pracochłonna i wykorzystuje metodę pośrednią do pomiaru integracji 6,7,18. Testy oparte na Sou...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych i niefinansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca jest częściowo wspierana przez granty DA024558, DA30896, DA033892 i DA021471 z NIDA/NIH na CD. Uznajemy również grant RCMI G12MD007586, grant Vanderbilt CTSA UL1RR024975, grant U54 RR026140 Meharry Translational Research Center (MeTRC) z NCRR/NIH, MD007593 grantowy U54 z NIMHD/NIH oraz grant Tennessee CFAR P30 AI110527.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze

Płodowa surowica bydlęca (FBS)

GIBCO/Invitrogen

10437-028

Inaktywowana termicznie płodowa surowica bydlęca (Hi-FBS)

GIBCO/Invitrogen

10438-026

Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s medium (DMEM)

GIBCO/Invitrogen

11995-065

Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 średnie

GIBCO/Invitrogen

11875-093

sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) (1x)

GIBCO/Invitrogen

20012-027

Trypsyna-EDTA (0,25%)

GIBCO/Invitrogen

25200-056

Roztwór penicyliny-streptomycyny (100x)

Cellgro/Mediatech

30-002-CI

HEK293T komórek (293T)

American Type Culture Collection (ATCC)

CRL-3216

HIV-1 prowirusowy klon molekularny pNL4-3

NIH AIDS Research and Reference Reagent Program

114

PolyFect odczynnik do transfekcji

Qiagen

301107

DNaza 1

Calbiochem/Merckmillipore

260913

Sup-T1 cells

American Type Culture Collection (ATCC)

CRL-1942

HEPES pH 7,2 - 7,5

< p>(roztwór gotowy do użycia)

GIBCO/Invitrogen

15630-080

Roztwór chlorku potasu (KCl)

Sigma-Aldrich<

p>60142

Roztwór chlorku magnezu (MgCl2

Sigma-Aldrich

M1028

Dithiothreitol (DTT)

Sigma-Aldrich

43815

Aprotinina

Sigma-Aldrich< >

A6106

Digitonina

Sigma-Aldrich

D141

RNaza A

Invitrogen

12091-021

Sacharoza

Sigma-Aldrich

S0389

phiX174 Forma replikacyjna 1 DNA

Promega

D1531

PhiX174-F starter:

5'-CGCTTCCATGACGCAGAAGTT-3'

PhiX174-R starter:

5'-CACTGACCCTCAGCAATCTTA-3'

Invitrogen i/lub IDT-DNA

dNTP mix

Promega

U1515

Go Taq Polimeraza DNA

Promega

M3005

Zestaw do ekstrakcji żelu Qiaquick

Qiagen

28706

Ultraczysta woda destylowana

Invitrogen

10977-015

Bufor

Tris-EDTA (TE) (100x)

Sigma-Aldrich

T9285

Sodium Dodecyl Sulphate (SDS)

Sigma-Aldrich

L3771

Roztwór soli disodowej (EDTA), 0,5 M, pH 8,0

Sigma-Aldrich

E7889

Proteinaza K (20 mg/ml roztworu gotowego do użycia)

Qiagen

19131

Fenol (zrównoważony z 10  mM Tris HCl, pH  8.0 oraz 1  mM EDTA)

Sigma-Aldrich

P4557

Chloroform

Sigma-Aldrich

288306

Glikogen (5 mg/ml roztworu)

Ambion/Invitrogen

AM9510

Octan sodu (3 M, pH 5,2)

Sigma-Aldrich

S7899

etanol

Sigma-Aldrich

E7023

Pierwsza runda :

5'-GTGCCGCTTCAGCAAG-3'

Pierwsza runda spłonka phiX174:

5'-CACTGACCCTCAGCAATCTTA-3'

Invitrogen i/lub IDT-DNA

---

Druga runda LTR-R Primer:

5'-TCTGGCTAACTAGGGAACCCA-3'

Druga runda Podkład LTR-U:

5'-CTGACTAAAAGGGTCTGAGG-3'

Druga runda sondy Taqmana:

  5'-6- FAM/TTAAGCCTCAATAAAGCTTGC

CTTGAGTGC/6-TAMRA/-3'

Invitrogen i/lub IDT-DNA

---

iQ Supermix

Bio-Rad

170-8862

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sattentau, Q. J., Weiss, R. A. The CD4 antigen: physiological ligand and HIV receptor. Cell. 52 (5), 631-633 (1988).
  2. Wilen, C. B., Tilton, J. C., Doms, R. W. Molecular mechanisms of HIV entry. Adv Exp Med Biol. 726, 223-242 (2012).
  3. Bowerman, B., Brown, P. O., Bishop, J. M., Varmus, H. E. A nucleoprotein complex mediates the integration of retroviral DNA. Genes Dev. 3 (4), 469-478 (1989).
  4. Bukrinsky, M. I., Sharova, N., Dempsey, M. P., et al. Active nuclear import of human immunodeficiency virus type 1 preintegration complexes. Proc Natl Acad Sci. 9 (14), 6580-6584 (1992).
  5. Hansen, M. S., Smith, G. J. 3rd, Kafri, T., Molteni, V., Siegel, J. S., Bushman, F. D. Integration complexes derived from HIV vectors for rapid assays in vitro. Nature biotechnol. 17 (6), 578-582 (1999).
  6. Farnet, C. M., Haseltine, W. A. Integration of human immunodeficiency virus type 1 DNA in vitro. Proc Natl Acad Sci. 87 (11), 4164-4168 (1990).
  7. Fujiwara, T., Mizuuchi, K. Retroviral DNA integration: structure of an integration intermediate. Cell. 54 (4), 497-504 (1988).
  8. Brown, P. O., Bowerman, B., Varmus, H. E., Bishop, J. M. Correct integration of retroviral DNA in vitro. Cell. 49 (3), 347-356 (1987).
  9. Lewinski, M. K., Bushman, F. D. Retroviral DNA integration--mechanism and consequences. Adv Genet. 55, 147-181 (2005).
  10. Engelman, A., Mizuuchi, K., Craigie, R. HIV-1 DNA integration: mechanism of viral DNA cleavage and DNA strand transfer. Cell. 67 (6), 1211-1221 (1991).
  11. Goff, S. P. Genetics of retroviral integration. Ann rev gen. 26, 527-544 (1992).
  12. Panganiban, A. T., Temin, H. M. The terminal nucleotides of retrovirus DNA are required for integration but not virus production. Nature. 306 (5939), 155-160 (1983).
  13. Bieniasz, P. D. The cell biology of HIV-1 virion genesis. Cell host microbe. 5 (6), 550-558 (2009).
  14. Sherman, P. A., Fyfe, J. A. Human immunodeficiency virus integration protein expressed in Escherichia coli possesses selective DNA cleaving activity. Proc Natl Acad Sci. 87 (13), 5119-5123 (1990).
  15. Katzman, M., Katz, R. A., Skalka, A. M., Leis, J. The avian retroviral integration protein cleaves the terminal sequences of linear viral DNA at the in vivo sites of integration. J Virol. 63 (12), 5319-5327 (1989).
  16. Craigie, R., Mizuuchi, K., Bushman, F. D., Engelman, A. A rapid in vitro assay for HIV DNA integration. Nucl acid res. 19 (10), 2729-2734 (1991).
  17. Bushman, F. D., Craigie, R. Activities of human immunodeficiency virus (HIV) integration protein in vitro: specific cleavage and integration of HIV DNA. Proc Natl Acad Sci. 88 (4), 1339-1343 (1991).
  18. Pauza, C. D. Two bases are deleted from the termini of HIV-1 linear DNA during integrative recombination. Virology. 179 (2), 886-889 (1990).
  19. Engelman, A. Isolation and analysis of HIV-1 preintegration complexes. Meth Mol Biol. 485, 135-149 (2009).
  20. Engelman, A., Oztop, I., Vandegraaff, N., Raghavendra, N. K. Quantitative analysis of HIV-1 preintegration complexes. Methods. 47 (4), 283-290 (2009).
  21. Addai, A. B., Pandhare, J., Paromov, V., Mantri, C. K., Pratap, S., Dash, C. Cocaine modulates HIV-1 integration in primary CD4+ T cells: implications in HIV-1 pathogenesis in drug-abusing patients. J Leuk Biol. 97 (4), 779-790 (2015).
  22. Wehrly, K., Chesebro, B. p24 antigen capture assay for quantification of human immunodeficiency virus using readily available inexpensive reagents. Methods. 12 (4), 288-293 (1997).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Kompleks przedintegracyjny HIV 1test integracji in vitroizolacja PICstrategia zagnie d onego qPCRintegracja viralnego DNAinhibitor integrazy raltegravirinfekcja kom rek SupT1przygotowanie cytoplazmatycznego PICamplifikacja docelowego DNAekstrakcja fenolowo chloroformowa

Powiązane artykuły