Artykuł metodologiczny

Skuteczne zarodnikowanie Saccharomyces cerevisiae w formacie wielodołkowym 96

DOI:

10.3791/54584

⸱

17 września 2016

 , 
1Department of Biology, University of Massachusetts Boston

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj zarodnikowanie Saccharomyces cerevisiae odbywa się w formacie 96 wielodołkowym.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podczas stresu żywieniowego, Saccharomyces cerevisiae przechodzi gametogenezę, znaną jako sporulacja. Diploidalne komórki drożdży, które są pozbawione azotu i węgla, zainicjują proces zarodnikowania. Proces zarodnikowania obejmuje mejozę, po której następuje tworzenie zarodników, w których haploidalne jądra są pakowane w odporne na środowisko zarodniki. Opracowaliśmy metody efektywnego zarodnikowania pączkujących drożdży na 96 płytkach wielodołkowych, aby zwiększyć przepustowość badań przesiewowych komórek drożdży pod kątem fenotypów zarodnikowania. Metody te są zgodne z badaniami przesiewowymi drożdży zawierających plazmidy wymagające selekcji żywieniowej, gdy stosuje się odpowiednie minimalne pożywki, lub z badaniami przesiewowymi drożdży ze zmianami genomowymi, gdy stosuje się bogaty schemat presporulacji. Odkryliśmy, że w przypadku tej metody napowietrzanie podczas zarodnikowania ma kluczowe znaczenie dla tworzenia zarodników i opracowaliśmy techniki zapewniające wystarczające napowietrzenie, które są zgodne z formatem płytki wielodołkowej 96. Chociaż metody te nie osiągają typowego ~80% poziomu zarodnikowania, który można osiągnąć w eksperymentach opartych na kolbach o dużej objętości, metody te niezawodnie osiągną około 50-60% poziomu zarodnikowania na płytkach wielodołkowych o małej objętości.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sporulacja u pączkujących drożdży została zbadana, aby dostarczyć wglądu w wiele aspektów biologii, w tym kontrolę segregacji chromosomów podczas mejozy1, mechanizmy rekombinacji genetycznej2, kontrolę rozwoju przez sygnalizację komórkową3, kontrolę rozwoju odżywiania4, transkrypcyjną regulację rozwoju5 oraz badanie tworzenia się zarodników6. Tworzenie przetrwalników obejmuje nowe zdarzenie podziału komórki, polegające na tworzeniu nowych przedziałów błonowych w komórce macierzystej, po którym następuje osadzanie się ochronnej ściany zarodników6. Badania te, które badają komórki zarodnikujące, często wykorzystują szybko zarodnikujący szczep drożdży SK1, który może przejść proces zarodnikowania w ciągu około 24 godzin w stosunkowo wydajny sposób7,8. Chociaż optymalizacja warunków zarodnikowania dla pączkujących drożdży została opisana9-13, eksperymenty te dotyczyły zarodnikowania na pożywkach stałych lub w większych kulturach płynnych, w których zarodnikowanie przeprowadza się za pomocą probówek hodowlanych lub kolb.

Tutaj opisujemy metodę zarodnikowania drożdży w formacie 96-dołkowej płytki wielodołkowej. Stwierdziliśmy, że w przypadku tej metody napowietrzanie ma kluczowe znaczenie dla synchronicznego i wydajnego zarodnikowania i opracowaliśmy techniki zapewniające wystarczającą ilość zarodnikowania w formacie wielodołkowym o małej objętości. Zarodnikowanie w formacie 96-dołkowej płytki wielodołkowej pozwala na przesiewanie komórek przy użyciu technik o wysokiej przepustowości i odczynników zoptymalizowanych pod kątem formatu płytek wielodołkowych, takich jak badanie przesiewowe pod kątem supresorów o wysokiej liczbie kopii przy użyciu kafelkowej biblioteki14-16.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie do zarodnikowania

Uwaga: Media opisane w tym protokole są wykonane przy użyciu standardowych receptur i metod13,17. W tabeli 1 przedstawiono skład chemiczny dla 1 litra różnych pożywek stosowanych w niniejszym protokole.

Pepton Bacto Ekstrakt drożdżowy Agar Bacto Dekstroza Octan potasu Glicerol ddH2O Tabliczki YPG 20 gramów 10 gramów 20 gramów - - Pojemność 30 ml Pojemność 970 ml Tabliczki YPD 20 gramów 10 gramów 20 gramów 20 gramów - - Pojemność 1 000 ml płyn YPD 20 gramów 10 gramów - 20 gramów - - Pojemność 1 000 ml płyn YPA 20 gramów 10 gramów - - 20 gramów - Pojemność 1 000 ml Podłoża do zarodnikowania - - - - 10 gramów - Pojemność 1 000 ml

Tabela 1: Formuły podłoży. Ilości podane są dla 1 l podłoża. Szczegółowe informacje na temat składników podłoża można znaleźć w tabeli materiałów.

  1. Jeśli wszystkie komórki zarodnikujące będą miały ten sam genotyp, postępuj zgodnie z tą procedurą:
    1. Rozmrozić drożdże i użyć ich na talerzu YPG (YPGlycerol). Drożdże należy hodować przez 12-16 godzin w temperaturze 30 °C. Co ważne, komórki SK1 są również gotowe do zarodnikowania, więc szczepy SK1 nie powinny być pozostawiane zbyt długo na płytkach YPG, ponieważ mogą one zarodnikować na płytce.
      Uwaga: Preferowany jest świeżo rozmrożony szczep wyhodowany na YPG, ponieważ wykorzystanie glicerolu jako źródła węgla wymaga fosforylacji oksydacyjnej, a tym samym selekcji komórek, które mają funkcjonalne mitochondrialne DNA. Komórki SK1 mają tendencję do utraty funkcjonalnego mitochondrialnego DNA i stają się drobne. Do zarodnikowania potrzebne jest funkcjonalne mitochondrialne DNA.
    2. Przenieś drożdże z płytki YPG na płytkę YPD (YPDextrose) dla pojedynczych kolonii. Drożdże uprawiać na talerzu YPD 24-28 godzin w temperaturze 30 °C.
    3. Po około 36-48 godzinach wzrostu na pożywce stałej YPD, rozpocznij 25 ml kultury YPD, używając pojedynczej kolonii z płytki YPD. Hoduj tę kulturę, aż komórki osiągną okołoOD 600 = 4,0 do 7,0. Wykonać ten krok w temperaturze 30 °C przez noc w inkubatorze z wytrząsaniem, wytrząsając z prędkością 220 obr./min.
    4. Z hodowli YPD użyj odpowiedniej ilości komórek, aby rozpocząć 1,000 ml kultury YPA (YPAcetate), która wynosiOD 600 = 0,1 na każdą 96-dołkową płytkę potrzebną w sekcji 2. Drożdże hodować w inkubatorze z wytrząsaniem o temperaturze 30 °C (wytrząsanie przy 220 obr./min) do momentu, gdy poziom OD600 kultury wyniesie od 1,3 do 1,5<,5 br /> Uwaga: Zaszczepić 100 ml kultury YPA na każdą 96 płytek wielodołkowych, które mają być poddane badaniom przesiewowym w sekcji 2. Na przykład, w przypadku badań przesiewowych czterech 96 płytek wielodołkowych, potrzebne będzie 400 ml kultury YPA. Począwszy od 10% dodatkowej objętości w kulturze YPA, konieczne jest zabezpieczenie przed utratą objętości parowania. Zazwyczaj potrzeba od 12 do 16 godzin, aby ogniwa osiągnęły odpowiedni OD600; Czas ten może się różnić w zależności od genotypu szczepu drożdży. YPA jest pożywką presporulacyjną. Wstępny wzrost octanu pomaga indukować ekspresję genów (takich jak IME1) potrzebnych do wydajnego i synchronicznego zarodnikowania6.
    5. Wirować przy 1,800 x g w wirówce stołowej przez 5 minut, aby osadzać komórki wyhodowane w YPA. Umyj komórki 1x 0,5 objętości sterylnej autoklawowanej wody dejonizowanej. Ponownie zakręć i wyrzuć pranie. Ponownie zawiesić komórki w pożywce zarodnikowej o objętości 1x. Przejdź do sekcji 2.
  2. W przypadku używania komórek do zarodnikowania, które są o różnych genotypach (tj. przekształcone za pomocą różnych plazmidów lub zawierających różne mutacje, zwykle uzyskiwane i przechowywane jako zamrożone zapasy), komórki o różnych genotypach należy ułożyć w formacie 96 wielodołkowym. Następnie postępuj zgodnie z tą procedurą:
    1. Użyj sterylnej żabki z 96 bolcami, aby przenieść komórki z rozmrożonych zamrożonych wywarów w 96 płytkach wielodołkowych na stałe podłoże YPG. Drożdże uprawiać przez noc w temperaturze 30 °C.
    2. Używając sterylnego żabki z 96 bolcami, przenieś komórki z pożywki stałej YPG na pożywkę stałą YPD lub selektywną pożywkę stałą (tj. syntetyczną pożywkę minimalną pozbawioną aminokwasów, jeśli komórki zawierają plazmidy wymagające selekcji). Drożdże należy uprawiać w temperaturze 30 °C, aż dla każdego szczepu utworzą się kolonie, zazwyczaj 1 dzień w przypadku YPD i 2 dni, jeśli konieczne jest stosowanie selektywnych pożywek.
    3. Podwielokrotność 1,2 ml pożywki płynnej YPD lub selektywnej pożywki ciekłej do każdego dołka płytki wielodołkowej o głębokości 96 ml i pojemności 2 ml. Przenieś komórki z pożywki stałej do pożywki płynnej za pomocą żabki, przykryj plastikową pokrywką przytrzymywaną taśmą i hoduj przez noc w wytrząsarce o temperaturze 30 °C, wstrząsając z prędkością 220 obr./min.
      Uwaga: Aby zminimalizować zanieczyszczenie, przykryj płyty za pomocą plastikowych pokrywek z prostokątnej płytki Petriego. Przytrzymaj pokrywki na miejscu za pomocą kawałka taśmy, aby cyrkulacja powietrza była minimalnie ograniczona.
    4. Odwirować płytki o masie 1 800 x g przez 5 minut, używając obrotowej wirówki kubełkowej z adapterami, aby pomieścić 96-dołkowe płytki. Odlej pożywkę z komórek; dodać 500 μl YPA do każdej studzienki i ponownie zawiesić granulowane komórki w YPA. Przykryj plastikową pokrywką przytrzymywaną taśmą.
    5. Hodować komórki przez 15 godzin w temperaturze 30 °C w inkubatorze z wytrząsaniem, wytrząsając z prędkością 220 obr./min. Przejdź do sekcji 2.

2. Komórki zarodnikujące w formacie wielodołkowym 96

  1. Dodać jeden sterylny kulkę szklaną o średnicy 3 mm lub sterylny mieszadło magnetyczne o wymiarach 5 mm x 2 mm do każdej studzienki na płytce 96-dołkowej z dołkami o pojemności 1,3 ml. (Zobacz reprezentatywne wyniki poniżej, aby zapoznać się z dyskusją na temat tego, czy używać koralika, czy mieszadła.)
  2. Jeśli wszystkie komórki, które mają być poddane badaniom przesiewowym, mają ten sam genotyp, przejdź do 2.2.1. Jeżeli komórki, które mają być poddane badaniom przesiewowym, mają różne genotypy, należy przejść do sekcji 2.2.2.
    1. Pobrać komórki z kroku 1.1.5 i podwielokrotność 500 μl komórek wraz z pożywką do każdego dołka na 96 płytkach wielodołkowych. Przykryj plastikową pokrywką przytrzymywaną taśmą. Przejdź do punktu 2.3.
    2. Wiruj komórki, które są w YPA od 1.2.4 przy 1,800 x g przez 5 minut, używając wahadłowej wirówki kubełkowej z adapterami, aby pomieścić 96-dołkowe płytki. Odlej pożywkę z komórek. Dodać 500 μl pożywki zarodnikowej do każdej studzienki i ponownie zawiesić granulowane komórki w pożywce zarodnikowej. Przykryj plastikową pokrywką przytrzymywaną taśmą. Przejdź do punktu 2.3.
  3. W przypadku użycia szklanego kulki umieścić próbki w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 30 °C i wstrząsnąć z prędkością 220 obr./min w celu zarodnikowania. W przypadku korzystania z mieszadła magnetycznego należy umieścić próbki na płytce mieszającej w inkubatorze o temperaturze 30 °C w celu zarodnikowania.
    Uwaga: Dokładna prędkość mieszania mieszadła magnetycznego nie jest bardzo ważna, o ile wszystkie pręty poruszają się energicznie, a kultura jest napowietrzona.
  4. Aby monitorować postęp poprzez zarodnikowanie, pobrać próbki z kultury zarodnikującej w celu wizualizacji, dodać 6 μl komórek z kultur zarodnikujących do 24 μl pożywki zarodnikowej w 96-dołkowej płytce nakrywkowej (rozcieńczenie 1:5). Pozostaw komórki na 5 minut przed badaniem komórek za pomocą mikroskopu odwróconego.
    Uwaga: W komórkach SK1 typu dzikiego zwarte dojrzałe zarodniki utworzą się w ciągu 36 godzin po przeniesieniu do pożywki zarodnikowej. Postęp poprzez zarodnikowanie można monitorować za pomocą mikroskopii przy użyciu markerów fluorescencyjnych, takich jak marker jądrowy (tj. Htb2-mCherry18) w celu zbadania podziału mejotycznego lub marker błony prosporowej (tj. G2019) w celu zbadania morfogenezy zarodników. Alternatywnie, tworzenie się ogniotrwałych zarodników można zaobserwować za pomocą mikroskopii Nomarski DIC, rozpoczynającej się około 12 godzin po przeniesieniu do pożywki zarodnikowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby ocenić ten protokół, porównano skuteczność zarodnikowania uzyskaną z komórek zarodnikujących na płytkach wielodołkowych (jak opisano powyżej) z komórkami zarodnikowanymi przy użyciu większych objętości w kolbach (Tabela 2). Zastosowanie płytek wielodołkowych nie pozwoliło osiągnąć wysokiej wydajności obserwowanej podczas zarodnikowania w kolbach, gdzie rutynowo można zaobserwować wydajność ~80%. Zarodnikowanie na płytkach wielodołkowych z odpowiednim napowietrzeniem (...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym miejscu przedstawiamy protokół zarodnikowania drożdży SK1 w formacie wielodołkowym 96. Napowietrzanie jest kluczem do wydajnego zarodnikowania, które wymaga użycia mieszadła lub szklanego koralika w każdej studzience. Kiedy komórki są zarodnikowane na 96-dołkowej płytce w inkubatorze z wytrząsaniem bez kulki lub mieszadła, komórki nie zarodnikują wydajnie. Tylko niewielki wzrost skuteczności zarodnikowania obserwuje się, gdy komórki są zarodnikowane bez kulki lub mieszadła w inkubatorze do wytrząsania, w porównaniu...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez grant Josepha P. Healeya z University of Massachusetts Boston (L.S.H.) oraz R15 GM86805 z NIH (L.S.H.). S.M.P. jest częściowo wspierany przez Sanofi-Genzyme Fellowship na University of Massachusetts Boston.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Nunc 1,3 ml Płytki DeepWellThermoScientific260251Służy do zarodnikowania
Nunc 2,0 ml Płytki DeepWellThermoScientific278743Służy do wzrostu przed zasporulacją, krok 1.2.3
Koralik szklany 3 mmFisher11-312AUżywany do zarodnikowania
5 mm x 2 mm mieszadło, opakowanie 12 sztFisher14-511-82Używany do zarodnikowania
96 cóż, froggerV& P ScientificVP407potrzebny do kroku 1.2
kopiarki bibliotecznejV& P ScientificVP381potrzebny do kroku 1.2; do stosowania z
prostokątną szalką PetriegoThermoScientific264728potrzebne do kroku 1.2
Bacto PeptoneBD211677potrzebne do podłoża
Ekstrakt drożdżowyBD212750potrzebny do podłoża
Agar BactoBD212750potrzebny do podłoża
DekstrozaFisherD16-3potrzebny do podłoża
Octan potasuFisherP171-500potrzebny do podłoża
GlicerolFisherG33-500potrzebny do podłoża
96-dołkowa szklana płyta dolnaMatTekPBK96G-1.5.5-Fpotrzebny do kroku 2.4
. froggera

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Marston, A. L. Chromosome segregation in budding yeast: sister chromatid cohesion and related mechanisms. Genetics. 196 (1), 31-63 (2014).
  2. Keeney, S., Lange, J., Mohibullah, N. Self-organization of meiotic recombination initiation: general principles and molecular pathways. Annu. Rev. Genet. 48, 187-214 (2014).
  3. Granek, J. A., Kayikci, O., Magwene, P. M. Pleiotropic signaling pathways orchestrate yeast development. Curr. Opin. Microbiol. 14 (6), 676-681 (2011).
  4. Broach, J. R. Nutritional control of growth and development in yeast. Genetics. 192 (1), 73-105 (2012).
  5. Winter, E. The Sum1/Ndt80 transcriptional switch and commitment to meiosis in Saccharomyces cerevisiae. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 76 (1), 1-15 (2012).
  6. Neiman, A. M. Sporulation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 189 (3), 737-765 (2011).
  7. Padmore, R., Cao, L., Kleckner, N. Temporal comparison of recombination and synaptonemal complex formation during meiosis in S. cerevisiae. Cell. 66 (6), 1239-1256 (1991).
  8. Liti, G., et al. Population genomics of domestic and wild yeasts. Nature. 458 (7236), 337-341 (2009).
  9. McCusker, J. H., Haber, J. E. Efficient sporulation of yeast in media buffered near pH6. J. Bacteriol. 132 (1), 180-185 (1977).
  10. Codon, A. C., Gasent-Ramirez, J. M., Benitez, T. Factors which affect the frequency of sporulation and tetrad formation in Saccharomyces cerevisiae baker's yeasts. Appl. Environ. Microbiol. 61 (2), 630-638 (1995).
  11. Elrod, S. L., Chen, S. M., Schwartz, K., Shuster, E. O. Optimizing sporulation conditions for different Saccharomyces cerevisiae strain backgrounds. Methods Mol. Biol. 557, 21-26 (2009).
  12. Börner, G. V., Cha, R. S. Analysis of yeast sporulation efficiency, spore viability, and meiotic recombination on solid medium. Cold Spring Harb. Protoc. 2015 (11), 1003-1008 (2015).
  13. Börner, G. V., Cha, R. S. Induction and analysis of synchronous meiotic yeast cultures. Cold Spring Harb. Protocols. (10), 908-913 (2015).
  14. Jones, G. M., et al. A systematic library for comprehensive overexpression screens in Saccharomyces cerevisiae. Nat. Methods. 5 (3), 239-241 (2008).
  15. Fleming, M. S., Gitler, A. D. High-throughput yeast plasmid overexpession screen. J. Vis. Exp. (53), e2836(2011).
  16. Paulissen, S. M., Slubowski, C. J., Roesner, J. M., Huang, L. S. Timely Closure of the Prospore Membrane Requires SPS1 and SPO77 in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. , (2016).
  17. Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N. Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Labooratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring, NY. (2005).
  18. Parodi, E. M., Baker, C. S., Tetzlaff, C., Villahermosa, S., Huang, L. S. SPO71 mediates prospore membrane size and maturation in Saccharomyces cerevisiae. Eukaryot. Cell. 11 (10), 1191-1200 (2012).
  19. Nakanishi, H., de Los Santos, P., Neiman, A. M. Positive and negative regulation of a SNARE protein by control of intracellular localization. Mol. Biol. Cell. 15 (4), 1802-1815 (2004).
  20. Huang, L. S., Doherty, H. K., Herskowitz, I. The Smk1p MAP kinase negatively regulates Gsc2p, a 1,3-beta-glucan synthase, during spore wall morphogenesis in Saccharomyces cerevisiae. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 102 (35), 13431-13436 (2005).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Sporulacja Saccharomyces cerevisiaep ytka 96 do kowasporulacja dro d ywydajno sporulacjimetoda napowietrzaniakuleczki szklanemagnetyczny mieszad oprzesiewanie mejozypo ywki do sporulacjiwysokoprzepustowo

Powiązane artykuły