Artykuł metodologiczny

Model in vitro bariery krew-mózg przy użyciu spektroskopii impedancyjnej: skupienie się na interakcji limfocytów T z komórkami śródbłonka

DOI:

10.3791/54592

⸱

8 grudnia 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, University Hospital Münster, 2Institute of Biochemistry, University of Münster

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy mysi model bariery krew-mózg in vitro, który wykorzystuje impedancję spektroskopii komórek, koncentrując się na konsekwencjach dla integralności i przepuszczalności komórek śródbłonka po interakcji z aktywowanymi limfocytami T.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Załamanie bariery krew-mózg (BBB) jest krytycznym krokiem w rozwoju chorób autoimmunologicznych, takich jak stwardnienie rozsiane (SM) i eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia (EAE). Proces ten charakteryzuje się transmigracją aktywowanych limfocytów T przez komórki śródbłonka mózgu (EC), główne składniki bariery krew-mózg. Jednak konsekwencje interakcji z takimi limfocytami T dla funkcji EC mózgu są w dużej mierze nieznane. W tym miejscu opisujemy test, który pozwala na ocenę pierwotnej funkcji mikronaczyniowej EC mózgu myszy (MBMEC) i integralności bariery podczas interakcji z limfocytami T w czasie. Test wykorzystuje impedancję spektroskopii komórek, potężne narzędzie do badania integralności i przepuszczalności monowarstwy EC, poprzez pomiar zmian transśródbłonkowego oporu elektrycznego (TEER) i pojemności warstwy komórkowej (Ccl). W bezpośrednim kontakcie z EC stymulowane, ale nie naiwne limfocyty T są zdolne do indukowania dysfunkcji monowarstwy EC, co objawia się spadkiem TEER i wzrostem Ccl. Test rejestruje zmiany w integralności monowarstwy EC w sposób ciągły i zautomatyzowany. Jest na tyle czuły, że pozwala na rozróżnienie różnych sił bodźców i poziomów aktywacji limfocytów T oraz umożliwia badanie konsekwencji celowanej modulacji interakcji limfocytów T-EC przy użyciu szerokiej gamy substancji, takich jak przeciwciała, odczynniki farmakologiczne i cytokiny. Technika ta może być również stosowana jako kontrola jakości integralności EC w testach migracji limfocytów T in vitro. Te zastosowania sprawiają, że jest to wszechstronne narzędzie do badania właściwości BBB w warunkach fizjologicznych i patofizjologicznych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bariera krew-mózg oddziela krążenie ogólnoustrojowe od ośrodkowego układu nerwowego (OUN)1-3. Zapewnia fizyczną barierę, która hamuje swobodny ruch komórek i dyfuzję cząsteczek rozpuszczalnych w wodzie oraz chroni mózg przed patogenami i potencjalnie szkodliwymi substancjami. Oprócz funkcji barierowej, bariera krew-mózg umożliwia dostarczanie tlenu i składników odżywczych do miąższu mózgu, co zapewnia prawidłowe funkcjonowanie tkanki neuronalnej. Właściwości funkcjonalne BBB są silnie regulowane przez jego składniki komórkowe i bezkomórkowe, przy czym wysoce wyspecjalizowane EC są jego głównym elementem strukturalnym. EC BBB charakteryzują się obecnością kompleksów połączeń ścisłych (TJ), brakiem fenestracji, wyjątkowo niską aktywnością pinocytarną i trwale aktywnymi mechanizmami transportu. Inne składniki BBB, błony podstawnej EC, perycyty osadzające śródbłonek, astrocytarne stopy końcowe i = związana z nimi miąższowa błona podstawna również przyczyniają się do rozwoju, utrzymania i funkcji BBB2,4-6 i wraz z neuronami i mikroglejem tworzą jednostkę nerwowo-naczyniową (NVU), która umożliwia prawidłowe funkcjonowanie OUN 7-9.

W różnych chorobach neurologicznych, takich jak choroby neurodegeneracyjne, zapalne lub zakaźne, funkcja BBB jest zagrożona2,5,10. Rozregulowanie kompleksów TJ i mechanizmów transportu molekularnego prowadzi do zwiększonej przepuszczalności BBB, wynaczynienia leukocytów, stanu zapalnego i uszkodzenia neuronów. W celu zbadania właściwości BBB w takich patofizjologicznych warunkach stworzono różne modele BBB in vitro 9,11,12. Wspólnie dostarczyły one cennych informacji na temat zmian w integralności bariery, przepuszczalności oraz mechanizmach transportu. Modele te wykorzystują komórki śródbłonka pochodzenia ludzkiego, mysiego, szczurzego, wieprzowego lub bydlęcego13-18; Pierwotne komórki śródbłonka lub linie komórkowe są hodowane jako monokultura lub razem z perycytami i / lub astrocytami w celu dokładniejszego naśladowania BBB in vivo19-25. W ostatnich latach pomiar przezśródbłonkowego oporu elektrycznego (TEER) stał się powszechnie akceptowanym narzędziem do oceny właściwości bariery śródbłonkowej26,27.

TEER odzwierciedla impedancję strumienia jonów w monowarstwie komórki, a jego spadek stanowi czułą miarę naruszonej integralności bariery śródbłonkowej, a tym samym zwiększonej przepuszczalności. Opracowano różne systemy pomiarowe TEER, w tym woltoomomierz nabłonkowy (EVOM), wykrywanie impedancji podłoża elektrycznego (ECIS) oraz analizę komórek w czasie rzeczywistym15,28-30. TEER odzwierciedla opór strumienia jonów między sąsiednimi EC (szlak parakomórkowy) i jest wprost proporcjonalny do integralności bariery. W spektroskopii impedancyjnej27,31 mierzy się zespoloną impedancję całkowitą (Z), która dostarcza dodatkowych informacji na temat integralności bariery poprzez pomiar Ccl. Ccl odnosi się do prądu pojemnościowego przepływającego przez błonę komórkową (droga transkomórkowa): warstwa komórkowa działa jak kondensator w równoważnym obwodzie elektrycznym, oddzielając ładunki po obu stronach błony i jest odwrotnie proporcjonalna do integralności bariery. W przypadku uprawy na przepuszczalnych wkładkach, EC przylegają, namnażają się i rozprzestrzeniają po mikroporowatej membranie. Jest to odporne na prąd pojemnościowy tła wkładki (która sama działa jak kondensator) i prowadzi do spadku pojemności, aż osiągnie ona minimalny poziom. Następnie następuje tworzenie kompleksów TJ, które uszczelniają przestrzeń między sąsiednimi EC. Ogranicza to przepływ jonów przez drogę parakomórkową, a TEER wzrasta, aż osiągnie plateau. Jednak w stanach zapalnych bariera śródbłonkowa jest naruszona: TEER zmniejsza się, gdy kompleksy TJ zostają zakłócone, a Ccl wzrasta, gdy ponownie podnosi się składowa pojemnościowa wkładki.

Nasz pomiar TEER wykorzystuje zautomatyzowany system monitorowania komórek32: jest on zgodny z zasadą spektroskopii impedancyjnej i rozszerza swoje poprzednie zastosowania. W tym miejscu opisujemy model BBB in vitro, który umożliwia badanie właściwości bariery, w tym interakcji śródbłonka mózgu z komórkami odpornościowymi; w szczególności aktywowane limfocyty T. Takie stany patofizjologiczne obserwuje się w chorobach autoimmunologicznych OUN, takich jak stwardnienie rozsiane i jego eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia na modelu zwierzęcym33-37. W tym przypadku kluczowym krokiem jest transmigracja encefalitogennych, specyficznych dla mieliny limfocytów T przez barierę krew-mózg. Następnie następuje ich reaktywacja w przestrzeni okołonaczyniowej i wejście do miąższu mózgu, gdzie rekrutują inne komórki odpornościowe i pośredniczą w zapaleniu, a następnie demielinizacji1,35,38. Jednak molekularne mechanizmy interakcji między takimi limfocytami T a komórkami śródbłonka, głównymi składnikami bariery krew-mózg, nie są dobrze poznane. Nasz protokół ma na celu wypełnienie tej luki i dostarczenie nowych informacji na temat konsekwencji dla komórek śródbłonka (tj. integralności bariery i przepuszczalności) po ich bezpośrednim kontakcie i złożonej interakcji z aktywowanymi limfocytami T.

Opisany tutaj protokół wykorzystuje pierwotne komórki mikronaczyniowe śródbłonka mózgu myszy, hodowane jako monowarstwa na przepuszczalnych wkładkach z mikroporowatymi błonami. Komórki śródbłonka są hodowane wspólnie z limfocytami T CD4 +, które mogą być wstępnie aktywowane pokolonalnie lub w sposób specyficzny dla antygenu. Jednoczesna hodowla MBMEC z wstępnie aktywowanymi, ale nie naiwnymi limfocytami T indukuje spadek TEER i wzrost Ccl, co stanowi ilościową miarę dysfunkcji MBMEC i przerwania bariery. Technika jest nieinwazyjna: wykorzystuje wbudowane zamiast pałeczek elektrody, które zapobiegają poważnym zakłóceniom monowarstwy EC; Może być używany do monitorowania funkcji bariery bez użycia markerów komórkowych. Wykonuje ciągłe pomiary w sposób zautomatyzowany i umożliwia niezależną ocenę dwóch parametrów bariery (TEER i Ccl) jednocześnie w czasie. Metoda jest również wystarczająco czuła, aby rozróżnić różne poziomy aktywacji limfocytów T i wpływ takich limfocytów T na EC.

Może być używany w szerokim zakresie testów funkcjonalnych: różne cytokiny i/lub chemokiny zaangażowane w procesy zapalne mogą być dodawane do kokultury MBMEC i limfocytów T; można stosować przeciwciała blokujące przeciwko cząsteczkom adhezyjnym komórek po stronie EC lub komórek T; a inhibitory markerów aktywacji limfocytów T lub ich właściwości cytolitycznych mogą być dodawane podczas pobudzania limfocytów T lub ich wspólnej hodowli z EC. Test jest również przydatny w testach transmigracji limfocytów T, ponieważ może służyć jako kontrola jakości integralności monowarstwy MBMEC przed dodaniem limfocytów T. Wszystko to sprawia, że metoda ta jest wszechstronnym i niezawodnym narzędziem do badania BBB in vitro, ze szczególnym uwzględnieniem wpływu aktywowanych limfocytów T na integralność monowarstwy EC. Ma to szczególne znaczenie dla zrozumienia mechanizmów zaburzenia bariery krew-mózg w patogenezie chorób autoimmunologicznych, takich jak stwardnienie rozsiane i jego zwierzęcy model EAE, w którym samoreaktywne, encefalitogenne limfocyty T przenikają przez barierę krew-mózg i powodują stan zapalny i uszkodzenie neuronów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We wszystkich eksperymentach myszy były hodowane i utrzymywane w określonych warunkach wolnych od patogenów w centralnym ośrodku dla zwierząt na Uniwersytecie w Münster, zgodnie z niemieckimi wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami. Wszystkie doświadczenia zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi komisji etycznej ds. doświadczeń na zwierzętach i zatwierdzone przez władze lokalne Nadrenii Północnej-Westfalii w Niemczech (LANUV, AZ 84-02.05.20.12.217).

1. Izolacja i kultura MBMEC

UWAGA: Odizoluj MBMEC zgodnie z wcześniejszym opisem w szczegółach14 z następującymi modyfikacjami:

  1. Uśmierc 20 dorosłych myszy C57BL/6 (w wieku 6-8 tygodni) przez wdychanie CO2 i potwierdź ich śmierć, stwierdzając zatrzymanie akcji serca i oddechu.
  2. Opłucz mysz 70% etanolem i odetnij jej głowę nożyczkami; usuń skórę głowy za pomocą kleszczy i nożyczek. Wykonaj nacięcia po lewej i prawej stronie czaszki, zaczynając od otworu wielkiego. Podnieś czaszkę od strony ogonowej i wyjmij mózg kleszczami.
  3. Pod kapturem z przepływem laminarnym użyj sterylnych kleszczy, aby umieścić mózg na szalce Petriego i usunąć pień mózgu, móżdżek i wzgórze, pozostawiając tylko korę.
    UWAGA: Użycie mikroskopu nie jest konieczne do żadnego z tych kroków.
  4. Umieść korę na kawałku sterylnej bibuły Western i delikatnie zwiń ją kleszczami, aż opony mózgowe przestaną być widoczne.
  5. Po mechanicznym i enzymatycznym roztrawieniu (zgodnie z protokołem14) należy pobrać komórki śródbłonka z gradientu gęstości za pomocą długiej, sterylnej igły i tłoka o pojemności 5 ml. Komórki śródbłonka pojawiają się jako mętna warstwa nad czerwonym pierścieniem z erytrocytami. Przenieść 20-25 ml tej warstwy do nowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml; uzupełnij rurkę za pomocą DMEM.
  6. Po dwóch seriach przemywania14 ponownie zawiesić komórki w 6 ml pożywki MBMEC zawierającej Puromycynę (4 μg/ml) i wysiać je w sześciu powlekanych studzienkach na 24-dołkowej płytce; pozostawić je w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C i 5% CO2 (zwanym dalej "inkubatorem") na trzy dni.
    UWAGA: Szczegółowe informacje na temat rozwiązania powłokowego MBMEC znajdują się w tabeli materiałów.
  7. Zmienić pożywkę, dodając 1 ml do każdej studzienki świeżej pożywki MBMEC bez Puromycyny; umieścić płytkę z powrotem w temperaturze 37 °C i 5% CO2 na kolejne dwa dni.

2. Zbieranie MBMEC

  1. Piątego dnia po izolacji MBMEC należy wstępnie pokryć przepuszczalne wkładki roztworem powlekającym MBMEC: dodać 80 μl roztworu na wkładkę i pozostawić w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 3 godziny.
  2. Ostrożnie odpipetować roztwór powlekający i pozostawić wkładki do wyschnięcia na powietrzu przez 30 minut. Dodać 2 ml PBS o temperaturze pokojowej (RT) do każdego dołka płytki, używając MBMEC do przepłukania pożywki; powtórz ten krok. Dodać 0,05% trypsyny-EDTA (300 μl na dołek) i pozostawić płytkę w inkubatorze na 5-10 minut.
  3. Dodaj 2 ml pożywki MBMEC do każdej studzienki, aby zatrzymać trypsynizację. Przenieść zebrane komórki do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i odwirować je przy 700 x g przez 8 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml pożywki MBMEC bez Puromycyny.
  4. Policz komórki; zmieszaj 10 μl zawiesiny komórkowej z 90 μl 0,04% błękitu trypanowego (10-krotne rozcieńczenie komórek). Odpipetować 10 μl tej mieszaniny między szklaną pokrywą a komorą zliczania komórek (hemocytometrem). Policz komórki wolne od błękitu trypana we wszystkich czterech kwadrantach komory (N) i określ średnią liczbę zliczonych komórek (N') w następujący sposób: N' = N/4.
  5. Obliczyć stężenie komórek (w 106 komórkach/ml) za pomocą następującego wzoru: C = N' x 104 x 10, gdzie 104 jest podane przez wymiary hemocytometru, a 10 jest współczynnikiem rozcieńczenia z kroku 2.4.
  6. Wysiew: 2 x 104 komórki w objętości 260 μl na wkładkę. Dodać 810 μl pożywki MBMEC do dolnej komory każdej studzienki. Umieścić płytkę z wkładkami w inkubatorze do momentu, gdy będzie gotowa do kontynuowania pracy w punkcie 4.
    UWAGA: Objętości górnej i dolnej komory są specyficzne dla wkładki i nie działają we wszystkich formatach 24-dołkowych.

3. Izolacja i stymulacja limfocytów T CD4+

  1. Izolacja limfocytów T CD4+
    1. Uśmierc jedną dorosłą mysz (w wieku 6-8 tygodni) przez wdychanie CO2 i potwierdź jej śmierć, stwierdzając zatrzymanie akcji serca i oddechu.
    2. Połóż mysz na plecach na czystej desce rozbiorowej i spłucz ją 70% etanolem; użyj sterylnych nożyczek i kleszczy, aby otworzyć otrzewną i usunąć śledzionę i węzły chłonne (pachwinowe, pachowe, ramienne i szyjne); na koniec przenieś tkankę do 15 ml probówki wirówkowej zawierającej 5 ml PBS na lodzie.
    3. Pod kapturem z przepływem laminarnym przenieść tkankę, dekantując PBS wraz z tkanką, do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml z sitkiem do komórek 70 μm na górze; homogenizować tkankę, przeciskając ją tłokiem o pojemności 1 ml przez sitko.
    4. Dodać 30 ml buforu FACS i odwirować go przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 10 ml buforu FACS. Przefiltrować zawiesinę przez sitko o pojemności 40 μm, dodać kolejne 20 ml buforu FACS do probówki.
    5. Odwirować w temperaturze 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 500 μl buforu FACS.
    6. Dodać 20 μl mysich mikrokulek magnetycznych CD4, dobrze wymieszać i inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Dodać 25 ml buforu FACS i odwirowywać w temperaturze 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    7. W międzyczasie umieść kolumnę separacyjną LS w magnesie i przepłucz ją 3 ml buforu FACS. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 3 ml buforu FACS.
    8. Dodaj komórki do kolumny. Przemyć kolumnę trzykrotnie 3 ml buforu FACS. Wyjmij kolumnę z magnesu i umieść ją w nowej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml. Dodać 5 ml buforu FACS, wypłukać oznakowane komórki za pomocą tłoka kolumny i odwirować w temperaturze 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    9. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 3 ml pożywki z limfocytów T. Policz komórki zgodnie z opisem w ppkt 2.4 i zasiaj 1 x 105 komórek w 100 μl pożywki na dołek.
  2. Stymulacja limfocytów T CD4 +
    1. Poliklonalna stymulacja limfocytów T CD4 +
      1. Wstępnie pokryć okrągłodenną 96-dołkową płytkę oczyszczonym przeciwciałem anty-mysim CD3 (klon 145-2C11) w PBS w pożądanym stężeniu końcowym. Na przykład, aby wstępnie pokryć pełną płytkę α-CD3 w stężeniu 1 μg/ml, zmieszaj 10 μl przeciwciała (stężenie podstawowe = 0,5 mg/ml) z 5 ml PBS, odwiruj i dodaj 50 μl mieszanki do każdego dołka za pomocą wielokanałowej pipety.
      2. Pozostaw płytkę w inkubatorze na 3 godziny. Po wyizolowaniu limfocytów T należy dwukrotnie umyć wstępnie pokrytą płytkę PBS. Dodać oczyszczone przeciwciało anty-CD28 (klon 37,51) do wyizolowanych limfocytów T o pożądanym stężeniu końcowym (np. przy 1 μg/ml); Dobrze wymieszaj. Wysiej limfocyty T i pozostaw je w inkubatorze na dwa do trzech dni.
    2. Stymulacja limfocytów T CD4+ specyficznych dla antygenu komórkami dendrytycznymi (DC)
      UWAGA: Jeśli DC są używane jako komórki prezentujące antygen (APC), postępuj zgodnie z protokołem izolacji limfocytów T, z następującymi wyjątkami:
      1. Przed homogenizacją śledziony należy wstrzyknąć do niej 1 ml kolagenazy typu IA w PBS w dawce 0,5 mg/ml i przenieść do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
      2. Inkubować w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C przez 15 minut. Po umyciu PBS ponownie zawieś osad w buforze FACS i dodaj 20 μl mysich mikrokulek magnetycznych CD11c zamiast mikrokulek CD4.
      3. Użyć kolumny rozdzielającej MS i odpowiednich objętości: przepłukać kolumnę 1 ml buforu FACS; ponownie zawiesić komórki w 1 ml buforu FACS i przemyć kolumnę 1 ml buforu FACS trzy razy.
      4. Dodać wybrany antygen do DC (np. glikoproteinę mieliny oligodendrocytów (MOG) a.a. 35-55 w stężeniu 20 μg/ml), dobrze wymieszać i wysiać 5 x 104 komórek w 100 μl pożywki hodowlanej limfocytów T na 96 dołków okrągłodennych.
      5. Na końcu dodać 1 x 105 limfocytów T w 100 μl pożywki do hodowli limfocytów T na 96 dołków okrągłodennych, zgodnie z opisem w Protokole izolacji limfocytów T.
    3. Stymulacja limfocytów T CD4 + specyficzna dla antygenu limfocytami B
      UWAGA: Jeśli limfocyty B są używane jako APC, postępuj zgodnie z protokołem izolacji komórek T, z następującymi wyjątkami:
      1. Użyj śledziony od myszy transgenicznych, których limfocyty B są specyficzne dla antygenu (np. myszy IgHMOG (Th), których komórki B specyficznie rozpoznają MOG35-55).
      2. Użyj limfocytów T specyficznych dla antygenu (np. z myszy TCRMOG (2D2)). Dodaj 20 μl mysich mikrokulek magnetycznych CD19 zamiast mikrokulek CD4.
      3. Dodać wybrany antygen do limfocytów B (np. MOG35-55 w stężeniu 20 μg/ml), dobrze wymieszać i wysiać 5 x 104 komórki w 100 μl pożywki do hodowli komórek B na 96 dołków okrągłodennych.
      4. Dodać 1 x 105 limfocytów T w 100 μl pożywki do hodowli limfocytów T na 96 dołków okrągłodennych, jak opisano w Protokole izolacji limfocytów T.

4. Konfiguracja i wykonywanie pomiaru TEER

  1. Umieść 24-dołkowy moduł przyrządu TEER pod okapem z przepływem laminarnym. Zdejmij pokrywki i umieść wkładki z MBMEC w instrumencie za pomocą kleszczy.
  2. Odpipetować 810 μl świeżego podłoża do dolnej komory studzienek modułu: dodać ostrożnie między wkładkę a ściankę studzienki modułu.
  3. Zamknij pokrywy i umieść instrument w inkubatorze. Podłącz przyrząd do komputera; Włącz kontroler przyrządu i otwórz oprogramowanie.
  4. Wybierz "nowy pomiar" w wyskakującym okienku. Zaznacz pola "pokaż TEER" i "pokaż Ccl"; Następnie naciśnij "Start". Po zakończeniu pierwszego pomiaru wybierz "sprawdź wszystkie dołki" w zakładce "wyniki", aby zobaczyć wszystkie wartości TEER i Ccl.
  5. Zapisz plik: Plik>Zapisz jako>'nazwa pliku'.
    UWAGA: Ponieważ TEER i Ccl są mierzone w sposób ciągły w sposób zautomatyzowany, monitoruj ich wartości przez okres od trzech do pięciu dni. Zmiana pożywki nie jest konieczna, chyba że żywotność komórek jest nieoptymalna, co widać po braku wzrostu TEER.
  6. Wybierz punkt czasowy do kohodowli MBMEC z limfocytami T, gdy Ccl jest stabilne i niższe niż 1 μF/cm2, a TEER osiągnął maksymalny poziom.
  7. Dokładnie sprawdź bezwzględne wartości TEER i Ccl i wyklucz odwierty, w których MBMEC nie rozwinęły wystarczająco zlewających się monowarstw, odznaczając takie studnie.
  8. Pogrupuj pozostałe studnie: kliknij prawym przyciskiem myszy na studnię i wybierz "dodaj studnię do nowej średniej studni". Nazwij go w wyskakującym okienku; Zrób to samo dla wszystkich pojedynczych studzienek, które mają zostać zgrupowane.
  9. Sprawdź wszystkie średnie studzienki, aby potwierdzić, że wszystkie mają te same warunki początkowe przed kokulturą. Jeśli niektóre z nich mają znacząco różne bezwzględne wartości TEER lub nachylenia TEER lub błędy standardowe są zbyt duże, należy ponownie wykonać grupowanie.
    UWAGA: Optymalne grupowanie studni zapewnia minimalne różnice w wartościach TEER, zarówno w obrębie grup eksperymentalnych, jak i między nimi.
  10. W zakładce "eksperyment" naciśnij "pauza", odłącz instrument i wyjmij go z inkubatora. Zdejmij pokrywki pod okapem z przepływem laminarnym.
  11. Przygotować wstępnie aktywowane i/lub wcześniej nieuszkodzone limfocyty T, ze specyficznymi cytokinami, przeciwciałami lub innymi substancjami lub bez nich, zgodnie z potrzebami: Na przykład: zmieszać oczyszczone szczurze przeciwciało przeciw mysim IFN-γ NA/LE (klon XGM1.2) z przygotowanymi limfocytami T w ilości 20 μg/ml na studzienkę urządzenia TEER.
    UWAGA: Jeśli stosowane są substancje takie jak inhibitor granzymu B, dodaje się je do hodowli limfocytów T na początku stymulacji limfocytów T: np. Granzym B Inhibitor II (Calbiochem) miesza się z izolowanymi limfocytami T w końcowym stężeniu 10 μM w DMSO. Zobacz Materiały i wyposażenie, aby uzyskać więcej informacji.
  12. Usunąć część pożywki z wkładu (górna komora studzienki): np. ostrożnie odpipetować 150 μl (należy unikać wyjmowania całego podłoża, ponieważ mogłoby to zakłócić działanie monowarstwy MBMEC).
  13. Dodać limfocyty T do MBMEC, ostrożnie pipetując 150 μl pożywki zawierającej 2 x 105 komórek/wkładkę.
    UWAGA: Podczas zbierania wstępnie aktywowanych limfocytów T należy liczyć tylko komórki wolne od trypanu i trypanu.
  14. Zamknij pokrywy i umieść instrument z powrotem w inkubatorze. Podłącz ponownie przyrząd i naciśnij "wznów pomiar". Po 24 godzinach naciśnij "stop" w zakładce "eksperyment" i zapisz plik (File>Save).

5. Eksport danych i analiza statystyczna

  1. Wyeksportuj wyniki, wybierając opcję Plik>Eksportuj.
  2. W zakładce "ustawienia" wyskakującego okienka wybierz ".dot" w opcji "separator dziesiętny" i "tabulator" w opcji "ogranicznik pola".
  3. W zakładce "eksport wyników" nazwij plik, zaznacz wszystkie dołki do wyeksportowania, a także zaznacz pola "TEER" i "Ccl" w opcji "wybierz dane".
  4. Naciśnij "eksportuj dane", otwórz wyeksportowany plik i skopiuj dane do arkusza kalkulacyjnego.
  5. Znormalizuj wyeksportowane dane (posortowane według każdej repliki, z wartościami TEER i Ccl podanymi dla każdego przebiegu (pomiaru)): Ustaw wartości TEER i Ccl ostatniego punktu czasowego przed kokulturą na 100% i zmień odpowiednio wartości dla wszystkich innych przebiegów w stosunku do przebiegu "100%".
  6. Skopiuj znormalizowane dane do wybranego oprogramowania, aby wygenerować wykres, używając poszczególnych studzienek i wyświetlając błąd standardowy średniej dla każdej grupy leczonej.
  7. Wykonaj dwukierunkowy test statystyczny ANOVA z poprawką Bonferroniego dla wielokrotnych porównań, korzystając z wybranego oprogramowania statystycznego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rycina 1 przedstawia ogólny przegląd modelu bariery krew-mózg (BBB) in vitro wykorzystanego do badania interakcji między limfocytami T a komórkami śródbłonka. Eksperyment składa się z trzech głównych etapów. Pierwszym krokiem jest izolacja pierwotnych MBMEC z kory mózgu i ich hodowla przez pięć dni. Po osiągnięciu konfluencji w płytce hodowlanej, MBMEC są trypsynizowane i ponowne wysiewane na przepuszczalne wkłady, które następnie umieszcza się w urządzeniu do po...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Do udanego eksperymentu niezbędne jest wykonanie kilku etapów opisanego protokołu. Podczas początkowej izolacji i hodowli MBMEC ważne jest, aby praca była wykonywana w jak największym stopniu w sterylnych warunkach, aby zapobiec zanieczyszczeniu hodowli komórkowej zarodnikami grzybów lub bakteriami. W celu uzyskania czystej hodowli EC zaleca się stosowanie pożywki zawierającej Puromycynę przez pierwsze trzy dni, co umożliwia przeżycie EC, ale nie innych typów komórek (zwłaszcza perycytów)41,42. Kolejnym krytyc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I. Kuzmanow, A. M. Herrmann, S. G. Meuth, H. Wiendl i L. Klotz nie mają nic do ujawnienia. H.-J. Galla jest doradcą naukowym firmy nanoAnalytics GmbH, producenta automatycznego monitora komórek.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jesteśmy wdzięczni Annice Engbers i Frankowi Kurthowi za ich doskonałe wsparcie techniczne, a dr Markusowi Schäferowi (nanoAnalytics GmbH) za pomocne dyskusje na temat pomiarów TEER. Prace te były wspierane przez Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), SFB1009 projekt A03 do HW i LK, CRC TR128, projekty A08; Z1 i B01 do LK i HW oraz Interdyscyplinarne Centrum Badań Klinicznych (Wydział Medyczny w Münster) grant nr Kl2/2015/14 dla LK.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
cellZscopenanoAnalytics GmbHwww.nanoanalytics.com zawiera: 24-dołkowy moduł komórkowy, kontroler, komputer PC z oprogramowaniem cellZscope v2.2.2 
UltrawirówkaThermo Scientificwww.thermoscientific.comSORVALL RC 6+; wirnik F21S-8x50y; do cytometru przepływowego do izolacji MBMEC
Beckman Coulterwww.beckmancoulter.comdo analizy transmigracji limfocytów
T Oprogramowanie FlowJo7.6.5Tree Starwww.flowjo.comdo analizy transmigracji limfocytów T
Probówki wirówkowe Oak Ridge, PCThermo Fisher Scientific3118-005050 ml; do izolacji MBMEC
Wkłady membranowe Transwell - wielkość porów 0,4 i mikro; mCorning3470do pomiaru TEER jako główny odczyt
Wkłady membranowe Transwell - wielkość porów 3 i mikro; mCorning3472do pomiaru TEER jako kontrola jakości przed testem migracji limfocytów T
24-dołkowa płytka do hodowli komórkowychGreiner650 180płaskodenna; do hodowli MBMEC
96-dołkowa płytka do hodowli komórkowychCostar3526okrągłodenna; do hodowli komórek odpornościowych
Separator QuadroMACSMiltenyi Biotec130-090-976do izolacji limfocytów T i komórek B; podpory Kolumny MACS LS
OctoMACS SeparatorMiltenyi Biotec130-042-109do izolacji komórek dendrytycznych; obsługuje kolumny MACS MS Komora
licząca NeubauerMarienfeldMF-0640010do zliczania komórek
Sitko do komórek, 70 &mikro; mCorning352350do izolacji komórek odpornościowych
Sitko do komórek, 40 i mikro; mCorning352340do izolacji komórek odpornościowych
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303do izolacji komórek odpornościowych
Kolumny separacyjne MACS LSMiltenyi Biotec130-042-401do izolacji komórek T i komórek B
Kolumny separacyjne MACS MSMiltenyi Biotec130-042-201do izolacji komórek dendrytycznych
Mysz CD4 MicroBeadsMiltenyi Biotec130-049-201do izolacji komórek T CD4+
Mysz CD19 MikrokulkiMiltenyi Biotec130-052-201do izolacji komórek B
Mysz CD11c MicroBeadsMiltenyi Biotec130-052-001do izolacji komórek dendrytycznych
Kolagen typu IV z ludzkiego łożyskaSigmaC5533do roztworu powlekającego MBMEC
Fibronektyna z Osocze bydlęceSigmaF1141-5MGdo roztworu powlekającego MBMEC
Kolagenaza 2 (CSL2)WorthingtonLS004176do izolacji MBMEC
Kolagenaza/Dypaza (C/D)Roche11097113001do izolacji MBMEC
DNaza ISigmaDN25do izolacji MBMEC
Surowica bydlęca płodu (FBS)SigmaF7524do izolacji MBMEC
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Amresco0332-100Gdo izolacji MBMEC
PercollSigmaP1644-1Ldo izolacji MBMEC
DMEM (+ GlutaMAX)Gibco31966-021do izolacji MBMEC i pożywki hodowlanej MBMEC
Penicylina/StreptomycynaSigmaP4333do izolacji MBMEC i pożywki hodowlanej MBMEC
buforowane fosforanem Sól fizjologiczna (PBS)SigmaD8537do MBMEC i izolacji komórek odpornościowych
HeparynaSigmaH3393do pożywki hodowlanej MBMEC
Ludzki podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF)PeproTech100-18Bdo pożywki hodowlanej MBMEC
PuromycinSigmaP8833do pożywki hodowlanej MBMEC; tylko przez pierwsze trzy dni
0,05% Trypsyna-EDTAGibco25300-054do zbioru MBMEC
Kolagenaza typu IASigmaC9891do izolacji komórek dendrytycznych
Roztwór błękitu trypanowego, 0,4%Thermo Fisher Scientific15250061do liczenia komórek
EDTASigmaE5134do izolacji komórek odpornościowych
IMDM + 1% L-GlutaminaGibco21980-032do pożywki do hodowli komórek T
X-VIVO 15LonzaBE04-418Qchronić przed światłem; dla pożywki do hodowli komórek B
i beta-merkaptoetanoluGibco31350-010dla pożywki do hodowli komórek B
L-Glutamina (100x Glutamax)Gibco35050-061dla pożywki do hodowli komórek B
MOG35— 55 peptydBiotrendBP0328do aktywacji limfocytów T swoistych dla antygenu
oczyszczony klon antymysi CD3 AbBioLegend100302145-2C11; do aktywacji poliklonalnych limfocytów T
oczyszczony anty-mysi CD28 ABBD Pharmingen553294klon 37.51; do aktywacji poliklonalnych limfocytów T
Rekombinowany mysi IFN-γPeproTech315-05do testów transmigracji limfocytów T
Rekombinowany mysi TNF-αPeproTech315-01Ado testów transmigracji limfocytów T
NA/LE oczyszczone przeciwciało anty-mysie IFN-&gammaBD Biosciences554408klon XMG1.2; zalecane stężenie końcowe: 20 &mikro; g/ml
Granzyme B Inhibitor IICalbiochem 368055zalecane stężenie końcowe: 10 &mikro; Przeciwciało
anty-mysie CD4 M PEBiolegend116005klon RM4-4; do analizy transmigracji limfocytów T
,

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction. Semin Immunopathol. 31 (4), 497-511 (2009).
  2. Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier. Nat Med. 19 (12), 1584-1596 (2013).
  3. Abbott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiol Dis. 37 (1), 13-25 (2010).
  4. Luissint, A. -C., Artus, C., Glacial, F., Ganeshamoorthy, K., Couraud, P. -O. Tight junctions at the blood brain barrier: physiological architecture and disease-associated dysregulation. Fluids Barriers CNS. 9 (1), 23(2012).
  5. Zlokovic, B. V. The Blood-Brain Barrier in Health and Chronic Neurodegenerative Disorders. Neuron. 57, 178-201 (2008).
  6. Armulik, A., Genové, G., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).
  7. Stanimirovic, D. B., Friedman, A. Pathophysiology of the neurovascular unit: disease cause or consequence? J Cereb Blood Flow Metab. 32 (7), 1207-1221 (2012).
  8. Hawkins, B. T., Davis, T. P. The Blood-Brain Barrier / Neurovascular Unit in Health and Disease. Pharmacol Rev. 57 (2), 173-185 (2005).
  9. Cardoso, F. L., Brites, D., Brito, M. A. Looking at the blood-brain barrier: molecular anatomy and possible investigation approaches. Brain Res Rev. 64 (2), 328-363 (2010).
  10. Weiss, N., Miller, F., Cazaubon, S., Couraud, P. -O. The blood-brain barrier in brain homeostasis and neurological diseases. Biochim Biophys Acta. 1788 (4), 842-857 (2009).
  11. Deli, M. A., Ábrahám, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. Permeability studies on in vitro blood-brain barrier models: Physiology, pathology, and pharmacology. Cell Mol Neurobiol. 25 (1), 59-127 (2005).
  12. Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier. Acta Neurobiol Exp (Wars). 71 (1), 113-128 (2011).
  13. Bernas, M. J., Cardoso, F. L., et al. Establishment of primary cultures of human brain microvascular endothelial cells to provide an in vitro cellular model of the blood-brain barrier. Nat Protoc. 5 (7), 1265-1272 (2010).
  14. Ruck, T., Bittner, S., Epping, L., Herrmann, A. M., Meuth, S. G. Isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells. J Vis Exp. (93), e52204(2014).
  15. Molino, Y., Jabès, F., Lacassagne, E., Gaudin, N., Khrestchatisky, M. Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport. J Vis Exp. (88), (2014).
  16. Eigenmann, D. E., Xue, G., Kim, K. S., Moses, A. V., Hamburger, M., Oufir, M. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluids Barriers CNS. 10 (1), (2013).
  17. Patabendige, A., Skinner, R. A., Morgan, L., Abbott, N. J. A detailed method for preparation of a functional and flexible blood-brain barrier model using porcine brain endothelial cells. Brain Res. 1521, 16-30 (2013).
  18. Burek, M., Salvador, E., Förster, C. Y. Generation of an immortalized murine brain microvascular endothelial cell line as an in vitro blood brain barrier model. J Vis Exp. (66), e4022(2012).
  19. Thanabalasundaram, G., Schneidewind, J., Pieper, C., Galla, H. J. The impact of pericytes on the blood-brain barrier integrity depends critically on the pericyte differentiation stage. Int J Biochem Cell Biol. 43 (9), 1284-1293 (2011).
  20. Abbott, N. J., Dolman, D. E. M., Drndarski, S., Fredriksson, S. M. An Improved in vitro BBB model: RBEC co-cultured with astrocytes. Methods Mol Biol. 814, 415-430 (2012).
  21. Sansing, H. A., Renner, N. A., MacLean, A. G. An inverted blood-brain barrier model that permits interactions between glia and inflammatory stimuli. J Neurosci Methods. 207 (1), 91-96 (2012).
  22. Hatherell, K., Couraud, P. O., Romero, I. A., Weksler, B., Pilkington, G. J. Development of a three-dimensional, all-human in vitro model of the blood-brain barrier using mono-, co-, and tri-cultivation Transwell models. J Neurosci Methods. 199 (2), 223-229 (2011).
  23. Xue, Q., Liu, Y., et al. A novel brain neurovascular unit model with neurons, astrocytes and microvascular endothelial cells of rat. Int J Biol Sci. 9 (2), 174-189 (2013).
  24. Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature reviews. Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
  25. Nakagawa, S., Deli, M. A., et al. Pericytes from Brain Microvessels Strengthen the Barrier Integrity in Primary Cultures of Rat Brain Endothelial Cells. Cell Mol Neurobiol. 27 (6), 687-694 (2007).
  26. Srinivasan, B., Kolli, A. R., Esch, M. B., Abaci, H. E., Shuler, M. L., Hickman, J. J. TEER Measurement Techniques for In Vitro Barrier Model Systems. J Lab Autom. 20 (2), 107-126 (2015).
  27. Benson, K., Cramer, S., Galla, H. -J. Impedance-based cell monitoring: barrier properties and beyond. Fluids and barriers of the CNS. 10 (1), 5(2013).
  28. Szulcek, R., Bogaard, H. J., van Nieuw Amerongen, G. P. Electric cell-substrate impedance sensing for the quantification of endothelial proliferation, barrier function, and motility. J Vis Exp. (85), (2014).
  29. Kroon, J., Daniel, A. E., Hoogenboezem, M., van Buul, J. D. Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow. J Vis Exp. (90), e51766(2014).
  30. Rahim, S., Üren, A. A real-time electrical impedance based technique to measure invasion of endothelial cell monolayer by cancer cells. J Vis Exp. (50), (2011).
  31. Galla, H. J., Thanabalasundaram, G., Wedel-Parlow, M., Rempe, R. G., Kramer, S., El-Gindi, J., Schäfer, M. A. B. The Blood-Brain-Barrier in Vitro: Regulation, Maintenance and Quantification of the Barrier Properties by Impedance Spectroscopy. Horizons in Neuroscience Research. , Nova. New York. (2011).
  32. Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7 (9), 678-689 (2007).
  33. Holman, D. W., Klein, R. S., Ransohoff, R. M. The Blood-Brain Barrier, Chemokines and Multiple Sclerosis. Biochim Biophys Acta. 1812 (2), 220-230 (2011).
  34. Larochelle, C., Alvarez, J. I., Prat, A. How do immune cells overcome the blood-brain barrier in multiple sclerosis. FEBS Lett. 585 (23), 3770-3780 (2011).
  35. Choi, J., Enis, D. R., Koh, K. P., Shiao, S. L., Pober, J. S. T Lymphocyte-Endothelial Cell Interactions. Annu Rev Immunol. 22 (1), 683-709 (2004).
  36. Lyck, R., Engelhardt, B. Going Against the Tide - How Encephalitogenic T Cells Breach the Blood-Brain Barrier. J Vasc Res. 49 (6), 497-509 (2012).
  37. Engelhardt, B. Molecular mechanisms involved in T cell migration across the blood-brain barrier. J Neural Transm (Vienna). 113 (4), 477-485 (2006).
  38. von Wedel-Parlow, M., Schrot, S., Lemmen, J., Treeratanapiboon, L., Wegener, J., Galla, H. -J. Neutrophils cross the BBB primarily on transcellular pathways: An in vitro study. Brain Res. 1367, 62-76 (2011).
  39. nanoAnalytics GmbH, Münster, Germany. , Available from: http://www.nanoanalytics.com/en (2016).
  40. Perrière, N., Demeuse, P. H., et al. Puromycin-based purification of rat brain capillary endothelial cell cultures. Effect on the expression of blood-brain barrier-specific properties. J Neurochem. 93 (2), 279-289 (2005).
  41. Bendayan, R., Lee, G., Bendayan, M. Functional expression and localization of P-glycoprotein at the blood brain barrier. Microsc Res Tech. 57, 365-380 (2002).
  42. Steiner, O., Coisne, C., Engelhardt, B., Lyck, R. Comparison of immortalized bEnd5 and primary mouse brain microvascular endothelial cells as in vitro blood-brain barrier models for the study of T cell extravasation. J Cereb Blood Flow Metab. 31 (1), 315-327 (2011).
  43. Malina, K. C. K., Cooper, I., Teichberg, V. I. Closing the gap between the in-vivo and in-vitro blood-brain barrier tightness. Brain Res. 1284, 12-21 (2009).
  44. Ruck, T., Bittner, S., Meuth, S. Blood-brain barrier modeling: challenges and perspectives. Neural Regen Res. 10 (6), 889(2015).
  45. Weidenfeller, C., Schrot, S., Zozulya, A., Galla, H. -J. Murine brain capillary endothelial cells exhibit improved barrier properties under the influence of hydrocortisone. Brain Res. 1053, 162-174 (2005).
  46. Schrot, S., Weidenfeller, C., Schäffer, T. E., Robenek, H., Galla, H. -J. Influence of hydrocortisone on the mechanical properties of the cerebral endothelium in vitro. Biophys J. 89 (6), 3904-3910 (2005).
  47. Seebach, J., Dieterich, P., et al. Endothelial barrier function under laminar fluid shear stress. Lab Invest. 80 (12), 1819-1831 (2000).
  48. Siddharthan, V., Kim, Y. V., Liu, S., Kim, K. S. Human astrocytes/astrocyte-conditioned medium and shear stress enhance the barrier properties of human brain microvascular endothelial cells. Brain Res. 1147, 39-50 (2007).
  49. Santaguida, S., Janigro, D., Hossain, M., Oby, E., Rapp, E., Cucullo, L. Side by side comparison between dynamic versus static models of blood-brain barrier in vitro: a permeability study. Brain Res. 1109 (1), 1-13 (2006).
  50. Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (µBBB). Lab Chip. 12 (10), 1784(2012).
  51. Griep, L. M., Wolbers, F., et al. BBB ON CHIP: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomed Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Transendotelialna oporno elektrycznapojemno warstwy kom rkowejpierwotne kom rki r db onka mikro naczyniowego m zgu myszyaktywowane limfocyty Ttest kokulturyocena funkcji bariery w czasie rzeczywistymautoimmunologiczne schorzenia OUN

Powiązane artykuły