Artykuł metodologiczny

Zastosowanie elektroforezy kapilarnej do ilościowego oznaczania kwasów organicznych z tkanki roślinnej: przypadek testowy badający nasiona Coffea arabica

9.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54611

⸱

12 listopada 2016

 ,  , 
1Center for Applied Plant Sciences, The Ohio State University, OARDC, 2Department of Plant Pathology, The Ohio State University, OARDC, 3Department of Horticulture and Crop Science, The Ohio State University, OARDC, 4OARDC Metabolite Analysis Cluster, The Ohio State University, OARDC

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł przedstawia metodę wykrywania i kwantyfikacji kwasów organicznych z materiału roślinnego za pomocą swobodnej strefowej elektroforezy kapilarnej. Podano przykład potencjalnego zastosowania tej metody, określającej wpływ wtórnej fermentacji na poziom kwasów organicznych w nasionach kawy.

Streszczenie

Kwasy karboksylowe to kwasy organiczne zawierające jedną lub więcej końcowych karboksylowych grup funkcyjnych (COOH). Krótkołańcuchowe kwasy karboksylowe (SCCA; kwasy karboksylowe zawierające od trzech do sześciu atomów węgla), takie jak jabłczan i cytrynian, mają kluczowe znaczenie dla prawidłowego funkcjonowania wielu systemów biologicznych, w których działają w oddychaniu komórkowym i mogą służyć jako wskaźniki zdrowia komórek. W żywności zawartość kwasów organicznych może mieć znaczący wpływ na smak, a zwiększony poziom SCCA skutkuje kwaśnym lub "kwaśnym" smakiem. Z tego powodu metody szybkiej analizy poziomów kwasów organicznych są szczególnie interesujące dla przemysłu spożywczego i napojów. Niestety, większość metod stosowanych do oznaczania ilościowego SCCA opiera się na czasochłonnych protokołach wymagających derywatyzacji próbek za pomocą niebezpiecznych odczynników, a następnie kosztownych analiz chromatograficznych i/lub spektrometrycznych mas. Niniejsza metoda szczegółowo opisuje alternatywną metodę wykrywania i oznaczania ilościowego kwasów organicznych z materiału roślinnego i próbek żywności przy użyciu swobodnej strefowej elektroforezy kapilarnej (CZE), czasami nazywanej po prostu elektroforezą kapilarną (CE). CZE zapewnia opłacalną metodę pomiaru SCCA o niskiej granicy wykrywalności (0,005 mg/ml). Ten artykuł zawiera szczegółowe informacje na temat ekstrakcji i oznaczania ilościowego SCCA z próbek roślin. Podczas gdy przedstawiona metoda koncentruje się na pomiarze SCCA z ziaren kawy, przedstawiona metoda może być stosowana do wielu roślinnych materiałów spożywczych.

Wprowadzenie

Kwasy karboksylowe to związki organiczne zawierające jedną lub więcej końcowych karboksylowych grup funkcyjnych, z których każda jest przyłączona do grupy R zawierającej jeden lub więcej atomów węgla (R-C[O]OH). Krótkołańcuchowe kwasy karboksylowe o niskiej masie cząsteczkowej (krótkołańcuchowe kwasy karboksylowe, SCCA) zawierające od jednego do sześciu atomów węgla, są niezbędnymi składnikami oddychania komórkowego i funkcjonują w kilku szlakach biochemicznych niezbędnych do wzrostu i rozwoju komórek. SCCA odgrywają kluczową rolę w metabolizmie komórkowym1, sygnalizacji komórkowej2 i reakcjach organizmu na środowisko (takich jak antybioza3). Z tego powodu SCCA mogą służyć jako użyteczne wskaźniki zakłóceń metabolizmu komórkowego, reakcji roślin na stres4,5 i jakości owoców6,7. Do tej pory SCCA były oznaczane ilościowo głównie za pomocą technik chromatograficznych, takich jak wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) lub chromatografia gazowa ze spektroskopią mas (GC-MS). Chociaż metody te są w stanie osiągnąć bardzo niskie granice wykrywalności, mogą być kosztowne, wymagają derywatyzacji docelowych SCCA przy użyciu i/lub toksycznych odczynników i obejmują długie przebiegi separacji na GC lub HPLC. Z tego powodu stale rośnie zainteresowanie zastosowaniem wolnej, strefowej elektroforezy kapilarnej (CZE), która nie wymaga derywatyzacji próbki, do ilościowego oznaczania kwasów organicznych8.

Wolna strefowa elektroforeza kapilarna (CZE) to metodologia chromatograficznego rozdzielania, która, ze względu na dużą liczbę teoretycznych płytek, szybkość i względną łatwość użycia, coraz częściej zastępuje zarówno GC-MS, jak i wysokociśnieniową chromatografię cieczową jako metodę analityczną do oznaczania ilościowego (szczególnie dla celów kontroli jakości) anionów, kationów, aminokwasów, węglowodanów i krótkołańcuchowych kwasów karboksylowych (SCCA)8,9,10. Separacja małych cząsteczek, w tym SCCA, oparta na CZE, opiera się na dwóch podstawowych zasadach: elektroforetycznym ruchu naładowanych jonów w polu elektrycznym utworzonym w poprzek buforu wypełniającego kapilarę; oraz ruch elektroosmotyczny całego układu buforowego z jednego końca kapilary na drugi, na ogół w kierunku elektrody ujemnej. W tym układzie małe cząsteczki poruszają się w kierunku elektrody ujemnej z różnymi prędkościami, przy czym prędkość każdej cząsteczki zależy od stosunku ładunku netto cząsteczki do masy cząsteczkowej. Ponieważ ruch każdej pojedynczej cząsteczki w tym układzie zależy od stanu naładowania cząsteczki i ogólnej szybkości przepływu elektroosmotycznego (która z kolei opiera się na zawartości jonów w buforze używanym do wypełnienia kapilary), pH buforu i skład jonowy mają duży wpływ na stopień, w jakim cząsteczki mogą być skutecznie oddzielone za pomocą CZE. Z tego powodu SCCA, ze względu na stosunkowo wysoki stosunek ładunku do masy, są idealnymi celami do separacji opartej na CZE. Metabolity wydzielone za pomocą CZE można wykrywać różnymi metodami, w tym absorbancją UV, absorbancją spektralną (która jest zwykle wykonywana przy użyciu matrycy fotodiodowej [PDA]) i/lub spektroskopii mas (CE-MS lub CE-MS/MS)8. Różnorodność metod separacji i detekcji oferowanych przez CZE sprawia, że jest to technika niezwykle elastyczna i adaptowalna. Z tego powodu CZE jest coraz częściej stosowane jako standardowa metoda analizy w obszarach bezpieczeństwa i jakości żywności11,12, badań farmaceutycznych13 i monitorowania środowiska13,14.

Elektroforeza kapilarna jest używana do wykrywania i ilościowego oznaczania krótkołańcuchowych kwasów karboksylowych od prawie dwóch dekad13. Zdolność rozdzielcza (szczególnie w przypadku małych, naładowanych cząsteczek), krótki czas trwania i niski koszt analiz CZE w przeliczeniu na próbkę sprawiają, że CZE jest idealną techniką do rozdzielania i oznaczania ilościowego SCCA13. Metoda ta przedstawia protokół wykorzystania CZE do pomiaru stężenia kwasów organicznych w tkankach roślinnych. Przykładowe dane zostały wygenerowane dzięki pomyślnemu wdrożeniu tego protokołu w celu zmierzenia zmian poziomu kwasów organicznych w nasionach kawy po wtórnej fermentacji. Protokół szczegółowo opisuje krytyczne etapy i typowe błędy związane z separacją SCCA na podstawie CZE oraz omawia środki, za pomocą których protokół ten może być z powodzeniem stosowany do ilościowego oznaczania SCCA w dodatkowych tkankach roślinnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie próbki

  1. Przygotować próbki do ekstrakcji krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych (SCCA). Przygotowywać 1,0 g nasion kawy na raz, aby upewnić się, że po obróbce pozostanie wystarczająca ilość próbki.
    1. Jeśli próbki były zamrożone przed procesem mielenia, należy utrzymywać tkankę w stanie zamrożonym przez cały czas obróbki, aby zapobiec uszkodzeniom wynikającym z zamrażania/odmrażania oraz utlenianiu próbek. Wyjmować próbkę z zamrażarki lub przechowywania w temperaturze poniżej zera tylko w razie potrzeby mielenia.
    2. Świeże próbki należy gwałtownie zamrozić w ciekłym azocie bezpośrednio przed mieleniem. Aby zminimalizować manipulacje z próbkami, należy je zamrozić, umieszczając je w moździerzu wcześniej wypełnionym ciekłym azotem.
    3. Próbki w formie ciekłej należy analizować natychmiast po ich otrzymaniu lub zamrozić gwałtownie w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -20 ºC lub -80 ºC do czasu analizy. Przed analizą wyjąć zamrożone próbki z przechowywania i pozwolić im się rozmrozić. W przypadku próbek ciekłych przejść do kroku (3.5) w celu obróbki.
  2. Przed pracą z ciekłym azotem należy założyć odpowiednie środki ochrony osobistej (w tym okulary ochronne, rękawiczki i fartuch laboratoryjny).
  3. Próbki tkankowe zmielić trzykrotnie na jednorodny, drobny proszek (tj. o jednolitym rozmiarze cząstek) w ciekłym azocie, używając ceramicznego moździerza i tłuczka.
    UWAGA: Osiągnięcie jednolitego rozmiaru cząstek jest niezbędne dla maksymalizacji wydajności ekstrakcji SCCA.
    1. Przed dodaniem próbki schłodzić moździerz i tłuczek ciekłym azotem. Utrzymywać moździerz wypełniony niewielką ilością ciekłego azotu podczas dodawania próbki.
    2. Za pomocą chochli dodać do moździerza tyle ciekłego azotu, aby próbka była całkowicie zanurzona.
    3. Próbki łatwe do zmielenia, takie jak liście lub palona kawa, dodać do ciekłego azotu i rozgnieść okrężnym ruchem mielącym. Rozpocząć mielenie próbek, gdy poziom ciekłego azotu obniży się do punktu, w którym ledwie pokrywa on próbki.
    4. Próbki trudne do zmielenia, takie jak surowe nasiona kawy, dodać do ciekłego azotu i pozostawić do zamrożenia na 10-30 sec (lub do momentu, gdy ciekły azot przestanie gwałtownie wrzeć) przed mieleniem. Rozbić tkankę na mniejsze fragmenty za pomocą pionowego ruchu zgniatającego, a następnie dokończyć mielenie tkanki okrężnym ruchem mielącym.
    5. Powtórzyć kroki 1.3.2-1.3.4 jeszcze dwa razy, tak aby próbki zostały zmielone łącznie trzy razy. Zazwyczaj trzy kolejne cykle mielenia zredukują próbki do proszku o konsystencji mąki.
    6. Jeśli nie uzyskano konsystencji mąki, powtarzać kroki 1.3.2-1.3.4 do momentu zredukowania próbek do proszku o jednorodnie małym rozmiarze cząstek (wydajność ekstrakcji jest odwrotnie proporcjonalna do rozmiaru cząstek).
  4. Przenieść proszek do szklanych fiolek lub probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml. Rozpocząć dalszą obróbkę natychmiast po mieleniu (zalecane) lub przechowywać próbki w temperaturze -80 ºC do czasu, aż będą gotowe do ekstrakcji.
    1. Jeśli próbki muszą być przechowywane przed analizą, podzielić próbkę na alikwoty po 500 mg (lub alikwoty po 500 µl w przypadku próbek ciekłych) i rozdzielić je pomiędzy wiele probówek do przechowywania. Unikać poddawania próbek wielokrotnym cyklom zamrażania/odmrażania, ponieważ mogą one zmienić skład próbki i negatywnie wpłynąć na przyszłe pomiary.

2. Przygotowanie standardów kwasów organicznych

  1. Przygotuj autentyczne wzorce dla analizowanych SCCA. Posłużą one do sporządzenia zewnętrznych i wewnętrznych roztworów wzorcowych, wykorzystywanych do oznaczenia stężeń SCCA. W przypadku próbek kawy jako kwasy analizowane należy uwzględnić kwas cytrynowy, jabłkowy, octowy i mlekowy, a jako wzorzec wewnętrzny kwas adypinowy.
    1. Należy upewnić się, że wybrany standard wewnętrzny nie występuje naturalnie w próbce oraz że standard ten nie współeluuje z innymi pikami w profilu próbki.
    2. Wyznacz krzywe wzorcowe dla każdego analizowanego SCCA i określ zakres liniowej odpowiedzi dla każdego SCCA (instrukcje dotyczące przeprowadzania procedury znajdują się w rozdziale 4). Należy upewnić się, że krzywe wzorcowe zostały wyznaczone dla każdego SCCA, którego stężenie ma zostać zmierzone w próbce.
      UWAGA: Krzywe wzorcowe można wyznaczać w buforze lub w tle próbki poddawanej analizie. W drugim przypadku („metoda dodatku wzorca”) wartości pola powierzchni piku dla każdego punktu krzywej wzorcowej zostaną określone poprzez odjęcie tła próbki.
    3. Należy wcześniej opisać wszystkie potrzebne probówki i szkło laboratoryjne, podając nazwę kwasu SCCA, jego stężenie oraz datę przeprowadzenia analizy.
  2. Przygotować roztwory zapasowe dla każdego wzorca o znanym stężeniu (10 mg/ml), używając kolby miarowej w celu zapewnienia dokładności podczas przygotowania standardów.
    1. Rozpuścić stałe standardy SCCA (kwas cytrynowy i kwas jabłkowy) w wodzie ultrapurej (18,2 MΩ), aby uzyskać stężenie pożądane dla roztworu zapasu.
      1. Przygotuj roztwór zapasowy o stężeniu 10 mg/ml, wsypując 100 mg wzorca do kolby miarowej o pojemności 10 ml. Dopełnij kolbę miarową wodą ultrapure do kreski 10 ml, aby rozpuścić kwas.
      2. Należy przygotować standard kwasu o niższym stężeniu lub delikatnie podgrzać kolby, aby doprowadzić do rozpuszczenia trudnorozpuszczalnych standardów SCCA, takich jak kwas adypinowy.
    2. Rozcieńczyć ciekłe wzorce kwasów w fazie ciekłej (kwas octowy i kwas mlekowy) w wodzie ultrapurej, aby uzyskać pożądane stężenie.
      1. Wypełnij wstępnie kolbę miarową 5 ml wody ultrapure. Do kolby dodaj ilość kwasu niezbędną do przygotowania roztworu o stężeniu 10 mg/ml (obliczoną na podstawie gęstości kwasu podanej przez dostawcę), a następnie dopełnij wodą do końcowej objętości 10 ml.
  3. Przenieś każdy roztwór zapasowy do czystej szklanej probówki o pojemności 15 ml z nakrętką wyłożoną politetrafluoroetylenem (PTFE) i uszczelnij plastikową folią parafinową. Roztwory zapasowe można przechowywać w szczelnie zamkniętych probówkach w temperaturze 4 ºC przez 1 tydzień.
    1. Jeśli roztwory stokowe były przechowywane w lodówce po przygotowaniu, należy upewnić się, że standardy SCCA nie wytrąciły się z roztworu przed użyciem. Osady należy ponownie rozpuścić poprzez delikatne podgrzanie.
  4. Przygotować roztwór do ekstrakcji SCCA. Należy dodać standard wewnętrzny w stężeniu wystarczającym do detekcji w próbkach (0,05 mg/ml). Przygotować ilość roztworu wystarczającą do ekstrakcji wszystkich próbek.
    1. Przygotować 50 ml roztworu do ekstrakcji SCCA poprzez rozcieńczenie roztworu treściwego standardu wewnętrznego do stężenia 0,05 mg/ml w wodzie ultrapure. Dodać 250 µl roztworu wzorcowego standardu wewnętrznego (10 mg/ml) do 49,75 ml wody.
    2. Jeśli ekstrakt wymaga rozcieńczenia, należy dostosować stężenie wzorca wewnętrznego w roztworze ekstrakcyjnym tak, aby po rozcieńczeniu (0,05 mg/ml) stężenie końcowe mieściło się w granicach oznaczalności systemu CE (dając sygnał wykrywalny, ale nie nasycony, patrz punkt 5.2.2 poniżej).
    3. Przygotuj świeży roztwór do ekstrakcji dla każdej serii ekstrakcji (t. j. (dla każdej serii eksperymentalnej).
  5. Przygotować próbki do krzywej wzorcowej (serię odpowiednich rozcieńczeń) dla analizowanych SCCA, wykorzystując minimum 5 punktów. Zastosowane stężenia krzywej wzorcowej muszą mieścić się w zakresie liniowej odpowiedzi dla danego SCCA oraz obejmować stężenia SCCA przewidywane w próbkach.
    1. Do roztworów krzywej wzorcowej należy dodać wybrany standard wewnętrzny, aby umożliwić jego oznaczenie ilościowe w próbkach. Standard wewnętrzny zostanie wykorzystany do ułatwienia identyfikacji piku oraz obliczenia wydajności ekstrakcji (sekcja 6).
    2. Rozcieńczyć każdy SCCA do stężeń określonych powyżej (0,01, 0,02, 0,04, 0,06, 0,08 mg/ml; patrz powyżej, 2.4.2) w nowych probówkach do mikrocentryfugi (jedna dla każdego stężenia/punktu krzywej wzorcowej), używając wody ultrapure. Przygotować 1 ml roztworu dla każdego punktu stężenia krzywej wzorcowej. Należy upewnić się, że każdy punkt stężenia zawiera wszystkie cztery standardy kwasów oraz standard wewnętrzny w odpowiednim stężeniu.
    3. Przygotuj nowe punkty krzywej wzorcowej dla każdego zestawu próbek przeznaczonych do analizy w systemie elektroforezy kapilarnej. Próbki do krzywej wzorcowej SCCA przechowuj w temperaturze 4 ºC do momentu analizy, która zostanie przeprowadzona po ekstrakcji SCCA z tkanek docelowych (rozdział 3).

3. Ekstrakcja kwasów organicznych

  1. Należy wcześniej oznakować probówki, przygotowując co najmniej jedną probówkę dla każdej próbki przeznaczonej do ekstrakcji.
  2. Wyjąć z przechowywania próbki przeznaczone do ekstrakcji i umieścić je w lodzie podczas odważania materiału do ekstrakcji.
  3. Odważ 100 mg próbki do ekstrakcji SCCA.
    1. Po zważeniu każdej próbki przenieść tkankę do czystej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Odmierzyć ilość próbki jak najbliższą masie docelowej, aby zminimalizować zmienność.
    2. Należy zapisywać masę każdej zmierzonej próbki, ponieważ wykryte ilości SCCA zostaną znormalizowane z uwzględnieniem masy próbki (patrz punkt 6.5.2 poniżej).
  4. Po zważeniu wszystkich próbek, do każdej z probówek z próbką należy dodać 1 ml roztworu ekstrakcyjnego (mieszaniny wody i wzorca wewnętrznego z kroku 2.4). Należy zachować ten sam stosunek roztworu ekstrakcyjnego do masy tkanki we wszystkich ekstrakcjach (w tym przypadku 1 ml na 100 ± 5 mg tkanki). Całość należy dokładnie wymieszać w wstrząsarku wirówkowym (vortex) przez 10 s.
  5. Pozostawić próbki w temperaturze pokojowej na 1 h. W tym czasie mieszać zawartość każdej probówki co 15 min, zgodnie z opisem w kroku 3.4.
  6. Po 1 h ekstrakcji ponownie wymieszać próbki i przenieść probówki do mikrowirówki. Wirować próbki przy 4 °C, 10 000 x g przez 10 min w celu wytrącenia materiału stałego (ścian komórkowych, materii cząsteczkowej, itp.).
    1. Podczas przetwarzania próbek w fazie ciekłej należy dodać odpowiednie stężenie standardu wewnętrznego, krótko wymieszać, a następnie odwirować. Po wirowaniu próbki ciekłe należy traktować w taki sam sposób, jak ekstrakty z próbek stałych.
    2. Należy sprawdzić pH próbek, aby potwierdzić ich zgodność z zakresem pH buforu do elektroforezy w zestawie detekcyjnym (krok 4.6) lub stosowanym układem buforowym. Ze względu na to, że objętości próbek są zazwyczaj niewielkie, pomiar pH można przeprowadzić za pomocą papierka wskaźnikowego.
  7. Przygotuj próbki do filtracji przy użyciu filtrów dyskowych montowanych na strzykawkach (3.8).
    UWAGA: Aby zapobiec utracie próbki, należy upewnić się, że każdy filtr jest prawidłowo przymocowany do strzykawki przed przeniesieniem supernatantu. Należy przygotować jedną strzykawkę z zamontowanym filtrem dyskowym dla każdej próbki przeznaczonej do analizy (w tym dla próbek do krzywej wzorcowej).
  8. Po odwirowaniu próbek i przygotowaniu filtrów strzykawkowych, przenieś nadsącz z każdej próbki do strzykawki o pojemności 3 ml wyposażonej w 0.2 µm filtr strzykawkowy. Do każdej próbki należy użyć nowego filtra i strzykawki. Wszystkie próbki, w tym próbki do krzywej wzorcowej i kontrole buforowe, należy przefiltrować przed analizą w systemie CE.
  9. Przefiltruj próbkę bezpośrednio do czystej probówki do mikrowirówki. Po przefiltrowaniu zamknij probówkę z filtratem i zutylizuj strzykawkę wraz z zestawem filtracyjnym.
  10. Przetłoczone próbki należy niezwłocznie wprowadzić do systemu CE w celu detekcji SCCA lub przechowywać je w temperaturze 4 °C na noc. Jeśli próbki mają być przechowywane przez noc, należy uszczelnić probówki folią parafinową, aby zapobiec wymianie gazowej i odparowywaniu próbek.
    1. Jeśli próbki muszą być przechowywane dłużej niż jeden dzień po filtrowaniu, należy gwałtownie zamrozić ekstrakty w ciekłym azocie lub zamrozić je w temperaturze -20 ºC. Po rozmrożeniu należy jednak sprawdzić, czy w każdej próbce nie powstał osad i w razie potrzeby przefiltrować ją ponownie (zgodnie z krokiem 3.6).

4. Konfiguracja analizy detekcji SCCA

  1. Szczegółowe informacje dotyczące programowania oraz oprogramowania sterującego należy znaleźć w instrukcji obsługownika CE.
  2. Przygotować fiolki z próbkami do elektroforezy kapilarnej (CE) w celu oznaczenia SCCA. Upewnić się, że fiolki są prawidłowo oznakowane, czyste i wolne od wad.
  3. Przed użyciem należy umyć i osuszyć nakrętki fiolek do elektroforezy kapilarnej (CE).
    1. Umyć nakrętki, zanurzając je w wodzie ultrapurej i pozostawiając do namoczenia przez noc. Po namoczeniu nakrętek odlać roztwór i dwukrotnie przepłukać nakrętki wodą ultrapurej.
    2. Przenieść wypłukane nakrętki na czystą powierzchnię do suszenia wyłożoną beztkankową chusteczką i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu. Przed użyciem należy upewnić się, że nakrętki są całkowicie suche, aby uniknąć spadków ciśnienia.
  4. Przenieś 1 ml próbki do każdej fiolki CE, uważając, aby nie rozpryskać przypadkowo próbki na szyjkę fiolki. Po przeniesieniu zamknij każdą fiolkę nakrętką CE.
    1. Jeśli wymagane jest rozcieńczenie, należy rozcieńczyć próbki nasion kawy w stosunku 1:10 lub 1:100 bezpośrednio w fiolce do elektroforezy kapilarnej (CE), używając wody ultrapure. W przypadku rozcieńczeń większych niż 1:100 należy przygotować rozcieńczenie pośrednie, aby uniknąć błędów pipetowania.
  5. Przygotować jedną probówkę dla każdego punktu krzywej wzorcowej, przenosząc roztwory krzywej wzorcowej (1,0 ml) z kroku 2.5 do probówek CE. Każdą probówkę należy zakapslować po przeniesieniu cieczy.
  6. Przygotuj 0,1 M roztwór wodorotlenku sodu (NaOH), dodając 0,04 g NaOH do zlewki zawierającej 90 ml wody ultrapure i pozostawiając granulki do całkowitego rozpuszczenia. Przenieś 0,1 M roztwór NaOH do kolby miarowej o pojemności 100 ml i uzupełnij objętość do kreski 100 ml.
  7. Do czystej fiolki do elektroforezy kapilarnej (CE) dodać 1 ml 0,1 M roztworu NaOH i zakręcić.
  8. Przygotować fiolki z buforem do elektroforezy kapilarnej (CE) dla każdej partii próbek analizowanych w systemie CE. Można wykorzystać gotowe zestawy do separacji lub przygotować bufory według własnej receptury.13.
    1. Przygotować jedną probówkę zawierającą 1 ml roztworu buforu startowego i zakręcić ją.
    2. Przygotować trzy probówki, z których każda powinna zawierać 1 ml roztworu buforu do elektroforezy, i zakręcić je. Wymienić bufor do elektroforezy przed każdą serią próbek i punktów krzywej wzorcowej lub po analizie 35 próbek, w zależności od tego, co nastąpi wcześniej.
    3. Napełnij trzy dodatkowe fiolki 1 ml wody ultrapure i zakręć każdą z nich.
    4. Przygotuj jedną pustą probówkę na odpady z zakrętką.
  9. Po przygotowaniu fiolek opisanych w kroku 4.8, należy umieścić fiolki zawierające bufory i wodę, a także fiolki na odpady (z kroków 4.8.2–5) w tacy na bufory systemu elektroforezy kapilarnej, zgodnie z instrukcjami producenta.15Dokładnie odnotuj pozycję każdej fiolki w celu zaprogramowania autoprobnikora.
  10. Wprowadź fiolki zawierające punkty krzywej wzorcowej oraz fiolki zawierające próbki do analizy do tacy wlotowej na próbki, zgodnie z instrukcją producenta. Zanotuj położenie każdej fiolki w celu zaprogramowania autosamplera (patrz kroki 4.11.1 poniżej).
  11. Przygotować metody kondycjonowania i rozdziału próbek (programy dla tych metod znajdują się w Tabela 1 i 2odpowiednio) i utwórz przykładowy plik sekwencji zgodnie z instrukcją obsługi urządzenia. Należy zastosować metodę rozdziału opisaną w Tabela 2przepłukać kolumnę inicjatorem (20 psi) przez 0,2 min; przepłukać akceleratorem (20 psi) przez 0,5 min, wstrzyknąć próbki (0,5 psi) na kolumnę przez 0,09 min, rozdzielić próbki przy 20 kV przez 12 min, przepłukać NaOH (20 psi) przez 0,5 min, a na koniec przepłukać wodą (20 psi) przez 0,5 min.
    1. Używając oprogramowania sterującego CE, sporządź sekwencję analizy próbek (t. j. listę zadań (plik listy szczegółowo określający kolejność analizy próbek oraz metodę separacji dla każdej z nich) za pomocą interfejsu arkusza kalkulacyjnego „sequence”. Każdy wiersz w arkuszu będzie odpowiadać jednemu pomiarowi próbki i wygeneruje pojedynczy plik danych.
      1. Upewnij się, że podczas tworzenia pliku sekwencji próbki są identyfikowane zgodnie z ich właściwą pozycją w tacy do próbkowania. Upewnij się, że każdy plik danych ma unikalną nazwę, aby zapobiec nadpisywaniu poprzednich plików przez oprogramowanie. Zaprogramuj przebiegi kondycjonowania kapilary CE jako oddzielną sekwencję przed uruchomieniem sekwencji zawierającej metodę rozdziału próbek.
    2. Sekwencjonowanie próbek należy rozpocząć od roztworów krzywej wzorcowej, następnie analizować próbki SCCA, a zakończyć ponownym pomiarem roztworów krzywej wzorcowej. Pozwoli to na obliczenie stopnia ewentualnej utraty sygnału występującej podczas analizy próbek.

Tabela elektroforezy kapilarnej; etapy, czasy, roztwory, uwagi, 30 kV, NaOH, ustawienia ciśnienia.
Tabela 1: Program metody kondycjonowania stosowany do przygotowania kapilary do rozdziału krótkołańcuchowych kwasów karboksylowych za pomocą elektroforezy kapilarneja.

Tabela procesu elektroforezy kapilarnej, szczegółowo opisująca etapy ciśnienia i napięcia dla wtrysku próbki.
Tabela 2: Program metody rozdzielania stosowany do analizy krótkołańcuchowych kwasów karboksylowych za pomocą elektroforezy kapilarneja.

5. Wykonanie pomiaru detekcji SCCA i gromadzenie danych

  1. Rozpocznij cykle kondycjonowania kapilary. Należy spodziewać się konieczności kondycjonowania kapilary dwa lub trzy razy, zanim kolumna będzie gotowa do rozdziału próbek. Kondycjonowanie kolumny należy przeprowadzić zgodnie z opisem w Tabeli 1. W skrócie: przepłucz kolumnę 0,1 M NaOH (20 psi) przez 1 min, przepłucz wodą (20 psi) przez 1 min, przepłucz inicjatorem (20 psi) przez 0,5 min, przepłucz akceleratorem (20 psi) przez 0,5 min, przeprowadź rozdział akceleratora przy 30 kV przez 10 min, przepłucz kolumnę 0,1 M NaOH (20 psi) przez 0,5 min, a na koniec przepłucz kolumnę wodą (20 psi) przez 0,5 min.
    1. Kondycjonuj kapilarę przed każdym uruchomieniem sekwencji próbek. Prawidłowe kondycjonowanie osiąga się poprzez utrzymanie stałego napięcia rozdziału przez cały czas trwania procesu oraz obserwację płaskiej linii bazowej na zapisie z detektora matrycy fotodiodowej.
  2. Po kondycjonowaniu rozpocznij rozdział próbek, otwierając menu „control” w oprogramowaniu i wybierając (t.j. klikając) „run sequence”. Monitoruj zapis z detektora matrycy fotodiodowej (PDA), aby upewnić się, że rozdział przebiega prawidłowo.
    1. Obserwuj pierwszy zapis i upewnij się, że posiada on płaską linię bazową oraz wyraźnie rozdzielone (rozdzielczość do linii bazowej) poszczególne piki kwasów. Przeładowane próbki będą wykazywać długie ogony pików, czyli tzw. tailing, i będą wymagały rozcieńczenia (Rycina 1).

Wyniki chromatografii; detekcja piku kwasu octowego; analiza gradientu stężeń; wykres.
Rycina 1: Porównanie śladów PDA z zaznaczeniem przeładowanej próbki. Wraz ze wzrostem stężenia analitycznego geometria poszczególnych pików może stać się asymetryczna. Przy (a) 0.05 mg/ml kwas octowy wykazuje wyraźny, obustronnie symetryczny pik. Gdy stężenie kwasu octowego wzrasta do (b) 0.07 mg/ml i (c) 0.10 mg/ml, tworzy się ogon piku (strzałki). Takie rozmycie piku (tailing) jest wyraźną oznaką przeładowania próbki. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Po zakończeniu sekwencji pomiarowej otwórz pliki danych pojedynczo w oprogramowaniu do analizy CE i zintegruj piki.
    1. Zintegruj piki próbek.
      1. Otwórz pierwszy plik i ustaw kroki automatycznej integracji tak, aby wykluczyć pierwsze 3 min pomiaru (w których napięcie, a tym samym kierunek przepływu w kolumnie, jest odwrócone, jak opisano w Tabeli 1). W tym samym menu ustaw kryteria wyboru pików na minimalną szerokość piku 50 jednostek i pole piku 100 jednostek (lub domyślne ustawienia producenta), aby zapewnić umiarkowanie wysoki poziom selektywności, oddzielając piki kwasów od szumu tła w śladzie.
    2. Ręcznie sprawdź granice pików i linie bazowe dla każdego śladu PDA, aby zapewnić prawidłową integrację pików. Niewłaściwie zintegrowane piki (t.j. lekko asymetryczny pik SSCA, który został zintegrowany przez oprogramowanie automatyczne jako dwa oddzielne piki) będą wymagały ponownej integracji ręcznej.
  2. Po integracji wyświetl raport procentowej powierzchni, następnie zaznacz i skopiuj raport procentowej powierzchni i wklej go do oddzielnego arkusza kalkulacyjnego. Powtórz czynność dla każdej próbki, aby stworzyć pełny raport pików z całego pomiaru, w którym każdy wiersz reprezentuje pojedynczy pik (t.j. każdy pik powinien zawierać pojedynczy związek, jeśli rozdział przebiega prawidłowo).

6. Analiza danych

  1. Przygotuj dane do analizy, korzystając z arkusza kalkulacyjnego utworzonego w punkcie (5.4). Rozpocznij analizę od oznaczenia standardów kwasów dla każdego punktu krzywej wzorcowej, wliczając w to wzorzec wewnętrzny.
  2. Oblicz indeks retencji dla każdego piku, dzieląc czas retencji każdego piku w próbce przez czas retencji standardu wewnętrznego w tej samej próbce. Posortuj zestaw danych według otrzymanego indeksu retencji, aby zidentyfikować interesujące piki w każdej próbce.
  3. Po zidentyfikowaniu piku dla każdego z analizowanych kwasów, należy sporządzić krzywe wzorcowe dla każdego kwasu, wykorzystując punkty zewnętrznej krzywej wzorcowej.
    1. Wyznacz krzywą standardową (stężeniową) dla każdego standardu SCCA poprzez określenie pola powierzchni piku dla każdego stężenia standardów SCCA, a następnie nanieś stężenie na oś x oraz pole powierzchni piku na oś y. Wyznacz regresję liniową dla każdej krzywej standardowej SCCA i określ równanie nachylenia prostej (y = mx + b).
    2. Upewnij się, że R2 wartości regresji liniowej wynoszą 0,90 lub więcej, ponieważ kwantyfikacja jest przeprowadzana najdokładniej w zakresie liniowym krzywej wzorcowej.
  4. Oblicz stężenie kwasu dla danej SCCA w próbce, wykorzystując pole powierzchni piku oraz równanie nachylenia linii regresji liniowej dla krzywej wzorcowej (obliczonej w punkcie 6.3.2 powyżej). W skrócie: należy podzielić zaobserwowany obszar piku dla danego kwasu przez nachylenie linii regresji dla krzywej wzorcowej tego kwasu.
    1. Skoryguj surowe wartości stężeń obliczone w kroku 6.4 o ubytek próbki podczas przetwarzania, wykorzystując standard wewnętrzny (krok 6.5).
  5. Oblicz czynnik korekcyjny dla każdej próbki, wykorzystując wzorzec wewnętrzny.
    1. Podziel rzeczywiste stężenie wzorca wewnętrznego (t. j. znaną ilość dodaną na początku eksperymentu) przez obserwowaną wartość standardu wewnętrznego w próbce (t. j. ilość obliczona przy użyciu równania nachylenia krzywej wzorcowej dla wzorca wewnętrznego). Pomnożone należy surowe wartości stężeń każdego SCCA w próbce przez ten współczynnik korekcyjny.
    2. Stężenie SCCA skorygowane o standard wewnętrzny należy podzielić przez masę próbki wykorzystanej do ekstrakcji, aby skorygować wszelkie różnice w masie próbki. Obliczenie to pozwala wyznaczyć ilość analitytu na masę próbki (w tym przykładzie mg SCCA na mg mielonej kawy), co następnie można przeliczyć na jednostki odpowiednie dla danego badania (mg/mg, mg/g, g/g, itp.).
  6. Po obliczeniu stężeń SCCA (znormalizowanych względem masy [dla próbek stałych lub ciekłych] lub objętości [dla próbek ciekłych]), należy wykorzystać te wartości do analizy statystycznej, zgodnie z wymogami projektu doświadczalnego oraz badanymi problemami badawczymi.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Niniejszy protokół został z powodzeniem zastosowany do pomiaru wpływu zabiegów nasiennych na zawartość SCCA w ziarnach zielonej kawy. W tym eksperymencie zastosowano sześć wariantów: nasyconą zawiesinę mikrobiologiczną szczepu Leuconostoc pseudomesenteroides GCP674 w pożywce wzrostowej (1), wodną zawiesinę drobnoustrojów GCP674 w wodzie (2), wodny roztwór kwasu octowego i mlekowego (odpowiednio 0,15 i 0,4 mg/ml) (3), zużytą pożywkę wzrostową M1 (4), wodę dH2O (5) oraz ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Podobnie jak w przypadku każdej techniki analitycznej, istnieje kilka krytycznych czynników, które mogą znacząco wpłynąć na jakość i wiarygodność generowanych danych. Po pierwsze, ważne jest, aby przetwarzać próbki wydajnie, przy minimalnej liczbie cykli zamrażania/rozmrażania. Wielokrotne zamrażanie i rozmrażanie może pogorszyć skład chemiczny próbki przed przetwarzaniem lub analizą. Po drugie, bardzo ważne jest, aby konsekwentnie i równomiernie stosować etapy tego protokołu do wszystkich próbek. Błędy techniczne wynika...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Autorzy pragną podziękować za finansowe wsparcie tego projektu przez firmę The J.M. Smucker.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Ceramiczny Moarter i tłuczekCoorstek60310
System Beckman Coulter P / ACE MDQ CE BeckmanCoulterRóżne
szklane fiolki na próbkiFisher Inc.033917D
Probówki do mikrowirówek 1,5 ml Fisher Inc.02-681-5
Woda klasy LC/MSFisher Inc.W6-1Mili-Q woda (18.2  MΩ · cm) jest również dopuszczalna
15 ml szklana rurka / nakrętka wyłożona teflonem Fisher Inc.14-93331A
Parafilm MFisher Inc.13-374-12
Zestaw do wykrywania CElixirOA pH 5,4 MicroSolv06100-5.4
BD Safety-LokFisher Inc.14-829-32
Filtr strzykawkowy 17 mm, PTFEFisher Inc.
32 Karatów, V. 8.0 oprogramowanie sterująceBeckman Coulter285512
fiolki na próbki do elektroforezy kapilarnej (CE) Beckman Coulter144980
nakrętki do fiolek CE Beckman Coulter144648
Ciekły azotN/AN/ACiekły azot jest dostępny w większości usług obiektowych
Strzykawki 3377154

Bibliografia

  1. Araújo, W. L., Nunes-Nesi, A., Nikoloski, Z., Sweetlove, L. J., Fernie, A. R. Metabolic Control and Regulation of the Tricarboxylic Acid Cycle in Photosynthetic and Heterotrophic Plant Tissues: TCA Control and Regulation in Plant Tissues. Plant Cell Environ. 35 (1), 1-21 (2012).
  2. Finkemeier, I., Konig, A. C., et al. Transcriptomic Analysis of the Role of Carboxylic Acids in Metabolite Signaling in Arabidopsis Leaves. Plant Physiol. 162 (1), 239-253 (2013).
  3. Doyle, M. P., Buchanan, R. Food Microbiology: Fundamentals and Frontiers. , 4th, ASM Press. Washington, DC, USA. (2013).
  4. Tůma, P., Samcová, E., Štulìk, K. Determination of the Spectrum of Low Molecular Mass Organic Acids in Urine by Capillary Electrophoresis with Contactless Conductivity and Ultraviolet Photometric Detection-An Efficient Tool for Monitoring of Inborn Metabolic Disorders. Anal Chim Acta. 685 (1), 84-90 (2011).
  5. López-Bucio, J., Nieto-Jacobo, M. F., Ramı́rez-Rodrı́guez, V., Herrera-Estrella, L. Organic Acid Metabolism in Plants: From Adaptive Physiology to Transgenic Varieties for Cultivation in Extreme Soils. Plant Sci. 160 (1), 1-13 (2000).
  6. Cebolla-Cornejo, J., Valcárcel, M., Herrero-Martìnez, J. M., Rosellò, S., Nuez, F. High Efficiency Joint CZE Determination of Sugars and Acids in Vegetables and Fruits: CE and CEC. Electrophoresis. 33 (15), 2416-2423 (2012).
  7. Rosello, S., Galiana-Balaguer, L., Herrero-Martinez, J. M., Maquieira, A., Nuez, F. Simultaneous Quantification of the Main Organic Acids and Carbohydrates Involved in Tomato Flavour Using Capillary Zone Electrophoresis. J Sci Food Agr. 82 (10), 1101-1106 (2002).
  8. Wasielewska, M., Banel, A., Zygmunt, B. Capillary Electrophoresis in Determination of Low Molecular Mass Organic Acids. Int J Environ Sci Dev. 5 (4), 417-425 (2014).
  9. Galli, V., Garcìa, A., Saavedra, L., Barbas, C. Capillary Electrophoresis for Short-Chain Organic Acids and Inorganic Anions in Different Samples. Electrophoresis. 24 (1213), 1951-1981 (2003).
  10. Klampfl, C. W. Determination of Organic Acids by CE and CEC Methods. Electrophoresis. 28 (19), 3362-3378 (2007).
  11. Kenney, B. F. Determination of Organic Acids in Food Samples by Capillary Electrophoresis. J Chromatogr A. 546, 423-430 (1991).
  12. Galli, V., Barbas, C. Capillary Electrophoresis for the Analysis of Short-Chain Organic Acids in Coffee. J Chromatogr A. 1032 (1-2), 299-304 (2004).
  13. Capillary Electrophoresis: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. Schmitt-Kopplin, P. , Humana Press, USA. Totowa, NJ. 384(2008).
  14. Chromatographic analysis of the environment 3rd ed. Nollet, L. , CRC/Taylor & Franciss, Boca. Raton, USA. (2006).
  15. ElixerOA Organic Acids/Anions Operating and Instruction Manual, MicroSolv Technology Corperation. , Eatontown, NJ, USA. (2001).
  16. Dahlen, J., Hagberg, J., Karlsson, S. Analysis of low molecular weight organic acids in water with capillary zone electrophoresis employing indirect photometric detection. Fresenius J. Anal. Chem. 366 (5), 488-493 (2000).
  17. Ibanez, A. B., Bauer, S. Analytical method for the determination of organic acids in dilute acid pretreated biomass hydrolysate by liquid chromatography-time-of-flight mass spectroscopy. Biotech. For Biofuels. 7 (145), (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ilo ciowe oznaczanie kwas w organicznychkr tko a cuchowe kwasy karboksyloweekstrakcja z tkanki ro linnejanaliza ziaren kawywolna elektroforeza kapilarna strefowadetekcja SCCAprotok przygotowania pr bekdetekcja z u yciem matrycy fotodiodprzygotowanie krzywej wzorcowej

Powiązane artykuły