Zastosowanie elektroforezy kapilarnej do ilościowego oznaczania kwasów organicznych z tkanki roślinnej: przypadek testowy badający nasiona Coffea arabica

Kwasy karboksylowe to związki organiczne zawierające jedną lub więcej końcowych karboksylowych grup funkcyjnych, z których każda jest przyłączona do grupy R zawierającej jeden lub więcej atomów węgla (R-C[O]OH). Krótkołańcuchowe kwasy karboksylowe o niskiej masie cząsteczkowej (krótkołańcuchowe kwasy karboksylowe, SCCA) zawierające od jednego do sześciu atomów węgla, są niezbędnymi składnikami oddychania komórkowego i funkcjonują w kilku szlakach biochemicznych niezbędnych do wzrostu i rozwoju komórek. SCCA odgrywają kluczową rolę w metabolizmie komórkowym¹, sygnalizacji komórkowej² i reakcjach organizmu na środowisko (takich jak antybioza³). Z tego powodu SCCA mogą służyć jako użyteczne wskaźniki zakłóceń metabolizmu komórkowego, reakcji roślin na stres^4,5 i jakości owoców^6,7. Do tej pory SCCA były oznaczane ilościowo głównie za pomocą technik chromatograficznych, takich jak wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) lub chromatografia gazowa ze spektroskopią mas (GC-MS). Chociaż metody te są w stanie osiągnąć bardzo niskie granice wykrywalności, mogą być kosztowne, wymagają derywatyzacji docelowych SCCA przy użyciu i/lub toksycznych odczynników i obejmują długie przebiegi separacji na GC lub HPLC. Z tego powodu stale rośnie zainteresowanie zastosowaniem wolnej, strefowej elektroforezy kapilarnej (CZE), która nie wymaga derywatyzacji próbki, do ilościowego oznaczania kwasów organicznych⁸.

Wolna strefowa elektroforeza kapilarna (CZE) to metodologia chromatograficznego rozdzielania, która, ze względu na dużą liczbę teoretycznych płytek, szybkość i względną łatwość użycia, coraz częściej zastępuje zarówno GC-MS, jak i wysokociśnieniową chromatografię cieczową jako metodę analityczną do oznaczania ilościowego (szczególnie dla celów kontroli jakości) anionów, kationów, aminokwasów, węglowodanów i krótkołańcuchowych kwasów karboksylowych (SCCA)^8,9,10. Separacja małych cząsteczek, w tym SCCA, oparta na CZE, opiera się na dwóch podstawowych zasadach: elektroforetycznym ruchu naładowanych jonów w polu elektrycznym utworzonym w poprzek buforu wypełniającego kapilarę; oraz ruch elektroosmotyczny całego układu buforowego z jednego końca kapilary na drugi, na ogół w kierunku elektrody ujemnej. W tym układzie małe cząsteczki poruszają się w kierunku elektrody ujemnej z różnymi prędkościami, przy czym prędkość każdej cząsteczki zależy od stosunku ładunku netto cząsteczki do masy cząsteczkowej. Ponieważ ruch każdej pojedynczej cząsteczki w tym układzie zależy od stanu naładowania cząsteczki i ogólnej szybkości przepływu elektroosmotycznego (która z kolei opiera się na zawartości jonów w buforze używanym do wypełnienia kapilary), pH buforu i skład jonowy mają duży wpływ na stopień, w jakim cząsteczki mogą być skutecznie oddzielone za pomocą CZE. Z tego powodu SCCA, ze względu na stosunkowo wysoki stosunek ładunku do masy, są idealnymi celami do separacji opartej na CZE. Metabolity wydzielone za pomocą CZE można wykrywać różnymi metodami, w tym absorbancją UV, absorbancją spektralną (która jest zwykle wykonywana przy użyciu matrycy fotodiodowej [PDA]) i/lub spektroskopii mas (CE-MS lub CE-MS/MS⁾⁸. Różnorodność metod separacji i detekcji oferowanych przez CZE sprawia, że jest to technika niezwykle elastyczna i adaptowalna. Z tego powodu CZE jest coraz częściej stosowane jako standardowa metoda analizy w obszarach bezpieczeństwa i jakości żywności^11,12, badań farmaceutycznych¹³ i monitorowania środowiska^13,14.

Elektroforeza kapilarna jest używana do wykrywania i ilościowego oznaczania krótkołańcuchowych kwasów karboksylowych od prawie dwóch dekad¹³. Zdolność rozdzielcza (szczególnie w przypadku małych, naładowanych cząsteczek), krótki czas trwania i niski koszt analiz CZE w przeliczeniu na próbkę sprawiają, że CZE jest idealną techniką do rozdzielania i oznaczania ilościowego SCCA¹³. Metoda ta przedstawia protokół wykorzystania CZE do pomiaru stężenia kwasów organicznych w tkankach roślinnych. Przykładowe dane zostały wygenerowane dzięki pomyślnemu wdrożeniu tego protokołu w celu zmierzenia zmian poziomu kwasów organicznych w nasionach kawy po wtórnej fermentacji. Protokół szczegółowo opisuje krytyczne etapy i typowe błędy związane z separacją SCCA na podstawie CZE oraz omawia środki, za pomocą których protokół ten może być z powodzeniem stosowany do ilościowego oznaczania SCCA w dodatkowych tkankach roślinnych.

1. Przygotowanie próbki

1. Zebrać próbki do ekstrakcji krótkołańcuchowym kwasem karboksylowym (SCCA). Przygotuj jednorazowo 1,0 g nasion kawy, aby upewnić się, że po przetworzeniu pozostanie wystarczająca ilość próbki.
   1. Jeśli próbki zostały zamrożone przed procesem mielenia, tkankę należy przechowywać w stanie zamrożonym przez cały czas przetwarzania, aby zapobiec uszkodzeniom spowodowanym zamrażaniem/rozmrażaniem i utlenianiu próbki. Wyjmij próbkę z zamrażarki lub przechowywania w temperaturze poniżej zera tylko wtedy, gdy jest to potrzebne do mielenia.
   2. Szybkie zamrożenie świeżych próbek w ciekłym azocie bezpośrednio przed rozdrobnieniem próbki. Aby zminimalizować konieczność obchodzenia się z próbkami, należy je błyskawicznie zamrażać, umieszczając je w zaprawie wstępnie wypełnionej ciekłym azotem.
   3. Próbki cieczy należy analizować natychmiast po wytworzeniu lub błyskawicznie zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -20 ºC lub -80 ºC do czasu analizy. Przed analizą należy wyjąć zamrożone próbki z magazynu i pozostawić do rozmrożenia. W przypadku próbek ciekłych należy przejść do etapu (3.5) w celu przetworzenia.
2. Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej (w tym okulary ochronne, rękawice i fartuch laboratoryjny) przed pracą z ciekłym azotem.
3. Trzykrotnie zmielić próbki tkanek na jednolicie drobny proszek (tj. o jednolitej wielkości cząstek) w ciekłym azocie za pomocą moździerza ceramicznego i tłuczka.
   UWAGA: Osiągnięcie jednolitej wielkości cząstek jest niezbędne do maksymalizacji wydajności ekstrakcji SCCA.
   1. Przed dodaniem próbki należy wstępnie schłodzić moździerz i tłuczek ciekłym azotem. Utrzymuj zaprawę wypełnioną niewielką objętością ciekłego azotu podczas dodawania próbki.
   2. Za pomocą dodaj do zaprawy tyle ciekłego azotu, aby całkowicie zanurzyć próbkę.
   3. Dodaj łatwo zmielone próbki, takie jak liście lub palona kawa, do ciekłego azotu i zmiażdż okrężnymi ruchami mielenia. Mielenie próbek należy rozdrobnić, gdy poziom ciekłego azotu spadnie do punktu, w którym ledwo pokrywa próbki.
   4. Dodaj trudne do zmielenia próbki, takie jak surowe nasiona kawy, do ciekłego azotu i pozwól im zamrozić się przez 10-30 sekund (lub do momentu, gdy ciekły azot przestanie energicznie wrzeć) przed zmieleniem. Rozbij tkankę na mniejsze fragmenty za pomocą pionowego ruchu kruszącego, a następnie zakończ mielenie tkanki za pomocą okrężnego ruchu mielącego.
   5. Powtórzyć kroki 1.3.2-1.3.4 jeszcze dwa razy, tak aby próbki zostały zmielone łącznie trzy razy. Zazwyczaj trzy kolejne rundy mielenia redukują próbki do proszku o konsystencji przypominającej mąkę.
   6. Jeżeli nie zostanie uzyskana konsystencja mąki, należy powtórzyć czynności 1.3.2-1.3.4 aż do momentu, gdy próbki zostaną zredukowane do postaci proszku o jednolicie małych rozmiarach cząstek (wydajność ekstrakcji jest odwrotnie proporcjonalna do wielkości cząstek).
4. Przenieść proszek do szklanych fiolek lub probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Dalsze przetwarzanie należy rozpocząć natychmiast po zmieleniu (zalecane) lub przechowywać próbki w temperaturze -80 ºC do czasu, gdy próbki będą gotowe do ekstrakcji.
   1. Jeżeli próbki muszą być przechowywane przed analizą, należy podzielić próbkę na podwielokrotności 500 mg (lub podwielokrotności 500 μl w przypadku próbek płynnych) i podzielić na wiele probówek w celu przechowywania. Należy unikać poddawania próbek powtarzającym się cyklom zamrażania/rozmrażania, ponieważ mogą one zmienić skład próbki i negatywnie wpłynąć na przyszłe pomiary próbek.

2. Przygotowanie wzorca kwasu organicznego

1. Zgromadź autentyczne standardy dla interesujących Cię SCCA. Zostaną one wykorzystane do stworzenia zewnętrznych i wewnętrznych roztworów wzorcowych do wykorzystania w oznaczaniu stężeń SCCA. W przypadku próbek kawy należy wymienić kwas cytrynowy, jabłkowy, octowy i mlekowy jako kwasy będące przedmiotem zainteresowania oraz kwas adypinowy jako wzorzec wewnętrzny.
   1. Upewnij się, że wybrany wzorzec wewnętrzny nie występuje naturalnie w próbce i że wzorzec nie eluuje się z innymi pikami w profilu próbki.
   2. Uruchom standardowe krzywe dla każdego SCCA będącego przedmiotem zainteresowania i określ liniowy zakres odpowiedzi dla każdego SCCA (patrz sekcja 4, aby uzyskać instrukcje dotyczące uruchamiania). Upewnij się, że uruchomiłeś standardowe krzywe dla każdego SCCA, który ma być mierzony w próbce.
      UWAGA: Krzywe wzorcowe można przeprowadzić zarówno w buforze, jak i w tle próbki, która ma być oznaczona. W drugim przypadku ("dodawanie wzorca") wartości powierzchni piku każdego punktu krzywej wzorcowej zostaną określone poprzez odjęcie tła próbki.
   3. Wszystkie potrzebne probówki i naczynia szklane należy wstępnie oznaczyć nazwą kwasu SCCA, stężeniem i datą testu.
2. Przygotować roztwory podstawowe dla każdego wzorca o znanym stężeniu (10 mg/ml) przy użyciu kolby miarowej w celu zapewnienia dokładności podczas przygotowywania wzorca.
   1. Rozpuścić stałe wzorce SCCA (kwas cytrynowy i kwas jabłkowy) w ultraczystej wodzie (18,2 MΩ) w celu osiągnięcia stężenia pożądanego dla roztworu podstawowego.
      1. Sporządzić roztwór podstawowy o stężeniu 10 mg/ml, dodając 100 mg wzorca do kolby miarowej o pojemności 10 ml. Napełnić kolbę miarową do linii 10 ml ultraczystą wodą w celu rozpuszczenia kwasu.
      2. Stworzyć niższe stężenie wzorca kwasowego lub delikatnie podgrzać kolby, aby wprowadzić trudne do rozpuszczenia wzorce SCCA, takie jak kwas adypinowy, do roztworu.
   2. Rozcieńczyć wzorce kwasów w fazie ciekłej (kwas octowy i kwas mlekowy) w ultraczystej wodzie, aby osiągnąć pożądane stężenie.
      1. Napełnij wstępnie kolbę miarową 5 ml ultraczystej wody. Dodać do kolby wystarczającą ilość kwasu do przygotowania roztworu o stężeniu 10 mg/ml (obliczonego na podstawie gęstości kwasu dostarczonej przez dostawcę), a następnie dodać tyle wody, aby doprowadzić końcową objętość roztworu do 10 ml.
3. Przenieść każdy roztwór podstawowy do czystej szklanej probówki o pojemności 15 ml z nakrętką wyłożoną politetrafluoroetylenem (PTFE) i zamknąć folią parafinową z tworzywa sztucznego. Roztwory podstawowe można przechowywać w szczelnie zamkniętych probówkach w temperaturze 4 °C przez 1 tydzień.
   1. Upewnij się, że wzorce SCCA nie wytrąciły się z roztworu przed użyciem, jeśli roztwory podstawowe zostały schłodzone po przygotowaniu. Wprowadź osady z powrotem do roztworu poprzez delikatne ogrzewanie.
4. Przygotować roztwór ekstrakcyjny SCCA. Włączyć wzorzec wewnętrzny o stężeniu wystarczającym do wykrycia w próbkach (0,05 mg/ml). Przygotować wystarczającą ilość roztworu, aby wyekstrahować wszystkie próbki.
   1. Przygotować 50 ml roztworu ekstrakcyjnego SCCA, rozcieńczając roztwór podstawowy wzorca wewnętrznego do 0,05 mg/ml w wodzie ultraczystej. Dodać 250 μl roztworu podstawowego wzorca wewnętrznego (10 mg/ml) do 49,75 ml wody.
   2. Jeżeli ekstrakt musi być rozcieńczony, należy dostosować stężenie wzorca wewnętrznego w roztworze ekstrakcyjnym tak, aby końcowe stężenie mieściło się w granicach oznaczalności (dających wykrywalny, ale nie nadmiernie nasycony pik, patrz ppkt 5.2.2 poniżej) systemu CE po rozcieńczeniu (0,05 mg/ml).
   3. Przygotować świeży roztwór ekstrakcyjny dla każdej serii ekstrakcji (tj. dla każdej serii doświadczalnej).
5. Przygotować próbki krzywej wzorcowej (seria odpowiednich rozcieńczeń) dla SCCA będących przedmiotem zainteresowania, stosując co najmniej 5 punktów. Zastosowane stężenia w krzywej wzorcowej będą musiały mieścić się w liniowym zakresie odpowiedzi dla danego SCCA i obejmować stężenia SCCA oczekiwane w próbkach.
   1. Uwzględnij wybrany wzorzec wewnętrzny w roztworach krzywej wzorcowej, aby umożliwić ilościowe określenie wzorca wewnętrznego w próbkach. Wzorzec wewnętrzny zostanie wykorzystany do pomocy w identyfikacji pików i obliczeniu wydajności ekstrakcji (sekcja 6).
   2. Rozcieńczyć każdy SCCA do stężeń określonych powyżej (0,01, 0,02, 0,04, 0,06, 0,08 mg/ml; patrz wyżej, 2.4.2) w nowych probówkach do mikrowirówek (po jednej dla każdego stężenia/punktu krzywej wzorcowej) przy użyciu wody ultraczystej. Przygotować 1 ml roztworu dla każdego punktu stężenia krzywej wzorcowej. Upewnij się, że każdy punkt stężenia zawiera wszystkie cztery wzorce kwasowe i wzorzec wewnętrzny o właściwym stężeniu.
   3. Przygotować nowe standardowe punkty krzywej dla każdego zestawu próbek, które mają być poddane działaniu systemu elektroforezy kapilarnej. Próbki SCCA o krzywej wzorcowej należy przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu analizy, która nastąpi po ekstrakcji SCCA z tkanek docelowych (sekcja 3).

3. Ekstrakcja kwasów organicznych

1. Wstępnie oznaczyć probówki z próbkami, przygotowując co najmniej jedną probówkę dla każdej próbki, która ma być pobrana.
2. Wyjąć z magazynu próbki, które mają zostać wyekstrahowane, i umieścić je na lodzie, jednocześnie ważąc materiał do ekstrakcji.
3. Odważyć 100 mg próbki do ekstrakcji SCCA.
   1. Po zważeniu każdej próbki przenieś tkankę do czystej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Odmierz ilość próbki jak najbliżej masy docelowej, aby zmniejszyć zmienność.
   2. Należy śledzić masę każdej mierzonej próbki, ponieważ ilości wykrytych SCCA zostaną znormalizowane przy użyciu masy próbki (patrz ppkt 6.5.2 poniżej).
4. Po zważeniu wszystkich próbek dodać 1 ml roztworu ekstrakcyjnego (mieszanina woda + wzorzec wewnętrzny z kroku 2.4) do każdej z probówek z próbką. Stosunek roztworu ekstrakcyjnego do masy tkankowej powinien być taki sam we wszystkich ekstrakcjach (w tym przypadku 1 ml na 100 ± 5 mg tkanki). Dobrze wymieszaj przez wir przez 10 sekund.
5. Pozostawić próbki w temperaturze pokojowej na 1 godzinę. W ciągu tej godziny mieszaj każdą probówkę co 15 minut, jak w kroku 3.4.
6. Po 1 godzinie ekstrakcji wymieszać próbki po raz ostatni i przenieść probówki z próbkami do mikrowirówki. Odwirować próbki w temperaturze 4 °C, 10 000 x g przez 10 minut w celu wytrącenia materiału stałego (ścian komórkowych, cząstek stałych itp.).
   1. Podczas przetwarzania próbek cieczy należy dodać odpowiednie stężenie wzorca wewnętrznego, krótko wymieszać i odwirować. Po odwirowaniu próbki cieczy należy traktować identycznie jak ekstrakt z próbek stałych.
   2. Należy sprawdzić pH próbek, aby potwierdzić, że są one zgodne z zakresem pH buforu pracującego w zastosowanym zestawie detekcyjnym (krok 4.6) lub systemie buforowym. Ponieważ objętości próbek są zwykle dość małe, pH można monitorować za pomocą bibuły do pomiaru pH.
7. Przygotować do filtrowania próbek za pomocą filtrów tarczowych montowanych w strzykawce (3.8).
   UWAGA: Zapobiegaj utracie próbki, upewniając się, że każdy filtr jest prawidłowo podłączony do strzykawki przed przeniesieniem supernatantu. Przygotować jedną strzykawkę wyposażoną w filtr dyskowy dla każdej próbki przeznaczonej do analizy (w tym próbek o krzywej wzorcowej).
8. Po odwirowaniu próbek i przygotowaniu filtrów strzykawkowych, przenieść supernatant z każdej próbki do strzykawki o pojemności 3 ml wyposażonej w filtr strzykawkowy 0,2 μm. Do każdej próbki należy użyć nowego filtra i strzykawki. Przefiltrować wszystkie próbki, w tym próbki z krzywej wzorcowej i kontrole buforowe, przed uruchomieniem w systemie CE.
9. Przefiltrować próbkę bezpośrednio do czystej probówki mikrowirówkowej. Po przefiltrowaniu zamknąć probówkę z filtratem i wyrzucić strzykawkę/aparat filtrujący.
10. Przefiltrowane próbki należy natychmiast umieścić w systemie CE w celu wykrycia SCCA lub przechowywać próbki w temperaturze 4 °C przez noc. Jeśli próbki mają być przechowywane przez noc, należy uszczelnić probówki plastikową folią parafinową, aby zapobiec wymianie gazowej i parowaniu próbki.
    1. Jeżeli próbki muszą być przechowywane dłużej niż jeden dzień po przefiltrowaniu, ekstrakty z zamrażania błyskawicznego w ciekłym azocie lub zamrażanie w temperaturze -20 °C. Jednak po rozmrożeniu należy upewnić się, że każda próbka została zbadana pod kątem tworzenia się osadu i w razie potrzeby przefiltrować (jak w kroku 3.6).

4. Konfiguracja uruchamiania wykrywania SCCA

1. Zapoznaj się z instrukcją obsługi CE, aby uzyskać szczegółowe informacje dotyczące oprogramowania do programowania i sterowania.
2. Przygotować fiolki z próbkami do elektroforezy kapilarnej (CE) do wykrywania SCCA. Upewnij się, że fiolki są odpowiednio oznakowane, czyste i wolne od wad.
3. Przed użyciem umyć i osuszyć nakrętki fiolek CE.
   1. Umyj nakrętki, zanurzając je w ultraczystej wodzie i pozwalając im moczyć się przez noc. Po namoczeniu nakrętek wylej roztwór do namaczania i spłucz nakrętki jeszcze dwukrotnie ultraczystą wodą.
   2. Przenieś wypłukane nakrętki na czystą, suchą powierzchnię wyłożoną niestrzępiącą się chusteczką i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu. Przed użyciem upewnij się, że nakrętki są całkowicie suche, aby uniknąć awarii ciśnienia.
4. Przenieść 1 ml próbki do każdej fiolki CE, uważając, aby uniknąć przypadkowego rozpryskiwania próbki do szyjki fiolki. Po przeniesieniu należy umieścić nakrętkę CE na każdej fiolce.
   1. Jeśli potrzebne jest rozcieńczenie, rozcieńczyć próbki nasion kawy w stosunku 1:10 lub 1:100 bezpośrednio w fiolce CE przy użyciu ultraczystej wody. W przypadku rozcieńczeń większych niż 1:100 należy utworzyć rozcieńczenie pośrednie, aby uniknąć błędów pipetowania.
5. Przygotować jedną fiolkę dla każdego punktu krzywej wzorcowej, przenosząc roztwory krzywej wzorcowej (1,0 ml) z kroku 2.5 do fiolek CE. Zakryj każdą probówkę po przeniesieniu.
6. Przygotować 0,1 M roztwór wodorotlenku sodu (NaOH), dodając 0,04 g NaOH do zlewki zawierającej 90 ml ultraczystej wody i pozwalając granulkom się rozpuścić. Przenieść 0,1 M roztwór NaOH do kolby miarowej o pojemności 100 ml i doprowadzić całkowitą objętość do 100 ml.
7. Dodać 1 ml 0,1 M roztworu NaOH do czystej fiolki i nakrętki CE.
8. Przygotować fiolki buforowe CE dla każdej partii próbek, które mają być poddane działaniu systemu CE. Dostępne są zestawy separacyjne lub można użyć niestandardowych¹³.
   1. Przygotować 1 fiolkę z 1 ml początkowego roztworu buforowego i nakrętką.
   2. Przygotować trzy fiolki po 1 ml płynnego roztworu buforowego i nakrętką. Uruchomić bufor należy wymienić przed każdą partią próbek i wzorcowymi punktami krzywej lub po 35 próbkach, w zależności od tego, co nastąpi wcześniej.
   3. Napełnić trzy dodatkowe fiolki 1 ml ultraczystej wody i zakręcić każdą fiolkę.
   4. Przygotować 1 pustą fiolkę na odpady z nakrętką.
9. Po przygotowaniu fiolek opisanych w kroku 4.8, należy załadować fiolki zawierające i wodę, jak również fiolki na odpady (z kroków 4.8.2-5) do tacki buforowej systemu elektroforezy kapilarnej, zgodnie z instrukcjami producenta¹⁵. Dokładnie zanotować położenie każdej fiolki do programowania automatycznego próbnika.
10. Załadować fiolki zawierające standardowe punkty krzywej oraz fiolki zawierające próbki, które mają być oznaczone, do tacki na próbki wlotowe, zgodnie z opisem w instrukcjach producenta. Zwróć uwagę na położenie każdej fiolki do programowania automatycznego próbnika (patrz kroki 4.11.1 poniżej).
11. Przygotuj metody kondycjonowania i separacji próbek (programy do nich znajdują się odpowiednio w tabelach 1 i 2) i napisz plik sekwencji próbki zgodnie z instrukcją obsługi przyrządu. Zastosować metodę rozdzielania opisaną w tabeli 2: przepłukać kolumnę inicjatorem (20 psi) przez 0,2 min; płukać akceleratorem (20 psi) przez 0,5 min, wstrzykiwać próbki (0,5 psi) do kolumny przez 0,09 min, rozdzielać próbki pod napięciem 20 kV przez 12 min, płukać NaOH (20 psi) przez 0,5 min, a na koniec płukać wodą (20 psi) przez 0,5 min.
    1. Korzystając z oprogramowania sterującego CE, napisz sekwencję uruchamiania próbki (tj. listę roboczą; plik z listą szczegółowo opisującą kolejność, w jakiej próbki będą analizowane, oraz metodę, która ma być użyta do oddzielenia każdej próbki) za pomocą interfejsu arkusza kalkulacyjnego "sekwencja". Każdy wiersz w arkuszu kalkulacyjnym będzie odpowiadał przykładowemu przebiegowi i utworzy pojedynczy plik danych.
       1. Upewnij się, że podczas zapisywania pliku sekwencyjnego próbki są identyfikowane przy użyciu właściwej pozycji w tacy do pobierania próbek. Upewnij się, że każdy plik danych ma unikatową nazwę, aby zapobiec nadpisywaniu poprzednich plików przez oprogramowanie. Kondycjonowanie kapilarne w programie CE przebiega jako oddzielna sekwencja przed przebiegiem sekwencji zawierającym metodę rozdzielania próbki.
    2. Rozpocznij sekwencję próbek od roztworów krzywej wzorcowej, następnie próbek SCCA, a zakończ drugim przebiegiem roztworów krzywej wzorcowej. Pozwoli to na obliczenie stopnia utraty sygnału występującej podczas analiz próbek.

Tabela 1: Program metody kondycjonowania stosowany do przygotowania kapilary do krótkołańcuchowej separacji kwasów karboksylowych za pomocą elektroforezy kapilarnej^a.

Tabela 2: Program metody rozdzielania stosowany do analizy krótkołańcuchowych kwasów karboksylowych za pomocą elektroforezy^{kapilarnej a}.

5. Wykrywanie SCCA, uruchamianie, wykonywanie i zbieranie danych

1. Zainicjuj przebiegi kondycjonowania kapilarnego. Spodziewaj się, że kapilara będzie kondycjonowana dwa lub trzy razy, zanim kolumna będzie gotowa do oddzielenia próbki. Kondycjonowanie kolumn należy przeprowadzić zgodnie z opisem w tabeli 1. Krótko płukać kolumnę 0,1 M NaOH (20 psi) przez 1 min, płukać wodą (20 psi) przez 1 min, płukać inicjatorem (20 psi) przez 0,5 min, płukać akceleratorem (20 psi) przez 0,5 min, oddzielić akcelerator przy 30 kV przez 10 min, płukać kolumnę 0,1 M NaOH (20 psi) przez 0,5 min, a na koniec płukać kolumnę wodą (20 psi) przez 0,5 min.
   1. Kondycjonować kapilarnę przed każdym biegiem sekwencji próbki. Osiągnij odpowiednie kondycjonowanie, utrzymując stałe napięcie separacji przez cały przebieg i obserwując płaską linię bazową na ścieżce matrycy fotodiody.
2. Po kondycjonowaniu rozpocznij separację próbki, otwierając menu "kontrola" w oprogramowaniu i wybierając (tj. klikając) "uruchom sekwencję". Monitoruj ślad matrycy fotodiodowej (PDA), aby zapewnić prawidłową separację.
   1. Obserwuj pierwszy ślad i upewnij się, że ma on płaską linię podstawową i czysto rozdzielone (rozdzielczość podstawowa), poszczególne piki kwasu. Przeciążone próbki będą wykazywały długie ogony pików lub ogony pikowe i będą musiały zostać rozcieńczone (rysunek 1).

Rysunek 1: Porównanie śladów PDA z zaznaczoną przeciążoną próbką. Wraz ze wzrostem stężenia analitu geometria poszczególnych pików może zacząć stawać się asymetryczna. Przy stężeniu (a) 0,05 mg/ml kwas octowy ma dobrze zdefiniowany, obustronnie symetryczny pik. Gdy stężenie kwasu octowego wzrasta do (b) 0,07 mg/ml i (c) 0,10 mg/ml, tworzy się ogon piku (strzałki). Ten ogon szczytowy jest dobrą wskazówką, że próbka jest przeciążona. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Po zakończeniu przebiegu sekwencji otwórz pojedynczo pliki danych w oprogramowaniu do analizy CE i zintegruj piki.
   1. Integracja pików próbki.
      1. Otwórz pierwszy plik i ustaw kroki automatycznej integracji tak, aby wykluczyć pierwsze 3 minuty przebiegu (gdzie napięcie, a tym samym kierunek przepływu kolumny, jest odwrócony, jak opisano w tabeli 1). W tym samym menu ustaw kryteria wyboru piku na minimalną szerokość piku 50 jednostek i obszar piku na 100 jednostek (lub domyślne ustawienia producenta), aby zapewnić umiarkowanie wysoki poziom selektywności, oddzielając piki kwasu od szumu tła w ścieżce.
   2. Ręcznie sprawdzaj granice pików i linie bazowe dla każdej ścieżki PDA, aby zapewnić prawidłową integrację pików. Nieprawidłowo zintegrowane piki (tj. lekko asymetryczny pik SSCA, który został zintegrowany jako dwa oddzielne piki przez zautomatyzowane oprogramowanie) będą musiały zostać ponownie zintegrowane ręcznie.
4. Po integracji wyświetl raport procentowy powierzchni, a następnie zaznacz i skopiuj raport procentowy obszaru i wklej go do osobnego arkusza kalkulacyjnego. Powtórzyć te czynności dla każdej próbki, aby sporządzić pełny raport piku przebiegu, w którym każdy wiersz reprezentuje pojedynczy pik (tj. każdy pik powinien zawierać pojedynczy związek, jeśli rozdzielanie działa prawidłowo).

6. Analiza danych

1. Przygotuj dane do analizy za pomocą arkusza kalkulacyjnego skonstruowanego w (5.4). Rozpocznij analizę od oznaczenia wzorców kwasowych dla każdego z punktów krzywej wzorcowej, w tym wzorca wewnętrznego.
2. Obliczyć wskaźnik retencji dla każdego piku, dzieląc czas retencji dla każdego piku w próbce przez czas retencji wzorca wewnętrznego w tej próbce. Posortuj zestaw danych według wynikowego wskaźnika przechowywania, aby zidentyfikować szczyty zainteresowania w każdej próbce.
3. Po zidentyfikowaniu piku dla każdego kwasu będącego przedmiotem zainteresowania, skonstruuj krzywe wzorcowe dla każdego kwasu, korzystając z punktów zewnętrznej krzywej wzorcowej.
   1. Wygeneruj krzywą wzorca (stężenia) dla każdego wzorca SCCA, określając obszar piku dla każdego stężenia wzorców SCCA i wykreślając stężenie na osi x w funkcji obszaru piku na osi y. Wykreślić regresję liniową dla każdej krzywej standardowej SCCA i zdefiniować równanie nachylenia (y = mx + b).
   2. Upewnij się, że wartości R² regresji liniowej wynoszą 0,90 lub więcej, ponieważ kwantyfikacje są najdokładniej wykonywane w zakresie liniowym krzywej standardowej.
4. Obliczyć stężenie kwasu dla danego SCCA w próbce, wykorzystując powierzchnię piku i równanie nachylenia dla linii regresji liniowej krzywej wzorcowej (obliczone w ppkt 6.3.2 powyżej). Krótko mówiąc, podziel obserwowany obszar piku dla danego kwasu przez nachylenie linii regresji dla krzywej wzorcowej tego kwasu.
   1. Skorygować wartości stężenia surowca obliczone w kroku 6.4 w odniesieniu do ubytku próbki podczas przetwarzania przy użyciu wzorca wewnętrznego (krok 6.5).
5. Obliczyć współczynnik korygujący dla każdej próbki, stosując wzorzec wewnętrzny.
   1. Podzielić rzeczywiste stężenie wzorca wewnętrznego (tj. znaną ilość dodaną na początku doświadczenia) przez zaobserwowaną wartość wzorca wewnętrznego w próbce (tj. ilość obliczoną przy użyciu równania nachylenia krzywej wzorcowej dla wzorca wewnętrznego). Pomnóż wartości surowego stężenia każdego SCCA w próbce przez ten współczynnik korygujący.
   2. Podzielić skorygowane stężenie SCCA wzorca wewnętrznego przez masę próbki użytej do ekstrakcji w celu skorygowania wszelkich zmian w masie próbki. W wyniku tych obliczeń uzyskuje się ilość analitu na masę próbki (w tym przykładzie mg SCCA na mg zmielonej kawy), którą można następnie przeliczyć na odpowiednie jednostki dla danego badania (mg/mg, mg/g, g/g itd.).
6. Po obliczeniu stężeń SCCA (znormalizowanych do masy [dla próbek stałych lub ciekłych] lub objętości [dla próbek ciekłych]), użyj tych wartości do analizy statystycznej zgodnie z wymaganiami projektu eksperymentalnego i interesującymi pytaniami.

Ten protokół został z powodzeniem wykorzystany do pomiaru wpływu zaprawiania nasion na zawartość SCCA w nasionach zielonej kawy. W tym eksperymencie sześć zabiegów obejmowało: nasyconą zawiesinę mikrobiologiczną szczepu Leuconostoc pseudomesenteroides GCP674 w pożywce wzrostowej (1), wodną zawiesinę drobnoustrojów GCP674 w wodzie (2), wodny roztwór kwasu octowego i mlekowego (odpowiednio 0,15 i 0,4 mg / ml) (3), zużyte traktowanie pożywką wzrostową M1 (4), dH2O wodzie (5) i niepoddanej działaniu substancji kontrolnej (bez dodawania substancji do nasion) (6). Zabiegi zastosowano i pozostawiono do fermentacji na 24 godziny. Dla każdego leczenia oceniano cztery niezależne powtórzenia. Analizę przeprowadzono pod kątem stężenia kwasu cytrynowego (C), jabłkowego (M), octowego (A) i mlekowego (L) przy użyciu kwasu adypinowego jako wzorca wewnętrznego.

Dla każdego SCCA i wzorca wewnętrznego wygenerowano krzywe wzorcowe obejmujące zakres stężeń przewidywanych w próbkach kawy (5, 10, 20, 40, 60 i 80 ng/μl). Zgodnie z oczekiwaniami, każdy kwas wykazywał liniową odpowiedź dla tego zakresu stężeń z wartościami R-kwadrat wynoszącymi 0,9876 dla kwasu cytrynowego, 0,9987 dla kwasu jabłkowego, 0,9998 dla kwasu octowego i 0,9999 dla kwasu mlekowego. Wzorzec wewnętrzny (kwas adypinowy) również wykazywał odpowiedź liniową w tym zakresie stężeń, dając wartość R-kwadrat równą 0,9984. Przed analizą próbek wyznaczono granice wykrywalności (LOD) i granice oznaczalności (LOQ) dla każdego SCCA i wzorca wewnętrznego (kwas adypinowy). Granica wykrywalności kwasu cytrynowego, jabłkowego, octowego i adypinowego wynosiła 1 ng/μl; a LOD dla kwasu mlekowego wynosił 2 ng/μl. Granica oznaczalności kwasu cytrynowego, adypinowego, octowego i mlekowego wynosiła 4 ng/μl; a LOQ dla kwasu jabłkowego wynosił 2 ng/μl. Aby obliczyć procentowy odzysk SCCA i kwasu adypinowego, kawę doprawiono pojedynczymi SCCA lub kwasem adypinowym i przetworzono przy użyciu protokołu opisanego powyżej. Procentowy odzysk obliczono następnie przy użyciu następującego wzoru ([{próbka wzbogacona o obszar piku - próbka kontrolna o powierzchni piku}/teoretyczny obszar piku obliczonego stężenia próbki wzbogaconej {wygenerowany przez analizę buforu + SCCA/skok kwasu adypinowego}] x 100). Korzystając z tej metody, obliczyliśmy procentowe odzyski 106,08% ± 12,66 dla kwasu cytrynowego, 98,35% ± 1,15 dla kwasu jabłkowego, 91,94% ± 3,07 dla kwasu octowego, 97,42% ± 1,48 dla kwasu mlekowego i 100,19% ± 2,57 dla kwasu adypinowego.

Aby określić precyzję metody, obliczono również zmienność śród- i międzydzienną pomiarów wykonanych za pomocą CZE. Aby określić zmienność śróddzienną, próbki każdego SCCA i kwasu adypinowego mierzono z pojedynczej próbki kawy pięć razy w okresie 24 godzin, a współczynniki zmienności (COV; obliczone przez podzielenie odchylenia standardowego w obszarze piku [lub stężeniu] dla każdego SCCA przez średnią powierzchnię piku [lub stężenie] dla tego SCCA, a następnie pomnożenie wyniku przez 100) dla każdego związku obliczono przy użyciu powierzchni piku. Aby ocenić znaczenie korygowania próbek przy użyciu wzorca wewnętrznego, obliczono również współczynnik wariancji dla każdego SCCA przy użyciu stężeń każdego SCCA obliczonych przy użyciu kwasu adypinowego jako wzorca wewnętrznego. Zgodnie z oczekiwaniami, metoda CZE była w stanie precyzyjnie zmierzyć SCCA i kwas adypinowy, przy czym COV wynosiły 3,02% dla kwasu cytrynowego, 2,64% dla kwasu jabłkowego, 3,74% dla kwasu octowego i 2,01% dla kwasu adypinowego (kwas mlekowy był poniżej LOD/LOQ dla wszystkich mierzonych próbek kawy). Pomiary te powtarzano w okresie pięciu dni, a CV wahały się od 2,11-5,25% dla kwasu cytrynowego, 2,01-5,32% dla kwasu jabłkowego, 1,72-3,74% dla kwasu octowego i 1,26-3,82% dla kwasu adypinowego. Gdy obszary pików skorygowano za pomocą wzorca wewnętrznego, a do obliczenia COV wykorzystano obliczone stężenia SCCA, COV w ciągu dnia wahały się od 1,08-4,17% dla kwasu cytrynowego, 1,47-3,40% dla kwasu jabłkowego i 2,68-5,10% dla kwasu octowego. Aby ocenić zmienność między dniami, SCCA w pojedynczej próbce kawy mierzono raz dziennie przez okres pięciu dni. Eksperyment ten powtórzono następnie pięć razy dla każdego SCCA i kwasu adypinowego. COV dla każdego SCCA obliczono następnie, dzieląc odchylenie standardowe powierzchni piku (lub stężenia) dla każdego SCCA przez średnią powierzchnię piku (lub stężenie) dla tego SCCA i mnożąc przez 100. Aby ocenić znaczenie korygowania próbek przy użyciu wzorca wewnętrznego, COV obliczono również przy użyciu stężeń każdego SCCA obliczonych przy użyciu kwasu adypinowego jako wzorca wewnętrznego. Metoda CZE była w stanie wiarygodnie odtworzyć pomiary SCCA, przy czym COV wahały się od 5,24-10,02% dla kwasu cytrynowego, 6,55-9,47% dla kwasu jabłkowego, 7,67-8,63% dla kwasu octowego i 3,08-6,57% dla kwasu adypinowego. Gdy obszary pików zostały skorygowane za pomocą wzorca wewnętrznego i wykorzystano obliczone stężenia SCCA do obliczenia COV, COV między dniami wahały się od 4,56-6,23% dla kwasu cytrynowego, 3,39-4,99% dla kwasu jabłkowego i 9,5-10,94% dla kwasu octowego.

Rysunek 2: Przykładowe ślady PDA ze wskazaniami pików. Próbki zielonej kawy rozcieńczano w stosunku 1:10 przed załadowaniem do fiolek CE. Wskazane są kwasy, które mają zastosowanie: kwas octowy (A), kwas cytrynowy (C), kwas mlekowy (L), kwas jabłkowy (M) i wzorzec wewnętrzny, kwas adypinowy (IS). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Przeprowadzono analizę statystyczną skorygowanych stężeń kwasów przy użyciu ogólnego modelu liniowego (GLM) w celu określenia, czy leczenie zmieniło poziom kwasów organicznych. Dla GLM zaimplementowano model łączący "leczenie" x "przebieg" (zakodowany jako czynnik losowy). Porównania parami Tukeya z 95% pewnością wykorzystano do określenia kierunkowości zmian.

Leczenie zmieniło stężenie SCCA w zielonej kawie. Kwas octowy był znacznie wzbogacony we wszystkich zabiegach w porównaniu z grupą kontrolną bez leczenia (GLM, p <0,0001).

Rysunek 3: Wpływ leczenia na poziom kwasów organicznych w zielonej kawie. Leczenie nie miało wpływu na: a) poziom kwasu cytrynowego lub jabłkowego w zielonej kawie. Jednak wszystkie zabiegi znacznie zwiększały (b) poziom kwasu octowego w porównaniu z grupą kontrolną, która nie była leczona (GLM, p <0,001). Wzrost poziomu kwasu octowego był największy w przypadku leczenia mikrobem + pożywką. Litery wskazują na istotną różnicę w porównaniu parami Tukeya na poziomie 95%. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Największy wzrost zaobserwowano w przypadku leczenia mikrobami + mediami, które wzrosły 0,25-krotnie (0,5 vs 0,4 mg/g kawy w GCP674 vs. NT). Podobny trend zaobserwowano w stężeniach kwasu mlekowego, choć nie różniły się one istotnie. Nie zaobserwowano istotnych zmian ani tendencji w innych śledzonych kwasach (kwas cytrynowy i jabłkowy).

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.