Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Definiowanie specyficzności substratowej dla kandydatów na lipazę i fosfolipazę

14.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54613

⸱

23 listopada 2016

 ,  ,  ,  , 
1Centro de Ciencias Genómicas, Universidad Nacional Autónoma de México

W tym artykule

Podsumowanie

Wiele przewidywanych (fosfo)lipaz jest słabo scharakteryzowanych pod względem specyficzności substratowej i funkcji fizjologicznych. W tym miejscu przedstawiamy protokół optymalizacji aktywności enzymów, poszukiwania naturalnych substratów i proponowania funkcji fizjologicznych tych enzymów.

Streszczenie

Mikroorganizmy wytwarzają szerokie spektrum (fosfo)lipaz, które są wydzielane w celu udostępnienia organizmowi zewnętrznych substratów. Alternatywnie, inne (fosfo)lipazy mogą być fizycznie związane z organizmem wytwarzającym, powodując obrót wewnętrznych lipidów i często powodując przebudowę błon komórkowych. Chociaż potencjalne (fosfo)lipazy można przewidzieć za pomocą wielu algorytmów, gdy dostępna jest sekwencja genu/białka, często nie uzyskano eksperymentalnego dowodu na aktywność enzymu, specyficzność substratu i potencjalne funkcje fizjologiczne. W artykule opisano optymalizację warunków oznaczania dla prospektywnych (fosfo)lipaz o nieznanej specyficzności substratowej oraz sposób wykorzystania tych zoptymalizowanych warunków w poszukiwaniu naturalnego substratu odpowiedniej (fosfo)lipazy. Stosowanie sztucznych substratów chromogennych, takich jak pochodne p-nitrofenylu, może pomóc w wykryciu niewielkiej aktywności enzymatycznej przewidywanej (fosfo)lipazy w standardowych warunkach. Po napotkaniu tak niewielkiej aktywności enzymatycznej można zmieniać różne parametry testu enzymatycznego w celu uzyskania bardziej wydajnej hydrolizy sztucznego substratu. Po ustaleniu warunków, w których enzym działa dobrze, należy oznaczyć różne potencjalne naturalne substraty pod kątem ich degradacji, procesu, który można śledzić przy użyciu różnych metod chromatograficznych. Określenie specyficzności substratowej dla nowych enzymów często dostarcza hipotez dotyczących potencjalnej fizjologicznej roli tych enzymów, które następnie można przetestować eksperymentalnie. Postępując zgodnie z tymi wytycznymi, byliśmy w stanie zidentyfikować fosfolipazę C (SMc00171), która rozkłada fosfatydylocholinę do fosfocholiny i diacyloglicerolu, co jest kluczowym krokiem dla przebudowy błon w bakterii Sinorhizobium meliloti w warunkach wzrostu ograniczających fosfor. Dla dwóch przewidywanych fosfolipaz podobnych do patatyny (SMc00930 i SMc01003) tego samego organizmu, możemy ponownie zdefiniować ich specyficzność substratową i wyjaśnić, że SMc01003 jest lipazą diacyloglicerolową.

Wprowadzenie

Lipidy na bazie glicerolu, takie jak triacyloglicerole i (glicero)fosfolipidy, stanowią ważne i prawdopodobnie najbardziej znane klasy lipidów1. Triacyloglicerole (TAG) to tłuszcze lub oleje, które zwykle pełnią funkcję lipidów magazynujących, a zatem jako potencjalne źródła energii i węgla. TAG mogą być rozkładane przez lipazy, które są często wydzielane przez organizm wytwarzający w celu trawienia zewnętrznych TAG i udostępniania ich jako źródeł węgla. Ponadto lipazy były szeroko badane na przestrzeni lat ze względu na ich ważne zastosowania biotechnologiczne2.

Ze względu na ich amfifilową naturę i prawie cylindryczny kształt, (glicero)fosfolipidy wykazują właściwości błonotwórcze i zazwyczaj stanowią główne składniki lipidowe dwuwarstwowej membrany3. W prostych mikroorganizmach, takich jak bakteria Escherichia coli, spotyka się tylko trzy główne warianty grupy głównej: fosfatydyloglicerol (PG), kardiolipinę (CL) i fosfatydyloetanoloaminę (PE), chociaż należy mieć świadomość, że każdy z nich może być zastąpiony znaczną liczbą różnych łańcuchów tłuszczowych acylowych w pozycji sn-1 lub sn-2, co daje początek dużej liczbie różnych gatunków molekularnych4. Inne bakterie mogą mieć inne fosfolipidy dodatkowo lub zamiast niego. Na przykład Sinorhizobium meliloti, bakteria glebowa, która jest w stanie tworzyć symbiozę brodawek korzeniowych wiążących azot z lucerną siewną (Medicago sativa), zawiera oprócz PE drugi zwitterionowy fosfolipid, fosfatydylocholinę (PC)5. Ponadto lipidy niezawierające fosforu lub glicerolu mogą być amfifilowe i stanowić część błony komórkowej. Na przykład, w warunkach wzrostu ograniczających fosfor, u S. meliloti, (glicero)fosfolipidy są w dużej mierze zastępowane lipidami błonowymi, które nie zawierają fosforu, tj. sulfolipidami, lipidami ornityny i trimetylohomoseryną diacyloglicerylu (DGTS)6. U bakterii DGTS jest tworzony z diacyloglicerolu (DAG) w dwuetapowym szlaku7, ale źródło wytwarzania DAG nie było jasne. Eksperymenty z impulsem sugerują, że PC może być prekursorem DGTS8 i korzystając z metodologii opisanej w tym manuskrypcie, możemy zidentyfikować fosfolipazę C (PlcP, SMc00171), która powstaje w warunkach ograniczających fosfor i która może przekształcić PC w DAG i fosfocholinę8.

W osobnym badaniu odkryliśmy, że mutant S. meliloti lub Escherichia coli z niedoborem syntetazy acyl-CoA (FadD) gromadził wolne kwasy tłuszczowe podczas wchodzenia w stacjonarną fazę wzrostu9. Chociaż te kwasy tłuszczowe wydawały się pochodzić z lipidów błonowych, dokładne źródło wolnych kwasów tłuszczowych lub enzym(ów) je uwalniających nie było znane. Ponownie, stosując strategię opisaną w tym manuskrypcie, przewidywano dwie patatynopodobne10 (fosfo)lipazy (SMc00930 i SMc01003), które przyczyniły się do powstania wolnych kwasów tłuszczowych w S. meliloti11. Co zaskakujące, SMc01003 użył DAG jako substratu, przekształcając go w monoacyloglicerol, a na końcu w glicerol i wolne kwasy tłuszczowe11. Dlatego SMc01003 jest lipazą DAG (DglA).

Chociaż istnieje wiele algorytmów do przewidywania potencjalnych (fosfo)lipaz12,13, ich dokładna funkcja i rola fizjologiczna zazwyczaj nie są znane. Tutaj przedstawiamy protokół klonowania i nadekspresji przewidywanych lub potencjalnych (fosfo)lipaz. Ten manuskrypt wyjaśnia, w jaki sposób można opracować i zoptymalizować testy enzymatyczne dla nadekspresji (fosfo)lipazy (fosfo)lipazy przy użyciu sztucznych substratów chromogennych. Podajemy przykłady, w jaki sposób za pomocą zoptymalizowanego testu enzymatycznego można napotkać prawdziwy substrat (fosfo)lipazy i jak te odkrycia mogą wzbogacić naszą wiedzę na temat fizjologii drobnoustrojów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Klonowanie i nadekspresja genu strukturalnego dla przewidywanej lipazy

  1. Wykorzystując reakcję łańcuchową polimerazy (PCR)14 i specyficzne oligonukleotydy (Tabela 1)15, należy przeprowadzić amplifikację genu docelowego (smc0103, smc0930 lub smc0171), który według przewidywań koduje lipazę lub fosfolipazę, z genomowego DNA organizmu gospodarza (np. S. meliloti).
    1. Wprowadzić specyficzne miejsca restrykcyjne (poprzez zaprojektowaną sekwencję oligonukleotydów). Przetrawić amplifikowany fragment DNA odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi i sklonować go do wektora ekspresyjnego, takiego jak plazmidy z serii pET16.
    2. Po weryfikacji poprawności sekwencji DNA sklonowanego genu, przeprowadzić transformację wektora do szczepu ekspresyjnego, takiego jak Escherichia coli BL21(DE3) pLysS16.
  2. Przygotować nocną prekulturę gospodarza ekspresyjnego E. coli BL21(DE3) pLysS, zawierającego odpowiedni wektor pET ze sklonowanym genem lub pusty wektor, w kolbach hodowlanych o pojemności 10 ml zawierających 20 ml pożywki Luria Bertani (LB)17 z dodatkiem wymaganych antybiotyków. Hodować komórki w temperaturze 30 °C (lub w typowej temperaturze wzrostu bakterii, z której pochodzi lipaza).
    1. Wykorzystując nocne prekultury, zaszczepić 50 ml uprzednio ogrzanej pożywki LB (z dodatkiem wymaganych antybiotyków) w kolbach hodowlanych o pojemności 2 L, aby uzyskać początkową gęstość optyczną przy 620 nm (OD620) = 0,05. Monitorować wzrost kultur i przy OD620 = 0,3 dodać izopropyl-β-D-tiogalaktozyd (IPTG) do stężenia końcowego 10 µM i inkubować przy wstrząsaniu w temperaturze 30 °C przez 4 h.
    2. Po zakończeniu okresu inkubacji każdą kulturę przenieść do probówki do wirowania o pojemności 50 ml i wirować przy 5 0 x g w temperaturze 4 °C przez 30 min. Osady komórek bakteryjnych resuspenderć w 5 ml buforu do zawieszenia (np. komórki ekspresyjne SMc0930 i SMc0103 w 50 mM Tris-HCl pH 8,0 oraz komórki ekspresyjne SMc0171 w 50 mM dietanoloaminy-HCl pH 9,8). Zawiesiny komórkowe przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia.

2. Przygotowanie ekstraktów białkowych wolnych od komórek i oznaczenie stężenia białka

  1. Rozmrozić zawiesiny komórek bakteryjnych i przechowywać na lodzie. Przepuścić zawiesiny komórek trzykrotnie przez zimną prasę francuską przy ciśnieniu 20,0 lb per in2. Usunąć nieuszkodzone komórki i szczątki komórkowe poprzez wirowanie przy 5,00 x g przez 30 min w temperaturze 4 °C.
  2. Po wirowaniu przygotować z supernatantu alikwoty o objętości 10 i 50 µl do dalszych analiz i przechowywać je w temperaturze -80 °C do momentu użycia.
  3. Wykorzystać jedną alikwotę 10 µl do oznaczenia stężenia białka w poszczególnych ekstraktach bezkomórkowych wybraną metodą lub zgodnie z opisem18.

3. Wykorzystanie substratów sztucznych do optymalizacji aktywności enzymatycznej (fosfo)lipaz

  1. W celu wstępnego określenia zakresu aktywności poszczególnych enzymów należy zastosować substraty sztuczne, których hydroliza prowadzi do powstania produktu barwnego, takie jak p-nitrofenol (p-NP).
    1. W przypadku testów enzymatycznych zoptymalizowanych już z użyciem sztucznych substratów estrów p-nitrofenylowych (opisanych dla fosfolipazy C PlcP (SMc0171), a także dla przewidywanych fosfolipaz podobnych do patatyny SMc0930 i SMc0103), należy stosować schematy pipetowania przedstawione w Tabeli 2.
    2. Podczas badania nowej potencjalnej (fosfo)lipazy należy przygotować pierwszy standardowy test enzymatyczny zawierający 50 mM Tris-HCl, pH 8.5, 10 mM NaCl, 0.05% Triton X-10, 0.5 mM związku zawierającego grupę p-nitrofenylową (p-nitrofenylofosforan, bis-p-nitrofenylofosforan, p-nitrofenylodekanian lub p-nitrofenylopalmitian) oraz bezkomórkowy ekstrakt białkowy (sprawdzić 1, 3, 10, 30, 10, 30 i 1,0 µg) w całkowitej objętości 1 ml w plastikowych kuwetach o pojemności 1 ml.
      ​UWAGA: W przypadku monitorowania hydrolizy estrów p-nitrofenylowych w teście ciągłym należy zastosować pH zasadowe (Rysunek 1). Alternatywnie można stosować testy w pojedynczych punktach czasowych dla zakresu wartości pH, dodając NaOH po okresie inkubacji w celu zatrzymania reakcji enzymatycznej i zapewnienia, że cały p-NP występuje w formie fenolanu.
    3. Należy śledzić przebieg czasowy wzrostu absorbancji przy 405 nm, wynikający z tworzenia się p-NP, za pomocą spektrofotometru w temperaturze 30 °C przez okres 5 min. Początkowe liniowe tworzenie się p-NP należy określić, wyznaczając początkowe nachylenie wzrostu absorbancji w czasie.
    4. Zmianę stężenia (Δc) dla p-NP należy obliczyć zgodnie z prawem Lamberta-Beera (ΔA = ε Δc d)1.
      ​UWAGA: ΔA to wyznaczona liniowa zmiana absorbancji, ε to molowy współczynnik ekstynkcji dla odpowiedniej długości fali (w jednostkach M-1 cm-1), d to droga optyczna (1 cm), a Δc to zmiana stężenia (w jednostkach M), którą należy wyznaczyć.
      1. Przyjmując, że objętość testu wynosi 1 ml, należy obliczyć ilość powstałego p-NP.
        ​UWAGA: Ilość = stężenie x objętość.
      2. Aktywność enzymatyczną oblicza się, dzieląc ilość powstałego p-NP przez czas jego powstawania. Specyficzną aktywność enzymatyczną wyznacza się, dzieląc aktywność enzymatyczną przez ilość białka (w mg), która odpowiadała za wygenerowanie tej aktywności.
    5. Należy porównać zmiany absorbancji wywołane przez ekstrakty białkowe, w których ekspresowano gen kandydujący (smc0171, smc0930 lub smc0103), z ekstraktami zawierającymi jedynie pusty wektor.
      UWAGA: Aby przejść do kolejnych etapów, aktywności specyficzne wywołane przez ekstrakty białkowe z ekspresją genu kandydującego powinny być co najmniej dwukrotnie wyższe lub większe od wartości uzyskanych dla aktywności specyficznych wywołanych przez ekstrakty białkowe zawierające jedynie pusty wektor.
    6. Do dalszych doświadczeń należy wybrać takie warunki, w których hydroliza związku zawierającego grupę p-nitrofenylową jest minimalna w ekstraktach bezkomórkowych (tzn. pusty wektor), a w przypadku zastosowania ekstraktów białkowych z ekspresją genu kandydującego obserwuje się najbardziej wyraźne tworzenie się p-NP i anionu p-nitrofenolanu (Rysunek 1).
  2. Po wyznaczeniu początkowej aktywności enzymatycznej w punkcie 3.1, należy zoptymalizować warunki testu dla każdego enzymu, zmieniając pH, rodzaj buforu, siłę buforu, stężenia NaCl, detergenty takie jak Triton X-10 oraz obecność lub brak różnych kationów dwuwartościowych.
    1. Dla różnych stężeń każdej zmiennej należy wyznaczyć specyficzną aktywność enzymatyczną (patrz 3.1.4.2) (najwyższa uzyskana wartość definiuje warunek maksymalnej aktywności enzymatycznej). Należy zastosować kombinację optymalnych warunków znalezionych dla każdej zmiennej, aby zdefiniować zoptymalizowany test enzymatyczny, w którym każda zmienna występuje w optymalnym stężeniu.

Schemat reakcji hydrolizy, p-nitrofenyloestru do p-nitrofenolanu; zmiana barwy w kuwetach.
Rysunek 1. p- Estry nitropenylu jako sztuczne substraty dla (fosfo)lipaz w teście spektrofotometrycznym. Po hydrolizie pestryp-nitrofenylowe, kwas (R-OH) oraz p-nitrofenol (p-NP) są tworzone. Ze względu na pKa = 7,2 dla dysocjacji fenolowego wodoru H+ z p-NP, przy pH > 9.2 ponad 9% znajduje się w jasnożółtym obszarze p-postać nitropenolanowa oraz molowy współczynnik ekstynkcji wynoszący 18 00 M-1 cm-1 można stosować przy długości fali 405 nm do oznaczania ilości wolnych p-nitropenolanu22W przypadku zastosowania buforów o pH 8,5 absorbancję wyznaczano przy 40 nm, przyjmując molowy współczynnik ekstynkcji wynoszący 14 50 M-1 cm-1 zastosowano23. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

UWAGA: Po określeniu optymalnych warunków aktywności badanego enzymu, należy rozpocząć poszukiwania rzeczywistego/fizjologicznego substratu tej lipazy. W celu osiągnięcia tego celu należy w zasadzie zastosować dwa, często komplementarne podejścia: metodę in vivo lub metodę in vitro.

4. Identyfikacja fizjologicznego substratu lipazy in vivo

UWAGA: W podejściu in vivo należy wyexprymować interesującą nas lipazę w organizmie gospodarza8,1, aby zarejestrować w czasie, czy ekspresja lipazy zmienia profil lipidowy gospodarza. W innym podejściu in vivo należy stworzyć mutanta z deficytem interesującego nas genu8,1 i zbadać, czy jego profil lipidowy różni się od wersji typu dzikiego6,8,1. Aby uzyskać ilościową ocenę profilu lipidowego organizmu, można zastosować prostą metodę polegającą na znakowaniu radioaktywnym związków komórkowych, ekstrakcji lipidów, ich rozdziale za pomocą chromatografii oraz kwantyfikacji radioaktywnie znakowanych wydzielonych lipidów.

  1. Radioznakowanie lipidów.
    1. Przygotuj nocną prekulturę badanego organizmu (*E. coli* lub S. meliloti) w 5 ml pożądanego medium hodowlanego (podłoża złożonego lub zdefiniowanego podłoża minimalnego) i inkubować w 30 °C.
    2. Z przedkultury wykonaj inokulację do 20 ml tego samego świeżego medium w kolbie hodowlanej o pojemności 10 ml, aby uzyskać początkową wartość OD620 = 0,3 dla hodowli.
    3. W warunkach sterylnych pobrać alikwot (1 ml) hodowli i przenieść go do sterylnej polistyrenowej probówki o okrągłym dnie o pojemności 14 ml.
    4. Dodaj 1 µCi z [1-14ocet (60 mCi na mmol) do 1 ml hodowli.
    5. Inkubować kulturę w cieczy z wytrząsaniem w temperaturze 30 °C przez okres 24 godz.
    6. Po zakończeniu okresu inkubacji przenieść kulturę do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml i wirować z prędkością 12 0 x g w temperaturze pokojowej przez 5 min.
    7. Resuspendować osad w 100 µl wody. Na tym etapie należy przechowywać zawiesinę komórek w temperaturze -20 °C lub natychmiast przejść do ekstrakcji lipidów polarnych (sekcja 4.2).
  2. Ekstrakcja lipidów polarnych.
    UWAGA: Metoda opisana w niniejszym tekście w zasadniczości opiera się na procedurze przedstawionej przez Bligha i Dyera19.
    1. Do 100 µl zawiesiny komórkowej w roztworze wodnym, dodać 375 µl roztworu metanolu i chloroformu (2:1; obj./obj.).
    2. Mieszać na wirówce vortex przez 30 s, a następnie inkubować przez 5 min w temperaturze pokojowej.
    3. Wirować przez 5 min przy 12 0 x g w temperaturze pokojowej.
    4. Przenieś nadsącz do nowej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml.
    5. Dodaj 125 µl z chloroformu i 125 µl wody, wirować wstrząsarce (vortex) przez 30 s.
    6. Wirować przez 1 min w temperaturze pokojowej przy 12 00 x g.
    7. Przenieść dolną fazę chloroformową do nowej probówki i osuszyć strumieniem azotem.
    8. Rozpuścić wysuszone lipidy w 100 µl roztworu chloroformu i metanolu (1:1; obj./obj.).
      UWAGA: Na tym etapie alikwot 5 µl ilość roztworu lipidowego można określić za pomocą liczenia scyntylacyjnego w cieczy.
    9. W celu przeprowadzenia analizy metodą chromatografii cienkowarstwowej (TLC), odparuj pozostałą 95 µl strumieniem azotu, a następnie ponownie rozpuścić wysuszone lipidy w 20 µl roztworu chloroformu z metanolem (1:1; obj./obj.). Należy użyć 3 µl alikwot do analizy TLC.
  3. Rozdział lipidów polarnych za pomocą chromatografii cienkowarstwowej (TLC).
    UWAGA: W zależności od analizowanych klas lipidów do rozdzielania można zastosować różne kombinacje faz stacjonarnych i ruchomych. Przedstawiono tutaj typowy proces rozdzielania naładowanych lipidów polarnych oraz inny, bardziej odpowiedni dla neutralnych lipidów polarnych, z wykorzystaniem aluminiowych płytek żelowo-krzemionkowych do wysokorozdzielczej chromatografii cienkowarstwowej (HPTLC) jako fazy stacjonarnej.
    1. Rozdział naładowanych lipidów polarnych za pomocą dwuwymiarowej chromatografii cienkowarstwowej (2D-TLC).
      1. Nanieś 3 µl alikwot próbki lipidów w jednym rogu aluminiowej płyty HPTLC z żelem krzemionkowym (10 x 10 cm), 2 cm od krawędzi płyty.
      2. Przygotować i wymieszać fazę ruchomą (140 ml chloroformu, 60 ml metanolu i 10 ml wody) do rozdziału w pierwszym wymiarze.
      3. Wyłożyć wnętrze komory do rozwijania płytek TLC papierem chromatograficznym.
        UWAGA: Ma to na celu zapewnienie szybkiego nasycenia (w ciągu 30 min) fazy gazowej w komorze po dodaniu do niej fazy ruchomej dla pierwszego wymiaru i zamknięciu komory szklaną płytką.
      4. Przygotować i wymieszać fazę ruchomą (130 ml chloroformu, 50 ml metanolu i 20 ml octowego kwasu lodowatego) do rozdziału w drugim wymiarze, a następnie przenieść ją do drugiej komory do rozwijania TLC, wyłożonej od wewnątrz papierem chromatograficznym, i pozostawić do nasycenia komory.
      5. Ostrożnie przenieś płytkę aluminiową z żelem krzemionkowym HPTLC z wysuszoną próbką lipidów do pierwszej komory i przeprowadź rozwój (t. j., przeprowadź chromatografię) płytkę przez 60 min w zamkniętej komorze w pierwszym wymiarze5.
      6. Wyjmij płytkę z komory i pozostaw do wyschnięcia rozpuszczalników w dygestorium z przepływem laminarnym przez 30 min.
      7. Po obróceniu płytki o 90 stopni względem poprzedniej chromatografii, przenieś aluminiową płytkę z żelem krzemionkowym HPTLC, na której lipidy zostały rozdzielone w pierwszym wymiarze, do drugiej komory i przeprowadzaj rozwój płytki przez 60 min w drugim wymiarze.5.
      8. Wyjmij arkusz z komory i pozostaw do wyschnięcia rozpuszczalników w dygestorium przez co najmniej 2 godziny.
    2. Rozdział neutralnych lipidów polarnych.
      1. Zastosuj 3 µl alikwoty próbek lipidowych na aluminiową płytkę z żelem krzemionkowym HPTLC, zaczynając 2 cm od krawędzi płytki. W przypadku analizy wielu próbek w chromatografii jednowymiarowej należy zachować odległość co najmniej 1,5 cm między poszczególnymi punktami aplikacji próbek.
      2. Przygotować i wymieszać fazę ruchomą (140 ml heksanu, 60 ml eteru dietylowego i 8 ml kwasu octowego), a następnie przelać ją do komory do rozwijania płyt TLC wyłożonej od wewnątrz papierem chromatograficznym i przykrytej płytą szklaną, aby pozwolić na nasycenie komory (30 min).
      3. Przenieś płytkę aluminiową z żelem krzemionkowym HPTLC z wysuszonymi próbkami lipidów do komory i prowadź rozwój płytki przez 30 min w zamkniętej komorze.
      4. Wyjmij płytkę z komory i pozostaw do wyschnięcia rozpuszczalników w komorze z przepływem laminarnym przez 2 h.
  4. Ilościowe oznaczenie i wizualizacja rozdzielonych lipidów polarnych.
    1. Po wyschnięciu rozwiniętej płytki TLC należy inkubować ją z ekranem luminescencji fotostymulowanej (PSL) w zamkniętej kasecie przez 3 dni.
    2. Naświetl inkubowany ekran skanerem PSL i uzyskaj obraz wirtualny rozdzielonych lipidów znakowanych izotopowo.
    3. Wykonaj kwantyfikację przy użyciu oprogramowania PSL20.
  5. Wizualizacja i izolacja poszczególnych klas lipidów polarnych.
    1. Inkubować wywołaną płytkę TLC przez 10 min w komorze chromatograficznej w obecności 1 g kryształów jodu.
      UWAGA: Rozdzielone związki lipidowe rozpuszczą jod i pojawią się jako brązowe plamki.
    2. Obrysuj plamki ołówkiem, a następnie porównaj je z wartością względnej ruchomości (Rf)f) związków wzorcowych (t. j. 1,2-dipalmitylo-Wprowadzenie do badania natężenia powierzchniowego za pomocą metody kropli siedzącej (pendant drop) Podsumowanie W niniejszym filmie zaprezentowano technikę pomiaru natężenia powierzchniowego cieczy za pomocą metody kropli siedzącej. Metoda ta polega na analizie profilu kształtu kropli zawieszonej na końcu kapilary lub igły, gdzie równowaga między siłami grawitacji a napięciem powierzchniowym determinuje geometrię kropli. Wykorzystując analizę obrazu i odpowiednie równania matematyczne (równanie Younga-Laplace'a), można precyzyjnie wyznaczyć wartość natężenia powierzchniowego próbki. Technika ta jest niezwykle przydatna w badaniach nad surfaktantami, koloidami oraz w analizie właściwości fizykochemicznych różnych roztworów. Słowa kluczowe natężenie powierzchniowe, metoda kropli siedzącej, analiza obrazu, równanie Younga-Laplace'a, fizykochemia powierzchni, surfaktanty, kropla zawieszona-glicerol, dipalmitoylo-L-α-fosfatydylocholina, DL-α-monopalmityna lub kwas palmitynowy) i określić, do której klasy lipidów mogą należeć.
    3. W dygestorium należy odczekać do odparowania jodu z płytki TLC.
    4. Za pomocą szpatułki zeskrobać z płytki żel krzemionkowy zawierający interesujący związek, a następnie wyekstrahować związek z żelu krzemionkowego za pomocą mieszaniny 100 µl wody i 375 µl roztworu metanolu i chloroformu (2:1; obj./obj.).
    5. Kontynuuj ekstrakcję zgodnie z metodą Bligha i Dyera, jak opisano w dalszej części (od punktu 4.2.2).
    6. Przechowywać oczyszczoną klasę lipidów w 100 µl roztworu chloroformu z metanolem (1:1; obj./obj.) w temperaturze -20 °przechowywać w temperaturze C do momentu użycia.

5. Identyfikacja substratu fizjologicznego lipazy in vitro

UWAGA: W podejściu in vitro należy zbadać, czy analizowana lipaza może przekształcać mieszaninę wyizolowanych lipidów lub poszczególne czyste lipidy w odpowiadające im produkty hydrolizy w warunkach określonych jako optymalne w punkcie 3.2.

  1. Stosować schematy pipetowania dla testów enzymatycznych zgodnie z Tabelą 3 dla aktywności specyficznej wobec PC fosfolipazy C SMc0171 (patrz 5.2), fosfolipazy A (patrz 5.3) oraz lipazy DAG SMc0103 (patrz 5.4).
  2. Oznaczenie aktywności specyficznej wobec PC fosfolipazy C (Tabela 3).
    1. Do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml dodać 5 0 counts per minute (cpm) całkowitej PC znakowanej 14C oraz roztwór Triton X-10.
    2. Wymieszać i wysuszyć w strumieniu azotu.
    3. Dodać bufor dietanoloaminowy-HCl o pH 9,8, roztwory NaCl i MnCl2 oraz wodę bidestylowaną, aby uzyskać objętość końcową 9,5 µl. Wymieszać w wortexie przez 5 s.
    4. W celu zainicjowania reakcji dodać 0,5 µl enzymu (5 µg białka) (t.j. ekstrakt bezkomórkowy zawierający nadekspresyjne SMc00171). Krótko wymieszać.
    5. Inkubować w temperaturze 30 °C przez 4 h.
    6. Zatrzymać reakcję poprzez dodanie 250 µl metanolu i 125 µl chloroformu.
    7. Wyekstrahować lipidy zgodnie z wcześniejszym opisem (patrz 4.2).
    8. Rozdzielić lipidy za pomocą jednowymiarowej (1D)-TLC (patrz 4.3.2 i 4.4) i przeanalizować je za pomocą obrazowania PSL.
  3. Oznaczenie aktywności fosfolipazy A (Tabela 3).
    1. Do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml dodać 5 0 cpm całkowitych fosfolipidów znakowanych 14C oraz roztwór Triton X-10.
    2. Wymieszać i wysuszyć w strumieniu azotu.
    3. Dla końcowej objętości testu 100 µl dodać bufor Tris-HCl o pH 8,5, roztwór NaCl i wodę. Wymieszać wortexie przez 5 s.
    4. Dodać 5 µl enzymu (50 µg białka) (t.j. ekstrakt bezkomórkowy zawierający nadekspresyjne SMc0930 lub SMc0103).
    5. Inkubować w temperaturze 30 °C przez 5 h.
    6. Zatrzymać reakcję poprzez dodanie 250 µl metanolu i 125 µl chloroformu.
    7. Wyekstrahować lipidy zgodnie z wcześniejszym opisem (patrz 4.2), rozdzielić je za pomocą 1D-TLC, używając jako fazy ruchomej 130 ml chloroformu, 50 ml metanolu i 20 ml octowego kwasu lodowatego, a następnie przeanalizować za pomocą obrazowania PSL.
  4. Oznaczenie aktywności lipazy diacyloglicerolu (DAG).
    1. Przygotowanie DAG znakowanego 14C.
      1. Zznakować radioaktywnie kultury S. meliloti (patrz 4.1) i wyekstrahować lipidy polarne (patrz 4.2) zgodnie z opisem. Rozdzielić całkowite ekstrakty lipidowe S. meliloti za pomocą 1D-TLC w układzie chloroform:metanol:kwas octowy (130:50:20; obj/obj), stosując warunki opisane dla rozdzielania w drugiej wymiarowości w punkcie 4.3.1.
      2. Zwizualizować PC poprzez barwienie jodem i zaznaczyć ołówkiem lokalizację fosfatydylocholiny (PC).
      3. Wyizolować znakowaną radioaktywnie PC zgodnie z opisem w punkcie 4.5.
      4. Ilościowo oznaczyć wyekstrahowaną PC za pomocą licznika scyntylacyjnego.
        UWAGA: Przewiduje się uzyskanie ok. 320 00 cpm PC.
      5. PC (250 0 cpm) traktować 0,1 U fosfolipazy C z Clostridium perfringens w 50 mM Tris-HCl, pH 7,2, 0,5% Triton X-10 i 10 mM CaCl2 przez 2 h w całkowitej objętości 10 µl, a następnie zatrzymać reakcję, dodając 250 µl metanolu i 125 µl chloroformu.
      6. Wyekstrahować lipidy zgodnie z wcześniejszym opisem i rozdzielić je za pomocą 1D-TLC (patrz 4.3.2).
      7. Wyizolować diacyloglicerol z płytki krzemionkowej i oznaczyć ilościowo za pomocą licznika scyntylacyjnego (zgodnie z opisem w 4.2).
    2. Test lipazy diacyloglicerolu (Tabela 3).
      1. Do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml dodać 5 0 cpm DAG znakowanego 14C oraz roztwór Triton X-10.
      2. Wymieszać i wysuszyć w strumieniu azotu.
      3. Dla końcowej objętości testu 10 µl dodać bufor Tris-HCl (pH 9,0), roztwór NaCl i wodę bidestylowaną. Wymieszać wortexie przez 5 s.
      4. Zainicjować reakcję, dodając 5 µl enzymu (50 µg białka ekstraktu bezkomórkowego).
      5. Inkubować w temperaturze 30 °C przez 4 h.
      6. Zatrzymać reakcję poprzez dodanie 250 µl metanolu i 125 µl chloroformu, a następnie wyekstrahować lipidy zgodnie z wcześniejszym opisem (patrz 4.2).
      7. Przeanalizować neutralne lipidy polarne za pomocą 1D-TLC (patrz 4.1.3.2) i następującego po tym obrazowania PSL.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aktywność specyficznej dla PC fosfolipazy C SMc00171 z bis-p-nitrofenylofosforanem

Ekstrakty bezkomórkowe otrzymane z E. coli BL21(DE3) x pLysS, który posiadał smc0171 wykazano ekspresję, a następnie zbadano ich zdolność do hydrolizy bis-pestry p-nitrofenylofosforanowe, przy użyciu spektrofotometrycznego testu enzymatycznego, mierząc p

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W ciągu ostatnich 20 lat zsekwencjonowano genomy wielu organizmów i chociaż wygenerowano wiele danych dotyczących sekwencji genomu, interpretacja funkcjonalna pozostaje w tyle, co utrudnia nasze zrozumienie funkcji genomu. Funkcje genów w genomach są często przypisywane na podstawie podobieństwa do genów o znanej funkcji lub występowania konserwatywnych motywów. Jednak dokładna funkcja danego genu często nie jest znana. W szczególności przewidywane geny strukturalne enzymów nie mogą być łatwo zbadane za pomocą technik om...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty z Consejo Nacional de Ciencias y Tecnología-México (CONACyT-Mexico) (82614, 153998, 253549, and 178359 w Investigación Científica Básica oraz 118 w Investigación en Fronteras de la Ciencia) oraz z Dirección General de Asuntos de Personal Académico-Universidad Nacional Autónoma de México (DGAPA-UNAM; PAPIIT IN202616, IN203612).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
ChloroformJT Baker9180-03Analiza TLC i Ekstrakcja lipidów
MetanolJT Baker9070-03TLC analiza i Ekstrakcja lipidów
Kwas octowyJT Baker9507-05Analiza TLC i Ekstrakcja
lipidów HeksanyJT Baker9309-02Analiza TLC i Ekstrakcja lipidów
Eter dietylowySigma32203Testy enzymatyczne
woda bidestylowana  WZELAKI  NATesty enzymatyczne
Tris BaseSigmaT-1503Testy enzymatyczne
HClBaker9535-02Testy enzymatyczne
NaClBaker3624-01Testy enzymatyczne
Triton X-100SigmaX-100Testy enzymatyczne
Bulion LBDOWOLNABRAK DANYCHWzrost bakterii, 10 g tryptonu + 5 g ekstraktu drożdżowego + 10 g NaCl per litr wody bidestylowanej
tryptonBecton Dickinson and Company211705
Ekstrakt z drożdżyBecton Dickinson and Company212750Wzrost bakterii
TY bulionANYNAWzrost bakterii, 8 g tryptonu + 3 g ekstraktu drożdżowego + 66 mg CaCl2· 2H2O na litr wody destylowanej
CaCl2· 2H2OBaker1332-01Testy enzymatyczne
izopropylo-β-D-tiogalaktozyd (IPTG)Invitrogen15529-019Wzrost bakterii
DietanoloaminaSigmaD-8885Testy enzymatyczne
MnCl2Sigma221279Testy enzymatyczne
Fosfolipaza A2 wąż venomSigmaP0790Testy enzymatyczne
Fosfolipaza C Clostridium perfringensSigmaP7633Testy enzymatyczne
Bis-p-nitrofenylowy fosforanSigma07422AHTesty enzymatyczne
p-stearynian nitrofenyluSigmaN3627Testy enzymatyczne
p-dodekanian nitrofenyluSigma61716Testy enzymatyczne
p-dekanian nitrofenyluSigmaN0252Testy enzymatyczne
p-palmitynian nitrofenyluSigmaN2752Testy enzymatyczne
p-maślan nitrofenyluSigmaN9876Testy enzymatyczne
p-oktanian nitrofenyluSigma21742Testy enzymatyczne
Kwas octowy, sól sodowa [1-14C]Perkin ElmerNEC084Wzrost bakterii
dimetylosulfotlenek (DMSO)JT Baker9224-01Testy enzymatyczne
Żel krzemionkowy Aluminium HPTLC 60 płytek. Płytki HPTLC z żelem krzemionkowym o wymiarach 20 x 20 cm, 25 arkuszy.Merck105547Analiza TLC & Ekstrakcja lipidów
Spektrometr UV/VIS Lambda 35Perkin ElmerNATesty enzymatyczne
Storm 820 PhosphorimagerDynamika molekularnaNAFotostymulowalny skaner luminescencyjny 
Wielofunkcyjny licznik scyntylacyjnyBeckman CoulterNAKwantyfikacja radioaktywności
Francuska komórka ciśnieniowaThermoSpectronicNA Pękanie komórek
bibuła chromatograficzna 3MM ChrWhatman3030917analiza TLC
Sinorhizobium meliloti 1021naszeodniesienie 11badanych szczep
Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS Kompetentne komórkiNovagen69451szczep ekspresji białka
wektor pET9aWektor ekspresji białkaNovagen69431
pET17b wektorNovagen69663wektor ekspresji białka
sterylna probówka okrągłodenna z polistyrenu polistyrenowego (14 ml) FalconBecton Dickinson352057znakowanie radioizotopowe kultur bakteryjnych
polipropylenowe probówki wirówkowe (1,5 ml)Eppendorf30125.15Testy enzymatyczne
1,2-dipalmitoilo-sn-glicerolSigmaD9135wzorzec lipidowy
L-&alfa;-fosfatydylocholina, dipalmitoiloSigmaP6267wzorzec lipidowy
DL-&alfa;-monopalmitynaSigmaM1640wzorzec lipidowy
kwas palmitynowySigmaP0500wzorzec lipidowy
wzrostu bakterii

Bibliografia

  1. Nelson, D. L., Cox, M. M. Lehninger, Principles of Biochemistry. , W. H. Freeman and Company. New York. (2013).
  2. Jaeger, K. E., Eggert, T. Lipases for biotechnology. Curr. Opin. Biotechnol. 13 (4), 390-397 (2002).
  3. Dowhan, W., Bogdanov, M., Mileykovskaya, E. Functional roles of lipids in membranes. Biochemistry of Lipids, Lipoproteins and Membranes. , 5th, Elsevier. Amsterdam, The Netherlands. 1-37 (2008).
  4. Dowhan, W. Molecular basis for membrane phospholipid diversity: why are there so many lipids? Annu. Rev. Biochem. 66, 199-232 (1997).
  5. De Rudder, K. E. E., Thomas-Oates, J. E., Geiger, O. Rhizobium meliloti mutants deficient in phospholipid N-methyltransferase still contain phosphatidylcholine. J. Bacteriol. 179, 6921-6928 (1997).
  6. Geiger, O., Röhrs, V., Weissenmayer, B., Finan, T. M., Thomas-Oates, J. E. The regulator gene phoB mediates phosphate stress-controlled synthesis of the membrane lipid diacylglyceryl-N,N,N-trimethylhomoserine in Rhizobium (Sinorhizobium) meliloti. Mol. Microbiol. 32 (1), 63-73 (1999).
  7. Klug, R. M., Benning, C. Two enzymes of diacylglyceryl-O-4'-(N,N,N,-trimethyl)homoserine biosynthesis are encoded by btaA and btaB in the purple bacterium Rhodobacter sphaeroides. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98 (10), 5910-5915 (2001).
  8. Zavaleta-Pastor, M., et al. Sinorhizobium meliloti phospholipase C required for lipid remodeling duringphosphorus limitation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107 (1), 302-307 (2010).
  9. Pech-Canul, A., et al. FadD is required for utilization of endogenous fatty acids released from membrane lipids. J. Bacteriol. 193 (22), 6295-6304 (2011).
  10. Banerji, S., Flieger, A. Patatin-like proteins: a new family of lipolytic enzymes present in bacteria? Microbiology. 150 (Pt 3), 522-525 (2004).
  11. Sahonero-Canavesi, D. X., et al. Fatty acid-releasing activities in Sinorhizobium meliloti include unusual diacylglycerol lipase. Environ. Microbiol. 17 (9), 3391-3406 (2015).
  12. Fischer, M., Pleiss, J. The Lipase Engineering Database: a navigation and analysis tool for protein families. Nucl. Acid. Res. 31 (1), 319-321 (2003).
  13. Sigrist, C. J. A., et al. New and continuing developments at PROSITE. Nucleic Acids Res. 41 (Database issue), D344-D347 (2013).
  14. Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. J. Vis. Exp. (63), e3998(2012).
  15. Untergasser, A., et al. Primer3 - new capabilities and interfaces. Nucl. Acids Res. 40 (15), e115(2012).
  16. Studier, F. W., Rosenberg, A. H., Dunn, J. J., Dubendorff, J. W. Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes. Methods Enzymol. 185, 60-89 (1990).
  17. Miller, J. H. Experiments in Molecular Genetics. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Plainview, NY, USA. (1972).
  18. Desjardins, P., Hansen, J. B., Allen, M. Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer. J. Vis. Exp. (33), e1610(2009).
  19. Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method for total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37 (8), 911-917 (1959).
  20. Molecular Dynamics. Phosphorimager SI User´s Guide. , http://www.camd.lsu.edu/SAXS/Files/PIManual.pdf (1994).
  21. Dixon, M., Webb, E. Enzymes: Third Edition. , Longman, USA. (1979).
  22. Rudolph, A. E., et al. Expression, characterization, and mutagenesis of the Yersinia pestis murine toxin, a phospholipase D superfamily member. J. Biol. Chem. 274 (17), 11824-11831 (1999).
  23. Kato, S., Yoshimura, T., Hemmi, H., Moriyama, R. Biochemical analysis of a novel lipolytic enzyme YvdO from Bacillus subtilis. Biosci. Biotechnol. Biochem. 74 (4), 701-706 (2010).
  24. Peppelenbosch, M. P. Kinome profiling. Scientifica (Cairo). , Article ID 306798 (2012).
  25. Manafi, M., Kneifel, W., Bascomb, S. Fluorogenic and chromogenic substrates used in bacterial diagnostics. Microbiol. Rev. 55 (3), 335-348 (1991).
  26. Kuznetsova, E., et al. Enzyme genomics: Application of general enzymatic screens to discover new enzymes. FEMS Microbiol. Rev. 29 (2), 263-279 (2005).
  27. Scopes, R. K. Protein Purification, Principles and Practice. , Springer. New York. (2010).
  28. Geiger, O., Lopez-Lara, I. M., Sohlenkamp, C. Phosphatidylcholine biosynthesis and function in bacteria. Biochim. Biophys. Acta. 1831 (3), 503-513 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

aktywno lipazyanaliza fosfolipazyoptymalizacja enzymuswoisto substratowasubstraty chromogennecienkowarstwowa chromatografiaznakowanie radioaktywnedegradacja fosfatydyloch cholinielipaza diacyloglicerolowaSinorhizobium meliloti
Definiowanie specyficzności substratowej dla kandydatów na lipazę i fosfolipazę
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.