Method Article

Definiowanie specyficzności substratowej dla kandydatów na lipazę i fosfolipazę

DOI:

10.3791/54613

⸱

November 23rd, 2016

 ,  ,  ,  , 
1Centro de Ciencias Genómicas, Universidad Nacional Autónoma de México

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wiele przewidywanych (fosfo)lipaz jest słabo scharakteryzowanych pod względem specyficzności substratowej i funkcji fizjologicznych. W tym miejscu przedstawiamy protokół optymalizacji aktywności enzymów, poszukiwania naturalnych substratów i proponowania funkcji fizjologicznych tych enzymów.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroorganizmy wytwarzają szerokie spektrum (fosfo)lipaz, które są wydzielane w celu udostępnienia organizmowi zewnętrznych substratów. Alternatywnie, inne (fosfo)lipazy mogą być fizycznie związane z organizmem wytwarzającym, powodując obrót wewnętrznych lipidów i często powodując przebudowę błon komórkowych. Chociaż potencjalne (fosfo)lipazy można przewidzieć za pomocą wielu algorytmów, gdy dostępna jest sekwencja genu/białka, często nie uzyskano eksperymentalnego dowodu na aktywność enzymu, specyficzność substratu i potencjalne funkcje fizjologiczne. W artykule opisano optymalizację warunków oznaczania dla prospektywnych (fosfo)lipaz o nieznanej specyficzności substratowej oraz sposób wykorzystania tych zoptymalizowanych warunków w poszukiwaniu naturalnego substratu odpowiedniej (fosfo)lipazy. Stosowanie sztucznych substratów chromogennych, takich jak pochodne p-nitrofenylu, może pomóc w wykryciu niewielkiej aktywności enzymatycznej przewidywanej (fosfo)lipazy w standardowych warunkach. Po napotkaniu tak niewielkiej aktywności enzymatycznej można zmieniać różne parametry testu enzymatycznego w celu uzyskania bardziej wydajnej hydrolizy sztucznego substratu. Po ustaleniu warunków, w których enzym działa dobrze, należy oznaczyć różne potencjalne naturalne substraty pod kątem ich degradacji, procesu, który można śledzić przy użyciu różnych metod chromatograficznych. Określenie specyficzności substratowej dla nowych enzymów często dostarcza hipotez dotyczących potencjalnej fizjologicznej roli tych enzymów, które następnie można przetestować eksperymentalnie. Postępując zgodnie z tymi wytycznymi, byliśmy w stanie zidentyfikować fosfolipazę C (SMc00171), która rozkłada fosfatydylocholinę do fosfocholiny i diacyloglicerolu, co jest kluczowym krokiem dla przebudowy błon w bakterii Sinorhizobium meliloti w warunkach wzrostu ograniczających fosfor. Dla dwóch przewidywanych fosfolipaz podobnych do patatyny (SMc00930 i SMc01003) tego samego organizmu, możemy ponownie zdefiniować ich specyficzność substratową i wyjaśnić, że SMc01003 jest lipazą diacyloglicerolową.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lipidy na bazie glicerolu, takie jak triacyloglicerole i (glicero)fosfolipidy, stanowią ważne i prawdopodobnie najbardziej znane klasy lipidów1. Triacyloglicerole (TAG) to tłuszcze lub oleje, które zwykle pełnią funkcję lipidów magazynujących, a zatem jako potencjalne źródła energii i węgla. TAG mogą być rozkładane przez lipazy, które są często wydzielane przez organizm wytwarzający w celu trawienia zewnętrznych TAG i udostępniania ich jako źródeł węgla. Ponadto lipazy były szeroko badane na przestrzeni lat ze względu na ich ważne zastosowania biotechnologiczne2.

Ze względu na ich amfifilową naturę i prawie cylindryczny kształt, (glicero)fosfolipidy wykazują właściwości błonotwórcze i zazwyczaj stanowią główne składniki lipidowe dwuwarstwowej membrany3. W prostych mikroorganizmach, takich jak bakteria Escherichia coli, spotyka się tylko trzy główne warianty grupy głównej: fosfatydyloglicerol (PG), kardiolipinę (CL) i fosfatydyloetanoloaminę (PE), chociaż należy mieć świadomość, że każdy z nich może być zastąpiony znaczną liczbą różnych łańcuchów tłuszczowych acylowych w pozycji sn-1 lub sn-2, co daje początek dużej liczbie różnych gatunków molekularnych4. Inne bakterie mogą mieć inne fosfolipidy dodatkowo lub zamiast niego. Na przykład Sinorhizobium meliloti, bakteria glebowa, która jest w stanie tworzyć symbiozę brodawek korzeniowych wiążących azot z lucerną siewną (Medicago sativa), zawiera oprócz PE drugi zwitterionowy fosfolipid, fosfatydylocholinę (PC)5. Ponadto lipidy niezawierające fosforu lub glicerolu mogą być amfifilowe i stanowić część błony komórkowej. Na przykład, w warunkach wzrostu ograniczających fosfor, u S. meliloti, (glicero)fosfolipidy są w dużej mierze zastępowane lipidami błonowymi, które nie zawierają fosforu, tj. sulfolipidami, lipidami ornityny i trimetylohomoseryną diacyloglicerylu (DGTS)6. U bakterii DGTS jest tworzony z diacyloglicerolu (DAG) w dwuetapowym szlaku7, ale źródło wytwarzania DAG nie było jasne. Eksperymenty z impulsem sugerują, że PC może być prekursorem DGTS8 i korzystając z metodologii opisanej w tym manuskrypcie, możemy zidentyfikować fosfolipazę C (PlcP, SMc00171), która powstaje w warunkach ograniczających fosfor i która może przekształcić PC w DAG i fosfocholinę8.

W osobnym badaniu odkryliśmy, że mutant S. meliloti lub Escherichia coli z niedoborem syntetazy acyl-CoA (FadD) gromadził wolne kwasy tłuszczowe podczas wchodzenia w stacjonarną fazę wzrostu9. Chociaż te kwasy tłuszczowe wydawały się pochodzić z lipidów błonowych, dokładne źródło wolnych kwasów tłuszczowych lub enzym(ów) je uwalniających nie było znane. Ponownie, stosując strategię opisaną w tym manuskrypcie, przewidywano dwie patatynopodobne10 (fosfo)lipazy (SMc00930 i SMc01003), które przyczyniły się do powstania wolnych kwasów tłuszczowych w S. meliloti11. Co zaskakujące, SMc01003 użył DAG jako substratu, przekształcając go w monoacyloglicerol, a na końcu w glicerol i wolne kwasy tłuszczowe11. Dlatego SMc01003 jest lipazą DAG (DglA).

Chociaż istnieje wiele algorytmów do przewidywania potencjalnych (fosfo)lipaz12,13, ich dokładna funkcja i rola fizjologiczna zazwyczaj nie są znane. Tutaj przedstawiamy protokół klonowania i nadekspresji przewidywanych lub potencjalnych (fosfo)lipaz. Ten manuskrypt wyjaśnia, w jaki sposób można opracować i zoptymalizować testy enzymatyczne dla nadekspresji (fosfo)lipazy (fosfo)lipazy przy użyciu sztucznych substratów chromogennych. Podajemy przykłady, w jaki sposób za pomocą zoptymalizowanego testu enzymatycznego można napotkać prawdziwy substrat (fosfo)lipazy i jak te odkrycia mogą wzbogacić naszą wiedzę na temat fizjologii drobnoustrojów.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Klonowanie i nadekspresja genu strukturalnego dla przewidywanej lipazy

  1. Za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR)14 i specyficznych oligonukleotydów (Tabela 1)15 amplifikuj gen będący przedmiotem zainteresowania (smc01003, smc00930 lub smc00171), który ma kodować lipazę lub fosfolipazę, z genomowego DNA organizmu gospodarza (tj. S. meliloti).
    1. Wprowadź określone miejsca restrykcyjne (z zaprojektowaną sekwencją oligonukleotydów). Strawić amplifikowany fragment DNA za pomocą odpowiednich enzymów restrykcyjnych i sklonować go do wektora ekspresyjnego, takiego jak plazmidy z seriipET 16.
    2. Po zweryfikowaniu prawidłowej sekwencji DNA dla sklonowanego genu, przekształć wektor w szczep ekspresyjny, taki jak Escherichia coli BL21(DE3) pLysS16.
  2. Przygotować przez noc wstępną hodowlę pLysS gospodarza ekspresji E. coli BL21(DE3) pLysS, zawierającą odpowiedni wektor pET ze sklonowanym genem lub pustym wektorem, w 100 ml kolbach hodowlanych zawierających 20 ml bulionu Luria Bertani (LB)17 oraz wymagane antybiotyki. Hodować komórki w temperaturze 30 °C (lub w zwykłej temperaturze wzrostu bakterii, z której pochodzi lipaza).
    1. Korzystając z nocnych kultur wstępnych, zaszczepić 500 ml wstępnie podgrzanej pożywki LB (plus wymagane antybiotyki) w 2 litrowych kolbach hodowlanych, aby uzyskać początkową gęstość optyczną przy 620 nm (OD620) = 0,05. Śledzić wzrost kultur i przy OD620 = 0,3, dodać izopropylo-β-D-tiogalaktozyd (IPTG) do końcowego stężenia 100 μM i inkubować pod mieszaniem w temperaturze 30 °C przez okres 4 godzin.
    2. Pod koniec okresu inkubacji przenieść każdą kulturę do probówki wirówkowej o pojemności 500 ml i odwirować przy 5 000 x g w temperaturze 4 °C przez 30 minut. Zawiesić osady komórek bakteryjnych w 5 ml buforu zawiesinowego (np. komórki wykazujące ekspresję SMc00930 i SMc01003 w 50 mM Tris-HCl pH 8,0 i komórki wykazujące ekspresję SMc00171 w 50 mM dietanoloamina-HCl pH 9,8). Zawiesiny komórek należy przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu użycia.

2. Przygotuj bezkomórkowe ekstrakty białkowe i określ stężenie białka

  1. Rozmrozić zawiesiny komórek bakteryjnych i przechowywać na lodzie. Przepuść zawiesiny komórek trzykrotnie przez zimną komorę ciśnieniową o sile 20 000 funtów na2. Usunąć nienaruszone komórki i resztki komórek przez odwirowanie przy 5 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
  2. Po odwirowaniu przygotować porcje 100 i 500 μl z supernatantu do dalszej analizy i przechowywać je w temperaturze -80 °C do momentu użycia.
  3. Użyć jednej z podwielokrotności 100 μl w celu oznaczenia stężenia białka w odrębnych ekstraktach bezkomórkowych za pomocą wybranej metody lub zgodnie z opisem18.

3. Wykorzystanie sztucznych substratów do optymalizacji aktywności enzymatycznej (fosfo)lipaz

  1. Aby uzyskać wstępne pokrycie różnych aktywności enzymatycznych, użyj sztucznych substratów, które po hydrolizie dają kolorowy produkt, takich jak p-nitrofenol (p-NP).
    1. W przypadku testów enzymatycznych zoptymalizowanych już przy użyciu sztucznych substratów estrów p-nitrofenylowych (opisanych dla fosfolipazy C PlcP (SMc00171), jak również dla przewidywanych fosfolipaz podobnych do patatyny SMc00930 i SMc01003), należy stosować schematy pipetowania opisane w tabeli 2.
    2. Badając nowy potencjał (fosfo)lipazy, przygotuj pierwszy standardowy test enzymatyczny zawierający 50 mM Tris-HCl, pH 8,5, 100 mM NaCl, 0,05% Triton X-100, 0,5 mM związku zawierającego p-nitrofenyl (fosforan p-nitrofenylu, fosforan bis-p-nitrofenylu, dekanian p-nitrofenylu lub palmitynian p-nitrofenylu) oraz bezkomórkowy ekstrakt białkowy (sprawdź 1, 3, 10, 30, 100, 300 i 1000 μg) w łącznej objętości 1 ml w plastikowych kuwetach o pojemności 1 ml.
      UWAGA: Użyj zasadowego pH (rysunek 1) podczas wykonywania hydrolizy estru p-nitrofenylowego w teście ciągłym. Alternatywnie, należy zastosować testy z pojedynczym punktem czasowym dla zakresu wartości pH, dodając NaOH pod koniec okresu inkubacji w celu zakończenia reakcji enzymatycznej i zapewnienia, że wszystkie p-NP są obecne w postaci fenolanu.
    3. Postępować zgodnie z przebiegiem czasu dla zwiększenia absorbancji przy 405 nm, spowodowanej tworzeniem się p-NP, w spektrofotometrze w temperaturze 30 °C przez okres 5 minut. Określ ilościowo początkowe liniowe tworzenie p-NP, określając początkowe nachylenie wzrostu absorbancji w czasie.
    4. Obliczyć zmianę stężenia (Δc) dla p-NP za pomocą prawa Lamberta-Beera (ΔA = ε Δc d)1,
      UWAGA: ΔA jest liniową zmianą absorbancji wyznaczoną, ε jest molowym współczynnikiem ekstynkcji przy odpowiedniej długości fali (w jednostkach M-1 cm-1), d jest długością drogi światła (1 cm), a Δc jest zmianą stężenia (w jednostkach M), która ma zostać określona.
      1. Biorąc pod uwagę, że objętość testu wynosi 1 ml, obliczyć ilość utworzonego p-NP.
        UWAGA: Ilość = stężenie x objętość.
      2. Oblicz aktywność enzymu, dzieląc ilość powstałego p-NP przez czas, w którym powstaje. Określ specyficzną aktywność enzymu, dzieląc aktywność enzymu przez ilość białka (w mg), które było odpowiedzialne za generowanie tej aktywności.
    5. Porównaj zmiany absorbancji wywołane przez ekstrakty białkowe, w których gen kandydujący (smc00171, smc00930 lub smc01003) uległ ekspresji z ekstraktami, które zawierają tylko pusty wektor.
      UWAGA: Aby kontynuować następujące kroki, określone działania wywołane przez ekstrakty białkowe, w których uległa ekspresja genu kandydującego, powinny być co najmniej dwa razy lub więcej niż wartości uzyskane dla określonych działań spowodowanych przez ekstrakty białkowe, które zawierają tylko pusty wektor.
    6. Do dalszych doświadczeń wybierz te warunki, w których hydroliza związku zawierającego p-nitrofenyl jest minimalna w przypadku ekstraktów bezkomórkowych (tj. pustego wektora) i dla których najbardziej wyraźne tworzenie p-NP i anionu p-nitrofenolanu (ryc. 1) można zaobserwować, gdy stosowane są ekstrakty białkowe, w których uległa ekspresji gen kandydujący.
  2. Po określeniu początkowej aktywności enzymu w ppkt 3.1, zoptymalizować warunki oznaczania dla odpowiedniego enzymu poprzez zmianę pH, rodzaju buforu, siły buforu, stężeń NaCl, detergentów, takich jak Triton X-100, oraz braku lub obecności różnych kationów dwuwartościowych.
    1. Dla różnych stężeń każdej zmiennej należy określić specyficzną aktywność enzymu (patrz ppkt 3.1.4.2) (najwyższa uzyskana liczba określa warunek maksymalnej aktywności enzymu). Użyj kombinacji optymalnych warunków napotkanych dla każdej zmiennej, aby zdefiniować zoptymalizowany test enzymatyczny, w którym każda zmienna jest obecna w optymalnym stężeniu.

figure-protocol-1
Rysunek 1. Estry p-nitrofenylu jako sztuczne substraty dla lipaz (fosfo)lipaz w teście spektrofotometrycznym. W wyniku hydrolizy estrów p-nitrofenylowych powstaje kwas (R-OH) i p-nitrofenol (p-NP). Ze względu na pKa = 7.2 dla dysocjacji fenolowej czcionki H+ od p-NP, przy pH > 9,2 ponad 99% jest w jasnożółtej formie p-nitrofenolanu i współczynniku ekstynkcji molowej 18 000 M-1 cm-1 może być użyty przy długości fali 405 nm do ilościowego określenia wolnego p-nitrofenolanu22. Gdy zastosowano o pH 8,5, oznaczono absorbancję na poziomie 400 nm i współczynnik ekstynkcji molowej 14 500 M-1 cm-<1 zastosowano font size="2">23. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

UWAGA: Po określeniu optymalnych warunków dla aktywności interesującego enzymu, rozpocznij poszukiwanie rzeczywistego/fizjologicznego substratu tej lipazy. Zasadniczo, aby osiągnąć ten cel, należy przyjąć dwa, często uzupełniające się podejścia: podejście in vivo lub podejście in vitro.

4. Identyfikacja in vivo fizjologicznego substratu lipazy

UWAGA: W podejściu in vivo, wyraź interesującą lipazę w organizmie gospodarza8,11, aby zarejestrować z czasem, czy ekspresja lipazy zmienia profil lipidowy gospodarza. W innym podejściu in vivo wygeneruj mutanta z niedoborem interesującego genu8,11 i zbadaj, czy jego profil lipidowy różni się od wersji typu dzikiego6,8,11. W celu uzyskania ilościowej oceny profilu lipidowego organizmu, prosta metoda polega na znakowaniu radioizotopem związków komórkowych, ekstrakcji lipidów, rozdzielaniu ich za pomocą chromatografii i ilościowym określaniu izoaktywnie znakowanych radioaktywnie oddzielonych lipidów.

  1. Znakowanie radioaktywne lipidów.
    1. Przygotować przez noc wstępną hodowlę organizmu będącego przedmiotem zainteresowania (E. coli lub S. meliloti) w 5 ml żądanej pożywki (pożywki złożonej lub określonej pożywki minimalnej) i rosnąć w temperaturze 30 °C.
    2. Z kultury wstępnej zaszczepić w 20 ml tej samej świeżej pożywki w kolbie hodowlanej o pojemności 100 ml, aby uzyskać początkowy OD620 = 0,3 dla kultury.
    3. Pobrać podwielokrotność (1 ml) kultury w sterylnych warunkach i przenieść do sterylnej probówki okrągłodennej z polistyrenu o pojemności 14 ml.
    4. Dodać 1 μCi octanu [1-14C] (60 mCi na mmol) do 1 ml kultury.
    5. Inkubować płynną kulturę pod mieszaniem w temperaturze 30 °C przez okres 24 godzin.
    6. Pod koniec okresu inkubacji przenieść kulturę do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i wirować przy 12 000 x g w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
    7. Zawiesić osad w 100 μl wody. W tym momencie należy przechowywać zawiesinę komórek w temperaturze -20 °C lub natychmiast przystąpić do ekstrakcji lipidów polarnych (punkt 4.2).
  2. Ekstrakcja lipidów polarnych.
    UWAGA: Opisana tutaj metoda jest zasadniczo zgodna z procedurą opisaną przez Bligha i Dyera19.
    1. Do 100 μl wodnej zawiesiny komórek dodać 375 μl roztworu metanolu: chloroform (2:1; obj./obj.).
    2. Wirować przez 30 sekund i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Wirować 5 minut przy 12 000 x g w temperaturze pokojowej.
    4. Przenieść supernatant do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.
    5. Dodać 125 μl chloroformu i 125 μl wody, wirować 30 sek.
    6. Wirować 1 min przy 12 000 x g w temperaturze pokojowej.
    7. Przenieść dolną fazę chloroformu do świeżej probówki i osuszyć strumieniem azotu gazowego.
    8. Rozpuścić wysuszone lipidy w 100 μl roztworu chloroformu:metanolu (1:1; obj./obj.).
      UWAGA: W tym momencie podwielokrotność 5 μl roztworu lipidowego można określić ilościowo przez zliczanie scyntylacyjne cieczy.
    9. W przypadku analizy chromatograficznej cienkowarstwowej (TLC) wysuszyć pozostałe 95 μl strumieniem azotu gazowego i ponownie rozpuścić wysuszone lipidy w 20 μl roztworu chloroformu:metanolu (1:1; obj./obj.). Do analizy TLC należy użyć podwielokrotności 3 μl.
  3. Rozdzielanie polarnych lipidów metodą chromatografii cienkowarstwowej (TLC).
    UWAGA: W zależności od analizowanych klas lipidów, do separacji można zastosować różne kombinacje fazy stałej i ruchomej. W tym miejscu przedstawiono typową separację dla naładowanych lipidów polarnych i inną, bardziej odpowiednią dla neutralnych lipidów polarnych, wykorzystującą arkusze aluminiowe z żelu krzemionkowego z wysokosprawnej chromatografii cienkowarstwowej (HPTLC) jako fazę stałą.
    1. Separacja naładowanych lipidów polarnych za pomocą dwuwymiarowej TLC (2D-TLC).
      1. Nałożyć 3 μl podwielokrotności próbki lipidów w jednym rogu arkusza aluminiowego z żelu krzemionkowego HPTLC (10 x 10 cm), w odległości 2 cm od krawędzi płytki.
      2. Przygotować i wymieszać fazę ruchomą (140 ml chloroformu, 60 ml metanolu i 10 ml wody) w celu rozdzielenia w pierwszym wymiarze.
      3. Pokryj komorę wywoływania TLC wewnętrznie bibułą chromatograficzną.
        UWAGA: Ma to na celu zapewnienie, że faza gazowa komory zostanie szybko nasycona (w ciągu 30 minut) po dodaniu do komory fazy ruchomej dla pierwszego wymiaru i zamknięciu komory szklaną płytką.
      4. Przygotować i wymieszać fazę ruchomą (130 ml chloroformu, 50 ml metanolu i 20 ml lodowatego kwasu octowego) do rozdzielenia w drugim wymiarze i przenieść do drugiej komory wywoływania TLC, wewnętrznie pokrytej bibułą chromatograficzną i pozostawić komorę do nasycenia.
      5. Ostrożnie przenieść arkusz aluminiowy z żelu krzemionkowego HPTLC z wysuszoną próbką lipidów do pierwszej komory i rozwijać (tj. przeprowadzić chromatografię) płytkę przez 60 minut w zamkniętej komorze w pierwszym wymiarze5.
      6. Wyjąć płytkę z komory i pozostawić rozpuszczalniki do wyschnięcia w okapie przepływowym na 30 minut.
      7. Po obróceniu płytki o 90 stopni w stosunku do poprzedniej chromatografii, przenieść blachę aluminiową z żelu krzemionkowego HPTLC, na której rozdzielono lipidy w jednym wymiarze, do drugiej komory i rozwijać płytkę przez 60 minut w drugim wymiarze5.
      8. Wyjmij arkusz z komory i pozwól rozpuszczalnikom wyschnąć w okapie przepływowym przez co najmniej 2 godziny.
    2. Separacja obojętnych lipidów polarnych.
      1. Nałożyć 3 μl porcji próbek lipidów na blachę aluminiową z żelu krzemionkowego HPTLC, zaczynając 2 cm od krawędzi płytki. Jeżeli w chromatografii jednowymiarowej analizowanych jest wiele próbek, należy zachować odległość co najmniej 1,5 cm między różnymi miejscami aplikacji próbki.
      2. Przygotować i wymieszać fazę ruchomą (140 ml heksanu, 60 ml eteru dietylowego i 8 ml kwasu octowego) i przenieść do komory rozwijania TLC, wewnętrznie pokrytej bibułą chromatograficzną i przykrytej szklaną płytką, aby komora mogła się nasycić (30 min).
      3. Przenieść arkusz aluminiowy z żelu krzemionkowego HPTLC z wysuszonymi próbkami lipidów do komory i wywołać płytkę przez 30 minut w zamkniętej komorze.
      4. Wyjmij płytkę z komory i pozostaw rozpuszczalniki do wyschnięcia w okapie przepływowym na 2 godziny.
  4. Kwantyfikacja i wizualizacja oddzielonych lipidów polarnych.
    1. Po wyschnięciu opracowanego arkusza TLC inkubuj go z ekranem luminescencji fototymulacyjnej (PSL) w zamkniętej kasecie przez 3 dni.
    2. Wystaw inkubowany ekran na skaner PSL i uzyskaj wirtualny obraz oddzielonych lipidów znakowanych radioaktywnie.
    3. Wykonaj kwantyfikację za pomocą oprogramowania PSL20.
  5. Wizualizacja i izolacja poszczególnych klas lipidów polarnych.
    1. Inkubować rozwinięty arkusz TLC przez 10 minut w komorze chromatograficznej w obecności 1 g kryształów jodu.
      UWAGA: Oddzielone związki lipidowe rozpuszczą jod i pojawią się jako brązowawe plamy.
    2. Zakreśl plamki ołówkiem, porównaj je ze względną ruchliwością (Rf) standardowych związków (tj. 1,2-dipalmitoilo-sn-glicerolu, dipalmitoilo-L-α-fosfatydylocholiny, DL-α-monopalmityny lub kwasu palmitynowego) i określ, do której klasy lipidów mogą należeć.
    3. W dygestorium pozwól, aby jod odparował z arkusza TLC.
    4. Za pomocą szpatułki zeskrobać żel krzemionkowy zawierający interesujący go związek z arkusza i wyekstrahować związek z żelu krzemionkowego mieszaniną 100 μl wody i 375 μl roztworu metanolu:chloroform (2:1; obj./obj.).
    5. Kontynuować ekstrakcję zgodnie z Bligh i Dyer, jak opisano (4.2.2 i następne).
    6. Oczyszczoną klasę lipidów przechowywać w 100 μl roztworu chloroformu:metanolu (1:1; obj./obj.) w temperaturze -20 °C do czasu użycia.

5. Identyfikacja in vitro fizjologicznego substratu lipazy

UWAGA: W podejściu in vitro zbadaj, czy interesująca lipaza może przekształcić mieszaninę izolowanych lipidów lub pojedynczych czystych lipidów w odpowiednie produkty hydrolizy w warunkach określonych jako optymalne w 3.2.

  1. Schematy pipetowania należy stosować do oznaczania enzymów zgodnie z tabelą 3 dla aktywności fosfolipazy C SMc00171 specyficznej dla PC (patrz 5.2), fosfolipazy A (patrz 5.3) i lipazy DAG SMc01003 (patrz 5.4).
  2. Oznaczanie aktywności fosfolipazy C specyficznej dla PC (Tabela 3).
    1. Do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml dodać 5 000 zliczeń na minutę (cpm) łącznie 14PC znakowanych C i roztwór Triton X-100.
    2. Wymieszaj i wysusz pod strumieniem azotu.
    3. Dodać dietanoloaminę-HCl, bufor o pH 9,8, a także roztwory NaCl i MnCl2 oraz wodę wodorodestylowaną, aby uzyskać końcową objętość 99,5 μl. Wirować przez 5 sek.
    4. Dodać 0,5 μl enzymu (5 μg białka) (tj. ekstraktu bezkomórkowego, w którym obecna jest nadekspresja SMc00171), aby zainicjować reakcję. Krótko wymieszaj.
    5. Inkubować w temperaturze 30 °C przez 4 godziny.
    6. Zatrzymać reakcję przez dodanie 250 μl metanolu i 125 μl chloroformu.
    7. Ekstrahować lipidy w sposób opisany wcześniej (patrz 4.2).
    8. Oddzielić lipidy za pomocą jednowymiarowej (1D)-TLC (patrz 4.3.2 i 4.4) i przeanalizować je za pomocą obrazowania PSL.
  3. Oznaczanie aktywności fosfolipazy A (Tabela 3).
    1. Do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml dodać 5 000 cpm łącznie 14fosfolipidów znakowanych C i roztwór Triton X-100.
    2. Wymieszaj i wysusz pod strumieniem azotu.
    3. Aby uzyskać końcowy test 100 μl, dodaj Tris-HCl, bufor o pH 8,5, roztwór NaCl i wodę. Wiruj przez 5 sekund.
    4. Dodać 5 μl enzymu (50 μg białka) (tj. ekstraktu bezkomórkowego, w którym występuje nadekspresja SMc00930 lub SMc01003).
    5. Inkubować w temperaturze 30 °C przez 5 godzin.
    6. Zatrzymać reakcję przez dodanie 250 μl metanolu i 125 μl chloroformu.
    7. Ekstrahować lipidy w sposób opisany wcześniej (patrz 4.2), rozdzielać je za pomocą 1D-TLC, używając 130 ml chloroformu, 50 ml metanolu i 20 ml lodowatego kwasu octowego jako fazy ruchomej i analizować je za pomocą obrazowania PSL.
  4. Oznaczanie aktywności lipazy diacyloglicerolu (DAG).
    1. Przygotowanie 14DAG znakowanych C.
      1. Znakować radioizotopem kultury S. meliloti (patrz 4.1) i ekstrahować polarne lipidy (patrz 4.2) zgodnie z opisem. Oddzielić całkowite ekstrakty lipidowe S. meliloti za pomocą 1D-TLC w chloroformie:metanol:kwas octowy (130:50:20; obj./obj.), stosując warunki opisane dla rozdzielania w drugim wymiarze w ppkt 4.3.1.
      2. Wizualizuj PC przez barwienie jodem i użyj ołówka, aby zaznaczyć lokalizację fosfatydylocholiny (PC).
      3. Odizolować znakowany radioizotopowo PC zgodnie z opisem w 4.5.
      4. Określ ilościowo wyekstrahowany PC przez zliczanie scyntylacyjne.
        UWAGA: Spodziewane jest około 320 000 kopii/min komputera.
      5. Potraktuj PC (250 000 cpm) 0,1 U fosfolipazy C z Clostridium perfringens w 50 mM Tris-HCl, pH 7,2, 0,5% Triton X-100 i 10 mM CaCl2 przez 2 godziny w całkowitej objętości 100 μl i zatrzymaj reakcję, dodając 250 μl metanolu i 125 μl chloroformu.
      6. Ekstrahować lipidy zgodnie z poprzednim opisem i rozdzielać je za pomocą 1D-TLC (patrz 4.3.2).
      7. Wyizolować diacyloglicerol z płytki krzemionkowej i oznaczyć ilościowo przez zliczanie scyntylacyjne (jak opisano w ppkt 4.2)
    2. Test lipazy diacyloglicerolu (Tabela 3).
      1. Do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml dodać 5 000 cpm 14DAG znakowanych C i roztwór Triton X-100.
      2. Wymieszaj i wysusz pod strumieniem azotu.
      3. Aby uzyskać końcowy test 100 μl, dodać bufor Tris-HCl (pH 9,0), roztwór NaCl i wodę wodorodestylowaną. Wiruj przez 5 sekund.
      4. Rozpocznij reakcję od dodania 5 μl enzymu (50 μg białka ekstraktu bezkomórkowego).
      5. Inkubować w temperaturze 30 °C przez 4 godziny.
      6. Zatrzymać reakcję przez dodanie 250 μl metanolu i 125 μl chloroformu oraz wyekstrahować lipidy, jak opisano wcześniej (patrz 4.2).
      7. Analizować obojętne lipidy polarne za pomocą 1D-TLC (patrz 4.1.3.2) i późniejszego obrazowania PSL.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aktywność specyficznej dla PC fosfolipazy C SMc00171 z fosforanem bis-p-nitrofenylu

Bezkomórkowe ekstrakty uzyskane z E. coli BL21(DE3) x pLysS, które miały wyrażony smc00171, zostały zbadane pod kątem ich zdolności do hydrolizy estrów fosforanu bis-p-nitrofenylu, przy użyciu spektrofotometrycznego testu enzymatycznego, mierzącego utworzony p-NP

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ciągu ostatnich 20 lat zsekwencjonowano genomy wielu organizmów i chociaż wygenerowano wiele danych dotyczących sekwencji genomu, interpretacja funkcjonalna pozostaje w tyle, co utrudnia nasze zrozumienie funkcji genomu. Funkcje genów w genomach są często przypisywane na podstawie podobieństwa do genów o znanej funkcji lub występowania konserwatywnych motywów. Jednak dokładna funkcja danego genu często nie jest znana. W szczególności przewidywane geny strukturalne enzymów nie mogą być łatwo zbadane za pomocą technik om...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez granty z Consejo Nacional de Ciencias y Tecnología-México (CONACyT-Mexico) (82614, 153998, 253549, and 178359 w Investigación Científica Básica oraz 118 w Investigación en Fronteras de la Ciencia) oraz z Dirección General de Asuntos de Personal Académico-Universidad Nacional Autónoma de México (DGAPA-UNAM; PAPIIT IN202616, IN203612).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ChloroformJT Baker9180-03Analiza TLC i Ekstrakcja lipidów
MetanolJT Baker9070-03TLC analiza i Ekstrakcja lipidów
Kwas octowyJT Baker9507-05Analiza TLC i Ekstrakcja
lipidów HeksanyJT Baker9309-02Analiza TLC i Ekstrakcja lipidów
Eter dietylowySigma32203Testy enzymatyczne
woda bidestylowana  WZELAKI&nbsp; NATesty enzymatyczne
Tris BaseSigmaT-1503Testy enzymatyczne
HClBaker9535-02Testy enzymatyczne
NaClBaker3624-01Testy enzymatyczne
Triton X-100SigmaX-100Testy enzymatyczne
Bulion LBDOWOLNABRAK DANYCHWzrost bakterii, 10 g tryptonu + 5 g ekstraktu drożdżowego + 10 g NaCl per litr wody bidestylowanej
tryptonBecton Dickinson and Company211705
Ekstrakt z drożdżyBecton Dickinson and Company212750Wzrost bakterii
TY bulionANYNAWzrost bakterii, 8 g tryptonu + 3 g ekstraktu drożdżowego + 66 mg CaCl2· 2H2O na litr wody destylowanej
CaCl2· 2H2OBaker1332-01Testy enzymatyczne
izopropylo-β-D-tiogalaktozyd (IPTG)Invitrogen15529-019Wzrost bakterii
DietanoloaminaSigmaD-8885Testy enzymatyczne
MnCl2Sigma221279Testy enzymatyczne
Fosfolipaza A2 wąż venomSigmaP0790Testy enzymatyczne
Fosfolipaza C Clostridium perfringensSigmaP7633Testy enzymatyczne
Bis-p-nitrofenylowy fosforanSigma07422AHTesty enzymatyczne
p-stearynian nitrofenyluSigmaN3627Testy enzymatyczne
p-dodekanian nitrofenyluSigma61716Testy enzymatyczne
p-dekanian nitrofenyluSigmaN0252Testy enzymatyczne
p-palmitynian nitrofenyluSigmaN2752Testy enzymatyczne
p-maślan nitrofenyluSigmaN9876Testy enzymatyczne
p-oktanian nitrofenyluSigma21742Testy enzymatyczne
Kwas octowy, sól sodowa [1-14C]Perkin ElmerNEC084Wzrost bakterii
dimetylosulfotlenek (DMSO)JT Baker9224-01Testy enzymatyczne
Żel krzemionkowy Aluminium HPTLC 60 płytek. Płytki HPTLC z żelem krzemionkowym o wymiarach 20 x 20 cm, 25 arkuszy.Merck105547Analiza TLC & Ekstrakcja lipidów
Spektrometr UV/VIS Lambda 35Perkin ElmerNATesty enzymatyczne
Storm 820 PhosphorimagerDynamika molekularnaNAFotostymulowalny skaner luminescencyjny 
Wielofunkcyjny licznik scyntylacyjnyBeckman CoulterNAKwantyfikacja radioaktywności
Francuska komórka ciśnieniowaThermoSpectronicNA Pękanie komórek
bibuła chromatograficzna 3MM ChrWhatman3030917analiza TLC
Sinorhizobium meliloti 1021naszeodniesienie 11badanych szczep
Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS Kompetentne komórkiNovagen69451szczep ekspresji białka
wektor pET9aWektor ekspresji białkaNovagen69431
pET17b wektorNovagen69663wektor ekspresji białka
sterylna probówka okrągłodenna z polistyrenu polistyrenowego (14 ml) FalconBecton Dickinson352057znakowanie radioizotopowe kultur bakteryjnych
polipropylenowe probówki wirówkowe (1,5 ml)Eppendorf30125.15Testy enzymatyczne
1,2-dipalmitoilo-sn-glicerolSigmaD9135wzorzec lipidowy
L-&alfa;-fosfatydylocholina, dipalmitoiloSigmaP6267wzorzec lipidowy
DL-&alfa;-monopalmitynaSigmaM1640wzorzec lipidowy
kwas palmitynowySigmaP0500wzorzec lipidowy
wzrostu bakterii

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nelson, D. L., Cox, M. M. Lehninger, Principles of Biochemistry. , W. H. Freeman and Company. New York. (2013).
  2. Jaeger, K. E., Eggert, T. Lipases for biotechnology. Curr. Opin. Biotechnol. 13 (4), 390-397 (2002).
  3. Dowhan, W., Bogdanov, M., Mileykovskaya, E. Functional roles of lipids in membranes. Biochemistry of Lipids, Lipoproteins and Membranes. , 5th, Elsevier. Amsterdam, The Netherlands. 1-37 (2008).
  4. Dowhan, W. Molecular basis for membrane phospholipid diversity: why are there so many lipids? Annu. Rev. Biochem. 66, 199-232 (1997).
  5. De Rudder, K. E. E., Thomas-Oates, J. E., Geiger, O. Rhizobium meliloti mutants deficient in phospholipid N-methyltransferase still contain phosphatidylcholine. J. Bacteriol. 179, 6921-6928 (1997).
  6. Geiger, O., Röhrs, V., Weissenmayer, B., Finan, T. M., Thomas-Oates, J. E. The regulator gene phoB mediates phosphate stress-controlled synthesis of the membrane lipid diacylglyceryl-N,N,N-trimethylhomoserine in Rhizobium (Sinorhizobium) meliloti. Mol. Microbiol. 32 (1), 63-73 (1999).
  7. Klug, R. M., Benning, C. Two enzymes of diacylglyceryl-O-4'-(N,N,N,-trimethyl)homoserine biosynthesis are encoded by btaA and btaB in the purple bacterium Rhodobacter sphaeroides. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98 (10), 5910-5915 (2001).
  8. Zavaleta-Pastor, M., et al. Sinorhizobium meliloti phospholipase C required for lipid remodeling duringphosphorus limitation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107 (1), 302-307 (2010).
  9. Pech-Canul, A., et al. FadD is required for utilization of endogenous fatty acids released from membrane lipids. J. Bacteriol. 193 (22), 6295-6304 (2011).
  10. Banerji, S., Flieger, A. Patatin-like proteins: a new family of lipolytic enzymes present in bacteria? Microbiology. 150 (Pt 3), 522-525 (2004).
  11. Sahonero-Canavesi, D. X., et al. Fatty acid-releasing activities in Sinorhizobium meliloti include unusual diacylglycerol lipase. Environ. Microbiol. 17 (9), 3391-3406 (2015).
  12. Fischer, M., Pleiss, J. The Lipase Engineering Database: a navigation and analysis tool for protein families. Nucl. Acid. Res. 31 (1), 319-321 (2003).
  13. Sigrist, C. J. A., et al. New and continuing developments at PROSITE. Nucleic Acids Res. 41 (Database issue), D344-D347 (2013).
  14. Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. J. Vis. Exp. (63), e3998(2012).
  15. Untergasser, A., et al. Primer3 - new capabilities and interfaces. Nucl. Acids Res. 40 (15), e115(2012).
  16. Studier, F. W., Rosenberg, A. H., Dunn, J. J., Dubendorff, J. W. Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes. Methods Enzymol. 185, 60-89 (1990).
  17. Miller, J. H. Experiments in Molecular Genetics. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Plainview, NY, USA. (1972).
  18. Desjardins, P., Hansen, J. B., Allen, M. Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer. J. Vis. Exp. (33), e1610(2009).
  19. Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method for total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37 (8), 911-917 (1959).
  20. Molecular Dynamics. Phosphorimager SI User´s Guide. , http://www.camd.lsu.edu/SAXS/Files/PIManual.pdf (1994).
  21. Dixon, M., Webb, E. Enzymes: Third Edition. , Longman, USA. (1979).
  22. Rudolph, A. E., et al. Expression, characterization, and mutagenesis of the Yersinia pestis murine toxin, a phospholipase D superfamily member. J. Biol. Chem. 274 (17), 11824-11831 (1999).
  23. Kato, S., Yoshimura, T., Hemmi, H., Moriyama, R. Biochemical analysis of a novel lipolytic enzyme YvdO from Bacillus subtilis. Biosci. Biotechnol. Biochem. 74 (4), 701-706 (2010).
  24. Peppelenbosch, M. P. Kinome profiling. Scientifica (Cairo). , Article ID 306798 (2012).
  25. Manafi, M., Kneifel, W., Bascomb, S. Fluorogenic and chromogenic substrates used in bacterial diagnostics. Microbiol. Rev. 55 (3), 335-348 (1991).
  26. Kuznetsova, E., et al. Enzyme genomics: Application of general enzymatic screens to discover new enzymes. FEMS Microbiol. Rev. 29 (2), 263-279 (2005).
  27. Scopes, R. K. Protein Purification, Principles and Practice. , Springer. New York. (2010).
  28. Geiger, O., Lopez-Lara, I. M., Sohlenkamp, C. Phosphatidylcholine biosynthesis and function in bacteria. Biochim. Biophys. Acta. 1831 (3), 503-513 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Lipase ActivityPhospholipase AssayEnzyme OptimizationSubstrate SpecificityChromogenic SubstratesThin Layer ChromatographyRadioactive LabelingPhosphatidylcholine DegradationDiacylglycerol LipaseSinorhizobium Meliloti

Related Articles