In vivo (in vivo) Badanie interakcji śródbłonka człowieka z perycytami za pomocą testu Matrix Gel Plug u myszy

Podsumowanie

Przedstawiamy protokół do badania interakcji między ludzkim śródbłonkiem a perycytami u myszy za pomocą wariantu testu angiogenezy z zatyczką żelową macierzy.

Streszczenie

Angiogeneza to proces, w którym nowe naczynia krwionośne są formowane z istniejących naczyń. Wzrost nowych naczyń wymaga skoordynowanej proliferacji, migracji i wyrównania komórek śródbłonka w celu utworzenia struktur rurkowych, a następnie rekrutacji perycytów w celu zapewnienia wsparcia ściennego i ułatwienia dojrzewania naczyń. Obecne metody hodowli komórkowych in vitro nie są w stanie w pełni odtworzyć złożonego środowiska biologicznego, w którym komórki śródbłonka i perycyty oddziałują na siebie, tworząc funkcjonalne naczynia. Przedstawiamy nowatorskie zastosowanie testu in vivo z zatyczką żelową macierzy do badania interakcji śródbłonka-perycytów i tworzenia funkcjonalnych naczyń krwionośnych przy użyciu myszy z ciężką złożoną mutacją niedoboru odporności (SCID). Krótko mówiąc, żel matrycowy miesza się z roztworem zawierającym komórki śródbłonka z perycytami lub bez, a następnie wstrzykuje się w plecy znieczulonych myszy SCID. Po 14 dniach zatyczki żelowe matrycy są usuwane, mocowane i cięte na sekcje do analizy histologicznej. Długość, liczba, wielkość i zakres pokrycia perycytami dojrzałych naczyń krwionośnych (zdefiniowany przez obecność czerwonych krwinek w świetle) można określić ilościowo i porównać między grupami eksperymentalnymi za pomocą komercyjnych platform statystycznych. Oprócz zastosowania jako test angiogenezy, ten test wkładu żelowego Matrix może być używany do prowadzenia badań genetycznych i jako platforma do odkrywania leków. Podsumowując, protokół ten pozwoli naukowcom uzupełnić dostępne testy in vitro do badania interakcji śródbłonka-perycytów i ich znaczenia dla angiogenezy układowej lub płucnej.

Wprowadzenie

Angiogeneza to proces, w którym nowe naczynia krwionośne są formowane z wcześniej istniejącej sieci naczyniowej¹ i jest przedmiotem ciągłych badań w wielu obszarach, od normalnego rozwoju po chorobę. Ten dynamiczny proces obejmuje proliferację i migrację komórek śródbłonka (EC) oraz rekrutację perycytów w celu skonstruowania cewy naczyniowej, która jest skierowana w stronę miejsca, które potrzebuje dostarczania tlenu i składników odżywczych². Zbadanie tego procesu wymaga równie dynamicznego testu, a przede wszystkim takiego, który może podsumować trójwymiarową naturę powstawania rurek. Testy matrycowe 3D in vitro zostały opracowane w celu zaspokojenia tej potrzeby i sprawdziły się, umożliwiając naukowcom zdefiniowanie dyskretnych etapów w przestrzeni i czasie, w których zachodzi angiogeneza ^3,4,5,6. Jednak te modele matrycowe 3D in vitro są ograniczone do badania nieperfundowanych naczyń krwionośnych i dlatego brakuje im krytycznych składników związanych z procesem angiogenezy (np. krążących czynników wzrostu i hamujących, nienaturalnych napięć/sił w łożysku naczyniowym) i nie symulują złożonego środowiska obecnego w żywej tkance. Aby rozwiązać to ograniczenie, opracowano kilka testów angiogenezy in vivo ⁷, w tym test czopa żelowego Matrix, który będzie przedmiotem naszego raportu ^8,9.

Test zatyczek żelowych w macierzy jest dobrze znanym testem angiogenezy in vivo, który przemawia do badaczy, ponieważ stanowi solidną platformę do testowania ról różnych komórek i substancji w angiogenezie. Żel Matrix jest dostępnym na rynku roztworem błony podstawnej, który jest wydzielany przez linię komórkową mięsaka myszy Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), która krzepnie w żel w temperaturze 37 °C. Żel macierzowy można mieszać z komórkami i/lub substancjami, takimi jak czynniki wzrostu, i wstrzykiwać podskórnie myszy. EC gospodarza zaatakują czop w ciągu 14 dni, utworzą sieć naczyniową i ulegną perfuzji z krwią gospodarza. Do tej pory testy czopów żelowych macierzy koncentrowały się wyłącznie na badaniu zachowania komórek śródbłonka podczas angiogenezy, jednak zgodnie z naszą najlepszą wiedzą nie podjęto jeszcze żadnych wysiłków, aby ustalić, czy test ten można wykorzystać do wspólnej hodowli komórek śródbłonka i perycytów w celu zbadania, jak te dwa typy komórek oddziałują podczas angiogenezy. W szczególności zrozumienie związku między EC a perycytami jest cenne dla badania chorób, w których utrata naczyń krwionośnych jest patologiczna, w tym niedokrwienia mikronaczyniowego i choroby naczyń obwodowych 10,11,12.

Tutaj opisujemy protokół, który wprowadza perycyty pochodzące z człowieka do mieszaniny żelu macierzowego wraz z ludzkimi EC i czynnikiem wzrostu fibroblastów (bFGF). Mieszanina ta może być następnie wstrzykiwana podskórnie w grzbiet myszy z SCID, aby umożliwić utworzenie w pełni funkcjonalnych, pokrytych perycytami, naczyń hybrydowych. Nasz protokół opisuje, jak przygotować wtyczki żelowe zawierające ludzkie EC z ludzkimi perycytami lub bez, umieszczać je u myszy SCID i jak analizować skrawki histologiczne pod kątem krytycznych punktów końcowych angiogenezy.

Protokół

Oświadczenie etyczne: Procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt w Stanford University School of Medicine.

UWAGA: Zwierzęta są znieczulone 3% izofluranem parownika i 3% zapasem gazu_O2. Stosowanie maści weterynaryjnej na oczy może pomóc w zapobieganiu wysuszeniu podczas znieczulenia.

1. Przygotowanie komórek

1. Hodować hodowle ludzkich komórek śródbłonka i perycytów na płytkach o średnicy 100 mm z 10 ml odpowiedniej pożywki. Wymieniaj 10 ml świeżej pożywki co 2-3 dni, aż komórki osiągną 80% zbieżności.
   1. Hodowla komórek śródbłonka (ECs) w kompletnych pożywkach z komórek śródbłonka (ECM) uzupełniona dostarczonymi przez firmę 5% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 10% penicyliną/streptomycyną i 10% suplementem wzrostu komórek śródbłonka.
   2. Hodowla perycytów w kompletnych pożywkach perycytycznych (PM) uzupełniona dostarczonym przez firmę 2% FBS, 10% penicyliną/streptomycyną i 10% suplementem wzrostu perycytów.
2. Przygotuj mieszaniny komórek
   1. Oblicz wymaganą liczbę komórek dla grupy doświadczalnej i kontrolnej.
      UWAGA: Każda wtyczka w grupie eksperymentalnej zawiera milion (1 x 10⁶) ludzkich EC i dwieście tysięcy (2 x 10⁵) perycytów. W grupie kontrolnej każda wtyczka zawiera tylko 1,2 miliona ludzkich EC. Grupa kontroli ujemnej ma tylko żel matrycowy. Każda grupa powinna zawierać co najmniej cztery zatyczki, co wymagałoby dwóch myszy, ponieważ zatyczki można wstrzyknąć z każdej strony dolnej części pleców myszy. Trzy zatyczki służyłyby jako potrójne zatyczki do eksperymentu, a czwarta mogłaby być użyta w przypadku, gdyby jedna z nich się nie powiedziała. Przygotuj 25% dodatkowych komórek, aby dopasować dodatkową objętość żelu.
   2. Zbierz i policz komórki z płytek hodowlanych.
      1. Aby odłączyć komórki, usuń pożywkę i przemyj raz 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanem (PBS) o temperaturze pokojowej. Usunąć PBS, dodać 1 ml 0,25% trypsyny/2,21 mM EDTA i inkubować przez 1 minutę. Zmyć komórki z płytki, dodając 2 ml pożywki i zebrać do probówki o pojemności 15 ml.
      2. Policz komórkę za pomocą hemocytometru zgodnie z instrukcjami producenta.
      3. Odwirować odpowiednią liczbę komórek w postaci osadu o masie 400 x g przez 5 minut. W przypadku grupy eksperymentalnej odwiruj zarówno EC, jak i perycyty razem w jednym osadzie.

2. Przygotowanie żelu Matrix

1. Całkowicie rozmrozić żel matrycowy w temperaturze 4 °C przez 4 godziny lub przez noc, aby uzyskać jednorodny roztwór. Nie jest wymagane mieszanie.
2. Podwielokrotność żelu matrycowego w probówkach o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze 4 °C.
3. Sterylne probówki o pojemności 1,5 ml i strzykawki insulinowe 28 G 1 ml należy schłodzić w temperaturze 4 °C. Uwaga: Żel matrycowy należy zawsze przechowywać na lodzie.
4. Zmieszać zimny żel matrycowy z bFGF w stosunku objętościowym 1:100 (końcowe stężenie bFGF = 0,5 μg/ml; roztwór podstawowy bFGF = 50 μg/ml) Po wymieszaniu roztworu żelu matrycowego przez kilkakrotne pipetowanie w górę i w dół, inkubować na lodzie przez 30 - 60 minut przed zmieszaniem z komórkami w kroku 3.1.
   UWAGA: Rozmrozić bulion bFGF przed wymieszaniem. Oblicz liczbę zatyczek potrzebnych do wtrysku. Na przykład każda wtyczka wymaga 200 μl żelu matrycowego. Dlatego przygotuj 25% dodatkowego żelu.

3. Wymieszaj żel Matrix z komórkami

1. Dla każdej grupy ponownie zawiesić osad komórkowy (zawierający odpowiednią liczbę komórek) z obliczoną objętością żelu matrycowego zawierającego bFGF. Delikatnie wymieszaj, aby uniknąć pienienia się i pozostaw w tubce o pojemności 15 ml na lodzie, aż myszy będą przygotowane do wstrzyknięcia.

4. Przygotowanie myszy

1. Znieczulij 1 myszy SCID przez 5 minut w 3% izofluranu plus 3%_O2 w komorze indukcyjnej. Skoncentruj się na jednej grupie eksperymentalnej lub 2 myszach na raz.
2. Wyjmij mysz z komory indukcyjnej, umieść ją na poduszce grzewczej brzuszną stroną do dołu i szybko przymocuj dyszę pyska do pyska myszy za pomocą systemu bez ponownego oddychania, aby zapewnić znieczulenie przez cały czas trwania procedury wstrzykiwania. Przełącz przepływ gazu z komory indukcyjnej na system bez ponownego oddychania i obniż ciśnienie gazu do 1,5% izofluranu i 1,5%_O2.
3. Usuń włosy z obu bocznych tylnych obszarów (około 1 cm średnicy) za pomocą golarki lub kremu do depilacji.
4. Przetrzyj obszar skóry wacikiem nasączonym 70% alkoholem.
5. Umieść mysz z powrotem w komorze indukcyjnej i powtórz kroki 4.2 - 4.4 z drugą myszą.

5. Wstrzyknięcie żelu Matrix

1. Przygotować jedną mysz do wstrzyknięcia, podłączając ją do systemu bez oddychania i kładąc na poduszce grzewczej brzusznie do dołu.
2. Załaduj żel matrycowy do wstępnie schłodzonej strzykawki insulinowej 28 G i pojemności 1 cm3, po jednej myszy na raz.
   1. Do strzykawki załadować pełną objętość 500 μl żelu matrycowego na dwie zatyczki (200 μl na wtyczkę plus 25% dodatkowo) do strzykawki.
   2. Należy upewnić się, że wstrzyknąłeś żel macierzowy myszom w ciągu 3 minut od włożenia komórek do strzykawki, aby zapobiec osiadaniu komórek na boku strzykawki i zastygnięciu żelu matrycowego wewnątrz strzykawki.
3. Unieś skórę pleców, aby zlokalizować przestrzeń podskórną, a następnie powoli i równomiernie wstrzyknij 200 μl żelu macierzowego w przestrzeń podskórną tylnej części klatki piersiowej.
4. Powoli wyjmować igłę do wstrzykiwań, uważając, aby żel matrycowy nie wyciekł z miejsca wstrzyknięcia. W miejscu wstrzyknięcia utworzy się guzek. Przetrzeć miejsce wstrzyknięcia wacikiem nasączonym alkoholem.
5. Powtórz kroki wstrzykiwania 5,2 - 5,5 po drugiej stronie grzbietu myszy, a następnie pozostaw mysz na plecach na 1 minutę, aby umożliwić żelowanie żelu matrycowego na poduszce grzewczej.
6. Obrysuj oba guzki za pomocą trwałego markera, aby zidentyfikować guzek po 14 dniach. Po odrośnięciu niektórych włosów łatwiej będzie znaleźć guzek.

6. Izolacja zatyczki żelowej Matrix: 14 dni po wstrzyknięciu

1. Poddaj myszy eutanazji w sposób humanitarny, wystawiając zwierzęta na >5 minuty wdychania dwutlenku węgla, a następnie zwichnięcie szyjki macicy, aby zapewnić śmierć.
2. Wyjmij zatyczkę żelową matrycy z tyłu myszy.
   1. Delikatnie usunąć odrastające włosy wokół miejsca wstrzyknięcia, w którym znajduje się zatyczka, powtarzając krok 4.3. Linia znacznika wskazuje rozmiar oryginalnego guzka pod skórą.
   2. Wytnij zatyczkę wraz z otaczającą ją skórą i warstwami mięśni przyczepionymi odpowiednio na górnej i dolnej stronie zatyczki.
      1. Za pomocą cienkich nożyczek chirurgicznych wykonaj nacięcie na zaznaczonej granicy zatyczki, która jest prostopadła do skóry i przeciąć mięsień pod zatyczką. Następnie ostrożnie przeciąć wokół obwodu wtyczki wzdłuż zaznaczonej granicy.
      2. Wyjmij zatyczkę, trzymając ją wciśniętą między warstwę skóry i mięśni. Natychmiast spłukać w małej zlewce z 1x PBS, aby zmyć nadmiar krwi. Wtyczka jest teraz gotowa do zamocowania (następny krok, 6.3).
3. Zamocuj korek w 4% paraformaldehydzie.
   1. Umieść całą zatyczkę, łącznie ze skórą i warstwami mięśniowymi, w probówce o pojemności 50 ml z 25 ml 4% paraformaldehydu na 24 godziny w temperaturze pokojowej bez kołysania. Następnego dnia przenieś zatyczkę do 25 ml 70% etanolu na kolejne 24 godziny przed zatopieniem w parafinie.
      UWAGA: Z paraformaldehydem należy obchodzić się ostrożnie. Nosić rękawice.

7. Proces parafinowy w zatyczce żelowej Matrix

1. Przygotuj zatyczkę do zatapiania parafiny.
   1. Ustaw zatyczkę tak, jak pokazano na rysunku 1a; umieść zatyczkę w kasecie na chusteczki tak, aby strona zatyczki była skierowana do góry, a zarówno warstwa skóry, jak i mięśni były widoczne na powierzchni bloku tkanki, który zostanie przecięty jako pierwszy podczas cięcia.
2. Parafina zatapia korek zgodnie ze standardowymi protokołami zatapiania parafiny¹³.
3. Wyciąć skrawki o grubości 8 - 10 μm z bloku tkanki i zamontować na szkiełkach mikroskopowych zgodnie ze standardowymi protokołami cięcia parafiny¹³.
4. Przechowuj szkiełka w chłodnym, suchym miejscu w temperaturze pokojowej, aż będą gotowe do barwienia.

8. Plamy z barwnikiem Hematoxylin i Eozyny (H&E)¹³

1. Odparafinować skrawki tkanki, przepuszczając szkiełka przez 100% ksylenu dwukrotnie, 100% etanolu, 95% etanolu, 70% etanolu i na koniec 1x PBS, każdy przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Pozostaw slajdy w 1x PBS do następnego kroku.
2. Pobrać pipetą 100 μl roztworu H&E na wycinek i inkubować przez 1 - 5 minut lub do momentu, gdy pojawi się wyraźny kontrast między niebieskimi jądrami a różową cytoplazmą w komórce, oglądany pod pionowym mikroskopem świetlnym przy 10-krotnym powiększeniu. Uważaj, aby żadne rozwiązanie BHP nie dotknęło obiektywu.
3. Zmyć roztwór H&E ze szkiełka, zanurzając szkiełko w dużej zlewce z wodą z kranu, a następnie umieścić szkiełko w stojaku w zlewce i spłukiwać pod bieżącą wodą przez 2 minuty.
4. Przejdź do kroku 9.8, aby zamontować prowadnice.

9. Barwienie innych preparatów do ludzkich naczyń włosowatych i perycytów

1. Odparafinować skrawki tkanki, przepuszczając szkiełka przez 100% ksylenu dwukrotnie, 100% etanolu, 95% etanolu, 70% etanolu i na koniec 1x PBS, każdy przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Pozostaw slajdy w 1x PBS do następnego kroku.
2. Zagotuj skrawki w roztworze do pobierania antygenu.
   1. W zlewce o pojemności 2 l przygotować wrzący roztwór do pobierania antygenu, używając 1x buforu cytrynianowego (pH 7,0) w temperaturze 95 °C na bloku grzewczym.
   2. Po ugotowaniu umieść szkiełka w metalowym stojaku i zanurz je we wrzącym roztworze antygenu na 20 minut.
   3. Ostrożnie wyjmij zlewkę z bloku grzewczego z szkiełkami nadal zanurzonymi i pozwól, aby roztwór powoli powrócił do temperatury pokojowej przez około 30 minut.
   4. Umieść szkiełka w 1x PBS do następnego kroku.
3. Zablokuj sekcje w buforze blokującym (1x PBS, 5% Kozia Surowica, 0,3% Triton X-100).
   1. Narysuj hydrofobowy okrąg wokół krawędzi każdej sekcji za pomocą pisaka PAP.
   2. Umieść szkiełka w tacce na wilgoć z wodą destylowaną na dnie tacy.
   3. Odpipetować 100 μl buforu blokującego na skrawki, upewniając się, że cała tkanka jest pokryta płynem (może wymagać więcej niż 100 μl).
   4. Inkubować sekcje z buforem blokującym przez 1 godzinę.
4. Inkubować skrawki z przeciwciałem pierwotnym.
   1. Przygotuj jeden roztwór z dwoma przeciwciałami pierwszorzędowymi, aby zbadać każdą sekcję pod kątem CD31 (EC) i aktyny mięśni gładkich (perycyty) rozcieńczonych w buforze rozcieńczającym (1x PBS, 1% BSA, 0,3% Triton X-100).
      UWAGA: Tutaj stężenie anty-CD31 wynosi 1:50, a stężenie aktyny przeciwko mięśniom gładkim wynosi 1:300.
   2. Inkubować skrawki przez noc w temperaturze 4 °C ze 100 μl przeciwciał pierwszorzędowych na tacy nawilżającej zawierającej wodę destylowaną.
5. Umyj szkiełka trzy razy w 1x PBST (1x PBS + 0,1% Tween20) przez 5 minut każde mycie.
6. Inkubować skrawki z przeciwciałem drugorzędowym.
   1. Przygotować roztwór z sprzężonym z fluoroforem kozim przeciwciałem drugorzędowym przeciwko królikowi w celu rozpoznania przeciwciała królika anty-CD31 rozcieńczonego w buforze rozcieńczającym.
      1. UWAGA: Przeciwciało pierwszorzędowe aktyny mięśni gładkich jest już sprzężone z fluoroforem CY3, więc nie jest potrzebne barwienie przeciwciałami wtórnymi. Stężenie przeciwciał drugorzędowych przeciwko królikowi wynosi 1:250.
   2. Inkubować skrawki przez 1 godzinę ze 100 μl przeciwciała drugorzędowego na tacy nawilżającej zawierającej wodę destylowaną.
7. Umyj szkiełka trzy razy w 1x PBST przez 5 minut każde mycie.
8. Zamontuj zjeżdżalnie.
   1. Odpipetować 2 - 3 krople (~ 40 - 60 μl) roztworu montażowego zapobiegającego blaknięciu z barwieniem jądrowym DAPI na każdą sekcję.
   2. Delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe nr 1.5 na sekcjach i roztworze montażowym, pozwalając płynowi rozprowadzić się po sekcjach i na krawędziach szkiełka nakrywkowego. Delikatnie palcem wyciśnij pęcherzyki powietrza, które mogą znajdować się nad sekcją.
   3. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na co najmniej 1 godzinę przed użyciem.

10. Ilościowe określenie gęstości i struktury kapilar¹⁴

1. Policz liczbę naczyń włosowatych w skrawkach wybarwionych H&E, wyrażoną jako #/mm².
   1. Zrób zdjęcia czterech różnych pól na pionowym mikroskopie świetlnym pod 40-krotnym powiększeniem.
      UWAGA: Naczynia włosowate są identyfikowane jako probówki wypełnione czerwonymi krwinkami.
   2. Alternatywnie, zamiast ręcznie liczyć naczynia włosowate, należy użyć oprogramowania do analizy obrazu (np. Wimasis Image Analysis) do ilościowego określenia różnych parametrów angiogenezy, takich jak liczba naczyń krwionośnych, średnia długość i średnica naczynia oraz punkty rozgałęzień.
2. Analiza struktury kapilarnej w skrawkach barwionych immunofluorescencyjnie.
   1. Uzyskaj zdjęcia czterech różnych pól na odwróconym mikroskopie fluorescencyjnym z FITC i kostką filtra TxRed.
      1. Użyj kostki FITC do obrazowania EC przez wzbudzenie przy długości fali 488 nm i użyj kostki TxRed do obrazowania perycytów przez wzbudzenie przy długości fali 594 nm.

Wyniki

Reprezentatywne barwienia H&E oraz immunofluorescencyjne przekrojów wtyczek z żelu macierzyowego przedstawiono na Rysunku 2. Przekroje wtyczek zawierających wyłącznie EC wykazują obecność niektórych naczyń, które w większości nie są ukrwione (Rysunek 2 góra po lewej, czarne strzałki), natomiast wtyczki zawierające zarówno EC, jak i perycyty wykazują kilka ukrwionych naczyń o większych średnicach i pełnym pokryciu perycytami, o czym świadczy pozyty...

Dyskusja

Test zatyczek żelowych Matrix okazał się wygodną i skuteczną metodą oceny regulacji genów w angiogenezie, związkach angiogennych i antyangiogennych in vivo oraz w celu uzupełnienia testów in vitro . W tym miejscu szczegółowo opisujemy nowatorski test czopa żelowego macierzy ludzkiej angiogenezy, który bada interakcję między komórkami śródbłonka a perycytami podczas tworzenia naczyń.

W tym protokole jest kilka nowatorskich i krytycznych kroków. Preferowane są komórki o niskim ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami)	Corning	21-031-CV
0,25% trypsyny/0,53 mM EDTA	Zestaw
pożywek dla komórek śródbłonka (ECM)	Sciencell	1001	zawiera pożywkę, suplement wzrostu EC oraz penicylinę/streptomycynę, z których każdy jest dostarczany w odpowiedniej objętości dla łatwego mieszania
Zestaw pożywki perycytowej (PM)	Sciencell	1201	obejmuje pożywkę, suplement wzrostu Pericyte oraz penicylinę/streptomycynę, z których każdy jest dostarczany w odpowiedniej objętości w celu łatwego mieszania
pierwotnych ludzkich komórek śródbłonka mikronaczyniowego płuc	Przełomowa inicjatywa		ten typ komórek jest również dostępny na rynku. Komórki używane w pasażu 1-4
pierwotne ludzkie perycyty płucne	Przełomowa inicjatywa		ten typ komórek nie jest dostępny na rynku, ale paricyty mózgu są.  Komórki używane przy pasażowaniu 1-4
bFGF (podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów)	Peprotech	100-18B	roztwór podstawowy wynosi 50 μ g/ml w 0,1% BSA w PBS, podwielokrotności przy 50 μ l i przechowywane w temperaturze -20 stopni
Matrigel Basement Membrane Matrix	BD	356237
28 G 1 cc Insluin Syringe	BD	329410
SCID (Ciężki Złożony Niedobór Odporności) myszy	The Jackson Laboratory	5557	NOD. Szczep SCID IL2R gamma knockout jest najlepszym szczepem; 4-6 tygodni życia
1,5 ml probówki do mikrowirówek, sterylne	Thermo Fisher Scientific	05-408-129
15 ml zakręcane probówki, sterylne	BD Biosciences	352096
Długopis PAP	Hemocytometr Life Technologies	8899
	ThermoFisher Scientific	02-671-6
Krem do depilacji Nair	Walmart
anty-ludzkie przeciwciało pierwotne CD31	LifeSpan Biosciences	LS-B4737	to 1:50
anty-ludzkie przeciwciało fluorescencyjne aktyny mięśni gładkich CY3 roztwór	Sigma	C6198	to 1:300
kozie przeciwciało wtórne przeciwko królikowi; 488/zielony	ThermoFisher Scientific	A-11008	to 1:250
Roztwór DAPI Prolong Gold	Komórka Szkiełka mikroskopowe sygnalizacyjne	8961S
VWR	48300-047
nr 1.5 szkiełka nakrywkowe	Thermo Fisher Scientific	12-544-D
bardzo cienkie nożyczki chirurgiczne
		245-685
Kasety na tkanki	Simport	M492-12
surowica kozia	Dako	X0907