Zastosowanie nieprzepuszczalnych barier w połączeniu z kulkami nasączonymi czynnikiem kandydującym do badania sygnałów indukcyjnych w pisklątku

Podsumowanie

Opisane są protokoły wykorzystujące nieprzepuszczalne bariery do blokowania zdarzeń indukcyjnych między tkankami głównej osi ciała a bokiem zarodka pisklęcia, wymagane do tworzenia kończyn. Koraliki nasączone potencjalnymi sygnałami indukcyjnymi są wykorzystywane do przezwyciężenia efektu umieszczania bariery, a analiza ekspresji genów to potwierdza.

Streszczenie

Zarodek pisklęcia stanowi doskonały model kręgowca, który może być wykorzystany do bezpośredniego analizowania zagadnień rozwojowych. Jego dostępność i wytrzymałość po interwencji chirurgicznej to kluczowe atuty eksperymentalne. Płytki mikowe były pierwszymi barierami stosowanymi w celu zapobiegania inicjacji pąków kończyn piskląt¹. Opisano protokoły, które wykorzystują folię aluminiową jako nieprzepuszczalną barierę dla indukcji i/lub inicjacji zawiązków skrzydeł lub nóg. Łączymy tę technikę z umieszczaniem koralików bocznie do bariery, aby egzogennie dostarczyć kandydujące czynniki endogenne, które zostały zablokowane przez barierę. Wyniki są analizowane przy użyciu hybrydyzacji in situ późniejszej ekspresji genów. Koncentrujemy się głównie na roli sygnalizacji kwasu retinowego w indukcji, a następnie inicjacji zarodka pisklęcia kończyny przedniej i tylnej. Używamy namoczonych kulek BMS 493 (odwrotny agonista receptorów kwasu retinowego (RAR)) wszczepionych w mezodermę płytki bocznej (LPM), aby naśladować efekt bariery umieszczonej między somitami (źródło kwasu retinowego (RA)) a LPM, z którego wyrastają pąki kończyn. Zmodyfikowane wersje tych protokołów mogą być również wykorzystane do odpowiedzi na inne pytania dotyczące pochodzenia i czasu sygnałów indukcyjnych. Zakładając, że obszar zarodka pisklęcia jest dostępny na odpowiednim etapie rozwoju, można umieścić barierę między dwiema tkankami i w konsekwencji badać zmiany w rozwoju. Przykłady można znaleźć w rozwijającym się mózgu, wydłużeniu osi oraz w rozwoju narządów, takich jak indukcja wątroby lub nerek.

Wprowadzenie

Klasyczni embriolodzy tradycyjnie stosowali techniki fizyczne do badania mechanizmów kontrolujących rozwój embrionalny. W latach sześćdziesiątych i siedemdziesiątych XX wieku badacze opracowali techniki, które wykorzystywały nieprzepuszczalne bariery umieszczone między tkankami rozwijającego się zarodka, aby zademonstrować znaczenie sygnałów indukcyjnych podczas embriogenezy. Interesuje nas rozwój kończyn kręgowców, a w szczególności to, jakie wydarzenia poprzedzają wyrastanie pąków kończyn. Na przykład wprowadzenie bariery może zapobiec wyrastaniu pąków kończyn po jednej stronie zarodka pisklęcia, umożliwiając jednocześnie normalny przebieg po przeciwnej, nieoperowanej stronie. Materiały użyte do wykonania tych barier były różne; Na przykład płytki mikowe ¹ i folia tantalowa ². Bariery te skutecznie oddzielają mezodermę płytki bocznej (LPM), z której tworzy się pączek kończyny, od somitów powstałych z mezodermy przyosiowej. Techniki przeszczepu chirurgicznego pokazują, że ścisły związek z somitami jest niezbędny, jeśli inicjacja zawiązków kończyn ma nastąpić w LPM ³⁴. W latach 80. i 90. biolodzy rozwojowi odkryli dyfuzyjne cząsteczki sygnałowe, które są niezbędne do kontrolowania procesów rozwojowych. Koraliki nasączone tymi cząsteczkami sygnałowymi mogą być zagnieżdżane w określonych obszarach zarodka i powodować zmiany w rozwoju embrionalnym. Na przykład kwas retinowy (RA) pobierany przez kulki jonowymienne jest uwalniany w ciągu 24 godzin po wszczepieniu do zarodka pisklęcia i może powodować lustrzane odbicie cyfr ⁵. Akrylowe kulki heparyny zawierające białko FGF mogą inicjować wyrastanie pąków kończyn z międzykończynowego LPM ⁶.

Ostatnio genetyka myszy i ryb przeniosła badania nad inicjacją kończyn kręgowców w nową erę (przejrzane w ⁷). Istnieją dobre dowody na to, że RZS obecne w somitach przed inicjacją pąków kończyn jest niezbędnym sygnałem dyfuzyjnym wymaganym przez LPM do zainicjowania pączkowania kończyn. Chcieliśmy wykorzystać dostępność i solidność eksperymentalną zarodka pisklęcia, aby przeanalizować wpływ implantacji bariery na ekspresję genów w LPM w czasie inicjacji zawiązków kończyn. Nowatorską adaptacją naszej metody jest połączenie bariery, która blokuje sygnały z tkanek osiowych, z umieszczeniem koralików bocznie do bariery, aby egzogennie dostarczyć kandydujące czynniki endogenne, które zostały zablokowane przez barierę. Poniższe protokoły są tymi, które zostały opracowane w celu poznania mechanizmów indukcji i inicjacji zawiązków kończyn.

Badanie inicjacji zawiązków kończyn oznacza wykorzystanie zarodków we wczesnym stadium. Wielu badaczy bada jaja kurze, usuwając najpierw część albuminy przez worek powietrzny za pomocą igły podskórnej. Zarodek, który leży na żółtku, będzie następnie leżał niżej w jaju. Jest to zaleta niektórych technik, takich jak elektroporacja, ale może być wadą, jeśli pożądana jest chirurgiczna manipulacja zarodkiem. Uważamy, że posiadanie zarodka jak najbliżej otworu w jaju jest zaletą.

Pozostają pytania dotyczące sygnałów, które kontrolują indukcję i inicjację zawiązków kończyn kręgowców, a następujące protokoły są odpowiednie, aby je rozwiązać. Jako pierwsi opracowaliśmy protokół wprowadzania barier zapobiegających wyrastaniu pąków kończyn piskląt na etapie wcześniejszym niż stadium 12 ⁸. Zmodyfikowane wersje tych protokołów mogą być również wykorzystane do odpowiedzi na inne pytania dotyczące pochodzenia i czasu sygnałów indukcyjnych, w których dostępna tkanka indukująca leży w sąsiedztwie indukowanego zawiązka. Zakładając, że obszar zarodka jest dostępny na odpowiednim etapie rozwoju, można umieścić barierę między dwiema tkankami i w konsekwencji badać zmiany w rozwoju. Przykłady można znaleźć w rozwoju mózgu, rozszerzeniu osi i ewentualnie rozwoju narządów, takich jak indukcja wątroby lub nerek.

Protokół

Poniższy protokół wykorzystuje zarodki kurze w czasie krótszym niż dziesięć dni inkubacji. Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi King's College London w Wielkiej Brytanii i brytyjskiego Ministerstwa Spraw Wewnętrznych dotyczącymi opieki nad zwierzętami.

1. Przygotowanie wymagane przed operacją zarodka piskląt

1. Zbierz następujące narzędzia chirurgiczne potrzebne do operacji, do pobierania i utrwalania zarodków piskląt: dwie pary kleszczy zegarmistrzowskich nr 5, jedną parę mocnych kleszczy, np. typu AA, zakrzywione nożyczki z ostrzami o długości 2,5 cm, kleszcze zakrzywione z końcem o długości około 0,5 cm, a także dwie pary kleszczy zegarmistrzowskich nr 4 do użycia przy wykonywaniu barier foliowych (1.6.3).
2. Zrób mikronóż ze stalowego kołka (o średnicy 0,3 mm) naostrzonego olejem na kamieniu do ostrzenia. Za pomocą mikroskopu dwuokularowego naostrz końcówkę szpilki do płaskiego ostrza. Umieść szpilkę w uchwycie na igłę i chroń jej ostry koniec przed uderzeniem i wgnieceniem.
   UWAGA: Schowanie noża z końcówką do pipety o pojemności 1 000 μl jest do tego prostą opcją.
3. Przygotuj 70% etanolu w plastikowej butelce do mycia. Użyj spryskania tego na papierowej chusteczce, aby wytrzeć narzędzia chirurgiczne i mikronóż przed i po użyciu, aby je wysterylizować i wyczyścić.
4. Kup przezroczystą taśmę klejącą o szerokości 5 cm i odpowiedni dyspenser. Znajdź lub wyprodukuj podpórkę odpowiednią do stabilnego trzymania jaja kurzego na boku.
5. Twórz i przechowuj roztwory do namaczania koralików.
   1. Przygotować roztwór 0,35 mg/ml białka czynnika wzrostu fibroblastów 4 (FGF4) z 1 mg/ml zamrożonego bulionu, rozcieńczając go wodą i przechowywać w temperaturze -20 °C w 30 μl podwielokrotności.
   2. Przygotować roztwory (0,05 lub 0,1 mg/ml) kwasu all-trans-retinowego (RA) rozcieńczonego dimetylosulfotlenkiem (DMSO) w ciemnych probówkach do mikrowirówek z zapasu o stężeniu 5 mg/ml. Przechowywać zapas i 100 μl porcji w temperaturze -20 °C.
   3. Przygotować roztwory (2,5 lub 5 mg/ml) BMS 493 (odwrotnego agonisty NAR) rozcieńczone DMSO w ciemnych probówkach do mikrowirówek z zapasu 10 mg/ml. Przechowywać zapas i 100 μl porcji w temperaturze -20 °C.
6. Wykonaj bariery z folii aluminiowej.
   UWAGA: Folia użyta do wykonania barierek to standardowa folia gastronomiczna (mierzona mikrometrem jako grubość 0,013 mm). Każda domowa folia aluminiowa byłaby prawdopodobnie odpowiednia.
   1. Wytnij kwadratowy kawałek folii aluminiowej o średnicy 1 cm i wysterylizuj go, przecierając go 70% etanolem na chusteczce. Umieść go na sterylnej plastikowej szalce Petriego o średnicy 6 cm. Wyrzuć pokrywkę i zrób pokrywkę na naczynie z folii.
      UWAGA: Zapobiegnie to późniejszemu przywieraniu barier tnących do plastikowej pokrywy naczynia z powodu ładunków elektrostatycznych.
   2. Umieść szalkę Petriego na siatce stolika (o długości 1 cm podzielonej na 100 sekcji) pod mikroskopem dwuokularowym z powiększeniem ustawionym na 1,6x. Za pomocą małego skalpela z ostrzem nr 15 przytnij paski folii na dokładną szerokość, np. 0,7 mm lub 1,3 mm.
   3. Oddziel paski folii za pomocą dwóch par kleszczy zegarmistrzowskich nr 4. Następnie wykonaj zagięcie pod kątem prostym na środku bariery foliowej tak, aby przypominało zawias o określonej szerokości.
      UWAGA: Ten kształt bariery jest zaczerpnięty z ^{9, 10}. Bariera na zawiasach utrzymuje się na swoim miejscu lepiej niż prosta, płaska bariera. Kleszcze nr 4 są stosunkowo i są używane, ponieważ są mniej podatne na wgniecenia lub nacięcia w barierach foliowych.
   4. Ustaw barierki na środku szalki Petriego tak, aby jedna strona przylegała płasko do naczynia, a druga była skierowana do góry poza szalkę, przesuwając pozostałą niepociętą folię na jedną stronę. Przygotuj 20 lub więcej barier przed dniem operacji. Umieść foliową pokrywkę na naczyniu i przechowuj barierki w miejscu, w którym nie będą przeszkadzać.
      UWAGA: Nawet lekkie uderzenie może przewrócić barierki lub oznaczać, że przyklejają się one elektryzując się do boków naczynia.
7. Zapłodnione jaja kurze należy inkubować na bokach na tekturowych tackach na jajka w temperaturze 38 °C przez odpowiedni czas przed dniem operacji, tak aby zarodki osiągnęły pożądany etap ⁸.

2. Przygotowanie zarodków i koralików piskląt w dniu operacji

1. Jaja kurze inkubowane w oknie
   UWAGA: Poniższa metoda otwierania jaj została przekazana przez Dennisa Summerbella (nieopublikowana).
   1. Gdy jajo leży na boku, przebij koniec (koniec worka powietrznego) jajka mocnymi kleszczami typu AA, upewniając się, że wewnętrzna błona skorupy została przerwana. Aby to zrobić, chwyć mocno kleszcze i użyj kontrolowanego ruchu kłującego, trzymając jajko wolną ręką.
   2. Weź jajko, nadal leżące na boku, w obie ręce (po jednej z każdej strony), obróć je o 180° wzdłuż osi poziomej i umieść je w tacy na jajka tak, aby strona, która była najwyższa, znajdowała się teraz obok tacy.
      UWAGA: Powoduje to rozluźnienie zarodka z błon skorupy i oznacza, że zarodek jest mniej podatny na przecięcie, gdy skorupa nad zarodkiem zostanie usunięta.
   3. Weź kawałek przezroczystej taśmy o powierzchni około 5 cm kwadratowych i przyklej go ściśle do najwyższej powierzchni jaja, aby zapobiec rozpadaniu się skorupki jajka na zarodek po otwarciu jaja.
   4. Użyj zakrzywionych nożyczek, aby delikatnie przebić się przez skorupę i jej błony w środku najwyższej części jaja, wykonaj bardzo mały otwór jednym ostrzem nożyczek, aby powietrze mogło dostać się do jaja nad zarodkiem (który leży tuż pod najwyższą częścią skorupy).
      UWAGA: Po prostu przerywając błony skorupy i nie przerywając żadnej z błon pokrywających zarodek, powietrze dostające się do jaja oddzieli zarodek od skorupy, a zarodek spocznie na żółtku około 0,5-1 cm od skorupy.
   5. Za pomocą zakrzywionych nożyczek powiększ otwór w skorupce do koła o średnicy około 1 cm. Usuń kawałek wyciętej skorupki i zakryj otwór w jajku kawałkiem przezroczystej taśmy o boku około 5 cm kwadratowych. Aby łatwo usunąć tę taśmę, dociśnij taśmę tak, aby przykleić ją tylko na krawędzi otworu, pozostawiając pozostałą taśmę wolną. Wolną taśmę można następnie chwycić, aby rozpieczętować jajko.
2. Stadium zarodków
   1. Po inkubacji w temperaturze 38 °C (patrz krok 1.7) i okienkowaniu (etap 2.1) należy użyć mikroskopu dwuokularowego do oceny zarodków piskląt zgodnie z ^{punktem 8}. Zrób to tuż przed zamknięciem jaj po oknowie. Napisz etap każdego zarodka na skorupce jajka. Włóż jaja do inkubatora.
      UWAGA: Zarodki w stadium od 8 do 15 nadają się do eksperymentów z barierą i kulkami. Zarodki mają większe szanse na przeżycie, jeśli nie zostały pozostawione poza inkubatorem zbyt długo przed operacją.
3. Moczenie koralików przed operacją.
   1. FGF4 powiedział:
      1. Weź liczbę kulek żelu do chromatografii powinowactwa (150-300 μm), które przyklejają się do końca końcówki pipety o pojemności 1 000 μl i umyj je w 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w probówce mikrowirówkowej w celu usunięcia azydku, w którym są przechowywane. Wirować przez 5 sekund, wyrzucić PBS i powtórzyć proces dwukrotnie.
      2. Namocz kulki żelowe w 30 μl kropli 0,35 mg/ml białka FGF4 na sterylnej szalce Petriego na lodzie przez 30 minut. Za pomocą mikrokleszczyków nr 5 nabierz kulki o średnicy około 150 μm w celu wprowadzenia do zarodka.
         UWAGA: Z kulkami z żywicy jonowymiennej używanymi w poniższych krokach należy obchodzić się za pomocą mikrokleszczyków nr 5 i chwytać je bardzo delikatnie, ponieważ kulki są kruche i mogą pęknąć, jeśli zostaną ściśnięte zbyt mocno. To ostrzeżenie dotyczy 2.3.2-2.3.3 i wszystkich operacji ze zrubieniami żywicy.
   2. Ra
      1. Rozmrozić podwielokrotność 0,05 lub 0,1 mg/ml all-trans-RA rozcieńczoną DMSO i umieścić kroplę o objętości 100 μl na sterylnej szalce Petriego (o średnicy 9 cm), która została uprzednio pokryta folią w celu ochrony RZS przed światłem. Weź końcówkę pipety o pojemności 10 μl i nabierz na jej końcu kilka kulek żywicy jonowymiennej z chlorku i zanurz je w kropli RA chronionej przed światłem w temperaturze pokojowej na 20 minut.
      2. Opłucz kulki w trzech kolejnych kroplach po 100 μl zmodyfikowanego podłoża Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) umieszczonych na tej samej szalce Petriego w odległości co najmniej 1 cm od siebie.
         UWAGA: Koraliki pobierają czerwony barwnik fenolowy z DMEM. Ta metoda opiera się na ⁵.
      3. Wybierz koraliki o średnicy około 100 μm (kulki mają rozmiar od 75 do 180 μm, gdy są mokre) do wprowadzenia do zarodka, używając szkiełka siatkowego mikroskopu pod szalką Petriego i mikrokleszczyków nr 5 do przytrzymania koralików. Podczas pobierania kulki ze 100 μl kropli DMEM, najpierw umieść kulkę na szalce Petriego i usuń z niej resztki DMEM, wypychając kulkę z kropli lub umieszczając zamknięte kleszcze obok kulki (działanie kapilarne odciąga płyn od kulki).
   3. Przekaźnik BMS 493
      1. Jeśli chodzi o RA (2.3.2), namocz kulki żywicy jonowymiennej w 100 μl kropli 2,5 lub 5,0 mg/ml BMS 493 w DMSO w temperaturze pokojowej przez 20 minut, a następnie spłucz w 100 μl kropli DMEM. Wybierz koraliki o średnicy około 100 μm w celu wprowadzenia do zarodka.
   4. Sterowanie DMSO
      1. Jeśli chodzi o RA (2.3.2), namocz kulki żywicy jonowymiennej w 100 μl kropli DMSO w temperaturze pokojowej przez 20 minut, a następnie spłucz w 100 μl kropli DMEM. Wybierz koraliki o średnicy około 100 μm w celu wprowadzenia do zarodka.

3. Operacje na barierach i koralikach

Rysunek 1. Schematy zarodków piskląt w różnych stadiach rozwoju pokazujące, gdzie należy umieścić bariery i/lub koraliki. (A) Schemat zarodka pisklęcia w stadium 13 przedstawiający położenie bariery (zielona linia) między somitami a LPM na przypuszczalnym poziomie skrzydeł (somity 15-20). (B) Ten sam schemat co w (A), wskazujący, gdzie należy umieścić koralik RA (czerwone kółko) przed wstawieniem bariery. (C) Schemat przedstawiający położenie bariery (zielona linia) na przypuszczalnym poziomie nóg (somity 26-32) w zarodku w stadium 15. (D) Ten sam schemat co w (C), wskazujący gdzie należy umieścić koralik RA (czerwone kółko). (E) Schemat wskazujący, gdzie koraliki BMS 493 (fioletowe kółka) powinny być umieszczone w LPM zarodka w stadium 15. (F) Schematyczny schemat zarodka pisklęcia w stadium 9 wskazujący położenie bariery (zielona linia) między mezodermą presomityczną a LPM na przypuszczalnym poziomie skrzydeł. (G) Schematyczny schemat zarodka w stadium 9 pokazujący położenie bariery (zielona linia) i koralika RZS (czerwone kółko). (H) Schematyczny schemat zarodka pisklęcia w stadium 10 przedstawiający położenie bariery (zielona linia) na przypuszczalnym poziomie nogi. (I) Schemat ideowy przedstawiający pozycję stopki BMS 493 (fioletowe kółko) w etapie 10 LPM na poziomie nóg. Liczba ta została zmodyfikowana z ⁷. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

1. Bariera wprowadzona na etapie 13, aby zapobiec inicjacji pąków skrzydeł.
   1. Pobrać zarodek w stadium 13 z inkubatora i umieścić komórkę jajową na podpórce pod mikroskopem dwuokularowym ustawionym na powiększenie 3,2x lub większe, jeśli wolisz. Usuń górną warstwę przezroczystej taśmy.
      1. Za pomocą stalowego mikronoża wykonaj nacięcie przez błonę witelinową i mezodermę płytki bocznej (LPM) przylegającą do somitów od 15 do 20 (ryc. 1A) po prawej stronie zarodka (nie wszystkie somity uformowały się na tym etapie). Cięcie przylega do ostatnich czterech utworzonych somitów i kontynuuj cięcie o dwie długości somitów doogonowo.
      2. Podnieś barierę (o szerokości 0,7-1 mm) za pomocą mikrokleszczyków nr 5 na końcu wystającym z szalki Petriego i przekręć rękę, aby włożyć wolny koniec bariery do nacięcia. Bariera w kształcie zawiasu leży płasko na membranie witeliny nad LPM, a jej połowa wystaje w dół przez nacięcie dystalne do somitów. Tak szybko, jak to możliwe, zaklej jajo przezroczystą taśmą i włóż je z powrotem do inkubatora.
         UWAGA: Mikronóż i kleszcze stają się lepkie w kontakcie z membraną witelinową. Ważne jest, aby wytrzeć je do czysta 70% etanolem przed przystąpieniem do kolejnej operacji. Dotyczy to wszystkich późniejszych opisów operacji oraz implantacji perełek.
      3. Jeśli koralik ma być wprowadzony w połączeniu z barierą, najpierw weź koralik z mikrokleszczyków nr 5 i włóż go do przeciętej powierzchni LPM po dystalnej stronie nacięcia, a następnie włóż barierę do nacięcia bliższego stopki (ryc. 1B). Zamknij jajo i niezwłocznie włóż je z powrotem do inkubatora.
2. Bariera założona na etapie 15, aby zapobiec inicjacji pąków nóg.
   UWAGA: Przykład wyniku tej operacji na wyrażeniu czynnika transkrypcyjnego Tbox 4 (Tbx4) pokazano na rysunkach 2D i 2E.
   1. Pobrać zarodek w stadium 15 z inkubatora i umieścić jajo na podpórce pod mikroskopem dwuokularowym ustawionym na powiększenie 3,2x lub większe, jeśli wolisz. Usuń górną warstwę przezroczystej taśmy.
      1. Za pomocą stalowego mikronoża wykonaj nacięcie przez błonę witeliny i LPM w sąsiedztwie somitów od 26 do 32 (ryc. 1C) po prawej stronie zarodka (nie wszystkie somity uformowały się na tym etapie). Cięcie przylegające do dwóch ostatnich utworzonych somitów i kontynuuj cięcie o pięć długości somitów doogonowo.
      2. Podnieś barierę (o szerokości 1,2-1,3 mm) za pomocą mikrokleszczyków nr 5 na jednym końcu i przekręć barierę, aby włożyć wolny koniec do nacięcia. Tak szybko, jak to możliwe, zaklej jajo przezroczystą taśmą i włóż je z powrotem do inkubatora.
         UWAGA: Bariera w kształcie zawiasu leży płasko na membranie witeliny nad LPM, a jej połowa wystaje w dół przez nacięcie dystalne do somitów.
      3. Jeśli koralik ma być wprowadzony w połączeniu z barierą, najpierw weź koralik z mikrokleszczyków nr 5 i włóż go do przeciętej powierzchni LPM po dystalnej stronie nacięcia, a następnie włóż barierę do nacięcia proksymalnie do stopki (ryc. 1D). Zamknij jajo i niezwłocznie włóż je z powrotem do inkubatora.
      4. Jeżeli koralik lub koraliki mają być wprowadzone bez bariery, np. koraliki BMS 493 do okolicy nogi na etapie 15, nie należy wykonywać długiego nacięcia (3.2.2.1). Wykonaj małe nacięcie przez membranę witeliny i do LPM w miejscu, w którym ma być umieszczony koralik. Weź koralik w mikrokleszkach nr 5 i włóż go do otworu w LPM. Wepchnij go nieco dalej za pomocą zamkniętych końców kleszczy (Rysunek 1E).
3. Bariera umieszczona na etapie 9, aby zapobiec indukcji i inicjacji zawiązków skrzydeł.
   1. Pobrać zarodek w stadium 8 lub 9 z inkubatora i umieścić komórkę jajową na podpórce pod mikroskopem dwuokularowym ustawionym na powiększenie 3,2x lub większe, jeśli wolisz.
      1. Za pomocą stalowego mikronoża wykonaj nacięcie przez błonę witelinową i LPM boczne i rostralne do prymitywnej smugi, na ogonowym końcu zarodka w linii z somitami (ryc. 1F) o długości około 5 długości somitu.
      2. Podnieś barierę (o szerokości 0,7-1 mm) za pomocą mikrokleszczyków nr 5 na końcu wystającym z szalki Petriego i przekręć rękę, aby włożyć wolny koniec bariery do nacięcia. Tak szybko, jak to możliwe, zaklej jajo przezroczystą taśmą i włóż je z powrotem do inkubatora.
         UWAGA: Bariera w kształcie zawiasu leży płasko na membranie witelinowej nad LPM, a jej połowa wystaje w dół przez nacięcie.
      3. Jeśli koralik ma być wstawiony w połączeniu z barierą, najpierw weź koralik z mikrokleszczyków nr 5 i włóż go do przeciętej powierzchni LPM po dystalnej stronie nacięcia, a następnie włóż barierę do nacięcia proksymalnie do stopki (ryc. 1G). Zamknij jajo i niezwłocznie włóż je z powrotem do inkubatora.
4. Bariera wprowadzona na etapie 10, aby zapobiec indukcji i inicjacji pąków nóg.
   UWAGA: Przykładowy wynik tej operacji na wyrażeniu Tbx4 pokazano na rysunku 2G.
   1. Weź zarodek w stadium 10 z inkubatora i umieść jajo na podpórce pod mikroskop dwuokularowy ustawiony na powiększenie 3,2x lub większe, jeśli wolisz.
      1. Za pomocą stalowego mikronoża wykonaj nacięcie przez błonę witelinową i LPM bocznie do pierwotnej smugi, na ogonowym końcu zarodka w linii z somitami (ryc. 1H) o długości około 6 długości somitów.
      2. Podnieś barierę (o szerokości 1,2 mm) za pomocą mikrokleszczyków nr 5 na końcu wystającym z szalki Petriego i przekręć rękę, aby włożyć wolny koniec bariery do nacięcia. Tak szybko, jak to możliwe, zaklej jajo przezroczystą taśmą i włóż je z powrotem do inkubatora.
         UWAGA: Bariera w kształcie zawiasu leży płasko na membranie witelinowej nad LPM, a jej połowa wystaje w dół przez nacięcie.
      3. Jeśli stopka ma być wprowadzona bez bariery, np. stopka BMS 493 w okolicę nogi na etapie 10, należy wykonać małe nacięcie przez błonę witelinową i do LPM w miejscu, w którym ma być umieszczona. Weź koralik w mikrokleszkach nr 5 i włóż go do otworu w LPM. Wepchnij go nieco dalej za pomocą zamkniętych końców kleszczy (Rysunek 1I).
5. 24 godziny lub więcej po operacji sprawdź położenie bariery w porównaniu z pojawiającym się przeciwległym zawiązkiem kończyny. Wyrzuć wszystkie zarodki, w których bariera wyraźnie nie znajduje się naprzeciwko zawiązka lewej kończyny. W tym przypadku szlaban został źle ustawiony
.

4. Pobieranie zarodków, utrwalanie i przygotowanie do hybrydyzacji in situ (WISH)

1. Pobieranie zarodków po operacji.
   1. Pobrać zarodki w stadium 19-23 w taki sposób, aby morfologia zawiązków kończyn była wyraźnie widoczna zarówno po stronie operowanej, jak i po przeciwnej stronie kontrolnej.
      1. Za pomocą zakrzywionych nożyczek wytnij większy otwór w skorupce jajka. Przeciąć wokół zarodka, trzymając duże naczynie krwionośne po lewej stronie zarodka za pomocą mikrokleszczy. Za pomocą tego uchwytu naczynia wyjąć zarodek i umieścić go na szalce Petriego z buforem soli fizjologicznej (PBS) o pH 7,3.
      2. Pod mikroskopem dwuokularowym wypreparuj dodatkowe naczynia i błony embrionalne za pomocą kombinacji zakrzywionych nożyczek i mikrokleszczy nr 5. Zdejmij głowę za pomocą nożyczek.
2. Utrwalanie zarodków po zbiorach.
   1. Za pomocą zakrzywionych, kleszczy podnieś zarodek i umieść go w 5 ml 4% paraformaldehydu (PFA) w PBS w temperaturze pokojowej na dwie godziny kołysania, a następnie w temperaturze 4 °C przez noc w szklanej butelce o pojemności 20 ml z zakrętką.
      Uwaga: PFA stanowi poważne zagrożenie dla zdrowia. Jest to szkodliwy, środek drażniący i należy zapobiegać kontaktowi proszku ze skórą, oczami i płucami. Podczas przygotowywania roztworu należy używać osobistej odzieży ochronnej i dygestorium. Gdy roztwór wynosi 4%, należy założyć rękawice, okulary ochronne i fartuch laboratoryjny.
      UWAGA: Ważne jest, aby zarodki szybko się naprawiły, aby jak najlepiej zachować integralność mRNA.
3. Usuwanie barier przed hybrydyzacją in situ metodą wholemount.
   UWAGA: Bariery są usuwane, ponieważ są ostre i mogą uszkadzać zarodki podczas przechodzenia przez protokół hybrydyzacji in situ, zwłaszcza jeśli kilka zarodków jest barwionych jednocześnie.
   1. Po utrwaleniu umieść zarodek w naczyniu z PBS pod mikroskopem dwuokularowym.
   2. Używając dwóch par mikrokleszczyków nr 5, umieść lewą parę blisko po obu stronach bariery po operowanej stronie zarodka. Chwyć barierę prawą parą i delikatnie pociągnij barierę od zarodka za pomocą lewej pary, aby utrzymać zarodek w dół i zapobiec przyleganiu jakiejkolwiek tkanki do bariery podczas jej usuwania.
4. Wykonaj WISH zasadniczo zgodnie z opisem w ^{punkcie 11}.

Wyniki

Protokół opisany powyżej opisuje metody zastosowane w Nishimoto et al., 2015. W pracy badano indukcję i inicjację zawiązków kończyn zarówno w przedniej, jak i tylnej kończynie zarodka pisklęcia. Wyniki po wprowadzeniu nieprzepuszczalnych barier zapobiegających wyrastaniu zawiązka kończyny przedniej zostały opublikowane wcześniej ^{1, 2, 9}, ale przeprowadzono tylko jedno badanie opisujące bariery uniemożliwiające inicjację zawiązków nóg ¹. Dane dotyczące kończyn tylnych z Nishimoto i wsp., 2015 są przedstawione tutaj jako reprezentatywne wyniki badania ekspresji mRNA po insercji bariery.

tbx4 wyrażenie w LPM nie jest wystarczające do zainicjowania wzrostu kończyn tylnych:
Ryciny 2B i C (Tabela 2) pokazują, że wprowadzenie bariery na etapie 15 (Figura 2A) (patrz protokół 3.2) prowadzi do braku ekspresji zarówno Fgf10, jak i Fgf8 w obszarze zawiązka nogi (oznaczonego nawiasem) po operowanej prawej stronie. Porównaj z nieobsługiwaną lewą stroną. Jednak ekspresję Tbx4 obserwuje się zarówno na etapie 19, jak i 23 po stronie operowanej (ryc. 2D i E). Wnioskujemy, że sama ekspresja Tbx4 nie jest wystarczająca do zainicjowania wzrostu kończyn tylnych z LPM. Inne badania na pisklęciu sugerują, że ekspresja genu Tbx jest wystarczająca do zainicjowania tworzenia pąków kończyn przednich ^{12, 13}.

Rysunek 2C' jest dołączony, aby zilustrować, jak wygląda bariera osadzona w okolicy nogi zarodka po utrwaleniu. W większości przypadków bariery zostały usunięte przed hybrydyzacją in situ (protokół 4.3).

RA z Somitów jest niezbędne w LPM, zanim Fgf10 wywoła wzrost pąków kończyn:
Rysunek 3A jest schematem przedstawiającym dodawanie dystalnie nasączonej RA kulki do bariery wprowadzonej na etapie 15 (protokół 3.2.1.3). Po tej operacji obserwuje się wyrostek pąka kończyny (oznaczony gwiazdką) po operowanej prawej stronie, a Tbx4, Fgf10 i Fgf8 są wyrażane w pączku tak, jak znajdują się po kontrolnej lewej stronie (ryc. 3B, C i D, tabela 2). W ten sposób dodanie RZS do LPM przezwycięża efekt bariery i następuje inicjacja pąków kończyn. Wnioskujemy, że w normalnym rozwoju RZS z somitów jest niezbędne w LPM, zanim będzie można zainicjować wyrastanie pąków kończyn. Powstałe pąki kończyn tylnych są na ogół mniejsze niż te po stronie kontrolnej. Może to wynikać z faktu, że dawka RZS w LPM nie jest równoważna z sytuacją typu dzikiego. Jeśli dawka RZS jest zbyt wysoka, wierzchołkowy grzbiet ektodermalny (AER) może zostać skrócony, a mniejsze pąki uzyskają ^{14, 15}.

Aby potwierdzić, że RA (z somitów) w LPM jest wymagane do normalnej inicjacji pąków kończyn, użyto odwrotnego agonisty RAR, BMS 493. Koraliki są wszczepiane w obszar nogi LPM na etapie 15 (patrz protokół 3.2.1.4) (Rysunek 3E). Ekspresja Fgf10 jest regulowana w dół po zastosowaniu kulek BMS 493 w LPM, co skutkuje mniejszymi pąkami kończyn tylnych w porównaniu ze stroną kontrolną (Figura 3F; Tabela 3). Koraliki kontrolne DMSO nie powodują tych wad (rysunki 3G i 3H; Tabela 3). Wady obserwowane po zastosowaniu BMS 493 są łagodniejsze niż te wywołane działaniem bariery; tj. Fgf10 jest nadal wyrażany i tworzą się pąki kończyn. Jest to prawdopodobnie spowodowane tym, że działanie BMS 493 jest ograniczone lokalnie wokół kulek i może nie być w stanie zantagonizować całego RA wytwarzanego przez tkanki osiowe.

Wczesne sygnały osiowe określają komórki LPM, które później wyrażają Tbx4:
Sprawdziliśmy, kiedy LPM nabywa zdolność do ekspresji Tbx4 w prospektywnym regionie formowania nóg. Najwcześniejszym etapem, w którym można wprowadzić barierę, która następnie zablokuje wyrastanie pąków nóg, jest etap 10. Jako pierwsi opracowaliśmy protokół wprowadzania barier na etapach wcześniejszych niż etap 12. Bariery wprowadzone między mezodermą przyosiową a przypuszczalnym LPM nogi na etapie 10 (patrz protokół 3.4) blokują tworzenie się pąków nóg i ekspresję Tbx4 w LPM tworzącym nogi (ryc. 2F i 2G, tabela 2), co sugeruje, że sygnał z tkanek osiowych na etapie 10 jest wymagany do późniejszej ekspresji Tbx4 w LPM kończyny tylnej. Porównaj ten wynik z rysunkami 2D i E, gdzie późniejsze wstawienie bariery pozwala na ustalenie ekspresji Tbx4. Ponadto sprawdziliśmy, czy ten sygnał osiowy może być RA, obserwując, czy odwrotny agonista RAR zmniejsza ekspresję Tbx4. Koralik BMS 493 umieszczony w LPM kończyny tylnej na etapie 10 (patrz protokół 3.4.1.3) obniża ekspresję Tbx4 (ryc. 2H i 2I), podczas gdy koraliki kontrolne nasączone DMSO nie wpływają na ekspresję Tbx4 (ryc. 2J i 2K). Łącznie wyniki te wspierają model, w którym sygnał RA z tkanek osiowych reguluje indukcję kończyn poprzez pozytywną regulację Tbx4 w LPM ⁷ kończyny tylnej.

Śmierć pooperacyjna:
Tabele 1, 2 i 3 zawierają szczegółowe informacje na temat wyników eksperymentalnych, w tym liczby zarodków piskląt, które zmarły po operacji i przed pobraniem. Należy spodziewać się niektórych zgonów po tego rodzaju mikrochirurgii. Liczbę umierających można ograniczyć do minimum, upewniając się, że narzędzia są czyste, otwór w jaju ma minimalny wymagany rozmiar, aby zarodki pozostały bez zabezpieczenia w postaci taśmy klejącej przez plombę przez minimalny czas oraz, w połączeniu z tym ostatnim punktem, aby operacja została przeprowadzona tak szybko, jak to możliwe. Żadna z tych operacji nie jest bardzo czasochłonna, ale operacje z użyciem koralików i barier zajmują trochę więcej czasu. Pomimo tych środków, operacje przeprowadzane w najwcześniejszych stadiach i te w okolicy skrzydła są bardziej narażone na śmierć. Wokół obszarów tworzących kończyny znajdują się duże naczynia krwionośne, a przypadkowe pęknięcie tych naczyń może prowadzić do śmierci z powodu utraty krwi. Okazuje się, że jaja otwarte w stadium 8 lub 9, których zarodki nie były operowane, często umierają następnego dnia. Dlatego jedynym rozwiązaniem tych problemów jest przeprowadzenie dużej liczby eksperymentów.

Rysunek 2. Ekspresja genów markerowych zmienia się po wprowadzeniu bariery lub koralika na przypuszczalnym poziomie nogi. (A) Schemat przedstawiający położenie bariery (zielona linia) na przypuszczalnym poziomie nóg (somity 26-32) w zarodku w stadium 15. (B-E oraz G) Analiza WISH na operowanych zarodkach. Obszar ramienia jest obrysowany (nawiasy). (B) Ekspresja Fgf10 jest nieobecna w operowanym LPM, ale silna ekspresja jest wykrywana w lewym pąku. (C) Ekspresja Fgf8 jest nieobecna po stronie operowanej, co sugeruje, że nie ma AER. (C') Ten sam zarodek przed usunięciem bariery. (D) Tbx4 wyraża się w LPM na tym samym poziomie ogonowym co pączek kontrolny. (E) Ekspresja Tbx4 utrzymuje się w okolicy prawej nogi pomimo braku wzrostu kończyn. (F) Schematyczny schemat zarodka pisklęcia w stadium 10 przedstawiający położenie bariery (zielona linia) na przypuszczalnym poziomie nóg. (G) Wyrażenie Tbx4 jest nieobecne w operowanym prawym LPM (nawias). (H) Schematyczny schemat zarodka pisklęcia w stadium 10 przedstawiający położenie koralików BMS 493 (fioletowe kółko) na przypuszczalnym poziomie nóg. (I) Ekspresja Tbx4 jest regulowana w dół po operowanej prawej stronie po leczeniu BMS 493. (J) Schemat ideowy zarodka pisklęcia w stadium 10 pokazujący kontrolną pozycję koralików DMSO (szare kółko). (K) Tbx4 ulega ekspresji po operowanej prawej stronie na poziomie podobnym do poziomu po lewej stronie kontrolnej po leczeniu samym DMSO. Liczba ta została zmodyfikowana z ⁷. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3. RZS ratuje brak pąka kończyny spowodowany wstawieniem bariery i jest niezbędny w LPM przed wyrostem pąka nogi. (A) Schemat ideowy wskazujący położenie bariery (zielona linia) na przypuszczalnym poziomie nóg (somity 26-32) i koralik nasączony RAS (czerwone kółko). (B-D) RZS ratuje wyrostek pąków nóg (oznaczony gwiazdką). (B) Ekspresja Tbx4 jest obecna w uratowanym pąku nogi podobnie jak po stronie nieoperowanej. (C) Fgf10 ulega ekspresji w uratowanym pąku nogi podobnie jak po stronie nieoperowanej. (D) Fgf8 jest wyrażany w AER uratowanego zawiązka prawej nogi. (E) Schemat wskazujący, gdzie umieszczono koraliki BMS 493 (fioletowe kółka) w przypuszczalnej nodze LPM zarodków w stadium 15. (F) Ekspresja Fgf10 jest zmniejszona po operowanej prawej stronie, a pączek nogi jest mały po leczeniu BMS 493. Koraliki są oznaczone gwiazdką. (G) Schemat podobny do (E), wskazujący położenie koralików DMSO sterujących (szare kółka). (H) Koraliki DMSO (oznaczone gwiazdkami) nie wpływały na ekspresję Fgf10 ani rozmiar pąków nóg. Liczba ta została zmodyfikowana z ⁷. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rozdział Rozdział

Umieszczona barierka sceniczna (+ listwa) *	Obsługiwana liczba	Brak skrzydła **	Skrzydło obecne **	Liczba zmarłych
Etap 12-14	Rozdział 40	24	1	15
Etap 8/9	65	23	0	42 Rozdział 42
Etap 12-13 (koralik FGF4)	Rozdział 41	7 (brak koralika)	17	17
Etap 12-13 (koralik RA)	75	9 (brak koralika)	Rozdział 32	Rozdział 34
Etap 13 (koralik kontrolny)	5	3	0	cyfra arabska
* 0,7-1 mm bariery foliowe umieszczone między somitami 15-20 a mezodermą płytki bocznej. 0,35 mg/ml FGF4 kulka. 0,05-0,1 mg/ml koralik RA.
Koralik kontrolny DMSO.
** Zarodki piskląt w stałym stadium 21-23

Tabela 1. Wyniki eksperymentu z barierą na poziomie skrzydła i koralikami.

Umieszczona barierka sceniczna (+ listwa) *	Obsługiwana liczba	Brak nogi **	Noga obecna **	Liczba zmarłych
Etap 12-15	Rozdział 43	39 Rozdział 39	0	4
Etap 10/11	23	16	0	7
Stopień 15 (stopka FGF4)	8	0	5	3
Etap 15 (koralik RA)	Rozdział 18	0	Rozdział 18	0
* 0,7-1,3 mm bariery foliowe umieszczone między somitami 26-32 a mezodermą płytki bocznej. 0,35 mg/ml FGF4 kulka. 0,05-0,1 mg/ml koralik RA.
** Zarodki piskląt w stałym stadium 18-24

Tabela 2. Wyniki eksperymentu z barierą na poziomie nóg i koralikami.

Obsługiwana liczba	Pączek nogi mały	Pączek nogi lekko mały	Normalny rozmiar pąka nogi	Liczba zmarłych
Koraliki BMS 493 *
15	12	3	0	0
Koraliki DMSO **
12	0	3	9	0
* 2-3 koraliki nasączone 5 mg/ml BMS 493 umieszczone we właściwym stopniu 14-15 LPM na poziomie nóg.
** 2-3 koraliki nasączone samym DMSO umieszczone w odpowiednim stopniu 15 LPM na poziomie nóg.
Zarodki piskląt utrwalone w stadium 17-19.

Tabela 3. Wyniki eksperymentu z koralikami BMS 493 na poziomie nóg.

Dyskusja

Opisujemy zastosowanie nieprzepuszczalnych barier zapobiegających tworzeniu się zawiązków kończyn w zarodku pisklęcia. Ta technika składa się z kilku krytycznych kroków. Po wstępnych eksperymentach stwierdziliśmy, że bariery w kształcie zawiasów zastosowane w ^{9, 10} pozostają na swoim miejscu w zarodku znacznie lepiej niż bariery proste. Dystalna płaska strona bariery przylega do błony witelinowej i utrzymuje barierę na miejscu (rysunek 2C'). Staranne przygotowanie barier w kształcie zawiasów z folii aluminiowej, jak opisano w kroku 1.6 protokołu, ma zasadnicze znaczenie dla powodzenia operacji. Drugim ważnym krokiem jest upewnienie się, że jaja nie są pozostawione poza inkubatorem zbyt długo po oknierzeniu i ocenie stopnia zaawansowania przed operacją na zarodku. Z naszego doświadczenia wynika, że zarodki lepiej przeżywają operację, jeśli w momencie przeprowadzania operacji znajdują się w temperaturze inkubacji lub w jej pobliżu. W związku z tym operacje powinny być przeprowadzane tak szybko, jak to możliwe, a jaja powinny być niezwłocznie ponownie zamykane, aby zapewnić dobre wskaźniki przeżycia. Wielu badaczy dodaje kroplę antybiotyków do zarodka po mikrooperacji przed powrotem jaj do inkubatora. Obecność cieczy uniemożliwiała dobre przyleganie barier na miejscu. Dodanie antybiotyku może również usunąć kulki po umieszczeniu. Dlatego zaleca się niestosowanie antybiotyków, szybkie operacje i dobrą czystość narzędzi, aby uniknąć infekcji. Wycieranie narzędzi 70% etanolem po każdym etapie operacji jest niezbędne, aby zapobiec lepkości narzędzi w kontakcie z membraną witelinową, co może powodować przyleganie zarówno barier, jak i kulek do kleszczy (patrz krok protokołu 3.1.2.2). Obie odmiany użytych koralików mogą wypaść na miejsce po operacji. Kiedy następnego dnia sprawdzono położenie bariery, nie było możliwe zajrzenie przez barierę, aby upewnić się, czy stopka pozostała na swoim miejscu, czy nie. W przypadkach, gdy koralik wypadł, wyrostek pąka skrzydłowego nie został uratowany (tab. 1). Unikanie przenoszenia płynu wraz ze stopką podczas ich implantacji oznacza, że koraliki łatwiej przyklejają się do przeciętej powierzchni LPM (patrz protokół 2.3.2.3). Wreszcie, zapewnienie, że zarodki zostaną utrwalone natychmiast po pobraniu, ma kluczowe znaczenie dla prawidłowej późniejszej analizy ekspresji genów (patrz krok 4.2 protokołu).

Protokół ten modyfikuje wcześniej opublikowane eksperymenty, w których wykorzystywano bariery zapobiegające inicjacji pąków kończyn, określa określone optymalne szerokości barier i wprowadza łączenie umieszczania barier i koralików, a następnie analizę ekspresji genów. Odkryliśmy, że użycie konwencjonalnej folii aluminiowej, która jest tania i łatwo dostępna we wszystkich laboratoriach, daje wyniki równe tym, które wcześniej stosowano przy użyciu folii tantalowej. Folię można pozostawić w zarodku podczas przeprowadzania hybrydyzacji in situ (ryc. 2C'), ale zwykle usuwamy ją, jeśli przetwarzany jest więcej niż jeden zarodek, aby zapobiec uszkodzeniu zarodków przez ostre krawędzie folii. Badania pilotażowe wykazały, że szczególnie ważna jest szerokość barier w obszarze nóg. Początkowo testowane bariery były zbyt krótkie, a wyrastanie pąków nóg nie zostało zapobieżone. 1,2-1,3 mm to optymalna szerokość, aby bariera całkowicie zablokowała wyrastanie pąków nóg. Najwęższe bariery na skrzydłach, które można dokładnie umieścić, aby zapobiec wyrastaniu pąków, zapewniają najlepsze wskaźniki przeżycia. Może to być nawet 0,5-0,7 mm. Jednak bariery, które są nieco szersze, z większym prawdopodobieństwem spowodują całkowite zablokowanie wyrastania pąków skrzydeł, ponieważ pozwalają na niewielką niedokładność umieszczenia (użyliśmy 0,7-1 mm). Unikanie naczyń krwionośnych podczas wykonywania nacięcia ma kluczowe znaczenie dla barier na poziomie pąków skrzydeł. Bariery półprzepuszczalne były wcześniej używane do przecinania pąka kończyn piskląt. MacCabe i Parker, 1976 i Summerbell, 1979 używali filtrów o wielkości porów 0,45 μm i 0,8 μm, odpowiednio ^{16, 17.} Stwierdzili, że sygnały dyfuzyjne mogą przechodzić przez pory w filtrach i że wyniki uzyskane przy użyciu barier półprzepuszczalnych znajdowały się w połowie drogi między pąkiem kończyny bez bariery a pąkiem z nieprzepuszczalnej folii tantalowej. Protokół ten można dostosować do wykorzystania półprzepuszczalnych barier o różnej wielkości porów w celu różnicowania sygnałów kandydujących na podstawie rozmiaru lub modyfikowania dynamiki dyfuzji sygnału.

Protokół ten ma różne ograniczenia, związane głównie z samym organizmem modelowym. Takie techniki mogą być wykorzystane do zbadania dalszych pytań dotyczących rozwoju kończyn, a także innych kwestii związanych z embriogenezą kręgowców. Zastrzeżenie jest takie, że dany narząd/obszar powinien się rozwijać, gdy zarodek pisklęcia jest dostępny do interwencji. Obecność dużych naczyń krwionośnych w obszarze, w którym należy umieścić barierę, sprawia, że umieszczenie bariery później niż na etapie 13 lub 14 jest technicznie trudne. Jeśli duże naczynia krwionośne zostaną przecięte podczas umieszczania bariery, może to spowodować śmiertelność zarodków. Nasze badanie tego, kiedy czynniki transkrypcyjne Tbx5 i Tbx4 są po raz pierwszy indukowane w LPM, było ograniczone przez najwcześniejszy etap, na którym mogliśmy umieścić barierę, która później znalazłaby się naprzeciwko odpowiednio pąka skrzydła lub nogi. Pouczająca może być próba zablokowania indukcji genu Tbx na wcześniejszych etapach, bliżej gastrulacji. Najwcześniej udało się umieścić barierę w przypuszczalnym obszarze skrzydła w stadium 8, a w obszarze nóg w stadium 10. Protokół ten prawdopodobnie nie nadaje się do badania ekspresji genów poza stadiami zawiązków kończyn, ponieważ późniejszy szybki wzrost spowodowałby przemieszczenie bariery, a wyniki odnosiłyby się tylko do początkowej pozycji bariery.

Odnosząc się w tym kontekście do ograniczeń zarodka pisklęcia, można stwierdzić, że jego zalety w porównaniu z innymi modelowymi organizmami kręgowców są liczne. Zarodek pisklęcia jest bardzo odpowiednim modelem zwierzęcym do tego typu fizycznej interwencji w zarodku kręgowców. Zarodki są stosunkowo duże i łatwo dostępne przez skorupkę jaja. Można wrócić do zarodka w celu dalszych eksperymentów (np. usunięcia koralika ¹⁸ lub nawet bariery) lub sprawdzić postępy, po prostu usuwając okienko taśmy. Możliwy jest zakres obrazowania na żywo lub obrazowania poklatkowego. Opisujemy metodę okienkowania jaj kurzych, która jest szczególnie odpowiednia do operacji na zarodkach we wczesnym stadium. W przypadku badań kończyn bardzo ważne i pomocne jest, aby dla każdego eksperymentu istniała przeciwległa kończyna kontrolna, która służy jako idealna kontrola wewnętrzna dla każdej repliki biologicznej.

Połączenie stosowania nieprzepuszczalnych barier zapobiegających rozrastaniu się kończyn i koralików nasączonych cząsteczkami sygnałowymi nie zostało wcześniej zgłoszone. Nasza analiza ekspresji mRNA po takich interwencjach jest również nowatorska. Techniki te pozwoliły nam przeanalizować trudny problem, kiedy czynniki transkrypcyjne specyficzne dla kończyn Tbx5 i Tbx4 są indukowane w LPM, a także wykazać, że później, przed inicjacją zawiązków kończyn, obecność tych genów Tbx w LPM nie jest wystarczająca do aktywacji transkrypcji Fgf10 i rozpoczęcia wzrostu pąków kończyn. Rysunki 2G, 2D i 2E dobrze ilustrują te ustalenia. Brak ekspresji Tbx4 po wstawieniu bariery na etapie 10 na rysunku 2G jest w wyraźnym kontraście z jej obecnością w 2D i 2E po indukcji bariery na etapie 15, po indukcji Tbx4. Implantacja kulek nasączonych RZS ułatwiła uratowanie inicjacji zawiązków kończyn po wprowadzeniu bariery, a zatem wskazuje na to, że RZS z somitów jest niezbędne w LPM, zanim zacznie się wyrastanie pąków kończyn. Takie techniki mogą być wykorzystane do rozwiązania dalszych problemów związanych z rozwojem kończyn, ale także innych kwestii związanych z embriogenezą kręgowców. Obszary mózgu, oka i tułowia mogą być odpowiednie.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kleszcze zegarmistrzowskie Dumont nr 5, x2	Narzędzia do nauki pięknej  www.finescience.de	11251-20
Kleszcze zegarmistrzowskie Dumont nr 4, x2	Narzędzia do nauki pięknej  www.finescience.de	11241-30
Kleszcze mocne Dumont, typ AA	Narzędzia do nauki pięknej  www.finescience.de	11210-10
Nożyczki zakrzywione z ostrzami o długości	2,5 cmNarzędzia naukowe  www.finescience.de	14061-11
Kleszcze zakrzywione z tępo zakończonym końcem, końce ok. 0,5  cm długości	Fine Science Tools www.finescience.de	11065-07
Stalowy trzpień o szerokości 0,2 mm	Fine Science Tools  www.finescience.de	26002-20
Kamień do ostrzenia, kwadratowy	Fine Science Tools  www.finescience.de	29008-01
Olej
Uchwyt na igłę	Fine Science Tools  www.finescience.de	26016-12
Taśma przezroczysta, 50 mm x 66  m	www.5staroffice.com	295985
Białko			Prezent od Cliffa Tabina.
kwas all-trans-retinowy	Sigma www.sigmaaldrich.com	R2625-50MG	Pamiętaj o ochronie przed światłem.
BMS 493	Sigma www.sigmaaldrich.com	B6688-5MG
Ostrze skalpela nr 15	www.swann-morton.com	nr kat. 0105
Affi-Gel Blue, żel do chromatografii powinowactwa	Bio-Rad www.bio-rad.com	153-7301	Koraliki do dostarczania białka.
AG1-X2 Żywica jonowymienna	Bio-Rad www.bio-rad.com	140-1251	Koraliki do dostarczania RA lub BMS 493.
Inkubator do jaj	Memmert	www.hce-uk.com LAB128
Paraformaldehyd (PFA)	Sigma www.sigmaaldrich.com	P6148-1KG	Szkodliwy, drażniący,.  Z proszkiem należy obchodzić się w oparach w pełnym ubraniu ochronnym.
Etanol	Sigma www.sigmaaldrich.com	32221-2.5L
DMEM, wysoka glukoza	Gibco www.thermofisher.com	41965-039	500 ml
Dimetylosulfotlenek (DMSO)	Fisher Scientific webshop.fishersci.com	D/4121/PB08	500 ml
Mikroskop dwuokularowy	Leica www.leica-microsystems.com	MZ6	zastąpiony przez M60
Jaja kurze	Henry Stewart & Co Ltd sales@medeggs.com		Brązowe jaja