Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Model ostrej siatkówki do oceny naruszenia bariery siatkówkowej krwi i potencjalnych leków do leczenia

6.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54619

⸱

13 września 2016

 ,  ,  , 
1Graduate School of Biomedical Sciences, Rowan University, 2Department of Cell Biology, Rowan University School of Osteopathic Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Stworzono tani, łatwy w użyciu i potężny system do oceny potencjalnych metod leczenia, które mogłyby złagodzić naruszenie bariery siatkówki krwi wywołane przez histaminę. Nieszczelność naczyń krwionośnych, aktywacja komórek Müllera i ciągłość procesów neuronalnych są wykorzystywane do oceny odpowiedzi na uszkodzenie i jej odwrócenia za pomocą potencjalnego leku, lipoksy A4.

Streszczenie

Niskokosztowy, łatwy w użyciu i potężny system modelowy został stworzony do oceny potencjalnych metod leczenia, które mogłyby poprawić naruszenie bariery siatkówkowej krwi. Wykazano, że czynnik zapalny, histamina, narusza integralność naczyń w hodowanej siatkówce poprzez dodatnie barwienie IgG poza naczyniami krwionośnymi. Wpływ samej histaminy i leków kandydujących do potencjalnych terapii, takich jak lipoksyna A4, ocenia się za pomocą trzech parametrów: nieszczelności naczyń krwionośnych poprzez barwienie immunologiczne IgG, aktywacji komórek Müllera poprzez barwienie GFAP oraz zmiany w dendrytach neuronalnych poprzez barwienie MAP2. Co więcej, warstwowa organizacja siatkówki pozwala na szczegółową analizę procesów zachodzących w komórkach Müllera i komórkach zwojowych, takich jak zmiany szerokości i ciągłości. Chociaż przedstawione dane dotyczą hodowli siatkówki świń, system ma zastosowanie do wielu gatunków. W związku z tym model stanowi wiarygodne narzędzie do badania wczesnych skutków naruszenia integralności naczyń siatkówki na różne typy komórek, a także do oceny potencjalnych kandydatów na leki do leczenia.

Wprowadzenie

Coraz więcej dowodów potwierdza istnienie bariery siatkówkowej krwi (BRB)1-5 i jej podobieństwo do bariery krew-mózg (BBB)6,7. Naruszenie bariery krew-mózg jest ściśle powiązane przyczynowo lub jako marker diagnostyczny z przewlekłymi chorobami neurodegeneracyjnymi, takimi jak choroba Alzheimera (AD)8,9 i ostrymi stanami, takimi jak majaczenie10. Mechanistyczny wgląd w te patologie i odkrycia potencjalnych celów leków są na ogół utrudnione przez ograniczoną dostępność i złożoność sieciową mózgu. Stworzono alternatywy, takie jak obrazowanie in vivo 11, hodowla organotypowa mózgu12, pierwotne hodowle komórkowe13,14 i systemy kohodowli15. Jednak większość z tych modeli wymaga specjalnych instrumentów, długich okresów eksperymentalnych lub wielu markerów do identyfikacji komórek. Funkcjonalne i strukturalne podobieństwa między BBB i BRB, a także korelacja między dysfunkcjami tych dwóch substancji zostały dowiedzione16-19. Ponadto łatwiejszy dostęp, dobrze zdefiniowane typy komórek i warstwowa struktura pozwoliły dobrze scharakteryzowanej siatkówce stać się oknem na mózg. Tożsamość strukturalna i funkcjonalna BBB i BRB wymaga jeszcze szczegółowego porównania. Jednak patologie siatkówki, zwłaszcza naruszenie BRB, są również ściśle związane z postępem różnych chorób, w tym cukrzycy18-19 i AD21,22. W związku z tym interesujące jest ustanowienie systemu dysfunkcji BRB nie tylko w celu nakreślenia mechanizmu, ale także w celu zbadania potencjalnych leków. W niniejszym raporcie opracowano i przedstawiono protokół umożliwiający dysfunkcję BRB z wykorzystaniem prostego ostrego posiewu siatkówki.

Zwiększona przepuszczalność BBB i zmiany patologiczne podobne do AD zostały stwierdzone w organotypowej hodowli mózgu inkubowanej z histaminą, prozapalnym mediatorem12. Dlatego w prezentowanym systemie histaminę zastosowano do hodowli siatkówki ex vivo w celu wywołania dysfunkcji BRB. Przetestowano siatkówki kilku gatunków, takich jak Mus musculus i Bos Taurus. Ze względu na ich komercyjną dostępność i podobieństwo do tkanki ludzkiej, do dostarczenia przedstawionych tutaj danych wykorzystano świeże gałki oczne świń. Po inkubacji z histaminą i/lub innymi lekami, siatkówki poddano obróbce w celu oceny przez barwienie immunologiczne kilku białek12, takich jak immunoglobulina G (IgG), jeden z głównych składników krwi; kwaśne białko fibrylarne gleju (GFAP), dobrze znany marker aktywacji gleju; oraz białko związane z mikrotubulami 2 (MAP2), specyficzne dla neuronów białko cytoszkieletu niezbędne do składania mikrotubul. Ponadto warstwowa budowa siatkówki pozwala na szczegółową analizę procesów zachodzących w komórkach Müllera i komórkach zwojowych, takich jak zmiany ich szerokości i ciągłości. W związku z tym dostępnych jest kilka dodatkowych parametrów umożliwiających ocenę konsekwencji naruszenia BRB na wczesnym etapie, a także ocenę skutków odwrócenia potencjalnych metod leczenia.

W tym protokole, potencjalne efekty odwrócenia badań przesiewowych leków są oceniane z trzech perspektyw: wycieku naczyń krwionośnych (BV), aktywacji komórek glejowych i uszkodzenia komórek nerwowych. Stosuje się kilka metod kwantyfikacji, na przykład poziom ekspresji pokazany przez intensywność barwienia immunologicznego, pomiar szerokości procesu i ciągłość procesów neuronalnych pokazany przez filtr wzmacniający. Aby lepiej zilustrować metodę i pomóc w interpretacji wyników, do celów demonstracyjnych wybrano lipoksynę A4 (LXA4), związek endogennie syntetyzowany w odpowiedzi na uszkodzenie zapalne i łagodzenie dysfunkcji śródbłonka23.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie protokoły zostały przeprowadzone zgodnie z zasadami Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt, gdzie miało to zastosowanie.

1. Przygotowanie

  1. Przygotuj pożywkę stabilizacyjną z 75% zmodyfikowanym roztworem soli Dulbecco (DMEM), 25% zrównoważonym roztworem soli Hanksa (HBSS). Dobrze wymieszać, podaszkę i przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia.
  2. Przygotować sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) i sterylizować w autoklawie. Roztwór należy przechowywać w temperaturze pokojowej. Przed eksperymentem ogrzać PBS do temperatury 37 °C (5 ml na studzienkę).
  3. Przygotuj 10%, 20% i 30% sacharozy w PBS. Przefiltruj wszystkie roztwory pojedynczo na oddzielnych filtrach 0,22 μm do sterylizacji. Roztwory należy przechowywać w temperaturze 4 °C.
  4. Przygotować podstawowy roztwór histaminy w PBS do stężenia 90 mM. Wysterylizuj roztwór, filtrując przez filtr 0,22 μM. Podzielić roztwór na porcje i zachować go w temperaturze -80 °C. Unikać wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania.
  5. Zrób świeży 4% paraformaldehyd (PFA) w PBS przed eksperymentem. Umieść go na lodzie.
    Ostrzeżenie: PFA należy przechowywać w dygestoriach i nosić odpowiedni sprzęt ochronny.
  6. Rozmrozić pożywkę stabilizacyjną (20 ml na siatkówkę). Dodać penicylinę-streptomycynę do końcowego stężenia 100 j./ml. Ogrzać część pożywki (15 ml na siatkówkę) do temperatury 37 °C w inkubatorze przed eksperymentem. Resztę podłoża pozostaw na lodzie.
  7. Umieść HBSS (10 ml na siatkówkę) na lodzie.

2. Kultura organotypowa siatkówki

  1. Przenieść próbki do okapu do hodowli tkankowych. Otwórz muszlę oczną, nacinając wokół soczewki. Za pomocą szczoteczki delikatnie usuń ciało szkliste bez ciągnięcia za siatkówkę. Delikatnie odłącz siatkówkę od krawędzi cięcia za pomocą szczoteczki, aby odsłonić tarczę nerwu wzrokowego. Poostrz nerw wzrokowy brzytwą i uwolnij siatkówkę.
  2. Przenieś siatkówkę na szalkę Petriego i ostrożnie przepłucz siatkówkę za pomocą zimnego HBSS. Umieścić próbkę w HBSS na lodzie. Wypreparuj tyle siatkówk, ile potrzeba, powtarzając krok 2.1 i ten krok.
  3. Przetnij siatkówkę na pół symetrycznie za pomocą brzytwy. Delikatnie przenieść próbki na płytkę 6-dołkową z 3 ml pożywki stabilizacyjnej na studzienkę. Pozostawić do zrównoważenia przez 30 minut w temperaturze 37 °C w inkubatorze z atmosferą zawierającą 5% CO2 .
  4. Podczas inkubacji na etapie 2.3 przygotować następujące odczynniki: Rozcieńczyć podstawowy roztwór histaminy do pożądanego stężenia (450 μM) w ciepłym podłożu. LXA4 (przechowywany w argonie) rozpuścić w pożywce do końcowego stężenia 250 ng/ml.
    UWAGA: Podczas pomiaru wpływu LXA4, jedna połowa z pojedynczej siatkówki jest używana do samej histaminy, podczas gdy druga połowa jest używana do histaminy z LXA4.
  5. Ostrożnie zassać pożywkę stabilizacyjną i dodać przygotowaną pożywkę do każdej studzienki (3 ml na studzienkę). Próbki należy inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę w inkubatorze w atmosferze zawierającej 5% CO2 .
  6. Próbki należy przepłukać raz w ciepłym, sterylnym PBS.

3. Przygotuj próbki do barwienia immunologicznego

  1. Odessać PBS z płytek. Dodać 4% PFA (3 ml na studzienkę) i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
  2. Szybko zassać PFA. Przepłukać próbki jeden raz za pomocą PBS. Przenieść próbki do 10% sacharozy (5 ml na studzienkę) i inkubować przez 2-4 godziny w temperaturze 4 °C.
  3. Przenieść próbki do 30% sacharozy (5 ml na studzienkę) i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C. Wymieszać jedną część dostępnej w handlu pożywki do zamrażania z dwiema częściami 20% sacharozy, aby uzyskać roboczą pożywkę do zamrażania. Pozostawić w temperaturze 4 °C na noc lub dłużej, aż pęcherzyki powietrza znikną.
  4. Przenieść próbki do roboczego pożywki zamrażającej i pozostawić do zrównoważenia przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Przytnij każdą siatkówkę na prostokąty (około 3 mm na 5 mm).
  5. Ostrożnie przenieść próbki do roboczego podłoża do zamrażania znajdującego się w cylindrycznym pojemniku (promień około 1 cm x 2 cm wysokość) wykonanym z folii aluminiowej. Upewnij się, że plastry siatkówki są pionowe (zorientowane tak, aby zapewnić przekrój siatkówki po przekrojeniu) i zamroź je w ciekłym azocie. Przechowuj bloki w temperaturze -80 °C do czasu użycia.
  6. Pokrój każdy blok na kriostacie na plastry o grubości 14 μm i zamontuj je na szkiełkach podstawowych. Szkiełka należy przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu użycia.

4. Barwienie immunologiczne

  1. Jednokrotnie przemyć skrawki 5% buforem fosforanowo-sacharozowym (SPB, 5% sacharozy w PBS, pH 7,4). Zablokuj niespecyficzne miejsca wiązania, inkubując skrawki w buforze blokującym (5% SPB z 10% normalną surowicą kozią i 0,5% Triton X-100) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  2. Inkubować skrawki (na szkiełkach) z odpowiednim przeciwciałem pierwszorzędowym (GFAP lub MAP2, rozcieńczonym w stosunku 1:500 w buforze blokującym) przez 1 godzinę. Odsysać roztwór. Umyć trzy razy w 5% SPB. Aby zabarwić endogenne IgG, pomiń ten krok.
  3. Inkubować skrawki z odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi (IgG przeciwko myszy/przeciwko królikowi cyjaniny3/FITC, rozcieńczone w stosunku 1:800 w buforze blokującym) przez 1 godzinę.
  4. Dokładnie umyj sekcje trzykrotnie 5% SPB. Przygotować próbki do mikroskopii, umieszczając je w podłożu montażowym zawierającym DAPI i przykrywając szkiełkami nakrywkowymi.
  5. Za pomocą laserowego mikroskopu konfokalnego rejestruj obrazy przez obiektyw 20X przy identycznych parametrach, takich jak intensywność lasera, wartość wzmocnienia, czas przebywania itp. w różnych grupach. Ustaw długości fal wzbudzenia/emisji dla kanału niebieskiego (do wykrywania DAPI) na 408/447 nm, dla kanału czerwonego (do wykrywania cyjaniny3) na 561/785 nm, a dla kanału zielonego (do wykrywania FITC) na 488/525 nm.

5. Analiza obrazu

  1. Określ ilościowo procent nieszczelnych naczyń krwionośnych zgodnie z następującymi kryteriami12: Uwzględnij tylko naczynia krwionośne z jądrami komórek śródbłonka w płaszczyźnie przekroju w liczeniu; rozważ nieszczelne naczynie krwionośne, jeśli wykazuje gradient barwienia immunologicznego otaczającego naczynie.
  2. Aby określić poziom wyrażenia, wybierz obszary zainteresowania i zmierz średnią wartość szarości za pomocą oprogramowania do analizy obrazu.
  3. Aby zmierzyć szerokość procesu, wybierz obszar sekcji, w którym procesy są odrębne (na przykład zewnętrzna warstwa jądrowa, ONL). Następnie wybierz pole optyczne, w którym takie procesy są widoczne i ciągłe. Ustaw podziałkę zgodnie z ustawieniem mikroskopowym, narysuj linię w poprzek procesu i wykonaj pomiar.
  4. Aby przeanalizować ciągłość procesu, wybierz obszary zainteresowania, zastosuj filtr zwany wariancją, który uwydatnia krawędzie obrazu, zastępując każdy piksel jego wariancją sąsiedztwa, automatycznie dostosuj kontrast i jasność, policz linie i znormalizuj liczbę według obszaru.
  5. Obliczanie istotności statystycznych za pomocą dwustronnego testu t-Studenta. *, P < 0,05; **, P < 0,01; ***, P < 0,001. Wykreśl wynik jako średnią ± SEM.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przedstawiamy niskokosztowy, wydajny czasowo i łatwy w obsłudze system do oceny potencjalnych metod leczenia, które mogłyby chronić przed naruszeniem BRB wywołanym przez histaminę. W siatkówce kontrolnej IgG pozostaje w obrębie naczyń (Rysunek 1A), natomiast po ekspozycji na histaminę wycieka z naczyń krwionośnych (Rysunek 1B), co potwierdza pomyślne utworzenie modelu.

LXA4 wybrano w celu zademo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W niniejszym raporcie przedstawiamy potężny model ex vivo ostrej dysfunkcji BRB siatkówki z wykorzystaniem siatkówki świń. Ten model systemu nie wymaga specjalnych przyrządów i można go łatwo dostosować do większości warunków laboratoryjnych. Jednak, aby uzyskać pomyślny wynik, należy zwrócić szczególną uwagę na kilka kroków. Po pobraniu gałek ocznych ze źródła należy je przechowywać w temperaturze 4 °C lub na lodzie i jak najszybciej przetworzyć. Gdy analizowany jest efekt leczenia, należy użyć dwóch połówek te...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Bringhurst Meats (Berlin, NJ) jest doceniany za autentyczną pomoc w dostarczaniu gałek ocznych świni.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Technologie DMEMLife 11965-092
HBSSLife Technologies 14170-112
SacharozaJ.T.Baker4072-05
Histamina SigmaH7125-1G
Penicylina-Streptomycyna Invitrogen
PFAMikroskopia elektronowa Sciences15710
Zamrażanie pożywki Triangle Biomedical SciencesTFM-5
Normalna surowica kozia RocklandD104-00-0050
Triton X-100SigmaT8787
GFAP PrzeciwciałoMilliporeAB5804
MAP2 PrzeciwciałoEMD MilliporeMAB3418
FITC sprzężony z osłem anty-króliczym IgGJackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.711-095-152
Cy3 sprzężony z osiołkiem anty-mysi IgGJackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.715-165-150
medium montażowe zawierające DAPIVector Laboratories, Inc.H-1200
NikonEclipse Ti
ImageJNational Institutes of Health1.45s
Laserowy mikroskop konfokalny Mikroskop

Bibliografia

  1. Cunha-Vaz, J., Bernardes, R., Lobo, C. Blood-retinal barrier. J Ophthalmol. 21, 3(2011).
  2. Kim, J. H., et al. Blood-neural barrier: intercellular communication at glio-vascular interface. J Biochem Molec Biol. 39, 339-345 (2006).
  3. Kumagai, A. K. Glucose transport in brain and retina: implications in the management and complications of diabetes. Diabetes Metab Res Rev. 15, 261-273 (1999).
  4. Runkle, E. A., Antonetti, D. A. The blood-retinal barrier: structure and functional significance. Methods Molec Biol. 686, Clifton, N.J. 133-148 (2011).
  5. Takata, K., Hirano, H., Kasahara, M. Transport of glucose across the blood-tissue barriers. Int Rev Cytol. 172, 1-53 (1997).
  6. Goncalves, A., Ambrosio, A. F., Fernandes, R. Regulation of claudins in blood-tissue barriers under physiological and pathological states. Tissue Barriers. 1, 24782(2013).
  7. Patton, N., et al. Retinal image analysis: concepts, applications and potential. Prog Ret Eye Res. 25, 99-127 (2006).
  8. Di Marco, L. Y., et al. Vascular dysfunction in the pathogenesis of Alzheimer's disease--A review of endothelium-mediated mechanisms and ensuing vicious circles. Neurobiol Dis. 82, 593-606 (2015).
  9. Nagele, R. G., et al. Brain-reactive autoantibodies prevalent in human sera increase intraneuronal amyloid-beta(1-42) deposition. J Alzheimer's Dis: JAD. 25, 605-622 (2011).
  10. Goldwaser, E., Acharya, N., Nagele, R. Cerebrovascular and blood-brain barrier compromise: A mechanistic link between vascular disease and Alzheimer's disease subtypes of neurocognitive disorders. J Parkinsons Dis Alzheimer's Dis. 2, 10(2015).
  11. Horton, N. G., et al. In vivo three-photon microscopy of subcortical structures within an intact mouse brain. Nat Photonics. 7, (2013).
  12. Sedeyn, J. C., et al. Histamine Induces Alzheimer's Disease-Like Blood Brain Barrier Breach and Local Cellular Responses in Mouse Brain Organotypic Cultures. Biomed Res Int. 2015, 937148(2015).
  13. Avdeef, A., Deli, M. A., Neuhaus, W. Blood-Brain Barrier in Drug Discovery: Optimizing Brain Exposure of CNS Drugs and Minimizing Brain Side Effects for Peripheral Drugs. Di, L., Kerns, E. H. , John Wiley & Sons, Inc. Ch. 10 188(2014).
  14. Eigenmann, D. E., et al. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluids Barriers CNS. 10, 33(2013).
  15. Takeshita, Y., et al. An in vitro blood-brain barrier model combining shear stress and endothelial cell/astrocyte co-culture. J Neurosci Methods. 232, 165-172 (2014).
  16. Alberghina, M., Lupo, G., Anfuso, C. D., Moro, F. Palmitate transport through the blood-retina and blood-brain barrier of rat visual system during aging. Neurosci Lett. 150, 17-20 (1993).
  17. Hosoya, K., Yamamoto, A., Akanuma, S., Tachikawa, M. Lipophilicity and transporter influence on blood-retinal barrier permeability: a comparison with blood-brain barrier permeability. Pharm Res. 27, 2715-2724 (2010).
  18. Minamizono, A., Tomi, M., Hosoya, K. Inhibition of dehydroascorbic acid transport across the rat blood-retinal and -brain barriers in experimental diabetes. Biol Pharm Bull. 29, 2148-2150 (2006).
  19. Serlin, Y., Levy, J., Shalev, H. Vascular pathology and blood-brain barrier disruption in cognitive and psychiatric complications of type 2 diabetes mellitus. Cardiovasc Psychiatry Neurol. 2011, 609202(2011).
  20. Kolb, H. How the retina works - Much of the construction of an image takes place in the retina itself through the use of specialized neural circuits. Am Sci. 91, 28-35 (2003).
  21. Ikram, M. K., Cheung, C. Y., Wong, T. Y., Chen, C. P. Retinal pathology as biomarker for cognitive impairment and Alzheimer's disease. J Neurol Neurosurgery Psychiatry. 83, 917-922 (2012).
  22. Tan, Z., Ge, J. Amyloid-beta, the retina, and mouse models of Alzheimer disease. Am J Pathol. 176, 2055(2010).
  23. Serhan, C. N. Pro-resolving lipid mediators are leads for resolution physiology. Nature. 510, 92-101 (2014).
  24. Bucolo, C., et al. Effects of topical indomethacin, bromfenac and nepafenac on lipopolysaccharide-induced ocular inflammation. J Pharm Pharmacol. 66, 954-960 (2014).
  25. Edelman, J. L., Lutz, D., Castro, M. R. Corticosteroids inhibit VEGF-induced vascular leakage in a rabbit model of blood-retinal and blood-aqueous barrier breakdown. Exp Eye Res. 80, 249-258 (2005).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Leczenie histaminlipoksyna A4immunostaining IgGbarwienie GFAPbarwienie MAP2mikroskopia konfokalnahodowla ex vivoprzesiewanie lek w
Model ostrej siatkówki do oceny naruszenia bariery siatkówkowej krwi i potencjalnych leków do leczenia
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.