Genotypowanie Staphylococcus aureus metodą Ribosomal Spacer PCR (RS-PCR)

Podsumowanie

Tutaj, rybosomalny dystans PCR (RS-PCR) jest używany razem ze zminiaturyzowanym systemem elektroforezy jako szybka i wysokorozdzielcza metoda genotypowania S. aureus przy umiarkowanych kosztach, pozwalająca na wysoką przepustowość.

Streszczenie

Rybosomalny dystans PCR (RS-PCR) to wysoce rozdzielcza i solidna metoda genotypowania S. aureus, która pozwala na wysoką przepustowość przy umiarkowanych kosztach i dlatego nadaje się do rutynowych celów. Aby uzyskać najlepszą rozdzielczość, ocenę danych i zarządzanie danymi, wymagany jest zminiaturyzowany system elektroforezy. Wraz z takim systemem elektroforezy i opracowanym przez nas oprogramowaniem (dostępnym bezpłatnie tutaj) przypisanie wzoru prążków do genotypu jest ustandaryzowane i proste. Ekstrakcja DNA jest prosta (przygotowanie do wrzenia), ustawienie reakcji jest łatwe i można je uruchomić na dowolnej standardowej maszynie do PCR. Cykle PCR są powszechne, z wyjątkiem wydłużonych czasów narastania i wydłużania. W porównaniu do typowania spa i typowania sekwencyjnego w wielu miejscach (MLST), RS-PCR nie wymaga sekwencjonowania DNA, co znacznie upraszcza analizę i pozwala na wysoką przepustowość. Co więcej, rozdzielczość dla bydlęcych szczepów S. aureus jest co najmniej tak dobra, jak typowanie uzdrowiskowe i lepsza niż MLST lub elektroforeza żelowa w polu pulsacyjnym (PFGE). Baza danych RS-PCR obejmuje obecnie łącznie 141 genotypów i wariantów. Metoda ta jest silnie związana z wzorcem genów zjadliwości, zaraźliwością i patogennością szczepów S. aureus biorących udział w zapaleniu wymienia u bydła. S. aureus genotyp B (GTB) jest zaraźliwy i powoduje problemy w stadach, powodując duże koszty w Szwajcarii i innych krajach europejskich. Wszystkie inne genotypy zaobserwowane w Szwajcarii infekują pojedyncze krowy i ćwiartki. Genotypowanie metodą RS-PCR pozwala na wiarygodne przewidywanie potencjału epidemiologicznego i patogennego S. aureus zaangażowanego w zakażenie śródsutkowe bydła (IMI), dwóch kluczowych czynników dla klinicznej medycyny weterynaryjnej. Ze względu na te korzystne właściwości, w połączeniu z umiarkowanymi kosztami i wysoką przepustowością próbek, celem tej publikacji jest przedstawienie szczegółowego, krok po kroku protokołu łatwego tworzenia i przeprowadzania RS-PCR do genotypowania S. aureus w innych laboratoriach.

Wprowadzenie

Staphylococcus (S. aureus) jest znany jako najważniejszy patogen na świecie odpowiedzialny za infekcję wewnątrzsutkową (IMI) u bydła ¹. Badanie przeprowadzone przez Fourniera i wsp.2 przeprowadzone na krowach szwajcarskich oraz badania przeprowadzone przez Cosandeya i wsp. ³ i Boss i wsp. ⁴ u krów z 12 krajów europejskich, które S. aureus wyizolował z IMI bydła, jest genetycznie niejednorodną grupą. Poprzez amplifikację PCR międzygenowego regionu dystansowego 16S-23S rRNA (RS-PCR) początkowo wykryto łącznie 17 genotypów w 101 epidemiologicznie niezależnych izolatach ². Genotyp B i genotyp C (GTC) występowały najczęściej (80%), podczas gdy pozostałe 15 genotypów (GT) występowało rzadko, z których każdy stanowił od 1 do 4% wszystkich izolatów. Na poziomie ^{europejskim 3} najważniejszymi genotypami były GTB, GTC, GTF, GTI i GTR stanowiące 76% wszystkich analizowanych szczepów (n = 456). GTB znajdował się w Europie Środkowej, podczas gdy inne genotypy były szeroko rozpowszechnione. Pozostałe 24% szczepów obejmowało 41 genotypów, jednak wiele z nich zaobserwowano tylko raz.

Badania przeprowadzone przez Fourniera i wsp. ², Cosandey i wsp. ³ oraz Graber i wsp. ⁵ wykazało ponadto, że genotypy były silnie powiązane z ich wzorcem genów wirulencji, zarówno na poziomie szwajcarskim, jak i europejskim. Badania wykazały ponadto ogromne różnice w rozpowszechnieniu IMI między S. aureus GTB, GTC i innymi genotypami ^2,5: biorąc pod uwagę GTB, do 87% krów w stadzie było zakażonych tym genotypem. Jednak w przypadku GTC i innych genotypów IMI stwierdzono tylko u 1 do 2 krów w stadzie.

IMI wywołany przez S. aureus, zwykle powoduje zapalenie odpowiednich gruczołów sutkowych i wzrost komórek zapalnych w mleku. W konsekwencji zwiększa się liczba komórek somatycznych w mleku (SCC), kluczowy wskaźnik jakości mleka w większości krajów, co prowadzi do obniżenia ceny mleka, a nawet wstrzymania dostawy.

Oprócz RS-PCR Fourniera i wsp. ², opisano inne metody typowania dla podtypów szczepów bydlęcych S. aureus ^8-11. Dwa popularne z nich to pisanie w spa ¹² i pisanie sekwencyjne w wielu miejscach (MLST) ¹³. Pierwsza z nich opiera się na sekwencjonowaniu DNA regionu zmiennego odstępu genu gronkowcowego uzdrowiska kodującego białko A, podczas gdy druga wymaga sekwencjonowania 7 genów porządkowych. Oznacza to, że należy wykonać odpowiednio jeden ¹² i siedem PCR ¹³, a następnie oczyścić amplikon, reakcję sekwencjonowania i analizę przy użyciu specjalnego sprzętu. W porównaniu z RS-PCR, metody te wymagają znacznego dodatkowego wysiłku w laboratorium, co skutkuje niską przepustowością próbki i wysokimi kosztami. Przepustowość jest szczególnie niska w przypadku PFGE. Biorąc pod uwagę rozdzielczość tych metod dla bydlęcych szczepów S. aureus, RS-PCR jest co najmniej tak dobry, jak typ uzdrowiskowy ⁴ i lepszy niż MLST ⁴ lub PFGE ¹⁵.

Wszystkie te metody, w tym binarne typowanie ¹³, wykazały swoją skuteczność w uzyskiwaniu dalszych informacji na temat patogenezy IMI bydła wywoływanego przez S. aureus, ale z powodu wspomnianych ograniczeń są mniej odpowiednie dla dużych badań klinicznych. Ponadto genotypowanie metodą RS-PCR, jak opisano przez Fourniera i wsp.2, pozwala na wiarygodne przewidywanie potencjału epidemiologicznego i chorobotwórczego S. aureus zaangażowanego w IMI bydła, dwóch kluczowych wartości w klinicznej medycynie weterynaryjnej.

Protokół

1. Izoluje Staphylococcus aureus

1. Rozprowadzić 10 μl kultury podstawowej S. aureus lub jednej kolonii wyhodowanej na selektywnym podłożu na płytkach agarowych Columbia zawierających 5% krwi owczej (BA).
2. Inkubować w warunkach tlenowych w temperaturze 37 °C przez 18 godzin do 24 godzin.

2. Ekstrakcja DNA

1. Przygotować bufor TEL zawierający 10 mM Tris-HCl i 10 mM Na₂EDTA, pH 8,5. Przygotować podwielokrotności i sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 15 min.
2. Zbierz 1 kolonię z BA za pomocą sterylnej plastikowej pętelki lub sterylnej drewnianej wykałaczki i ponownie zawieś w 100 μl TEL. Użyj probówek o pojemności 1,5 ml z zakrętkami.
3. Inkubować w temperaturze 95 °C przez 10 minut. Następnie natychmiast umieścić próbki na mokrym lodzie.
4. Rozcieńczyć próbki w stosunku 1:100 w_H2Oodpowiednich do PCR (= matryca DNA do PCR). Nierozcieńczone i rozcieńczone próbki można przechowywać w temperaturze -20 °C przez 1 miesiąc.

3. RS-PCR

1. Na każdą próbkę odpipetować do probówki PCR: 1,5 μl_H2O, 12,5 μl Taq Master Mix, 2 μl G1 starter 10 μM, 2 μl L1 starter 10 μM i 7 μl matrycowego DNA, co odpowiada około 30 ng czystego DNA ².
2. Uruchom następujący program cykliczny w standardowym cyklerze PCR: 15 min 95 °C, następnie 27 cykli obejmujących 94 °C przez 1 min, a następnie 2-minutowa rampa i wyżarzanie w temperaturze 55 °C przez 7 min. Po kolejnych 2 minutach rozciągnąć w temperaturze 72 °C na 2 minuty. Przerwać PCR przez końcowe przedłużenie w temperaturze 72 °C na 10 minut, a następnie schłodzić do 4 °C.
   UWAGA: Produkty PCR można przechowywać w temperaturze -20 °C przez 5 dni.
3. Dla każdej serii RS-PCR należy uwzględnić kontrolę dodatnią, tj. próbkę o znanym genotypie (zwykle GTB) i kontrolę ujemną (_H2O).

4. Elektroforeza

1. Użyj komercyjnego zminiaturyzowanego zestawu do elektroforezy DNA (zestaw MED) wraz z bioanalizatorem podłączonym do komputera i zainstalowanym oprogramowaniem. Uważnie zapoznaj się z odpowiednimi instrukcjami producenta.
2. Ustawić stację zasysania wiórów i wyregulować zacisk strzykawki zgodnie z instrukcją producenta.
3. Przygotuj mieszankę żelu i barwnika zgodnie z instrukcją producenta.
4. Ładowanie mieszanki żelowo-barwnikowej (zgodnie z instrukcją producenta).
   1. Przed użyciem należy zrównoważyć mieszankę żelu i barwnika do RT przez 30 minut.
   2. Umieść nowy chip DNA na stacji do zasysania chipów. Odpipetować 9 μl barwnika żelowego w dobrze oznaczonej literze G.
   3. Upewnij się, że tłok jest umieszczony na poziomie 1 ml, a następnie zamknij stację zasysania wiórów. Nacisnąć tłok, aż zostanie przytrzymany przez zacisk strzykawki. Odczekać dokładnie 30 sekund, a następnie zwolnić zacisk strzykawki.
   4. Odczekać 5 sekund. Powoli odciągnąć tłok do pozycji 1 ml.
   5. Otwórz stację zasysania wiórów i odpipetuj 9 μl barwnika żelowego w obu studzienkach oznaczonych literą "G".
5. Ładowanie znacznika
   1. Odpipetować 5 μl markera we wszystkich 12 dołkach na próbki i w studzience drabinkowej. Nie zostawiaj żadnej z tych 13 studzienek pustych.
6. Załadunek drabiny i próbek.
   1. Odpipetować 1 μl drabinki DNA do dobrze oznaczonego znakiem drabinki.
   2. Odpipetować 1 μl próbki (zużyte studzienki) lub 1 μl wody dejonizowanej (nieużywane studzienki).
   3. Umieść chip poziomo w adapterze i wiruj przez 1 minutę przy 2,400 obr./min.
   4. Uruchom chip w bioanalizatorze w ciągu 5 minut.
7. Uruchamianie analizy
   1. Uruchom bioanalizator i podłączony komputer. Otwórz oprogramowanie.
   2. Otwórz pokrywę bioanalizatora i umieść chip w uchwycie na wióry (chip pasuje tylko w jeden sposób). Ostrożnie zamknij pokrywę.
   3. W kontekście urządzenia w oprogramowaniu wybierz "Elektroforeza" > "dsDNA" > "DNA 7500". Zaakceptuj bieżący prefiks pliku oprogramowania lub zmodyfikuj go.
   4. Kliknij przycisk Start znajdujący się w oprogramowaniu. Wprowadź przykładowe nazwy w oprogramowaniu. Po zakończeniu przebiegu chipa (po około 30 minutach) w oprogramowaniu bioanalizatora pojawia się komunikat o końcu pracy.
   5. Wyjmij chip i wyczyść elektrody bioanalizatora zgodnie z instrukcjami producenta.

5. Wnioskowanie o genotypie na podstawie profilu elektroforezy

1. Załaduj oprogramowanie Mahal (oprogramowanie jest dostępne bezpłatnie u autorów).
2. Importuj dane referencyjne do oprogramowania Mahal: "Plik" > "Importuj dane referencyjne"
3. Otwórz elektroforezę uruchomioną w kontekście danych oprogramowania bioanalizatora. Wybierz profil elektroforezy dla jednej próbki.
4. Sprawdź, czy są odpowiednie szczyty.
   1. Użyj oprogramowania Mahal, aby sprawdzić odpowiednie piki: "Narzędzia" > "Średnia fluorescencja". Wprowadź w polu "Fluorescencja" wartości fluorescencji wskazane jako jednostki fluorescencji (FU), tak jak można je odczytać z oprogramowania bioanalizatora. Wstaw 4 (3) piki o najwyższej fluorescencji w kolejności rosnącej i oddzielone przecinkiem. Przykład: 126 130 132 137.
      UWAGA: Jeśli nie wszystkie z tych pików FU są wskazane przez oprogramowanie bioanalizatora, należy je oszacować, odczytując je z wykresu.
5. Naciśnij przycisk "Oblicz". Pik jest istotny, jeśli obserwowana fluorescencja przekracza wartość podaną w rubryce "Minimalna wysokość piku".
6. Wywnioskuj genotyp.
   1. Wstaw do pola tekstowego Mahal "Piki wejściowe (bp)" rozmiary w bp wszystkich odpowiednich pików w kolejności rosnącej i oddzielone przecinkami. Przykład: 440 462 519 579 637.
      UWAGA: Jeśli nie wszystkie z tych rozmiarów pików są wskazane przez oprogramowanie bioanalizatora, należy je oszacować, odczytując je z wykresu.
7. Naciśnij przycisk "Oblicz".
8. W polu listy poszukaj minimalnej kwadratowej odległości Mahalanobisa "d2m". Jeśli odpowiadająca mu wartość P wynosi ≥0,05, to prawdopodobieństwo odrzucenia hipotezy zerowej H₀ wynosi ≥5% (H₀: profil obserwowany i profil referencyjny są identyczne), co oznacza, że obserwowany profil jest akceptowany jako identyczny z profilem referencyjnym wskazanego genotypu.
9. Jeśli d2m jest minimalne, ale pole odpowiadającej mu wartości P jest puste, odrzuć H₀ z prawdopodobieństwem <5%.
   UWAGA: Oznacza to, że profile są nierówne, chociaż d2m jest minimalne. Taki wynik może wynikać z nietypowych warunków elektroforezy.
   1. Aby skorygować te odchylenia, wstaw w polu tekstowym "Obserwowany szczyt (bp)" wartość 395 i naciśnij przycisk "Oblicz". Sprawdź ponownie, czy wartość d2m jest minimalna i odpowiada jej wartość P ≥0,05. Jeśli to się nie powiedzie, spróbuj użyć wartości 405, 415 i 425,
      UWAGA: Czasami wskazane są nawet mniejsze kroki. Jeśli nadal się nie powiedzie, obserwowany profil nie jest obecny w danych referencyjnych, może to być nowy genotyp lub wariant.
10. Różne profile
    1. Powtórz kroki od 5.6 do 5.9 dla każdego profilu elektroforezy osobno.

Wyniki

Definicja genotypu i jego wariantów

Profil elektroforetyczny różniący się więcej niż jednym prążkiem od wszystkich zidentyfikowanych genotypów jest uznawany za nowy genotyp. Nowe genotypy są nazywane i rozszerzane zgodnie z metodą Fournier et al. ⁵, co doprowadziło do powstania genotypów od GTA do GTZ, a następnie od GTAA do GTAZ, GTBA do GTBZ oraz obecnie od GTCA do GTCC. Zmienność w obrębie tylko jednego pr...

Dyskusja

Najbardziej krytycznym etapem całej procedury jest nadmiar DNA w RS-PCR (>30 ng czystego DNA/test) ². Ogólnie rzecz biorąc, rozdzielczość profilu jest optymalna, jeśli wszystkie jego szczyty zaczynają się i kończą na linii bazowej. Jeśli dwa szczyty znajdują się zbyt blisko siebie, rozdzielczość jest niepełna. W takich warunkach oprogramowanie bioanalizatora może prowadzić do niewłaściwej identyfikacji pików, tak że wymagana jest identyfikacja ręczna.

Wszystkie wyraźnie oddzielone i...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Tris(hydroksymetylo)-aminometan	Merck	1,08382,0500	Mw = 121,14 g/mol
Titriplex III	Merck	1,08418,0250	Mw = 372,24 g/mol; Substancja jest równoważna Na2EDTA· 2H2O
Kwas solny 5 mol/L	Merck	1.09911.0001
Agar Columbia + 5%	bioM&eaostry we krwi owczej; rieux	43049
Zestaw DNA7500 Agilent	Technologies	5067-1504
Bioanalizator Agilent 2100	Agilent Technologies	G2940CA
Oprogramowanie eksperckie Agilent 2100	Agilent Technologies
HotStarTaq master mix	Qiagen	203445
Primer L1	Mycrosinth		5'CAA GGC ATC CAC CGT3'Podkład
G1	Mycrosinth		5'GAA GTC GTA ACA AGG3'