Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Techniki empiryczne, metagenomiczne i obliczeniowe rzucają światło na mechanizmy, za pomocą których fungicydy zagrażają zdrowiu pszczół

9.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54631

⸱

9 października 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Vegetable Crop Research Unit, USDA-ARS, 2Department of Entomology, University of Wisconsin-Madison, 3Department of Horticulture, University of Wisconsin-Madison, 4Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agricolas y Pecuarias, 5Department of Bacteriology, University of Wisconsin-Madison, 6Laboratory of Genetics, Genome Center of Wisconsin, 7DOE Great Lakes Bioenergy Research Center, Wisconsin Energy Institute, 8J.F. Crow Institute for the Study of Evolution, University of Wisconsin-Madison

W tym artykule

Podsumowanie

Konsorcja mikrobiologiczne w ulach trzmieli wzbogacają i zachowują pyłek dla larw pszczół. Wykorzystując sekwencjonowanie nowej generacji, wraz z eksperymentami laboratoryjnymi i terenowymi, manuskrypt ten opisuje protokoły stosowane do testowania hipotezy, że pozostałości fungicydów zmieniają mikrobiom pyłku i demografię kolonii, ostatecznie prowadząc do utraty kolonii.

Streszczenie

Hodowcy często używają oprysków fungicydami podczas kwitnienia, aby chronić uprawy przed chorobami, które narażają pszczoły na pozostałości fungicydów. Chociaż uważa się, że jest to "bezpieczne dla pszczół", istnieje coraz więcej dowodów na to, że pozostałości fungicydów w pyłku są związane ze spadkiem liczebności pszczół (zarówno w przypadku gatunków pszczół miodnych, jak i trzmieli). Chociaż mechanizmy pozostają stosunkowo nieznane, naukowcy spekulują, że w grę wchodzą symbiozy pszczół i mikroorganizmów. Drobnoustroje odgrywają kluczową rolę w konserwacji i/lub przetwarzaniu pyłku, który służy jako pożywienie dla larw pszczół. Zmieniając społeczność mikrobiologiczną, prawdopodobne jest, że fungicydy zakłócają te usługi, w których pośredniczą drobnoustroje, a tym samym zagrażają zdrowiu pszczół. Niniejszy manuskrypt opisuje protokoły stosowane do badania pośrednich mechanizmów, za pomocą których fungicydy mogą powodować spadek liczebności kolonii. Eksperymenty z klatkami, w których pszczoły miały kontakt z kwiatami poddanymi działaniu fungicydów, dostarczyły już pierwszych dowodów na to, że fungicydy powodują głębokie straty w koloniach trzmieli (Bombus impatiens). Wykorzystując dawki fungicydów odpowiednie dla pola polowego, opracowano serię eksperymentów, aby zapewnić dokładniejszy opis dynamiki społeczności mikrobiologicznej pyłku narażonego na działanie fungicydów. Zmiany w składzie strukturalnym zbiorowisk grzybów i bakterii w obrębie mikrobiomu pyłku są badane za pomocą sekwencjonowania nowej generacji i analizy metagenomicznej. Eksperymenty opracowane w tym artykule zostały zaprojektowane w celu zapewnienia mechanistycznego zrozumienia, w jaki sposób fungicydy wpływają na mikrobiom zaopatrzenia w pyłek. Ostatecznie odkrycia te powinny rzucić światło na pośrednią ścieżkę, przez którą fungicydy mogą powodować spadek liczebności kolonii.

Wprowadzenie

Gatunki dzikich pszczół zarządzanych i dzikich doświadczają powszechnego spadku, co ma poważne konsekwencje zarówno dla systemów naturalnych, jak i rolniczych1. Pomimo wspólnych wysiłków zmierzających do zrozumienia przyczyn tego problemu, czynniki powodujące spadek liczebności pszczół miodnych nadal nie są dobrze poznane2,3,4. W przypadku niektórych gatunków dzikich, rodzimych pszczół sytuacja stała się tragiczna5,6. Jeśli populacje pszczół nie mogą być utrzymane, gdy krzyżują się z rolnictwem przemysłowym, ich populacje będą nadal spadać, a uprawy wymagające zapylaczy (35% światowej produkcji7) będą miały zmniejszone zbiory.

Chociaż wiele potencjalnych czynników, takich jak narażenie na pestycydy, choroby i utrata siedlisk1,4,8,9,10 było związanych z wyginięciem pszczół miodnych, stosunkowo niewiele wiadomo na temat interaktywnego wpływu tych czynników stresogennych na zdrowie rodzimych pszczół, w systemach rolniczych lub w ich pobliżu. Wiele obecnych wysiłków badawczych nadal koncentruje się na insektycydach (np. neonikotynoidy11,12), chociaż wcześniejsze badania wskazują, że fungicydy mogą również odgrywać rolę w spadku liczebności pszczół poprzez upośledzenie tworzenia pamięci, odbioru węchowego13, nest recognition14, aktywność enzymów i funkcje metaboliczne15,16,17. Na całym świecie fungicydy są nadal stosowane do roślin kwitnących podczas kwitnienia. Ostatnie badania udokumentowały, że pszczoły często przynoszą pozostałości fungicydów z powrotem do ula18, rzeczywiście, badania wykazały, że duża część testowanych uli zawierała pozostałości fungicydów19,20. Dalsze prace wykazały, że pozostałości fungicydów są związane z wysokimi wskaźnikami śmiertelności larw pszczół miodnych21,22,23 oraz obecność "pogrzebanego pyłku" w koloniach, który choć nietoksyczny, jest pozbawiony aktywności mikrobiologicznej i jest upośledzony pod względem odżywczym24. Pomimo faktu, że fungicydy od dawna są uważane za "bezpieczne dla pszczół", obecnie istnieją dowody na to, że narażenie na sam fungicyd może spowodować poważne straty w koloniach u rodzimego gatunku trzmieli, Bombus impatiens25.

Aby ustalić związek przyczynowo-skutkowy między ekspozycją na fungicydy a śmiertelnością kolonii, należy określić sposób działania tych chemikaliów. Jak wykazano w soils26, sediments27 i środowiskach wodnych28, atakując grzyby, fungicydy najprawdopodobniej zmieniają obfitość i różnorodność grzybów w obrębie zasobów pyłkowych, wywołując w ten sposób poważną zmianę społeczności, która może zdecydowanie faworyzować bakterie. Bez konkurentów lub antagonistów grzybów, niektóre bakterie chorobotwórcze mogą namnażać się stosunkowo niekontrolnie, ułatwiając psucie się zapasów pyłku. Wcześniejsze badania wykazały, że mikroorganizmy, w szczególności drożdże i grzyby strzępkowe, służą jako symbionty odżywcze dla pszczół29,30,31, chronią przed pasożytami i patogenami32,33 i zapewniają długoterminową ochronę magazynów pyłku. Fungicydy mogą zatem pośrednio szkodzić niedojrzałym pszczołom, zaburzając zbiorowość drobnoustrojów, która jest potrzebna do świadczenia tych usług i/lub zwiększając podatność na oportunistyczne patogeny i pasożyty12. Wraz z rosnącym zapotrzebowaniem na produkcję żywności, uprawy na całym świecie są co roku opryskiwane fungicydami w okresie kwitnienia, co podkreśla potrzebę zrozumienia skali takich skutków wywołanych fungicydami.

Do tej pory, podstawowe luki w wiedzy dotyczące rodzimej ekologii mikrobiologicznej pszczół można przedstawić za pomocą następujących pytań: W jakim stopniu fungicyd zmienia społeczność mikrobiologiczną w zakresie zaopatrzenia w pyłek pszczeli? Jakie są dalsze skutki spożywania pyłku w przypadku głęboko zmienionej społeczności mikrobiologicznej? Zgodnie z tymi ekologicznie niemieckimi pytaniami, opracowano eksperymenty, których głównym celem było ujawnienie: 1) że same pozostałości fungicydów mogą powodować poważny spadek liczby kolonii u rodzimych gatunków pszczół; 2) stopień, w jakim zbiorowiska mikrobiologiczne w zaopatrzeniu w pyłek są zmieniane przez fungicydy, oraz 3) jak na zdrowie pszczół wpływa poważnie zmieniona społeczność mikrobiologiczna. Cele eksperymentu zostały zdefiniowane w celu odpowiedzi na powyższe pytania przy użyciu kombinacji eksperymentów laboratoryjnych i terenowych. Wykorzystując najnowocześniejsze techniki metagenomiczne i molekularne wraz z tradycyjnymi metodami obserwacji terenowej, badania te mają na celu zebranie w całość potencjalnego wpływu fungicydów na zdrowie pszczół.

Pierwszym celem tego badania jest wykazanie, że samo narażenie na fungicydy może spowodować znaczne straty w koloniach wśród rodzimych gatunków pszczół. Badanie z udziałem dużych klatek polowych wykorzystano do zbadania wpływu ekspozycji na fungicydy na wzrost kolonii Bombus impatiens, wszechobecnej, licznie występującej rodzimej pszczoły w USA (Rysunek 1, Rysunek 2, Rysunek 3). Postawiono hipotezę, że ule traktowane fungicydami będą charakteryzować się niższą przydatnością i nietypową demografią w porównaniu z ulami nienarażonymi. Dane uzyskane w tym eksperymencie potwierdziły tę hipotezę, wykazując, że pozostałości fungicydów w pyłku mogą być jedyną przyczyną głębokich strat kolonii u rodzimych gatunków trzmieli25. Drugim celem tego badania jest zbadanie odpowiedzi mikrobiomu pyłkowego na ekspozycję na fungicydy. Przypuszcza się, że skład zbiorowisk drobnoustrojów w obrębie pyłków narażonych na działanie fungicydów będzie inny niż w pyłku nieleczonym. Chociaż oczekuje się, że liczebność i różnorodność grzybów znacznie spadnie, bakterie i/lub pojedynczy dominujący gatunek grzybów prawdopodobnie będą rosły w sposób niekontrolowany pod nieobecność innych konkurencyjnych grzybów. Dzięki serii badań in vivo te zmiany w składzie społeczności drobnoustrojów zostaną przeanalizowane za pomocą metagenomiki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Zbadaj wpływ ekspozycji na fungicydy na sukces kolonii trzmieli za pomocą eksperymentów w klatkach polowych

  1. Ustaw dziesięć siatkowych klatek na polu obsadzonym owsem. Wykop rów wokół każdej klatki i wkop wszystkie cztery krawędzie klatki siatkowej w ziemię, aby pszczoły nie mogły uciec. Zaopatrz klatki w doniczkowe, kwitnące rośliny, o których wiadomo, że są atrakcyjne dla pszczół (np. gryka, ogórecznik, alyssum, kosmos i słoneczniki) (Rysunek 2).
  2. Uzupełnij klatki pojedynczą tacą (36 cm x 42 cm) kwitnącej koniczyny. Skupisko zasobów kwiatowych w jednym rogu klatki, zajmując przestrzeń o wymiarach około 2,5 m x 1 m. Pozostałą powierzchnię klatki wegetuj owsem.
  3. Losowo przypisz koloniom trzmieli, z których każda zawiera robotnice i jedną królową, zabieg (fungicyd obecny/nieobecny, N = 5 kolonii na zabieg, łącznie 10 kolonii), a następnie umieść je w klatce polowej (N = 1/klatkę) na 29 dni (23 czerwca - 21 lipca 2014 r.).
  4. Ustaw skrzynki kolonijne tak, aby otwory kolonii były skierowane na południe, aby zapewnić pszczołom optymalne warunki nawigacyjne. Dofinansuj kolonie pęcherzami z wodą z cukrem, umieszczonymi w skrzynkach ula, aby uzupełnić dostępność nektaru.
  5. Fungicyd na bazie chlorotalonilu należy zastosować na poziomie odpowiednim dla pola (20 g/l) na rośliny kwitnące w pięciu klatkach do stosowania fungicydów, używając ręcznego opryskiwacza do pestycydów, dwa razy w trakcie badania (dzień 0 i 13). Pokryj kwiaty równomiernie, tak aby żaden płyn nie przylegał do powierzchni kwiatowych (Rysunek 3).
  6. Na zakończenie badania w klatkach polowych należy ręcznie usunąć kolonie B. impatiens z klatek, schłodzić ule, umieszczając je w zamrażarce w temperaturze -20 °C na 20 minut.
  7. Usuń pszczoły za pomocą sterylnych kleszczy i zapisz liczbę larw, poczwarek, dorosłych samic (i.e. zbieracze) i dorosłe samce. Za pomocą wagi analitycznej należy odnotować suchą masę matki, matki, larw, poczwarek, dorosłych samic (tj. zbieraczy) i dorosłych samców.

2. Zbadaj wpływ ekspozycji na fungicydy na społeczności mikrobiologiczne w zapasach pyłku w gniazdach trzmieli, korzystając z laboratoryjnych prób in vivo

  1. Sproszkować zakupiony w handlu pyłek na drobny proszek za pomocą standardowego laboratoryjnego młyna kulowego. Sterylizuj sproszkowany pyłek, mocząc go w 70% etanolu, pozwalając mu odparować przez noc w świetle UV. Sprawdź sterylność pyłku, posiewając ~0,5 mg na pożywkach agarowych ogólnego przeznaczenia.
    1. Do suchego, wysterylizowanego pyłku za pomocą wysterylizowanych pipet dodać odpowiednią dla pola dawkę fungicydu: propikonazol w stężeniu 14,3%; azoksystrobina w dawce 22,9% do zabiegów (odpowiednio 0,74 μl i 0,65 μl / dzień / ul). Dobrze wymieszaj za pomocą wysterylizowanych drewnianych patyczków.
  2. Umieść 6 uli doświadczalnych (n = 3 każdy do kontroli i leczenia) na czystym, higienicznym stole laboratoryjnym utrzymywanym w temperaturze pokojowej. Każdego dnia waż 4,27 g pyłku34,35 zmieszanego z fungicydami (do zabiegów) lub sterylną wodą (do kontroli) wewnątrz kaptura przy użyciu standardowej techniki aseptycznej.
    1. Korzystając z klap znajdujących się po stronie kartonu otaczającego ule, wprowadź pyłek do wnętrza uli. Co tydzień uzupełniaj ule wysterylizowanym roztworem cukru. Kontynuuj karmienie przez cztery tygodnie.
  3. Po zakończeniu badania laboratoryjnego schłodzić ule, umieszczając je w zamrażarce w temperaturze -20 °C na 20 minut. Za pomocą wysterylizowanych kleszczy i szpatułek zeskrobać zapasy pyłku znajdujące się w komorach lęgowych i umieścić je w sterylnych probówkach do przechowywania. Przechowywać w temperaturze -80 °C. Policz i zapisz masę robotnic i matki na początku i na końcu doświadczenia (etap 1.7).
  4. Wyizolować DNA z próbki pobierającej pyłek za pomocą dostępnych na rynku zestawów do izolacji DNA (szczegółowe informacje znajdują się w tabeli materiałów).
    1. Dodać 0,25 g preparatu pyłkowego do probówek ekstrakcyjnych, krótko zwirować do wymieszania.
    2. Przygotować roztwór lizozymu o stężeniu 200 mg/ml w dejonizowanej wodzie destylowanej, wystarczający na 50 μl / próbkę. Wstrząśnij energicznie, aż całkowicie utworzy roztwór.
    3. Dodać 50 μl roztworu lizozymu do probówek ekstrakcyjnych z próbką w środku i dobrze wymieszać, kilkakrotnie odwracając. Inkubować probówkę przez 10 minut w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej. Jeśli utworzył się osad, przed użyciem podgrzać roztwór do temperatury 60 °C aż do rozpuszczenia.
    4. Dodać 70 μl wodnego roztworu do lizy do probówek ekstrakcyjnych, zabezpieczyć poziomo na płaskiej podkładce wirowej z taśmą i wirować przez 10 minut. Probówki wirowe o sile 10 000 x g przez 30 s w temperaturze pokojowej.
    5. Przenieść sklarowany osad do czystej probówki zbiorczej o pojemności 2 ml. Dodaj 250 μl roztworu do wytrącania białek i wiruj przez 5 sekund. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 5 minut w łaźni lodowej.
      UWAGA: Spodziewaj się od 400 μl do 500 μl supernatantu. Supernatant może nadal zawierać pewne cząstki.
    6. Odwirować probówki w temperaturze pokojowej przez 1 minutę przy 10 000 x g i przenieść do 600 μl supernatantu do czystej probówki zbiorczej o pojemności 2 ml. Dodać 200 μl wodnego roztworu do usuwania inhibitorów, krótko zmieszać i inkubować w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Odwirować probówki w temperaturze pokojowej przez 1 minutę przy 10 000 x g. Przenieść do 750 μl supernatantu do czystej probówki zbiorczej o pojemności 2 ml.
    7. Dodać 1200 μl wodnego roztworu wiążącego do supernatantu i wirować przez 5 s. Załadować około 675 μl supernatantu na filtr wirowy i odwirować przy 10 000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej. Odrzuć przepływ.
    8. Powtórz 2.4.7. dwa razy.
      UWAGA: Wymagane są łącznie trzy ładunki dla każdej przetwarzanej próbki.
    9. Dodać 500 μl etanolu i wirować w temperaturze pokojowej przez 30 s przy 10 000 x g. Odrzucić przepływ i ponownie odwirować w temperaturze pokojowej przez 1 minutę przy 10 000 x g. Umieść filtr wirowy w czystej probówce zbiorczej o pojemności 2 ml.
    10. Dodać 100 μl buforu elucyjnego do środka membrany filtracyjnej. Wirować w temperaturze pokojowej przez 30 s przy 10 000 x g. Wyrzuć filtr wirowy. Przechowywać pobrane DNA w temperaturze od -20 °C do -80 °C
  5. Użyj wyizolowanego DNA do sekwencjonowania.
    1. Określ ilościowo i znormalizuj wyizolowane DNA do 2 ng / μl za pomocą analizy fluorometrycznej.
      1. Przygotuj reakcje w trzech egzemplarzach dla każdej wyekstrahowanej próbki, aby porównać względne ilości składników 28S (roślina), przeanalizować ITS (grzyby) i 16S (bakterie) w każdej próbce dostarczania pyłku36. Upewnij się, że każda reakcja zawiera 10 ng całkowitego DNA, 2x asymetrycznej mieszanki głównej na bazie barwnika cyjaninowego i 2,5 μl każdej z par starterów do przodu i do tyłu 28KJ/28B37 dla rośliny i ITS1/ITS5.8R dla DNA grzyba38.
    2. Amplifikować DNA przy użyciu następujących parametrów: 2 minuty wstępnej denaturacji w temperaturze 50 °C, 2 minuty początkowej denaturacji w temperaturze 95 °C, 40 cykli (15 s w temperaturze 98 °C, 15 s w temperaturze 58 °C, 60 s w temperaturze 72 °C), a następnie krzywa topnienia.
    3. Przygotuj 2-etapowy, zagnieżdżony protokół PCR przy użyciu bibliotek sekwencjonowania nowej generacji ukierunkowanych na region zmienny 16S rRNA V3/V4 i region dystansowy rRNA ITS/5,8s.
      1. Dodaj 12,5 μl DNA do 5 pmol każdego startera i 2x mieszanki głównej. Przeprowadzaj oddzielne reakcje dla każdego regionu (16S lub ITS; patrz Tabela 1). Zmodyfikuj startery specyficzne dla regionu, jak opisano wcześniej39,40, aby dodać sekwencje nukleotydowe specyficzne dla sekwencera adaptera do sekwencji specyficznych dla genu.
      2. Przeprowadzić wstępne amplifikację przy użyciu następujących parametrów: 3 minuty początkowej denaturacji w temperaturze 95 °C, 25 cykli (30 s w temperaturze 95 °C, 30 s w temperaturze 55 °C, 30 s w temperaturze 72 °C), 5 minut końcowego przedłużenia w temperaturze 72 °C.
      3. Po wstępnej amplifikacji sprawdź rozmiar i ilość biblioteki za pomocą ruchliwości elektroforetycznej i wyczyść za pomocą odwracalnych kulek unieruchamiających w fazie stałej o objętości 1x, aby usunąć resztki starterów i odczynników reakcyjnych. Pula 16S i amplikony ITS ilościowo, aby utworzyć pojedynczą pulę amplikonów dla każdej próbki.
      4. Dodaj adaptery specyficzne dla sekwencera i podwójne indeksy specyficzne dla próbki, używając następujących starterów (patrz Tabela 1). Dodaj 2,5 μl amplifikowanego DNA do 5 pmol każdego startera i 2x mieszanki głównej. Wykonaj amplifikację biblioteki przy użyciu następujących parametrów: 3 minuty początkowej denaturacji w temperaturze 95 °C, 8 cykli (30 s w 95 °C, 30 s w 55 °C, 30 s w temperaturze 72 °C), 5 minut końcowego przedłużenia w temperaturze 72 °C.
    4. Po PCR wyczyść gotowe biblioteki za pomocą 1 x objętość odwracalnych kulek unieruchamiających w fazie stałej. Oceń jakość i ilość gotowych bibliotek za pomocą odpowiednio ruchliwości elektroforetycznej i fluorometrii. Standaryzacja bibliotek do 2 μM i pula przed sekwencjonowaniem.
    5. Wykonaj sekwencjonowanie nowej generacji na platformie analogicznej do adapterów dodawanych w wtórnym PCR, o odpowiedniej długości, aby pokryć cały amplicon41.
  6. Adnotacja sekwencji i analiza składu mikrobiologicznego.
    1. Łączenie danych sekwencjonowania par końców (R1 i R2) w pojedyncze kontigi dla wszystkich sekwencjonowanych bibliotek. Po scaleniu plików R1 i R2 tworzony jest pojedynczy plik fasta dla każdej z bibliotek.
      UWAGA: Ten krok i procesy opisane poniżej (o ile nie wskazano inaczej) są wykonywane w Mothur w wersji 1.38.038.
    2. Prześwietl każdy plik fasta, aby usunąć niejednoznaczne zasady, nieoczekiwanie długie sekwencje i długie homopolimery.
      UWAGA: Parametry badania przesiewowego i usuwania sekwencji to maxambig = 0, maxlength = 600 i maxhomop = 8 dla obu genów. Usuń identyczne sekwencje, ale zachowaj tabelę kontyngencji oddzielnie dla wszystkich bibliotek (tzw. tabela zliczania w Mothur).
    3. Dopasuj unikalne sekwencje biblioteki genów 16S do bazy danych SILVA w wersji 123, a biblioteki ITS genów do bazy danych UNITE ITS42.
      UWAGA: Sekwencje muszą być opatrzone adnotacjami od poziomu królestwa do poziomu rodzaju.
      1. Następnie grupuj sekwencje wyrównane z funkcją pre.cluster za pomocą diff=5 i usuń chimery.
    4. Klasyfikuj sekwencje za pomocą metody Wang43 na podstawie plików taksonomii SILVA (dla genu 16S) i UNITE ITS (dla genu ITS) (wartość odcięcia 80%).
    5. Załaduj do R44 tabele kontyngencji (po jednej na gen) wygenerowane podczas procesu klasyfikacji w Mothur. Na każdym poziomie taksonomicznym uzyskaj względną obfitość na bibliotekę w celu dalszej analizy zmian w zbiorowisku drobnoustrojów.
      UWAGA: Na każdym poziomie taksonomicznym należy połączyć grupy taksonomiczne, gdy względna liczebność jest mniejsza niż 2% dla wszystkich powtórzeń eksperymentalnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Badanie w klatkach polowych:

Dane uzyskane z eksperymentów w klatkach wykazały, że kolonie trutni wykazały istotną reakcję na ekspozycję na fungicyd. Ule traktowane fungicydem wyprodukowały znacznie mniej robotnic (12,2 ± 3,8, średnia ± SE) niż ule kontrolne (43,2 ± 11,2, F1,9= 6,8, p = 0,03) (Rysunek 4). Ponadto biomasa pszczół w ulach traktowanych fungicydem (0,9...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Badania nad wpływem fungicydów na zdrowie pszczół pozostają niedostatecznie zbadanym aspektem strategii ochrony przed szkodnikami. Nasze badanie ma na celu wypełnienie tej luki w wiedzy poprzez zastosowanie zestawu uzupełniających się technik, które wyraźnie izolują potencjalne czynniki powodujące spadek liczebności pszczół. Planowanie, uzasadnienie i renderowanie tych eksperymentów są szczegółowo opisane poniżej.

Ważne jest, aby zapewnić, że żadne pszczoły nie będą mogły uciec z siatki doświa...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują Centrum Biotechnologii Uniwersytetu Wisconsin za udostępnienie urządzeń i usług do amplifikacji i sekwencjonowania, Caitlin Carlson, Jennifer Knack, Jake Otto i Max Haase za pomoc techniczną w analizie molekularnej. Praca ta była wspierana przez fundusze przyznane przez USDA-Agricultural Research Service (Current Research Information System #3655-21220-001). Dalszego wsparcia udzieliła Narodowa Fundacja Nauki (w ramach grantu nr Grantu). DEB-1442148), Centrum Badań Bioenergetycznych Wielkich Jezior Departamentu Energii (DOE Biuro Nauki BER DE-FC02-07ER64494) oraz Narodowy Instytut Żywności i Rolnictwa USDA (projekt Hatch 1003258). C.T.H. jest stypendystą Pew Scholar w dziedzinie nauk biomedycznych i Alfred Toepfer Faculty Fellow, wspieranym odpowiednio przez Pew Charitable Trusts i Fundację Alexandra von Humboldta. Autorzy dziękują Hannah Gaines-Day i Olivii Bernauer za ich wkład w nasze wcześniejsze, opublikowane prace terenowe.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Ul NatupolKoppertUSRESM116 uli
Propikonazol 14.3Quali-Ppro60207-90-1Propikonazol 14.3%
ObfitośćSyngenta4033540Azoksystrobina 22.9%
ChlorotalonilSyngenta3452Fungicyd stosowany do prób
Granulki pyłkuPszczoła uratowanaB004D5650C3X 16oz Butelki z pyłkiem do prób
Szczepy bakteryjne do inokulacjiCurrie Lab
Szczepy drożdży do inokulacjiHittinger lab
Pary starterówCentrum
Zestaw do izolacji DNAMo Bio12830-50Komercyjny zestaw do izolacji DNA
Zestaw do oznaczania Qubit dsDNA HSThermo FisherQ32851DNA Narzędzie do oznaczania ilościowego
Select Master Mix dla CFXThermo Fisher4472952Służy do wykonywania PCR w czasie rzeczywistym przy użyciu barwnika SYBR GreenER.
System wykrywania PCR w czasie rzeczywistym BioRad1855196Przyrząd używany do amplifikacji
PCR Zestaw do czyszczenia PCR,Axygen10159-696Służy do skutecznego usuwania nieinkorporowanych dNTP, soli i enzymów
Zestaw DNA 1000Agilent5067-1504Używany do wymiarowania i analizy fragmentów DNA
MiSeq SequencerIlluminaUżywany dla nowej generacji sekwencjonowanie
Asortyment wyrobów szklanych (zlewki, kolby, pipety, probówki, wypychacze)VWR
Biotechnologiczne UW

Bibliografia

  1. Potts, S. G., Biesmeijer, J. C., Kremen, C., Neumann, P., Schweiger, O., Kunin, W. E. Global pollinator declines: Trends, impacts and drivers. Trends Ecol Evolut. 25 (6), 345-353 (2010).
  2. Vanengelsdorp, D., Meixner, M. D. A historical review of managed honey bee populations in Europe and the United States and the factors that may affect them. J Invertebr Pathol. 103, Suppl 1. S80-S95 (2010).
  3. Ellis, J. D., Evans, J. D., Pettis, J. Colony losses, managed colony population decline, and Colony Collapse Disorder in the United States. J. Apic. Res. 49 (1), 134-136 (2010).
  4. Vanbergen, A. J. Insect Pollinators Initiative. Threats to an ecosystem service: pressures on pollinators. Front Ecol Environ. 11 (5), 251-259 (2013).
  5. Cameron, S. A., et al. Patterns of widespread decline in North American bumble bees. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (2), 662-667 (2011).
  6. Szabo, N. D., Colla, S. R., Wagner, D. L., Gall, L. F., Kerr, J. T. Do pathogen spillover, pesticide use, or habitat loss explain recent North American bumblebee declines? Conser Lett. 5 (3), 232-239 (2012).
  7. Klein, A. -M., et al. Importance of pollinators in changing landscapes for world crops. Proc R Soc Lond [Biol]. 274 (1608), 303-313 (2007).
  8. Sánchez-Bayo, F., Goulson, D., Pennacchio, F., Nazzi, F., Goka, K., Desneux, N. Are bee diseases linked to pesticides? - A brief review. Environ Int. 89, 7-11 (2016).
  9. Kwong, W. K., Moran, N. A. Gut microbial communities of social bees. Nature Rev. Microbiol. 14 (6), 374-384 (2016).
  10. Engel, P., et al. The Bee Microbiome: Impact on Bee Health and Model for Evolution and Ecology of Host-Microbe Interactions. mBio. 7 (2), e02164-e02115 (2016).
  11. Henry, M., et al. A common pesticide decreases foraging success and survival in honey bees. Science. 336 (6079), New York, N.Y. 348-350 (2012).
  12. Pettis, J. S., vanEngelsdorp, D., Johnson, J., Dively, G. Pesticide exposure in honey bees results in increased levels of the gut pathogen Nosema. Die Naturwissenschaften. 99 (2), 153-158 (2012).
  13. Williamson, S. M., Wright, G. A. Exposure to multiple cholinergic pesticides impairs olfactory learning and memory in honeybees. J. Exp. Biol. 216 (10), 1799-1807 (2013).
  14. Artz, D. R., Pitts-Singer, T. L. Effects of fungicide and adjuvant sprays on nesting behavior in two managed solitary bees, Osmia lignaria and Megachile rotundata. PLoS ONE. 10 (8), (2015).
  15. Johnson, R. M., Wen, Z., Schuler, M. A., Berenbaum, M. R. Mediation of Pyrethroid Insecticide Toxicity to Honey Bees (Hymenoptera: Apidae) by Cytochrome P450 Monooxygenases. J. Econ. Entomol. 99 (994), 1046-1050 (2006).
  16. Pilling, E. D., Bromleychallenor, K. A. C., Walker, C. H., Jepson, P. C. Mechanism of synergism between the pyrethroid insecticide lambda-cyhalothrin and the imidazole fungicide prochloraz, in the honeybee (Apis mellifera L). Pest Biochem Physiol. 51 (1), 1-11 (1995).
  17. Iwasa, T., Motoyama, N., Ambrose, J. T., Roe, R. M. Mechanism for the Differential Toxicity of Neonicotinoid Insecticides in the Honey Bee Mechanism for the differential toxicity of neonicotinoid insecticides in the honey bee, Apis mellifera. Crop Protection. , (2016).
  18. Mullin, C. A., et al. High levels of miticides and agrochemicals in North American apiaries: implications for honey bee health. PLoS One. 5 (3), e9754(2010).
  19. Pettis, J. S., Lichtenberg, E. M., Andree, M., Stitzinger, J., Rose, R., Vanengelsdorp, D. Crop pollination exposes honey bees to pesticides which alters their susceptibility to the gut pathogen Nosema ceranae. PLoS One. 8 (7), e70182(2013).
  20. David, A., et al. Widespread contamination of wildflower and bee-collected pollen with complex mixtures of neonicotinoids and fungicides commonly applied to crops. Environ Int. 88, 169-178 (2016).
  21. Zhu, W., Schmehl, D. R., Mullin, C. A., Frazier, J. L. Four common pesticides, their mixtures and a formulation solvent in the hive environment have high oral toxicity to honey bee larvae. PLoS One. 9 (1), e77547(2014).
  22. Simon-Delso, N., Martin, G. S., Bruneau, E., Minsart, L. A., Mouret, C., Hautier, L. Honeybee colony disorder in crop areas: The role of pesticides and viruses. PLoS ONE. 9 (7), (2014).
  23. Park, M. G., Blitzer, E. J., Gibbs, J., Losey, J. E., Danforth, B. N. Negative effects of pesticides on wild bee communities can be buffered by landscape context. Proc R Soc Lond [Biol]. 282 (1809), (2015).
  24. van Engelsdorp, D., et al. "Entombed Pollen": A new condition in honey bee colonies associated with increased risk of colony mortality. J Invertebr Pathol. 101 (2), 147-149 (2009).
  25. Bernauer, O. M., Gaines-Day, H. R., Steffan, S. A. Colonies of bumble bees (Bombus impatiens) produce fewer workers, less bee biomass, and have smaller mother queens following fungicide exposure. Insects. 6 (2), 478-488 (2015).
  26. Tu, C. M. Effect of fungicides, captafol and chlorothalonil, on microbial and enzymatic activities in mineral soil. J Environ Sci Health B. 28 (B28), 67-80 (1993).
  27. Huang, C. -Y., Ho, C. -H., Lin, C. -J., Lo, C. -C. Exposure effect of fungicide kasugamycin on bacterial community in natural river sediment. J Environ Sci Health B. 45 (5), 485-491 (2010).
  28. Artigas, J., et al. Effects of the fungicide tebuconazole on microbial capacities for litter breakdown in streams. Aquat. Toxicol. 122, 197-205 (2012).
  29. Goerzen, D. W. Microflora associated with the alfalfa leafcutting bee, Megachile rotundata (Fab) (Hymenoptera: Megachilidae) in Saskatchewan, Canada. Apidologie. 22 (5), 553-561 (1991).
  30. Anderson, K. E., Sheehan, T. H., Eckholm, B. J., Mott, B. M., DeGrandi-Hoffman, G. An emerging paradigm of colony health: Microbial balance of the honey bee and hive (Apis mellifera). Insectes Sociaux. 58 (4), 431-444 (2011).
  31. Crotti, E., et al. Microbial symbionts of honeybees: a promising tool to improve honeybee health. N. Biotechnol. 30 (6), 716-722 (2013).
  32. Koch, H., Schmid-Hempel, P. Socially transmitted gut microbiota protect bumble bees against an intestinal parasite. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (48), 19288-19292 (2011).
  33. Anderson, K. E., et al. Microbial ecology of the hive and pollination landscape: bacterial associates from floral nectar, the alimentary tract and stored food of honey bees (Apis mellifera). PloS One. 8 (12), e83125(2013).
  34. Evans, E. C., Spivak, M. Effects of Honey Bee (Hymenoptera: Apidae) and Bumble Bee (Hymenoptera: Apidae) Presence on Cranberry (Ericales: Ericaceae) Pollination. J Econ Entomol. 99 (3), 614-620 (2006).
  35. Goulson, D., et al. Can alloethism in workers of the bumblebee, Bombus terrestris, be explained in terms of foraging efficiency? Anim. Behav. 64 (1), 123-130 (2002).
  36. ThermoFisher Scientific. User Guide: Qubit dsDNA HS Assay Kits. , Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/Qubit_dsDNA_HS_Assay_UG.pdf 3-6 (2010).
  37. Khadempour, L., LeMay, V., Jack, D., Bohlmann, J., Breuil, C. The Relative Abundance of Mountain Pine Beetle Fungal Associates Through the Beetle Life Cycle in Pine Trees. Microbial Ecol. 64 (4), 909-917 (2012).
  38. Dorn-In, S., Hölzel, C. S., Janke, T., Schwaiger, K., Balsliemke, J., Bauer, J. PCR-SSCP-based reconstruction of the original fungal flora of heat-processed meat products. Int J Food Microbiol. 162 (1), 71-81 (2013).
  39. Klindworth, A., et al. Evaluation of general 16S ribosomal RNA gene PCR primers for classical and next-generation sequencing-based diversity studies. Nucleic Acids Res. 41 (1), (2013).
  40. White, T., Bruns, T., Lee, S., Taylor, J. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR protocols: a guide to methods and applications. 18 (1), 315-322 (1990).
  41. Illumina. 16S Metagenomic Sequencing Library Preparation: Preparing 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons for the Illumina MiSeq System. , Available from: http://ngs.biodiv.tw/NGSCore/wp-content/uploads/Documents/16s-metagenomic-library-prep-guide-15044223-b.pdf (2017).
  42. Kõljalg, U., et al. Towards a unified paradigm for sequence-based identification of fungi. Mol Ecol. 22 (21), 5271-5277 (2013).
  43. Wang, Q., Garrity, G. M., Tiedje, J. M., Cole, J. R. Naïve Bayesian Classifier for Rapid Assignment of rRNA Sequences into the New Bacterial Taxonomy. Appl. Environ. Microbiol. 73 (16), 5261-5267 (2007).
  44. Team, R. C. R: A language and environment for statistical computing [Computer software]. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. (2015).
  45. Kaltenpoth, M., Engl, T. Defensive microbial symbionts in Hymenoptera. Funct Ecol. 28 (2), 315-327 (2014).
  46. Gerth, M., Saeed, A., White, J. A., Bleidorn, C. Extensive screen for bacterial endosymbionts reveals taxon-specific distribution patterns among bees (Hymenoptera, Anthophila). FEMS Microbiol Ecol. 91 (6), (2015).
  47. Smith, C. J., Osborn, A. M. Advantages and limitations of quantitative PCR (Q-PCR)-based approaches in microbial ecology. FEMS Microbiol Ecol. 67 (1), 6-20 (2009).
  48. Kim, M., Morrison, M., Yu, Z. Evaluation of different partial 16S rRNA gene sequence regions for phylogenetic analysis of microbiomes. J Microbiol Methods. 84 (1), 81-87 (2011).
  49. DeSantis, T. Z., et al. Greengenes, a Chimera-Checked 16S rRNA Gene Database and Workbench Compatible with ARB. Appl. Environ. Microbiol. 72 (7), 5069-5072 (2006).
  50. Langille, M. G. I., et al. Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences. Nature Biotechnol. 31 (9), 814-821 (2013).
  51. Malik, S., Beer, M., Megharaj, M., Naidu, R. The use of molecular techniques to characterize the microbial communities in contaminated soil and water. Environ Int. 34 (2), 265-276 (2008).
  52. Ladurner, E., Bosch, J., Kemp, W. P., Maini, S. Assessing delayed and acute toxicity of five formulated fungicides to Osmia lignaria and Apis mellifera. Apidologie. 36 (3), 449-460 (2005).
  53. Huntzinger, C. I., James, R. R., Bosch, J., Kemp, W. P. Fungicide Tests on Adult Alfalfa Leafcutting Bees (Hymenoptera: Megachilidae). J Econ Entomol. 101 (4), 1088-1094 (2008).
  54. Gradish, A. E., Scott-Dupree, C. D., Shipp, L., Harris, C. R., Ferguson, G. Effect of reduced risk pesticides for use in greenhouse vegetable production on Bombus impatiens (Hymenoptera: Apidae). Pest Manag. Sci. 66 (2), 142-146 (2010).
  55. Calderone, N. W. Insect pollinated crops, insect pollinators and US agriculture: trend analysis of aggregate data for the period 1992-2009. PloS One. 7 (5), e37235(2012).
  56. Ollerton, J., Winfree, R., Tarrant, S. How many flowering plants are pollinated by animals? Oikos. 120 (3), 321-326 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Ekspozycja na fungicydymikrobiom pszczanaliza metagenomicznazapasy py kukolonie trutnieksperymenty klatkowedynamika spo eczno ci mikrobiologicznychmikrobiom py kutraktowanie fungicydami
Techniki empiryczne, metagenomiczne i obliczeniowe rzucają światło na mechanizmy, za pomocą których fungicydy zagrażają zdrowiu pszczół
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.