Recellularna macierz zewnątrzkomórkowa zdecelularizowanej wątroby szczura może być używana jako humanizowany, trójwymiarowy model ex vivo do badania dystrybucji i ekspresji transgenu wirusa lub wektora wirusowego.
Artykuł metodologiczny
Badanie wektorów wirusowych w trójwymiarowym modelu wątroby wypełnionym ludzką linią komórkową raka wątrobowokomórkowego HepG2
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Ten protokół opisuje generowanie trójwymiarowego (3D) modelu wątroby ex vivo i jego zastosowanie do badania i rozwoju systemów wektorów wirusowych. Model uzyskuje się poprzez ponowne zasiedlenie macierzy zewnątrzkomórkowej pozbawionej komórek wątroby szczura ludzką linią komórkową hepatocytów. Model umożliwia badania w unaczynionym systemie komórkowym 3D, zastępując potencjalnie szkodliwe eksperymenty z żywymi zwierzętami. Dodatkowym atutem jest humanizowany charakter modelu, który jest bliższy fizjologii człowieka niż modelom zwierzęcym.
W tym badaniu demonstrujemy transdukcję tego modelu wątroby za pomocą wektora wirusowego pochodzącego z wirusów związanych z adenowirusem (wektor AAV). Obwód perfuzyjny, który zaopatruje model wątroby 3D w podłoże, zapewnia łatwy sposób na zastosowanie wektora. System pozwala na monitorowanie głównych parametrów metabolicznych wątroby. Do końcowej analizy można pobrać próbki tkanek w celu określenia zakresu recelularyzacji za pomocą technik histologicznych. Dystrybucja wektora wirusa i ekspresja dostarczonego transgenu mogą być analizowane za pomocą ilościowego PCR (qPCR), Western blotting i immunohistochemii. Można przewidzieć liczne zastosowania modelu wektorowego w badaniach podstawowych i w rozwoju zastosowań terapii genowej, w tym rozwój nowych terapii przeciwwirusowych, badania nad rakiem oraz badanie wektorów wirusowych i ich potencjalnych skutków ubocznych.
Wprowadzenie
Większość obecnych badań biomedycznych opiera się na jednym z dwóch podejść, albo dwuwymiarowych (2D) eksperymentach z hodowlą komórkową, albo na modelach zwierzęcych, które są trójwymiarowe (3D) z samej swojej natury. Podejścia te mają jednak pewne poważne wady. Wykazano, że komórki hodowane w hodowli 2D różnią się wzorcami ekspresji genów i fizjologią komórki od tych hodowanych w warunkach 3D. 1 Modele zwierzęce, oprócz tego, że kojarzą się z kwestiami etycznymi, często nie modelują dobrze ludzkiej fizjologii. Chociaż brak oczywistych skutków toksycznych związku musi zostać potwierdzony w modelach zwierzęcych przed pierwszym dawkowaniem u ludzi, w badaniach klinicznych udokumentowano wiele przypadków, w których wystąpiły poważne, czasami śmiertelne, działania niepożądane. cyfra arabska
Aby przezwyciężyć te niedociągnięcia, humanizowane modele organów ex vivo w 3D stały się ważnymi narzędziami badawczymi. Podczas uprawy w odpowiednich warunkach komórki samoorganizują się w struktury 3D znane jako sferoidy. Jednak te sferoidy nie mają układu naczyniowego, co ogranicza dystrybucję małych związków molekularnych, dużych leków biologicznych i wektorów wirusowych. Na przykład wektory adenowirusowe transdukowały tylko zewnętrzne warstwy komórkowe sferoid przygotowanych z ludzkich glejaków. 3 Rozwiązaniem tego problemu jest wykorzystanie modelu narządu zawierającego układ naczyniowy. W tym celu interesujący nas narząd może zostać usunięty ze zwierzęcia, a komórki zwierzęce mogą zostać zastąpione komórkami ludzkimi. Opisano różne metody decelularyzacji wątroby zwierzęcej poprzez leczenie detergentami lub cholanem sodu. 4-6 Powstała macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) zawiera cytokiny i czynniki wzrostu, które regulują różne procesy komórkowe. 7 Może być używany jako rusztowanie do recelularizacji komórkami ludzkimi w celu uzyskania funkcjonalnego modelu narządu.
W niedawnym badaniu użyliśmy humanizowanego modelu 3D wątroby do zbadania dystrybucji i ekspresji transgenu wektora wirusa związanego z adenowirusem (AAV). 8 Wektory AAV należą do najbardziej obiecujących wektorów wirusowych do zastosowań w terapii genowej. 9 Pierwsza i jak dotąd jedyna zatwierdzona genowa interwencja terapeutyczna w świecie zachodnim wykorzystuje wektor AAV do przenoszenia lipazy lipoproteinowej. 10
Protokół
UWAGA: R.L. uzyskał zgodę etyczną na eksplantację organów z Landesamt für Gesundheit und Soziales (LaGeSo). Wątroby eksplantowano od szczurów linii Wister. Żyłę główną dolną oraz żyłę wrotną wątroby kaniulowano za pomocą kaniuli 22 G. Metody decelularyzacji eksplantowanych wątrób zostały opisane wcześniej.4,5 Wykorzystane w tej pracy macierze pozakomórkowe uzyskano poprzez nadmierną perfuzję wątroby szczura 1% roztworem deoksycholanu sodu.
1. Recelularyzacja macierzy pozakomórkowej (ECM) wątroby szczura
- Ekspansja linii komórkowej wątroby HepG2
- Hodować linię komórek raka wątrobowokomórkowego HepG2 w pożywce Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 uzupełnionej o 10% płodowej surowicy cielęcej, 2 mM glutaminy oraz po 2 mM penicyliny i streptomycyny.
- Zasiać 1,5 x 107 komórek w butelkach T175 i hodować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Zebrać komórki po 4 dniach poprzez trypsynizację przez 5 min w 37 °C, 5% CO2.
- Odwirować komórki przy 300 x g, resuspendować je w 4 ml PBS i policzyć komórki za pomocą komory Neubauera pod mikroskopem. Jedna butelka T175 dostarczy około 4,5 x 107 komórek.
UWAGA: Należy upewnić się, że hodowla zawiera wystarczającą liczbę komórek do recelularyzacji ECM wątroby szczura, przyjmując 6 x 108 komórek HepG2 na ECM (10 kolb hodowlanych o powierzchni 175 cm2 , każda zawierająca 4-5 x 108 komórek).
Rycina 1. System bioreaktora. A) Ten system bioreaktora został wykonany na specjalne zamówienie. Utrzymuje on modele narządów w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2. Przepływy pomp perystaltycznych mogą być regulowane indywidualnie. B) Wątrobę umieszcza się w komorze wzrostowej i podłącza do obwodu perfuzyjnego, który składa się z pompy perystaltycznej, zbiornika z medium, pułapki pęcherzykowej oraz czujnika ciśnienia. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
- Recelularyzacja ECM
- Przygotować system bioreaktora, zawierający komorę perfuzyjną wątroby, układ perfuzyjny, zbiornik z medium oraz pułapkę pęcherzyków powietrza. Sterylizować system bioreaktora (121 °C, 15 min).
- Połączyć system bioreaktora z pompą perystaltyczną i umieścić go w inkubatorze zapewniającym odpowiednie warunki (37 °C, 5% CO2). Umieścić zdecelularyzowane rusztowania wątroby szczura8 w komorze perfuzyjnej systemu bioreaktora (Rysunek 1).
- Połączyć kaniulowaną żyłę wrotną oraz vena cava z układem perfuzyjnym za pomocą klipsów do drenów. Równoważyć rusztowanie w 150 ml medium RPMI (zgodnie z opisem w 1.1) przez 5 d przy szybkości przepływu 1,25 ml/min.
- Odłączyć rusztowanie wątroby od obiegu mediów i zaszczepić rusztowanie 3 x 108 komórkami HepG2 (w 5 ml) przez żyłę wrotną za pomocą strzykawki 5 ml, unikając powstawania pęcherzyków powietrza, a następnie pozwolić komórkom zasiedlić ECM poprzez inkubację w rusztowaniu przez 1 hr przy wyłączonej pompie.
- Stopniowo zwiększać szybkość przepływu poprzez regulację pompy, zaczynając od 1,25 ml/min przez 10 min, następnie 2,5 ml/min przez 20 min i ostatecznie 3,75 ml/min przez 30 min.
- Powtórzyć kroki 1.2.4-1.2.5, aby osiągnąć całkowitą liczbę komórek 6 x 108.
- Uruchomić system bioreaktora przy szybkości przepływu 3,75 ml/min. Hodować recelularyzowaną wątrobę szczura przez 2 tygodnie.
UWAGA: Co drugi dzień wymieniać jedną trzecią medium na świeże medium (50 ml). Pobierać próbki medium hodowlanego w celu pomiaru parametrów fizjologicznych, takich jak aktywność dehydrogenazy mleczanowej, pH próbek medium oraz stężenie glukozy i mleczanu.
2. Transdukcja recelularyzowanej wątroby szczura
- Produkcja wektorów AAV na dużą skalę
- Wytworzyć, oczyścić i określić miano wektorów AAV zgodnie z wcześniejszym opisem:11
- W skrócie: wektory AAV wytworzyć w butelkach obrotowych (roller bottles), a następnie oczyścić za pomocą wirowania w gradiencie jodiksanolu. Pozostałości jodiksanolu usunąć poprzez filtrację na kolumnach żelowych PD10. Stężenie wektorów AAV określić metodą qPCR, stosując genomowe DNA AAV jako standard.
UWAGA: Samouzupełniający, pseudotypowany wektor AAV2/6 użyty w niniejszym badaniu kodował EmGFP jako reporter w celu wykazania wydajności transdukcji oraz kasetę ekspresyjną shRNA do wyciszenia genu eksprymowanego endogennie (human cyclophilin B (hCycB), Rycyna 2). Należy zapewnić odpowiednią ilość pseudotypowanych wektorów scAAV serotypu 6 (2,7 x 1013 wektorów AAV na model wątroby).
- W skrócie: wektory AAV wytworzyć w butelkach obrotowych (roller bottles), a następnie oczyścić za pomocą wirowania w gradiencie jodiksanolu. Pozostałości jodiksanolu usunąć poprzez filtrację na kolumnach żelowych PD10. Stężenie wektorów AAV określić metodą qPCR, stosując genomowe DNA AAV jako standard.
- Wytworzyć, oczyścić i określić miano wektorów AAV zgodnie z wcześniejszym opisem:11
Rycina 2. Mapa samouzupełniającego się, pseudotypowanego wektora AAV2/6 użytego w niniejszym badaniu. Genom składa się z odwróconych powtórzeń końcowych (ITR) AAV2 i koduje EmGFP pod kontrolą promotora CMV, a także shRNA pod kontrolą promotora U6. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
- Transdukcja modelu wątroby
- Dostosować stężenie roztworu wektora AAV do końcowego poziomu 2.7 x 1013 genomów wektora w 5 ml poprzez dodanie odpowiedniej objętości PBS.
- Odłączyć wątrobę od obwodu z medium, zdejmując dren z kaniuli. Podłączyć strzykawkę 5 ml do kaniuli żyły wrotnej i wstrzyknąć cały roztwór wektora AAV (5 ml).
UWAGA: Opcjonalnie można dodać czerwień fenolową (5 µg/ml), aby monitorować dystrybucję roztworu wektora AAV w całej wątrobie. - Inkubować przez 1 hr bez pompowania. Stopniowo zwiększać szybkość przepływu, zaczynając od 1.25 ml/min przez 10 min, następnie 2.5 ml/min przez 20 min oraz 3.75 ml/min przez 30 min. Hodować recelularyzowaną wątrobę szczura przez 6 dni.
UWAGA: Wymieniać jedną trzecią medium zgodnie z instrukcją w UWAGA pod punktem 1.2.7
3. Ocena recelularyzowanej, transdukowanej wątroby szczura
- Barwienie hematoksyliną i eozyną (HE) oraz analiza immunohistochemiczna
- Pobrać próbki (0,5 x 0,5 x 1,5-2 cm) z każdego płata wątroby za pomocą skalpela.
- Inkubować próbki (z punktu 3.1.1) w roztworze 4% paraformaldehydu (PFA) + 4% sacharozy przez 1,5 h w temperaturze 4 °C. (Uwaga: PFA jest toksyczny i rakotwórczy. Zawsze należy przechowywać PFA w dygestorium i używać odpowiedniej odzieży ochronnej.) Przemyć trzy razy PBS (1 min na każdy etap płukania) i inkubować w 8% sacharozie przez noc w temperaturze 4 °C.
- Nalać medium utrwalające do plastikowych form do krioembeddingu, umieścić próbki w medium utrwalającym tak, aby nie było pęcherzyków powietrza. Dodać medium utrwalające, aż próbka zostanie całkowicie przykryta. Próbki zatopione w medium przechowywać w -80 °C do czasu dalszego użycia.
- Przygotować krioprzekroje (10 µm) za pomocą kriostatu12. Ocenić recelularyzację za pomocą barwienia hematoksyliną i eozyną8. Ocenić wydajność transdukcji za pomocą barwienia immunohistochemicznego w kierunku badanego genu (tutaj: EmGFP).
- Pobieranie próbek do analiz molekularnych
- Pobrać próbki z każdego płata wątroby za pomocą biopsji grubościowej (średnica 4 mm). Izolować całkowite RNA, DNA i białka zgodnie z instrukcjami producenta w celu oceny ekspresji transgenu EmGFP oraz wyciszenia hCycB8.
Wyniki
W celu oceny stopnia recelularyzacji, z każdego płata każdego recelularyzowanego modelu wątroby przygotowano skrawki krio-sekcjonowane. Następnie skrawki poddano analizie z wykorzystaniem barwienia hematoksyliną i eozyną. Jak widać na Rysunku 3, każdy płat trzech modeli wątroby, oznaczonych jako TLM1, TLM2 (przetransdukowane modele wątroby 1 i 2) oraz Ctrl (kontrolny model wątroby, który został recelularyzowany, ale nie był transdukowany), został ponownie zasiedlony przez komórki HepG2. Ta linia komórkowa raka wątrobowokomórkowego została wyizolowana z tkanki guza 15-letniego chłopca z Argentyny. Niektóre obszary modeli wątroby były recelularyzowane bardziej intensywnie niż inne. Przyczyny tych różnic pozostają do ustalenia.
Rysunek 3. Barwienie hematoksyliną i eozyną każdego płata w trzech analizowanych modelach wątroby. TLM1+2: transdukowane modele wątroby 1 i 2; Ctrl.: kontrolny model wątroby, który został recelularyzowany, ale nie transdukowany. Pasek skali: 200 µm. (zreprodukowano za zgodą z Ref. 8.) Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
W następnym kroku oceniono transdukcję modeli wątroby. W tym celu przygotowano DNA z 28 biopsji wycinanych (punch biopsy) z każdego z modeli wątroby, a miano wektora określono za pomocą qPCR. Średnio zmierzono 55 i 90 zinternalizowanych genomów wektora na komórkę (VG/cell) dla dwóch transdukowanych modeli wątroby. Eksperymenty w dwuwymiarowych (2D) kulturach komórkowych wykazały, że 30 VG/cell jest wystarczające do silnej ekspresji transgenu oraz wyciszania za pośrednictwem RNAi. Produkcję EmGFP przeanalizowano za pomocą RT-PCR i Western blottingu. Rzeczywiście, ekspresję reportera wykryto w 80–90% biopsji odpowiednio na poziomie mRNA i białka.8 Aby uzyskać kompleksowy obraz wydajności transdukcji, przeanalizowano immunohistochemicznie skrawki kriostatyczne. Jak widać na Rysunku 4, obszary modelu wątroby, które zostały pomyślnie recelularyzowane, co zwizualizowano za pomocą barwienia DAPI, dawały również silne sygnały fluorescencyjne w analizie immunohistochemicznej ekspresji EmGFP. Zgodnie z oczekiwaniami, kontrolny model wątroby, który nie był traktowany wektorami AAV, nie wykazał ekspresji EmGFP.
Rycina 4. Analiza immunohistochemiczna ekspresji EmGFP. Komórki, które zasiedliły modele wątroby, zwizualizowano za pomocą barwienia DAPI (kolor niebieski); ekspresję EmGFP zwizualizowano za pomocą barwienia immunochemicznego (kolor czerwony). TLM1+2: przetransdukowane modele wątroby 1 i 2; Ctrl.: kontrolny model wątroby, który został recelularyzowany, ale nie przetransdukowany. Pasek skali: 200 µm. (Wydrukowano ponownie za zgodą z Ref. 8.) Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
W końcowym teście za pomocą qRT-PCR przeanalizowano wyciszenie hCycB za pośrednictwem AAV. Stwierdzono, że wyciszenie hCycB wynosiło od 70 do 90%, średnio dla wszystkich płatów dwóch transdukowanych modeli wątroby (Rysunek 5).
Rycina 5. Wyciszenie genu hCycB za pomocą RNAi w modelach wątroby 3D transdukowanych AAV. Wyciszenie hCycB określono za pomocą qRT-PCR. Wartości średnie i odchylenia standardowe (SD) obliczono dla wszystkich próbek każdego transdukowanego modelu wątroby 3D (odpowiednio TLM1 i 2) i znormalizowano do wartości średniej dla kontroli nietransdukowanej (Ctrl.). (Przedrukowano za zgodą z Ref. 8.) Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Dyskusja
Odtworzone wątroby 3D opisane tutaj stanowią model do badania wektorów wirusowych w humanizowanym systemie. Ponowna populacja ECM wątroby szczura ludzką linią komórkową raka wątrobowokomórkowego generuje system unaczyniony, który pozwala na badanie dużych leków biologicznych. Wyniki te stanowią dowód na słuszność koncepcji, że zrekonstruowany model wątroby może być skutecznie transdukowany za pomocą wektora wirusowego.
W pokazanych tutaj eksperymentach każdy płat wątroby został przetransdukowany przez wektor AAV. Jednak w niektórych wstępnych eksperymentach pojedyncze płaty nie zostały ponownie zasiedlone komórkami. Dlatego ważne jest, aby zapobiec zatykaniu układu naczyniowego przez resztki komórek lub inne składniki. Aby sprawdzić, czy wszystkie płaty mogą być perfundowane, nietoksyczny barwnik, taki jak czerwień fenolowa, można przepłukać przez model wątroby.
Kolejną istotną kwestią jest utrzymanie sterylności rusztowania wątrobowego. Podczas gdy leczenie etanolem lub antybiotykami jest niekorzystne dla układu naczyniowego, napromienianie macierzy zewnątrzkomórkowej promieniowaniem γ konserwuje naczynia i sterylizuje próbkę.
Co więcej, wielkość eksplantowanych wątrob będzie się różnić, tak że liczba komórek użytych do procedury recelularyzacji i czas ponownego zasiedlenia mogą wymagać dostosowania w celu uzyskania powtarzalnych wyników.
Wątroby szczurów użyte w niniejszym badaniu są stosunkowo duże i wymagają dużej ilości komórek i odczynników testowych (np. wektorów AAV). Ponadto procedura ponownego zasiedlenia trwała ponad dwa tygodnie. Ogranicza to liczbę powtórzeń, które można wykonać przy rozsądnym wysiłku. Obecnie ustalamy model dla wątroby myszy, która stanowi tylko około jednej piątej objętości wątroby szczura, co pozwala na użycie mniejszej liczby komórek i mniejszej liczby odczynników testowych. Chociaż proporcjonalne zmniejszenie liczby komórek wydaje się rozsądne, dokładne ilości muszą zostać określone w dalszych eksperymentach.
Kolejnym mankamentem obecnego modelu jest wykorzystanie wątrobowokomórkowej linii komórkowej HepG2. Trwają eksperymenty mające na celu opracowanie możliwości wykorzystania hepatocytów zróżnicowanych z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, co zapewni fizjologicznie bardziej odpowiedni model. Ponadto wątroba składa się z wielu typów komórek oprócz hepatocytów, np. komórek Kupffera i sinozydów. Zakładamy, że różne typy komórek ponownie zasiedlą swoje naturalne środowisko, gdy ECM zostanie ponownie komórkowany z wieloma typami komórek.
Model 3D wątroby łączy w sobie kilka zalet. Główną wadą konwencjonalnych modeli in vivo jest to, że fizjologia zwierząt znacznie różni się od fizjologii człowieka. Toksyczne skutki uboczne leczenia człowieka mogą zatem pozostać niewykryte. Tę wadę można przezwyciężyć, odtwarzając model 3D wątroby z ludzkimi komórkami, które lepiej odzwierciedlają biologię ludzkich pacjentów.
Drugą zaletą modelu wątroby jest jego wkład w dobrostan zwierząt. Chociaż do doświadczeń związanych z rekonstytucją wymagane są składniki pochodzenia zwierzęcego, podejście to jest nadal zgodne z celami zasady 3R (zastępstwo, redukcja, udoskonalenie), ponieważ można wykorzystać nadwyżki zwierząt, które zostały uśmiercone do celów innych doświadczeń na zwierzętach, tj. nie są potrzebne żadne dodatkowe zwierzęta, a podejście to całkowicie pozwala uniknąć cierpienia zwierząt, które często wiąże się z in vivo Eksperymenty. Sferoidy są alternatywnym narzędziem do badania procesów komórkowych w systemie 3D. Jednak sferoidy nie są unaczynione, dzięki czemu duże substancje i leki biologiczne nie wnikają głęboko w wewnętrzne części struktury. Problemy te zostały przezwyciężone dzięki unaczynionemu modelowi wątroby 3D.
W opisanych tu eksperymentach badano wektory AAV, ponieważ są one jednymi z najbardziej obiecujących kandydatów do zastosowań w terapii genowej. Ponieważ wiele podejść do terapii genowej ma na celu ukierunkowanie na wątrobę , np . w leczeniu zakażeń wirusami zapalenia wątroby lub niedoboru alfa-1-antytrypsyny, wątroba 3D może być wykorzystana w procesie rozwoju tych wektorów AAV. Oczywiście nadaje się również do badania innych hepatotropowych wektorów wirusowych, np. wektorów adenowirusowych. Ponadto może być stosowany do badania zakaźnych wirusów zapalenia wątroby, takich jak wirus zapalenia wątroby typu B lub C. Można go na przykład wykorzystać do projektowania nowych strategii przeciwwirusowych. Co więcej, modele 3D narządów stanowią obiecujące narzędzia do opracowywania nowych leków cytostatycznych do leczenia nowotworów oraz do prowadzenia badań toksykologicznych. Na dłuższą metę sztuczne wątroby mogą być wykorzystywane w medycynie regeneracyjnej jako przeszczepy. Podsumowując, trójwymiarowy model wątroby oferuje szeroki zakres zastosowań w biologii zakażeń i innych dziedzinach badań biomedycznych.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy dziękują Berndowi Krostitzowi za pomoc techniczną, Radosławowi Kędzierskiemu za początkowy wkład w projekt, Erikowi Wade'owi za korektę i pomocne komentarze, oraz prof. Heike Walles za dostarczenie bioreaktora i podzielenie się cennym doświadczeniem w zakresie decelularyzacji narządów. Jesteśmy również wdzięczni za sfinansowanie projektu i publikacji przez Politechnikę Berlińską.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Inkubator | Fraunhofer | / | |
| Pompa perystaltyczna | Fraunhofer | / | |
| Kołnierz z rowkiem | Duran | 2439454 | modyfikowany przez gaffer |
| O-ring Przezroczysty | Duran | 2922551 | |
| Zacisk szybkiego zwalniania | Duran | 2907151 | |
| Pokrywa z płaskim kołnierzem | Duran | 2429857 | zmodyfikowany przez gaffer |
| Gwint Rurka | Duran | 2483802 | modyfikowany przez gaffer |
| Gwint | Rurka Duran | 2483602 | modyfikowany przez gaffer |
| Silikonowy pierścień uszczelniający | Duran | 2862012 | |
| Zakrętka | Duran | 2924008 | |
| Zakrętka z otworem | Duran | ||
| Zakrętka z otworem | Filtr Duran | 2922705 | |
| Sarstedt | 831,826,001 | ||
| Rurka silikonowa | VWR | 228-1500 | |
| Łącznik rurowy | Ismatec | ISM556A | |
| Biokompatybilne rurki Kolby | hodowlane Ismatec | SC0736 | |
| T175 | Greiner bio-one | 660 160 | |
| RPMI 1640 | BioWest SAS (Th. Geyer) | L0501-500 | |
| glutamina | BioWest SAS (Th. Geyer) | X0551-100 | |
| Trypsyna | BioWest SAS (Th. Geyer) | L0940-100 | |
| penicylina/streptomycyna | BioWest SAS (Th. Geyer) | L0022-100 | |
| płodowa surowica cielęca | cc pro | S-10-M | |
| Tissue-Tek O.C.T. | Weckert-Labortechnik | 600001 | |
| HepG2 | DSMZ | ACC 180 | |
| Cryomold 15 x 15 x 5 mm | Sakura | 4566 | |
| Dziurkacz do biopsji 4 mm | pfm medical | 48401 | |
| MiRNA nukleospinowy | Macherey & Nagel | 740971.10 | |
| Zestaw nukleospinowego RNA/DNA | Macherey & Nagel | 740944 |
Bibliografia
- Chang, T. T., Hughes-Fulford, M. Monolayer and spheroid culture of human liver hepatocellular carcinoma cell line cells demonstrate distinct global gene expression patterns and functional phenotypes. Tissue Eng. Part A. 15 (3), 559-567 (2009).
- Butler, D., Callaway, E. Scientists in the dark after French clinical trial proves fatal. Nature. 529 (7586), 263-264 (2016).
- Enger, P. O., Thorsen, F., Lonning, P. E., Bjerkvig, R., Hoover, F. Adeno-associated viral vectors penetrate human solid tumor tissue in vivo more effectively than adenoviral vectors. Hum. Gene Ther. 13 (9), 1115-1125 (2002).
- Uygun, B. E., et al. Decellularization and recellularization of whole livers. J. Vis. Exp. (48), e2394(2011).
- Hillebrandt, K., et al. Procedure for Decellularization of Rat Livers in an Oscillating-pressure Perfusion Device. J. Vis. Exp. (102), e53029(2015).
- Baptista, P. M., et al. The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid. Hepatology. 53 (2), 604-617 (2011).
- Yagi, H., et al. Human-scale whole-organ bioengineering for liver transplantation: a regenerative medicine approach. Cell Transplant. 22 (2), 231-242 (2013).
- Wagner, A., et al. Use of a three-dimensional humanized liver model for the study of viral gene vectors. J. Biotechnol. 212, 134-143 (2015).
- Kay, M. A. State-of-the-art gene-based therapies: the road ahead. Nat. Rev. Genet. 12 (5), 316-328 (2011).
- Yla-Herttuala, S. Endgame: glybera finally recommended for approval as the first gene therapy drug in the European union. Mol. Ther. 20 (10), 1831-1832 (2012).
- Wagner, A., Röhrs, V., Kedzierski, R., Fechner, H., Kurreck, J. A novel method for the quantification of adeno-associated virus vectors for RNA interference applications using quantitative polymerase chain reaction and purified genomic adeno-associated virus DNA as a standard. Hum. Gene Ther. Methods. 24 (6), 355-363 (2013).
- Takagi, H., et al. Microdissected region-specific gene expression analysis with methacarn-fixed, paraffin-embedded tissues by real-time RT-PCR. J. Histochem. Cytochem. 52 (7), 903-913 (2004).
Przedruki i uprawnienia
