Badanie wektorów wirusowych w trójwymiarowym modelu wątroby wypełnionym ludzką linią komórkową raka wątrobowokomórkowego HepG2

Większość obecnych badań biomedycznych opiera się na jednym z dwóch podejść, albo dwuwymiarowych (2D) eksperymentach z hodowlą komórkową, albo na modelach zwierzęcych, które są trójwymiarowe (3D) z samej swojej natury. Podejścia te mają jednak pewne poważne wady. Wykazano, że komórki hodowane w hodowli 2D różnią się wzorcami ekspresji genów i fizjologią komórki od tych hodowanych w warunkach 3D. ¹ Modele zwierzęce, oprócz tego, że kojarzą się z kwestiami etycznymi, często nie modelują dobrze ludzkiej fizjologii. Chociaż brak oczywistych skutków toksycznych związku musi zostać potwierdzony w modelach zwierzęcych przed pierwszym dawkowaniem u ludzi, w badaniach klinicznych udokumentowano wiele przypadków, w których wystąpiły poważne, czasami śmiertelne, działania niepożądane. ^{cyfra arabska}

Aby przezwyciężyć te niedociągnięcia, humanizowane modele organów ex vivo w 3D stały się ważnymi narzędziami badawczymi. Podczas uprawy w odpowiednich warunkach komórki samoorganizują się w struktury 3D znane jako sferoidy. Jednak te sferoidy nie mają układu naczyniowego, co ogranicza dystrybucję małych związków molekularnych, dużych leków biologicznych i wektorów wirusowych. Na przykład wektory adenowirusowe transdukowały tylko zewnętrzne warstwy komórkowe sferoid przygotowanych z ludzkich glejaków. ³ Rozwiązaniem tego problemu jest wykorzystanie modelu narządu zawierającego układ naczyniowy. W tym celu interesujący nas narząd może zostać usunięty ze zwierzęcia, a komórki zwierzęce mogą zostać zastąpione komórkami ludzkimi. Opisano różne metody decelularyzacji wątroby zwierzęcej poprzez leczenie detergentami lub cholanem sodu. ^4-6 Powstała macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) zawiera cytokiny i czynniki wzrostu, które regulują różne procesy komórkowe. ⁷ Może być używany jako rusztowanie do recelularizacji komórkami ludzkimi w celu uzyskania funkcjonalnego modelu narządu.

W niedawnym badaniu użyliśmy humanizowanego modelu 3D wątroby do zbadania dystrybucji i ekspresji transgenu wektora wirusa związanego z adenowirusem (AAV). ⁸ Wektory AAV należą do najbardziej obiecujących wektorów wirusowych do zastosowań w terapii genowej. ⁹ Pierwsza i jak dotąd jedyna zatwierdzona genowa interwencja terapeutyczna w świecie zachodnim wykorzystuje wektor AAV do przenoszenia lipazy lipoproteinowej. ¹⁰

UWAGA: R.L. uzyskał etyczne zatwierdzenie eksplantacji organów od Landesamt für Gesundheit und Soziales (LaGeSo). Wątroby zostały wysadzone ze szczurów rasy Wister. Żyłę główną dolną i żyłę wrotną wątroby kaniulowano kaniulą 22 G. Metody decelularyzacji eksplantowanych wątrob zostały opisane wcześniej. ^4,5 Zastosowane tu matryce zewnątrzkomórkowe uzyskano w wyniku nadmiernej perfuzji wątroby szczura z 1% deoksycholanem sodu.

1. Recelularyzacja macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) wątroby szczura

1. Ekspansja linii komórek wątroby HepG2
   1. Hodowla linii komórkowej raka wątrobowokomórkowego HepG2 w pożywce Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 uzupełnionej 10% płodową surowicą cielęcą, 2 mM glutaminy i 2 mM penicyliny i streptomycyny.
   2. Wysiewaj 1,5 x 10⁷ komórek w butelkach T175 i hoduj komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ . Zebrać komórki po 4 dniach przez trypsynizację przez 5 minut w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ .
   3. Odwirować komórki w temperaturze 300 x g i ponownie zawiesić je w 4 ml PBS i policzyć komórki w komorze Neubauera pod mikroskopem. Jedna butelka T175 daje około 4,5 x 10⁷ komórek.
      UWAGA: Upewnij się, że hodowla zawiera wystarczającą liczbę komórek do recelularyzacji ECM wątroby szczura z 6 x 10⁸ komórek HepG2 na ECM (10 x 175 cm² kolby hodowlane po 4-5 x 10⁸ komórek każda).

Rysunek 1. System bioreaktorów. A) Ten system bioreaktora został wykonany na zamówienie. Utrzymuje modele organów w temperaturze 37 °C i 5% CO_{2 .} Natężenie przepływu pomp perystaltycznych można regulować indywidualnie. B) Wątrobę umieszcza się w komorze wzrostowej i podłącza do obwodu perfuzyjnego, który składa się z pompy perystaltycznej, zbiornika pożywki, pułapki bąbelkowej i czujnika ciśnienia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Recelularyzacja ECM
   1. Skonfiguruj system bioreaktora, zawierający komorę perfuzyjną wątroby, system perfuzyjny, zbiornik pożywki i pułapkę bąbelkową. Wysterylizować system bioreaktora (121 °C, 15 min).
   2. Połączyć system bioreaktora z pompą perystaltyczną i umieścić go w inkubatorze zapewniającym odpowiednie warunki (37 °C, 5%_CO2). Umieść zdecelularizowane rusztowania wątroby szczura⁸ w komorze perfuzyjnej wątroby systemu bioreaktora (ryc. 1).
   3. Połączyć kaniulowaną żyłę wrotną i żyłę główną za pomocą zacisków rurkowych do systemu perfuzyjnego. Zrównoważyć rusztowanie za pomocą pożywki o stężeniu 150 ml RPMI (jak opisano w ppkt 1.1) przez 5 dni z natężeniem przepływu 1,25 ml/min.
   4. Odłączyć rusztowanie wątroby od obwodu pożywki i zaszczepić rusztowanie 3 x 10⁸ komórek HepG2 (w 5 ml) przez żyłę wrotną za pomocą strzykawki o pojemności 5 ml, unikać tworzenia się pęcherzyków powietrza i pozwolić komórkom na ponowne zasiedlenie ECM poprzez inkubację przez 1 godzinę w rusztowaniu z wyłączoną pompą.
   5. Stopniowo zwiększaj natężenie przepływu, regulując pompę, zaczynając od 1,25 ml/min przez 10 min, 2,5 ml/min przez 20 min i kończąc 3,75 ml/min przez 30 min.
   6. Powtórz kroki 1.2.4-1.2.5, aby osiągnąć łączną liczbę komórek 6 x 10⁸.
   7. Uruchomić system bioreaktora z natężeniem przepływu 3,75 ml/min. Hodować zrecelularowaną wątrobę szczura przez 2 tygodnie.
      UWAGA: Zastępować jedną trzecią podłoża świeżą pożywką (50 ml) co drugi dzień. Pobrać próbkę pożywki w celu zmierzenia parametrów fizjologicznych, takich jak aktywność dehydrogenazy mleczanowej, pH próbek pożywki oraz stężenie glukozy i mleczanu.

2. Transdukcja zrecelularyzowanej wątroby szczura

1. Produkcja wektorów AAV na dużą skalę
   1. Produkuj, oczyszczaj i określaj ilościowo wektory AAV zgodnie z wcześniejszym opisem:¹¹
      1. Krótko mówiąc, wyprodukuj wektory AAV w butelkach rolkowych i oczyść je przez wirowanie w gradiacji jodiksanalu. Usunąć resztki jodiksanolu przez filtrację przez żelowe kolumny filtracyjne PD10. Określ stężenie wektora AAV za pomocą qPCR, używając genomowego DNA AAV jako standardu.
         UWAGA: Samouzupełniający, pseudotypowany wektor AAV2 / 6 zastosowany w niniejszym badaniu kodował EmGFP jako reporter w celu wykazania skuteczności transdukcji i kasety ekspresji shRNA do knockdownu endogennie eksprymowanego genu (ludzka cyklofilina B (hCycB), figura 2). Upewnij się, że wystarczająca liczba pseudotypowanych wektorów scAAV serotypu 6 (2,7 x 10¹³ wektorów AAV na model wątroby).

Rysunek 2. Mapa samokomplementarnego, pseudotypowanego wektora AAV2/6 wykorzystanego w niniejszym badaniu. Genom składa się z odwróconych powtórzeń końcowych (ITR) AAV2 i koduje EmGFP pod kontrolą promotora CMV, a także shRNA pod kontrolą promotora U6. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Transdukcja modelu wątroby
   1. Dostosować roztwór wektora AAV do końcowego stężenia 2,7 x^{10 13} genomów wektorowych w 5 ml, dodając odpowiednią objętość PBS.
   2. Odłącz wątrobę od obwodu pożywki, wyjmując rurkę z kaniuli. Podłączyć strzykawkę o pojemności 5 ml do kaniuli żyły wrotnej i wstrzyknąć cały roztwór wektora AAV (5 ml).
      UWAGA: Opcjonalnie dodaj czerwień fenolową (5 μg/ml), aby śledzić rozkład roztworu wektora AAV w wątrobie.
   3. Inkubować przez 1 godzinę bez pompowania. Stopniowo zwiększaj natężenie przepływu, zaczynając od 1,25 ml/min przez 10 min; 2,5 ml/min przez 20 min i 3,75 ml/min przez 30 min. Hodowla zrecellularizowanej wątroby szczura przez 6 dni.
      UWAGA: Wymień jedną trzecią pożywki, jak podano w UWAGA pod 1.2.7

3. Ocena recellularizowanej, transdukowanej wątroby szczura

1. Barwienie hematoksyliną i eozyną (HE) oraz analiza immunohistochemiczna
   1. Pobrać próbki (0,5 x 0,5 x 1,5-2 cm) z każdego płata wątroby za pomocą skalpela.
   2. Próbki (z ppkt 3.1.1) inkubować w 4% roztworze paraformaldehydu (PFA) + 4% sacharozy przez 1,5 godziny w temperaturze 4 °C. (Uwaga: PFA jest toksyczny i rakotwórczy. PFA należy zawsze przechowywać pod wyciągiem i nosić odpowiednią odzież ochronną.) Przemyć trzykrotnie PBS (1 minuta na każdy etap płukania) i inkubować w 8% sacharozie przez noc w temperaturze 4 °C.
   3. Wlać utrwalacz do plastikowych krioform, umieścić próbki w podłożu utrwalającym wolnym od pęcherzyków powietrza. Dodawać pożywkę utrwalającą, aż próbka zostanie dobrze pokryta. Osadzone próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia.
   4. Przygotować kriosekcje (10 μm) za pomocą kriotomu¹². Oceń recelularyzację za pomocą barwienia hematoksyliną + eozyną⁸. Oceń wydajność transdukcji za pomocą barwienia immunohistochemicznego dla interesującego genu (tutaj: EmGFP).
2. Molekularne pobieranie próbek biologicznych
   1. Pobrać próbki z każdego płata wątroby za pomocą stempla biopsyjnego (o średnicy 4 mm). Wyizolować całkowite RNA, DNA i białka zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi oceny ekspresji transgenu EmGFP i knock down hCycB ⁸.

Dla oceny zakresu recelularizacji, kriosekcje zostały przygotowane z każdego płata każdego modelu wątroby recelularyzowanej. Skrawki były następnie analizowane za pomocą barwienia hematoksyliną i eozyną. Jak widać na rycinie 3, każdy płat z trzech modeli wątroby, oznaczony jako TLM1, TLM2 (transdukowane modele wątroby 1 + 2) i Ctrl (kontrolny model wątroby, który został recellularowany, ale nie transdukowany), został ponownie zasiedlony komórkami HepG2. Ta linia komórkowa raka wątrobowokomórkowego została utworzona z tkanki nowotworowej 15-letniego argentyńskiego chłopca. Niektóre obszary modeli wątroby były intensywniej rekomórkowane niż inne. Przyczyny tych różnic nie zostały jeszcze ustalone.

Rysunek 3. Barwienie hematoksyliną i eozyną w każdym płacie z trzech analizowanych modeli wątroby. TLM1+2: transdukowane modele wątroby 1 i 2; Ctrl.: kontrolny model wątroby, który został zrecellularowany, ale nie transdukowany. Podziałka: 200 μm. (Przedruk za zgodą Ref. 8.) Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

W następnym kroku oceniono transdukcję modeli wątroby. W tym celu DNA przygotowano z 28 biopsji punktowych każdego z modeli wątroby, a miano wektora określono ilościowo za pomocą qPCR. Średnio mierzono 55 i 90 zinternalizowanych genomów wektorowych na komórkę (VG / komórkę) dla dwóch transdukowanych modeli wątroby. Eksperymenty w hodowli komórkowej 2D wykazały, że 30 VG / komórkę jest wystarczające do silnej ekspresji transgenu i wyciszenia za pośrednictwem RNAi. Wytwarzanie EmGFP analizowano za pomocą RT-PCR i Western blot. W rzeczywistości ekspresję reportera wykryto w 80-90% biopsji odpowiednio na poziomie mRNA i białka. 8 Aby uzyskać kompleksowy obraz wydajności transdukcji, kriosekcje poddano analizie immunohistologicznej. Jak widać na rycinie 4, obszary modelu wątroby, które zostały pomyślnie zrecellularowane, jak uwidoczniono za pomocą barwienia DAPI, dawały również silne sygnały fluorescencyjne w analizie immunohistochemicznej ekspresji EmGFP. Zgodnie z oczekiwaniami, kontrolny model wątroby, nieleczony wektorami AAV, nie wykazał żadnej ekspresji EmGFP.

Rysunek 4. Analiza immunohistochemiczna ekspresji EmGFP. Komórki, które ponownie zasiedliły modele wątroby, zostały uwidocznione za pomocą barwienia DAPI (niebieski); Ekspresję EmGFP uwidoczniono za pomocą barwienia immunochemicznego (kolor czerwony). TLM1+2: transdukowane modele wątroby 1 i 2; Ctrl.: kontrolny model wątroby, który został zrecellularowany, ale nie transdukowany. Podziałka: 200 μm. (Przedruk za zgodą Ref. 8.) Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

W końcowym teście, za pośrednictwem AAV, przeanalizowano knockdown hCycB za pomocą qRT-PCR. Stwierdzono, że knockdown hCycB wynosi od 70 do 90%, uśredniony dla wszystkich płatów dwóch transdukowanych modeli wątroby (ryc. 5).

Rysunek 5. Knockdown hCycB za pośrednictwem RNAi w modelach wątroby 3D transdukowanych AAV. Wyciszenie hCycB określono metodą qRT-PCR. Wartości średnie i odchylenia standardowe (SD) obliczono dla wszystkich próbek każdego transdukowanego modelu wątroby 3D (odpowiednio TLM1 i 2) i znormalizowano do średniej wartości kontroli niewydukowanej (Ctrl.). (Przedruk za zgodą Ref. 8.) Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.