Badanie wektorów wirusowych w trójwymiarowym modelu wątroby wypełnionym ludzką linią komórkową raka wątrobowokomórkowego HepG2

Podsumowanie

Recellularna macierz zewnątrzkomórkowa zdecelularizowanej wątroby szczura może być używana jako humanizowany, trójwymiarowy model ex vivo do badania dystrybucji i ekspresji transgenu wirusa lub wektora wirusowego.

Streszczenie

Ten protokół opisuje generowanie trójwymiarowego (3D) modelu wątroby ex vivo i jego zastosowanie do badania i rozwoju systemów wektorów wirusowych. Model uzyskuje się poprzez ponowne zasiedlenie macierzy zewnątrzkomórkowej pozbawionej komórek wątroby szczura ludzką linią komórkową hepatocytów. Model umożliwia badania w unaczynionym systemie komórkowym 3D, zastępując potencjalnie szkodliwe eksperymenty z żywymi zwierzętami. Dodatkowym atutem jest humanizowany charakter modelu, który jest bliższy fizjologii człowieka niż modelom zwierzęcym.

W tym badaniu demonstrujemy transdukcję tego modelu wątroby za pomocą wektora wirusowego pochodzącego z wirusów związanych z adenowirusem (wektor AAV). Obwód perfuzyjny, który zaopatruje model wątroby 3D w podłoże, zapewnia łatwy sposób na zastosowanie wektora. System pozwala na monitorowanie głównych parametrów metabolicznych wątroby. Do końcowej analizy można pobrać próbki tkanek w celu określenia zakresu recelularyzacji za pomocą technik histologicznych. Dystrybucja wektora wirusa i ekspresja dostarczonego transgenu mogą być analizowane za pomocą ilościowego PCR (qPCR), Western blotting i immunohistochemii. Można przewidzieć liczne zastosowania modelu wektorowego w badaniach podstawowych i w rozwoju zastosowań terapii genowej, w tym rozwój nowych terapii przeciwwirusowych, badania nad rakiem oraz badanie wektorów wirusowych i ich potencjalnych skutków ubocznych.

Wprowadzenie

Większość obecnych badań biomedycznych opiera się na jednym z dwóch podejść, albo dwuwymiarowych (2D) eksperymentach z hodowlą komórkową, albo na modelach zwierzęcych, które są trójwymiarowe (3D) z samej swojej natury. Podejścia te mają jednak pewne poważne wady. Wykazano, że komórki hodowane w hodowli 2D różnią się wzorcami ekspresji genów i fizjologią komórki od tych hodowanych w warunkach 3D. ¹ Modele zwierzęce, oprócz tego, że kojarzą się z kwestiami etycznymi, często nie modelują dobrze ludzkiej fizjologii. Chociaż brak oczywistych skutków toksycznych związku musi zostać potwierdzony w modelach zwierzęcych przed pierwszym dawkowaniem u ludzi, w badaniach klinicznych udokumentowano wiele przypadków, w których wystąpiły poważne, czasami śmiertelne, działania niepożądane. ^{cyfra arabska}

Aby przezwyciężyć te niedociągnięcia, humanizowane modele organów ex vivo w 3D stały się ważnymi narzędziami badawczymi. Podczas uprawy w odpowiednich warunkach komórki samoorganizują się w struktury 3D znane jako sferoidy. Jednak te sferoidy nie mają układu naczyniowego, co ogranicza dystrybucję małych związków molekularnych, dużych leków biologicznych i wektorów wirusowych. Na przykład wektory adenowirusowe transdukowały tylko zewnętrzne warstwy komórkowe sferoid przygotowanych z ludzkich glejaków. ³ Rozwiązaniem tego problemu jest wykorzystanie modelu narządu zawierającego układ naczyniowy. W tym celu interesujący nas narząd może zostać usunięty ze zwierzęcia, a komórki zwierzęce mogą zostać zastąpione komórkami ludzkimi. Opisano różne metody decelularyzacji wątroby zwierzęcej poprzez leczenie detergentami lub cholanem sodu. ^4-6 Powstała macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) zawiera cytokiny i czynniki wzrostu, które regulują różne procesy komórkowe. ⁷ Może być używany jako rusztowanie do recelularizacji komórkami ludzkimi w celu uzyskania funkcjonalnego modelu narządu.

W niedawnym badaniu użyliśmy humanizowanego modelu 3D wątroby do zbadania dystrybucji i ekspresji transgenu wektora wirusa związanego z adenowirusem (AAV). ⁸ Wektory AAV należą do najbardziej obiecujących wektorów wirusowych do zastosowań w terapii genowej. ⁹ Pierwsza i jak dotąd jedyna zatwierdzona genowa interwencja terapeutyczna w świecie zachodnim wykorzystuje wektor AAV do przenoszenia lipazy lipoproteinowej. ¹⁰

Protokół

UWAGA: R.L. uzyskał etyczne zatwierdzenie eksplantacji organów od Landesamt für Gesundheit und Soziales (LaGeSo). Wątroby zostały wysadzone ze szczurów rasy Wister. Żyłę główną dolną i żyłę wrotną wątroby kaniulowano kaniulą 22 G. Metody decelularyzacji eksplantowanych wątrob zostały opisane wcześniej. ^4,5 Zastosowane tu matryce zewnątrzkomórkowe uzyskano w wyniku nadmiernej perfuzji wątroby szczura z 1% deoksycholanem sodu.

1. Recelularyzacja macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) wątroby szczura

1. Ekspansja linii komórek wątroby HepG2
   1. Hodowla linii komórkowej raka wątrobowokomórkowego HepG2 w pożywce Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 uzupełnionej 10% płodową surowicą cielęcą, 2 mM glutaminy i 2 mM penicyliny i streptomycyny.
   2. Wysiewaj 1,5 x 10⁷ komórek w butelkach T175 i hoduj komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ . Zebrać komórki po 4 dniach przez trypsynizację przez 5 minut w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ .
   3. Odwirować komórki w temperaturze 300 x g i ponownie zawiesić je w 4 ml PBS i policzyć komórki w komorze Neubauera pod mikroskopem. Jedna butelka T175 daje około 4,5 x 10⁷ komórek.
      UWAGA: Upewnij się, że hodowla zawiera wystarczającą liczbę komórek do recelularyzacji ECM wątroby szczura z 6 x 10⁸ komórek HepG2 na ECM (10 x 175 cm² kolby hodowlane po 4-5 x 10⁸ komórek każda).

Rysunek 1. System bioreaktorów. A) Ten system bioreaktora został wykonany na zamówienie. Utrzymuje modele organów w temperaturze 37 °C i 5% CO_{2 .} Natężenie przepływu pomp perystaltycznych można regulować indywidualnie. B) Wątrobę umieszcza się w komorze wzrostowej i podłącza do obwodu perfuzyjnego, który składa się z pompy perystaltycznej, zbiornika pożywki, pułapki bąbelkowej i czujnika ciśnienia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Recelularyzacja ECM
   1. Skonfiguruj system bioreaktora, zawierający komorę perfuzyjną wątroby, system perfuzyjny, zbiornik pożywki i pułapkę bąbelkową. Wysterylizować system bioreaktora (121 °C, 15 min).
   2. Połączyć system bioreaktora z pompą perystaltyczną i umieścić go w inkubatorze zapewniającym odpowiednie warunki (37 °C, 5%_CO2). Umieść zdecelularizowane rusztowania wątroby szczura⁸ w komorze perfuzyjnej wątroby systemu bioreaktora (ryc. 1).
   3. Połączyć kaniulowaną żyłę wrotną i żyłę główną za pomocą zacisków rurkowych do systemu perfuzyjnego. Zrównoważyć rusztowanie za pomocą pożywki o stężeniu 150 ml RPMI (jak opisano w ppkt 1.1) przez 5 dni z natężeniem przepływu 1,25 ml/min.
   4. Odłączyć rusztowanie wątroby od obwodu pożywki i zaszczepić rusztowanie 3 x 10⁸ komórek HepG2 (w 5 ml) przez żyłę wrotną za pomocą strzykawki o pojemności 5 ml, unikać tworzenia się pęcherzyków powietrza i pozwolić komórkom na ponowne zasiedlenie ECM poprzez inkubację przez 1 godzinę w rusztowaniu z wyłączoną pompą.
   5. Stopniowo zwiększaj natężenie przepływu, regulując pompę, zaczynając od 1,25 ml/min przez 10 min, 2,5 ml/min przez 20 min i kończąc 3,75 ml/min przez 30 min.
   6. Powtórz kroki 1.2.4-1.2.5, aby osiągnąć łączną liczbę komórek 6 x 10⁸.
   7. Uruchomić system bioreaktora z natężeniem przepływu 3,75 ml/min. Hodować zrecelularowaną wątrobę szczura przez 2 tygodnie.
      UWAGA: Zastępować jedną trzecią podłoża świeżą pożywką (50 ml) co drugi dzień. Pobrać próbkę pożywki w celu zmierzenia parametrów fizjologicznych, takich jak aktywność dehydrogenazy mleczanowej, pH próbek pożywki oraz stężenie glukozy i mleczanu.

2. Transdukcja zrecelularyzowanej wątroby szczura

1. Produkcja wektorów AAV na dużą skalę
   1. Produkuj, oczyszczaj i określaj ilościowo wektory AAV zgodnie z wcześniejszym opisem:¹¹
      1. Krótko mówiąc, wyprodukuj wektory AAV w butelkach rolkowych i oczyść je przez wirowanie w gradiacji jodiksanalu. Usunąć resztki jodiksanolu przez filtrację przez żelowe kolumny filtracyjne PD10. Określ stężenie wektora AAV za pomocą qPCR, używając genomowego DNA AAV jako standardu.
         UWAGA: Samouzupełniający, pseudotypowany wektor AAV2 / 6 zastosowany w niniejszym badaniu kodował EmGFP jako reporter w celu wykazania skuteczności transdukcji i kasety ekspresji shRNA do knockdownu endogennie eksprymowanego genu (ludzka cyklofilina B (hCycB), figura 2). Upewnij się, że wystarczająca liczba pseudotypowanych wektorów scAAV serotypu 6 (2,7 x 10¹³ wektorów AAV na model wątroby).

Rysunek 2. Mapa samokomplementarnego, pseudotypowanego wektora AAV2/6 wykorzystanego w niniejszym badaniu. Genom składa się z odwróconych powtórzeń końcowych (ITR) AAV2 i koduje EmGFP pod kontrolą promotora CMV, a także shRNA pod kontrolą promotora U6. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Transdukcja modelu wątroby
   1. Dostosować roztwór wektora AAV do końcowego stężenia 2,7 x^{10 13} genomów wektorowych w 5 ml, dodając odpowiednią objętość PBS.
   2. Odłącz wątrobę od obwodu pożywki, wyjmując rurkę z kaniuli. Podłączyć strzykawkę o pojemności 5 ml do kaniuli żyły wrotnej i wstrzyknąć cały roztwór wektora AAV (5 ml).
      UWAGA: Opcjonalnie dodaj czerwień fenolową (5 μg/ml), aby śledzić rozkład roztworu wektora AAV w wątrobie.
   3. Inkubować przez 1 godzinę bez pompowania. Stopniowo zwiększaj natężenie przepływu, zaczynając od 1,25 ml/min przez 10 min; 2,5 ml/min przez 20 min i 3,75 ml/min przez 30 min. Hodowla zrecellularizowanej wątroby szczura przez 6 dni.
      UWAGA: Wymień jedną trzecią pożywki, jak podano w UWAGA pod 1.2.7

3. Ocena recellularizowanej, transdukowanej wątroby szczura

1. Barwienie hematoksyliną i eozyną (HE) oraz analiza immunohistochemiczna
   1. Pobrać próbki (0,5 x 0,5 x 1,5-2 cm) z każdego płata wątroby za pomocą skalpela.
   2. Próbki (z ppkt 3.1.1) inkubować w 4% roztworze paraformaldehydu (PFA) + 4% sacharozy przez 1,5 godziny w temperaturze 4 °C. (Uwaga: PFA jest toksyczny i rakotwórczy. PFA należy zawsze przechowywać pod wyciągiem i nosić odpowiednią odzież ochronną.) Przemyć trzykrotnie PBS (1 minuta na każdy etap płukania) i inkubować w 8% sacharozie przez noc w temperaturze 4 °C.
   3. Wlać utrwalacz do plastikowych krioform, umieścić próbki w podłożu utrwalającym wolnym od pęcherzyków powietrza. Dodawać pożywkę utrwalającą, aż próbka zostanie dobrze pokryta. Osadzone próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia.
   4. Przygotować kriosekcje (10 μm) za pomocą kriotomu¹². Oceń recelularyzację za pomocą barwienia hematoksyliną + eozyną⁸. Oceń wydajność transdukcji za pomocą barwienia immunohistochemicznego dla interesującego genu (tutaj: EmGFP).
2. Molekularne pobieranie próbek biologicznych
   1. Pobrać próbki z każdego płata wątroby za pomocą stempla biopsyjnego (o średnicy 4 mm). Wyizolować całkowite RNA, DNA i białka zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi oceny ekspresji transgenu EmGFP i knock down hCycB ⁸.

Wyniki

Dla oceny zakresu recelularizacji, kriosekcje zostały przygotowane z każdego płata każdego modelu wątroby recelularyzowanej. Skrawki były następnie analizowane za pomocą barwienia hematoksyliną i eozyną. Jak widać na rycinie 3, każdy płat z trzech modeli wątroby, oznaczony jako TLM1, TLM2 (transdukowane modele wątroby 1 + 2) i Ctrl (kontrolny model wątroby, który został recellularowany, ale nie transdukowany), został ponownie zasiedlony komórkami HepG2. Ta linia komórkowa raka wątrobowokomórkowego została utworzona z tkanki nowotworowej 15-letniego argentyńskiego chłopca. Niektóre obszary modeli wątroby były intensywniej rekomórkowane niż inne. Przyczyny tych różnic nie zostały jeszcze ustalone.

Rysunek 3. Barwienie hematoksyliną i eozyną w każdym płacie z trzech analizowanych modeli wątroby. TLM1+2: transdukowane modele wątroby 1 i 2; Ctrl.: kontrolny model wątroby, który został zrecellularowany, ale nie transdukowany. Podziałka: 200 μm. (Przedruk za zgodą Ref. 8.) Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

W następnym kroku oceniono transdukcję modeli wątroby. W tym celu DNA przygotowano z 28 biopsji punktowych każdego z modeli wątroby, a miano wektora określono ilościowo za pomocą qPCR. Średnio mierzono 55 i 90 zinternalizowanych genomów wektorowych na komórkę (VG / komórkę) dla dwóch transdukowanych modeli wątroby. Eksperymenty w hodowli komórkowej 2D wykazały, że 30 VG / komórkę jest wystarczające do silnej ekspresji transgenu i wyciszenia za pośrednictwem RNAi. Wytwarzanie EmGFP analizowano za pomocą RT-PCR i Western blot. W rzeczywistości ekspresję reportera wykryto w 80-90% biopsji odpowiednio na poziomie mRNA i białka. ⁸ Aby uzyskać kompleksowy obraz wydajności transdukcji, kriosekcje poddano analizie immunohistologicznej. Jak widać na rycinie 4, obszary modelu wątroby, które zostały pomyślnie zrecellularowane, jak uwidoczniono za pomocą barwienia DAPI, dawały również silne sygnały fluorescencyjne w analizie immunohistochemicznej ekspresji EmGFP. Zgodnie z oczekiwaniami, kontrolny model wątroby, nieleczony wektorami AAV, nie wykazał żadnej ekspresji EmGFP.

Rysunek 4. Analiza immunohistochemiczna ekspresji EmGFP. Komórki, które ponownie zasiedliły modele wątroby, zostały uwidocznione za pomocą barwienia DAPI (niebieski); Ekspresję EmGFP uwidoczniono za pomocą barwienia immunochemicznego (kolor czerwony). TLM1+2: transdukowane modele wątroby 1 i 2; Ctrl.: kontrolny model wątroby, który został zrecellularowany, ale nie transdukowany. Podziałka: 200 μm. (Przedruk za zgodą Ref. 8.) Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

W końcowym teście, za pośrednictwem AAV, przeanalizowano knockdown hCycB za pomocą qRT-PCR. Stwierdzono, że knockdown hCycB wynosi od 70 do 90%, uśredniony dla wszystkich płatów dwóch transdukowanych modeli wątroby (ryc. 5).

Rysunek 5. Knockdown hCycB za pośrednictwem RNAi w modelach wątroby 3D transdukowanych AAV. Wyciszenie hCycB określono metodą qRT-PCR. Wartości średnie i odchylenia standardowe (SD) obliczono dla wszystkich próbek każdego transdukowanego modelu wątroby 3D (odpowiednio TLM1 i 2) i znormalizowano do średniej wartości kontroli niewydukowanej (Ctrl.). (Przedruk za zgodą Ref. 8.) Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Odtworzone wątroby 3D opisane tutaj stanowią model do badania wektorów wirusowych w humanizowanym systemie. Ponowna populacja ECM wątroby szczura ludzką linią komórkową raka wątrobowokomórkowego generuje system unaczyniony, który pozwala na badanie dużych leków biologicznych. Wyniki te stanowią dowód na słuszność koncepcji, że zrekonstruowany model wątroby może być skutecznie transdukowany za pomocą wektora wirusowego.

W pokazanych tutaj eksperymentach każdy płat wątroby został przetransdukowany przez wektor AAV. Jednak w niektórych wstępnych eksperymentach pojedyncze płaty nie zostały ponownie zasiedlone komórkami. Dlatego ważne jest, aby zapobiec zatykaniu układu naczyniowego przez resztki komórek lub inne składniki. Aby sprawdzić, czy wszystkie płaty mogą być perfundowane, nietoksyczny barwnik, taki jak czerwień fenolowa, można przepłukać przez model wątroby.

Kolejną istotną kwestią jest utrzymanie sterylności rusztowania wątrobowego. Podczas gdy leczenie etanolem lub antybiotykami jest niekorzystne dla układu naczyniowego, napromienianie macierzy zewnątrzkomórkowej promieniowaniem γ konserwuje naczynia i sterylizuje próbkę.

Co więcej, wielkość eksplantowanych wątrob będzie się różnić, tak że liczba komórek użytych do procedury recelularyzacji i czas ponownego zasiedlenia mogą wymagać dostosowania w celu uzyskania powtarzalnych wyników.

Wątroby szczurów użyte w niniejszym badaniu są stosunkowo duże i wymagają dużej ilości komórek i odczynników testowych (np. wektorów AAV). Ponadto procedura ponownego zasiedlenia trwała ponad dwa tygodnie. Ogranicza to liczbę powtórzeń, które można wykonać przy rozsądnym wysiłku. Obecnie ustalamy model dla wątroby myszy, która stanowi tylko około jednej piątej objętości wątroby szczura, co pozwala na użycie mniejszej liczby komórek i mniejszej liczby odczynników testowych. Chociaż proporcjonalne zmniejszenie liczby komórek wydaje się rozsądne, dokładne ilości muszą zostać określone w dalszych eksperymentach.

Kolejnym mankamentem obecnego modelu jest wykorzystanie wątrobowokomórkowej linii komórkowej HepG2. Trwają eksperymenty mające na celu opracowanie możliwości wykorzystania hepatocytów zróżnicowanych z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, co zapewni fizjologicznie bardziej odpowiedni model. Ponadto wątroba składa się z wielu typów komórek oprócz hepatocytów, np. komórek Kupffera i sinozydów. Zakładamy, że różne typy komórek ponownie zasiedlą swoje naturalne środowisko, gdy ECM zostanie ponownie komórkowany z wieloma typami komórek.

Model 3D wątroby łączy w sobie kilka zalet. Główną wadą konwencjonalnych modeli in vivo jest to, że fizjologia zwierząt znacznie różni się od fizjologii człowieka. Toksyczne skutki uboczne leczenia człowieka mogą zatem pozostać niewykryte. Tę wadę można przezwyciężyć, odtwarzając model 3D wątroby z ludzkimi komórkami, które lepiej odzwierciedlają biologię ludzkich pacjentów.

Drugą zaletą modelu wątroby jest jego wkład w dobrostan zwierząt. Chociaż do doświadczeń związanych z rekonstytucją wymagane są składniki pochodzenia zwierzęcego, podejście to jest nadal zgodne z celami zasady 3R (zastępstwo, redukcja, udoskonalenie), ponieważ można wykorzystać nadwyżki zwierząt, które zostały uśmiercone do celów innych doświadczeń na zwierzętach, tj. nie są potrzebne żadne dodatkowe zwierzęta, a podejście to całkowicie pozwala uniknąć cierpienia zwierząt, które często wiąże się z in vivo Eksperymenty. Sferoidy są alternatywnym narzędziem do badania procesów komórkowych w systemie 3D. Jednak sferoidy nie są unaczynione, dzięki czemu duże substancje i leki biologiczne nie wnikają głęboko w wewnętrzne części struktury. Problemy te zostały przezwyciężone dzięki unaczynionemu modelowi wątroby 3D.

W opisanych tu eksperymentach badano wektory AAV, ponieważ są one jednymi z najbardziej obiecujących kandydatów do zastosowań w terapii genowej. Ponieważ wiele podejść do terapii genowej ma na celu ukierunkowanie na wątrobę , np . w leczeniu zakażeń wirusami zapalenia wątroby lub niedoboru alfa-1-antytrypsyny, wątroba 3D może być wykorzystana w procesie rozwoju tych wektorów AAV. Oczywiście nadaje się również do badania innych hepatotropowych wektorów wirusowych, np. wektorów adenowirusowych. Ponadto może być stosowany do badania zakaźnych wirusów zapalenia wątroby, takich jak wirus zapalenia wątroby typu B lub C. Można go na przykład wykorzystać do projektowania nowych strategii przeciwwirusowych. Co więcej, modele 3D narządów stanowią obiecujące narzędzia do opracowywania nowych leków cytostatycznych do leczenia nowotworów oraz do prowadzenia badań toksykologicznych. Na dłuższą metę sztuczne wątroby mogą być wykorzystywane w medycynie regeneracyjnej jako przeszczepy. Podsumowując, trójwymiarowy model wątroby oferuje szeroki zakres zastosowań w biologii zakażeń i innych dziedzinach badań biomedycznych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Inkubator	Fraunhofer	/
Pompa perystaltyczna	Fraunhofer	/
Kołnierz z rowkiem	Duran	2439454	modyfikowany przez gaffer
O-ring Przezroczysty	Duran	2922551
Zacisk szybkiego zwalniania	Duran	2907151
Pokrywa z płaskim kołnierzem	Duran	2429857	zmodyfikowany przez gaffer
Gwint Rurka	Duran	2483802	modyfikowany przez gaffer
Gwint	Rurka Duran	2483602	modyfikowany przez gaffer
Silikonowy pierścień uszczelniający	Duran	2862012
Zakrętka	Duran	2924008
Zakrętka z otworem	Duran
Zakrętka z otworem	Filtr Duran	2922705
Sarstedt	831,826,001
Rurka silikonowa	VWR	228-1500
Łącznik rurowy	Ismatec	ISM556A
Biokompatybilne rurki Kolby	hodowlane Ismatec	SC0736
T175	Greiner bio-one	660 160
RPMI 1640	BioWest SAS (Th. Geyer)	L0501-500
glutamina	BioWest SAS (Th. Geyer)	X0551-100
Trypsyna	BioWest SAS (Th. Geyer)	L0940-100
penicylina/streptomycyna	BioWest SAS (Th. Geyer)	L0022-100
płodowa surowica cielęca	cc pro	S-10-M
Tissue-Tek O.C.T.	Weckert-Labortechnik	600001
HepG2	DSMZ	ACC 180
Cryomold 15 x 15 x 5 mm	Sakura	4566
Dziurkacz do biopsji 4 mm	pfm medical	48401
MiRNA nukleospinowy	Macherey & Nagel	740971.10
Zestaw nukleospinowego RNA/DNA	Macherey & Nagel	740944