Test fluorescencyjny aktywności scramblazy fosfolipidowej

Podsumowanie

Opisujemy test oparty na fluorescencji do pomiaru mieszania fosfolipidów w dużych liposomach jednowarstwowych odtworzonych za pomocą opsyny.

Streszczenie

Scramblases translokują fosfolipidy przez dwuwarstwę błony dwukierunkowo w sposób niezależny od ATP. Pierwszym scramblazem, który został zidentyfikowany i zweryfikowany biochemicznie, była opsyna, apoproteina fotoreceptora rodopsyny. Rodopsyna jest receptorem sprzężonym z białkiem G zlokalizowanym w błonach dyskowych fotoreceptorów pręcików siatkówki, gdzie jest odpowiedzialna za percepcję światła. Aktywność śramblazy rodopsyny nie zależy od jej liganda 11-cis-retinalu, tj. opsyna apoproteinowa jest również aktywna jako scramblaza. Chociaż konstytutywne i regulowane mieszanie fosfolipidów odgrywa ważną rolę w fizjologii komórki, do tej pory zidentyfikowano tylko kilka scramblazów fosfolipidowych oprócz opsyny. Tutaj opisujemy oparty na fluorescencji test aktywności szyfrującej opsyny. Opsyna jest odtwarzana w dużych liposomach jednowarstwowych złożonych z fosfatydylocholiny, fosfatydyloglicerolu i śladowej ilości fluorescencyjnego PC znakowanego NBD (1-palmitoilo-2-{6-[7-nitro-2-1,3-benzoksadiazolo-4-ylo)amino]heksanoilo}-sn-glicero-3-fosfocholiny). Aktywność scramblazy określa się, mierząc stopień, w jakim cząsteczki NBD-PC znajdujące się w wewnętrznej płatku pęcherzyka są w stanie uzyskać dostęp do płatka zewnętrznego, gdzie ich fluorescencja jest chemicznie eliminowana przez środek redukujący, który nie może przejść przez błonę. Metody, które opisujemy, mają ogólne zastosowanie i mogą być wykorzystywane do identyfikacji i charakterystyki aktywności scramblazowej innych białek błonowych.

Wprowadzenie

Fotoreceptor rhodopsin, prototypowy receptor sprzężony z białkiem G (omówiony na przykład w odniesieniu ¹), jest pierwszym zidentyfikowanym i zweryfikowanym biochemicznie skramblasem fosfolipidowym ^2,3. Skramblasy są transporterami fosfolipidów, które zwiększają naturalnie powolną szybkość transportu fosfolipidów przez warstwy błony do poziomów fizjologicznie odpowiednich w sposób dwukierunkowy i niezależny od ATP ^4-6. Przykłady ich działania można znaleźć w retikulum endoplazmatycznym i bakteryjnej błonie cytoplazmatycznej, gdzie konstytutywny proces skramblowania jest niezbędny dla homeostazy i wzrostu błony, a także dla wielu szlakó....

Protokół

1. Przygotowanie liposomów i proteoliposomów

1. Tworzenie liposomów
   1. Za pomocą szklanej strzykawki dodać 1,435 μl POPC (25 mg/ml, w chloroformie) i 160 μl POPG (25 mg/ml w chloroformie) do kolby okrągłodennej, aby uzyskać 52,5 μmol lipidów w stosunku molowym POPC:POPG = 9:1.
   2. Suszyć lipidy przez 30 minut za pomocą wyparki obrotowej z prędkością obrotową 145 obr./min (dla tej objętości rozpuszczalnika nie jest potrzebna kąpiel wodna), a następnie przenieść kolbę do eksykatora próżniowego na co najmniej 3 godziny lub na noc, w temperaturze pokojowej (RT).
   3. Uwodnić wysuszony film lipidowy 10 ml 50 mM HEPES pH 7,4, 100 mM NaCl (zwan....

Wyniki

Opisujemy rekonstytucję opsyny w LUV w celu scharakteryzowania jej aktywności scramblazy przy użyciu testu fluorescencyjnego. Analizujemy wyniki, aby określić dolną granicę szybkości pośredniej przez opsynę wymiany fosfolipidów (scrambling) oraz ustalić stan oligomeryczny, w którym opsyna funkcjonalnie rekonstytuuje się w pęcherzykach.

Aby zidentyfikować optymalne warunki rekonstytucji, konieczne jest empiryczne określenie ilośc.......

Dyskusja

Test aktywności scramblase pozwolił nam pierwotnie ustalić, że opsyna ma aktywność fosfolipidową ². Test pozwolił nam również scharakteryzować aktywność skramblazy opsyny poprzez testowanie swoistości (użyliśmy różnych lipidów reporterowych znakowanych NBD, takich jak NBD-fosfatydyloetanoloamina, znakowana NBD na łańcuchu acylowym, jak pokazano dla NBD-PC na rysunku 1A, lub na grupie głównej, NBD-sfingomielina lub NBD-fosfatydyloseryna ²), wpływ składu lipidowego pęcherzyków (np.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1-palmitoilo-2-oleoilo-sn-glycero-3-fosfocholina	Avanti Polar Lipids	850457C	POPC
1-palmitoilo-2-oleoilo-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (sól sodowa)	Avanti Polar Lipids	840457C	POPG
1-palmitoilo-2-{6-[7-nitro-2-1,3-benzoksadiazol-4-ylo)amino]heksanoyl}-sn-glicero-3-fosfocholina	Avanti Polar Lipids	810130C	NBD-PC Kwas
4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy	VWR Scientific	EM-5330	HEPES
NaCl	Sigma	S7653-1KG	NaCl
Dodecyl-β-D-maltozyd	Anatrace	D310 5 GM	DDM
Kuwety fluorymetryczne	sigma	C0918-100EA	kuwety
Spektrofluorometr	Photon Technology International, Inc.	fluorymetr
Wodorosiarczyn sodu klasy technicznej, 85%	Sigma	157953-5G	ditionit
		Oprogramowanie GraphPad Prism 5	Prism
Tris Base	VWR	JTX171-3	Tris
LIPEX 10 ml extruder	Północna firma Lipids, Inc.		Ekstruder
Whatman, Tarcza drenażowa, PE, 25 mm	Sigma	28156-243	Wspornik dysku
Membrany Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes, 0,4 i mikro; m, Średnica 25 mm	Sigma	WHA110607	400 nm
Membrany Whatman Nucleopore Track-Etched Membranes, 0,2 i mikro; m, Średnica 25 mm	Membrana sodowa Sigma	WHA110606	200 nm
Sigma		S3264-500G
Probówki hodowlane VWR, jednorazowe, ze szkła borokrzemianowego, 13 x 100 mm	Rurki szklane	VWR Scientific	47729-572
Kwas nadchlorowy	Sigma	30755-500ML
Tetrahydrat molibdenianu amonu	Sigma	A-7302	molibdenian amonu
(+)-L-askorbinian sodu	Sigma	A7631-25G	askorbinian sodu
Bio-Beads SM2 adsorbenty	Bio Rad	1523920	polistyrenu
Mikroprobówki 2,0 ml przezroczyste	VWR Scientific	10011-742	Probówki
rekonstytucji Szklana probówka do rekonstytucji	VWR Scientific	53283-800	Probówki szklane do rekonstytucji
Zetasizer	Malvern		Dls

Membrana do