Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wizualizacja wczesnych stadiów fagocytozy

16.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54646

⸱

3 lutego 2017

 ,  , 
1Department of Molecular Microbiology & Immunology, Oregon Health & Science University, 2Ragon Institute of MGH, MIT and Harvard

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy technikę opartą na mikroskopie, aby wizualizować i kwantyfikować wczesne kaskady zdarzeń podczas fagocytozy patogenów, takich jak grzyby Candida albicans i cząstki większe niż 0,5 μm, w tym kulki pokryte zymozanem i IgG.

Streszczenie

Ciało ssaka jest wyposażone w różne warstwy mechanizmów, które pomagają bronić się przed inwazją patogenów. Profesjonalne fagocyty układu odpornościowego - takie jak neutrofile, komórki dendrytyczne i makrofagi - zachowują wrodzoną zdolność do wykrywania i usuwania takich atakujących patogenów poprzez fagocytozę1. Fagocytoza obejmuje choreograficzne zdarzenia reorganizacji błony i przebudowy aktyny na powierzchni komórki2,3. Fagocyty skutecznie internalizują i eliminują obce cząsteczki tylko wtedy, gdy spełnione są wszystkie etapy fagocytozy. Etapy te obejmują rozpoznawanie i wiązanie patogenu przez receptory rozpoznawania wzorców (PRR) znajdujące się na powierzchni komórki, tworzenie miseczki fagocytarnej przez błoniaste wypukłości wzbogacone w aktynę (pseudopody) otaczające cząstki oraz rozszczepienie fagosomu, a następnie dojrzewanie fagolizosomu, które powoduje zabicie patogenu3,4.

Obrazowanie i kwantyfikacja różnych etapów fagocytozy jest kluczowe dla wyjaśnienia molekularnych mechanizmów tego procesu komórkowego. Niniejszy manuskrypt przedstawia metody badania różnych faz fagocytozy. Opisujemy podejście oparte na mikroskopie do wizualizacji i ilościowego określania wiązania, tworzenia miseczek fagocytarnych i internalizacji cząstek stałych przez fagocyty. Ponieważ fagocytoza występuje, gdy wrodzone receptory na komórkach fagocytarnych napotykają ligandy na cząstce docelowej większej niż 0,5 μm, testy, które tutaj przedstawiamy, obejmują użycie chorobotwórczych grzybów Candida albicans i innych cząstek, takich jak zymosan i kulki pokryte IgG.

Wprowadzenie

Pomimo ciągłego narażenia na patogeny, takie jak bakterie, wirusy i grzyby, nasze ciało jest dobrze wyposażone w mechanizmy odpornościowe, które zapewniają ochronę przed infekcjami. Wrodzony układ odpornościowy jest pierwszą linią obrony przed atakującymi patogenami i opiera się głównie na komórkach fagocytarnych, które rozpoznają i internalizują obce cele.

Fagocytoza to ewolucyjnie zachowany proces komórkowy, który obejmuje pochłanianie niechcianych cząstek większych niż 0,5 μm. Komórki fagocytarne wyrażają szeroki zakres receptorów immunologicznych (znanych również jako receptory rozpoznawania wzorców, PRR) na powierzchni komórki, które umożliwiają im rozpoznawanie wzorców molekularnych związanych z patogenami (PAMP) obecnych na patogenach przed pochłonięciem3. Po wiązaniu patogenu następuje grupowanie receptorów na powierzchni komórki i wyzwala tworzenie miseczki fagocytarnej. Powoduje to przebudowę błony sterowanej aktyną, która wystaje wokół celu, ostatecznie otaczając go i ściskając, tworząc dyskretną wakuolę fagosomalną2,5. Fagosom następnie dojrzewa i zakwasza się przez późniejszą fuzję z późnymi endosomami i lizosomami, która tworzy fagolizosom6.

Chociaż fagocytoza jest opisywana jako zdarzenie zależne od receptora i napędzane aktyną, proces ten opiera się również na przestrzenno-czasowej modyfikacji lipidów tworzących błonę plazmatyczną, takich jak fosfoinozytydy (PI) i sfingolipidy7,8. Podczas gdy polimeryzacja aktyny jest podyktowana miejscową akumulacją fosfoinozytolo-4,5-bifosforanu (PI(4,5)P2) u podstawy miseczki fagocytarnej, depolimeryzacja aktyny zależy od konwersji (PI(4,5)P2 do fosfoinozytolu-3,4,5-bifosforanu (PI(3,4,5)P3)3,9. Obie modyfikacje są niezbędne, ponieważ pierwsza prowadzi do pomyślnego rozciągnięcia pseudopodów wokół celu, a druga umożliwia zatopienie cząstek w cytozolu fagocytu10.

Komórki, które mają zdolność do fagocytozy, to albo profesjonalne fagocyty, takie jak makrofagi/monocyty, granulocyty/neutrofile i komórki dendrytyczne (DC), albo nieprofesjonalne fagocyty, takie jak fibroblasty i komórki nabłonkowe11. Fagocytoza wykonywana przez wszystkie fagocyty odgrywa kluczową rolę w utrzymaniu i przebudowie tkanek, podczas gdy fagocytoza wykonywana przez profesjonalne fagocyty jest odpowiedzialna za koordynację wrodzonej i nabytej odpowiedzi immunologicznej przeciwko patogenom. Profesjonalne fagocyty nie tylko pochłaniają i zabijają patogen, ale także prezentują antygeny komórkom limfoidalnym adaptacyjnego układu odpornościowego. Przyczynia się to do uwalniania cytokin prozapalnych i angażowania komórek limfoidalnych, co prowadzi do skutecznej blokady infekcji12.

Konwencjonalne techniki biochemiczne odegrały kluczową rolę w zdobyciu wiedzy na temat molekularnego mechanizmu różnych procesów komórkowych podczas fagocytozy, takich jak modyfikacje potranslacyjne i różne związki o wysokim powinowactwie między białkami. Trudno jest jednak uzyskać informacje dotyczące przestrzennej i czasowej dynamiki zdarzeń fagocytarnych przy użyciu konwencjonalnych metod biochemicznych. Obrazowanie żywych komórek nie tylko pozwala nam monitorować zdarzenia komórkowe w sposób wrażliwy na czas, ale także umożliwia nam uzyskanie informacji na poziomie pojedynczej komórki. W tym miejscu opisujemy metodę badania różnych etapów fagocytozy, a także analizy całego procesu czasoprzestrzennie za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie linii komórkowych DC2.4 i RAW 264.7

UWAGA: Makrofagopodobna linia komórkowa RAW 264.7 i linia komórek dendrytycznych DC2.4 są pochodzenia mysiego, a do hodowli komórek zastosowano następujące warunki.

  1. Hoduj komórki RAW 264.7 w DMEM (pożywce Dulbecco's Minimal Eagle's) uzupełnionej 10% inaktywowaną płodową surowicą bydlęcą (FBS) w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze z 5% CO2 .
  2. Hoduj komórki DC2.4 w podobnych warunkach jak komórki RAW 264.7, z wyjątkiem użycia pożywki RPMI (Roswell Park Memorial Institute) uzupełnionej L-glutaminą zamiast DMEM.

2. Przygotowanie fluorescencyjnych cząstek sprzężonych: C. albicans, Zymosan, kulki pokryte IgG

  1. Uprawa Candida albicans
    1. Inokulować szczep C. albicans SC5314 z zamrożonego glicerolu w 25 ml YPD uzupełnionego Uri (2% baktopeptonu, 1% ekstraktu drożdżowego, 2% glukozy i 80 μg/ml urydyny) przez noc w temperaturze 30 °C.
      UWAGA: Unikaj uprawy kultury Candida powyżejOD 600 z 12.
    2. Weź 1 ml C. albicans i odwiruj go w temperaturze 2 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml PBS.
    4. Zebrać osad przez odwirowanie przy 2,000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    5. Powtórz krok 2.1.4.
    6. Obliczyć wielokrotność infekcji (MOI) C. albicans w stosunku do liczby fagocytów i przystąpić do testu fagocytozy, jak opisano w sekcji 3. OD600 1 odpowiada 2,5 x 107 Candida albicans na 1 ml.
      UWAGA: Generowanie Candida-BFP jest opisane w reference13.
  2. Przygotowanie kulek pokrytych Zymosanem i IgG
    UWAGA: Zymosan jest preparatem w postaci cząstek węglowodanowych grzybów zawierającym β-glukan, który pochodzi z Saccharomyces cerevisiae. Zymosan jest znany z wywoływania sygnałów zapalnych w makrofagach i komórkach dendrytycznych i był szeroko stosowany w badaniach nad fagocytozą 13,14,15.
      Krótko przemieszać
    1. probówkę zawierającą cząstki stałe i przelać do probówki o pojemności 1,5 ml ilość wystarczającą do przeprowadzenia eksperymentu.
      UWAGA: Zazwyczaj używamy proporcji 1:10 (na jedną komórkę dodaj 10 cząsteczek zymosanu lub kulek pokrytych IgG).
    2. Dodać 1 ml lodowatego PBS i zebrać cząstki, wirując przez 1 minutę przy 10 000 x g.
    3. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml lodowatego PBS.
    4. Powtórz kroki 2.2.2-2.2.3
      UWAGA: Przejdź do kroku 2.2.5 lub przechowuj probówkę w temperaturze 4 °C do czasu użycia.
    5. Sonikować cząstki stałe przez 10 sekund w ultradźwiękowym sonikatorze kąpieli (120 V, 50-60 kHz), aby uniknąć agregacji cząstek.

3. Fagocytoza

UWAGA: Fagocytoza to złożony proces, który rozpoczyna się od wiązania cząstek na powierzchni komórek fagocytów poprzez interakcję PRR z ligandami na powierzchni cząstki. Po wiązaniu następuje złożenie aktyny i związanych z nią białek w miejscu kontaktu oraz utworzenie miseczki fagocytarnej. Późniejszy demontaż aktyny zachodzi w fagosomie i powoduje całkowite pochłonięcie cząstek. Poniżej opisujemy różne etapy fagocytozy.

  1. Test wiążący
    UWAGA: Celem tego eksperymentu jest monitorowanie pierwszego etapu fagocytozy, który obejmuje interakcję między ligandami na cząstkach docelowych a receptorami na fagocytach.
    1. Zasiej około 5 x 104 komórek w szkiełku komorowym, tak aby w czasie eksperymentu zlewały się w 60-70%. Alternatywnie, płytki na szkiełkach nakrywkowych (w formacie 24- lub 12-dołkowym) lub 96-dołkowych płytkach ze szklanym dnem. Inkubować komórki przez noc w wilgotnym inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2,
      UWAGA: Komórki można liczyć za pomocą hemocytometru lub podobnej techniki.
    2. Umieścić szkiełko (lub płytę) komory w temperaturze 10 °C na 10 minut.
    3. Delikatnie usunąć pożywkę z każdej studzienki za pomocą pipety lub aspiratora.
      UWAGA: Wykonaj ten krok ostrożnie, ponieważ każda studzienka systemu komorowego szkła nakrywkowego jest mała; Łatwo jest zaburzyć komórki za pomocą końcówki pipety lub silnego przepływu powietrza z aspiratora.
    4. Zmieszać znakowane fluorescencyjnie cząstki z pożywką do hodowli komórkowych (przygotowaną w sposób opisany powyżej). Dodaj Candida-BFP (przy MOI 10), fluorescencyjnie sprzężony zymosan lub kulki lateksowe IgG-FITC królika (10 cząstek na komórkę) do komórek. Użyj końcowej objętości pożywki 200 μl na jedną komorę, aby upewnić się, że wszystkie komórki są pokryte.
    5. Wirować szkiełko komory przy 277 x g przez 3 minuty w temperaturze 10 °C.
      UWAGA: Ten etap wirowania pomaga zwiększyć kontakt między cząstkami stałymi a komórkami i synchronizuje proces wiązania.
    6. Natychmiast przenieść szkiełko komorowe do inkubatora z wilgotnością 37 °C z 5% CO2 na 5 minut.
    7. Wyjmij szkiełko komory z inkubatora i zassaj pożywkę.
    8. Umyj komórki 3x lodowatym PBS.
      UWAGA: Sprawdź obecność niezwiązanych cząstek pod mikroskopem świetlnym i w razie potrzeby przemyj więcej razy PBS. Konieczne jest usunięcie niezwiązanych cząstek z odwiertu, aby zminimalizować szum tła podczas analizy.
    9. Utrwal komórki, dodając 500 μl 4% paraformaldehydu (PFA) rozcieńczonego w PBS przez inkubację przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Ten krok wymaga użycia 4% PFA, który jest wysoce toksyczny, i potencjalnie rakotwórczy. Należy zachować odpowiednią ostrożność podczas używania tego płynu. Chroń również próbki przed światłem.
    10. Przemyć komórki, dodając 500 μl PBS do komory i delikatnie odessać roztwór.
    11. Powtórz krok 3.1.9 dwa razy.
      UWAGA: Na tym etapie należy ponownie napełnić każdą fiolkę natychmiast po wyjęciu poprzedniego PBS.
    12. Zatrzymać utrwalanie przez inkubację z 500 μl 50 mM NH4Cl w PBS przez 10 minut.
    13. Umyć komórki dwukrotnie PBS, jak opisano w kroku 3.1.10.
    14. Przepuszczalność komórek przez dodanie 250 μl buforu wiążącego (0,1% saponiny, 0,2% BSA w PBS) przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
    15. Barwnik F-aktyny przez dodanie fluorescencyjnie sprzężonej falloidyny (rozcieńczonej w stosunku 1:500 w buforze wiążącym). Inkubuj komórki przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    16. Umyć komórki trzykrotnie PBS, jak opisano w kroku 3.1.10.
    17. Rejestruj obrazy za pomocą mikroskopu konfokalnego (obiektyw 63x oraz laser 402 nm i 488 nm) i analizuj obrazy za pomocą ImageJ16.
      UWAGA: Udane wiązanie cząstek charakteryzuje się obecnością miseczki fagocytarnej w miejscu, w którym cząstki stykają się z komórką fagocytarną (ryc. 1). Patrz krok 3.2.5.
  2. Test wychwytu fagocytozy
    UWAGA: Ten eksperyment ma na celu monitorowanie całkowitej internalizacji fluorescencyjnie znakowanych cząstek przez fagocyty za pomocą mikroskopii konfokalnej (ryc. 2).
    1. Zasiej około 5 x 104 komórek w szkiełku komorowym, tak aby w czasie eksperymentu zlewały się w 60-70%. Alternatywnie, płytki na szkiełkach nakrywkowych (w formacie 24- lub 12-dołkowym) lub 96-dołkowych płytkach ze szklanym dnem. Inkubować komórki przez noc w wilgotnym inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2,
      UWAGA: Komórki można liczyć za pomocą hemocytometru lub podobnej techniki.
    2. Szkiełka komory (lub płytę) należy przechowywać w temperaturze 10 °C przez 10 min.
      UWAGA: Chłodzenie jest konieczne w celu zablokowania endocytozy, a także niepożądanej fagocytozy, a następnie uzyskania zsynchronizowanej fagocytozy.
    3. Wykonaj kroki od 3.1.3 do 3.1.5
    4. Przenieść szkiełko komorowe do inkubatora z wilgotnością 37 °C z 5% CO2 i inkubować w różnych punktach czasowych. Napraw komórki po 30, 60 i 90 minutach po zakażeniu. Obserwuj, jak C. albicans zaczyna tworzyć strzępki po 60 minutach od zakażenia; Fagocyty zaczynają wykazywać śmierć komórkową (piroptozę) po 90 min8.
      UWAGA: Jest to zalecenie, a optymalizacja jest niezbędna w zależności od typu ogniwa i zastosowanych cząstek stałych.
    5. Wykonaj kroki od 3.1.7 do 3.1.15. Analizuj obrazy za pomocą ImageJ16.
      UWAGA: pomyślny wychwyt charakteryzuje się całkowitą internalizacją cząstki wewnątrz cytoplazmy fagocytu (ryc. 2). Barwienie fagocytów markerem powierzchni komórki, takim jak falloidyna, pomaga wytyczyć kontur komórek. Niezbędne jest również wykonanie z-stacków w celu określenia, czy cząstki są związane z powierzchnią komórki, czy całkowicie zinternalizowane.
  3. Obrazowanie fagocytozy na żywo
    UWAGA: W tym protokole opisujemy zastosowanie mikroskopii konfokalnej do uchwycenia różnych etapów fagocytozy przy użyciu fluorescencyjnie sprzężonego zymozanu. Używamy dendrytycznej linii komórkowej DC2.4, która stabilnie wyraża oznaczoną mCherry F-actin8, biosensora, który pokazuje rozkład nitkowatej aktyny w żywych komórkach. Ponieważ fagocytoza jest procesem napędzanym aktyną, obrazowanie na żywo w tej komórce nie tylko pozwala nam uchwycić ruch i dynamikę sieci F-aktyny, ale także uwidocznić różne zdarzenia fagocytarne w żywych komórkach (ryc. 3, film 1).
    1. Wysiewaj około 5 x 104 komórek w komorze szkiełka w stężeniu tak, aby w czasie eksperymentu zlewały się w 60-70%. Inkubować komórki przez noc w wilgotnym inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2,
      UWAGA: Komórki można liczyć za pomocą hemocytometru lub podobnej techniki.
    2. Utrzymuj szkiełka komory na lodzie przez 10 min.
      UWAGA: Chłodzenie jest konieczne, aby zablokować niepożądane wchłanianie i uzyskać zsynchronizowaną fagocytozę.
    3. Wykonaj kroki od 3.1.3 do 3.1.5
    4. Rozgrzej wstępnie stolik mikroskopu do 37 °C i zrównoważ komorę z 5% CO2 . Odczekaj 30-45 minut, aż temperatura i CO2 ustabilizują się przed rozpoczęciem obrazowania.
      UWAGA: Ponieważ poziomy CO2 i temperatury mają kluczowe znaczenie dla fagocytozy, ważne jest, aby włączyć grzałkę mikroskopu przed eksperymentem, aby zrównoważyć komorę środowiskową.
    5. Umieścić szkiełko komorowe zawierające komórki w komorze inkubatora mikroskopu w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
    6. Wykonywanie obrazowania na żywo17,18.
      UWAGA: Ustawienia mocy lasera (wzmocnienie, otwór itp.) mogą się różnić w zależności od typu używanego mikroskopu i sondy fluorescencyjnej. Dlatego zalecamy zapoznanie się z instrukcją obsługi mikroskopu w celu uzyskania optymalnych warunków do obrazowania na żywo 17,18.
      1. Użyj konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego (i powiązanego oprogramowania) do obrazowania na żywo. Użyj obiektywu olejowego 63X 1.4NA z otworem 1-1.1 Airy.
      2. Aby rozpocząć obrazowanie, użyj jasnego pola, aby znaleźć reprezentatywny obszar na szkiełku komory. Następnie wybierz pole, klikając opcję Pozycja w oprogramowaniu. Do wykrycia GFP na ścieżce 1 użyto zestawu filtrów dla lasera 488 nm z rozdzielaczem wiązki przy 582 nm, do wykrywania długości fal od 488 do 582 nm.
      3. Na ścieżce 2 wybierz zestaw filtrów optymalny dla mCherry (RFP) za pomocą rozdzielacza wiązki o długości fali 578 nm i wykrywającego długości fal od 578 do 600 nm. Używaj laserów 488 nm i 578 nm o 50% mocy lasera i wzmocnieniu wyjściowym 600-700. Uzyskuj obrazy co 30 sekund, łącznie przez 90 minut.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przedstawiono metodę mikroskopową do monitorowania różnych etapów fagocytozy. Pokazano poszczególne zdarzenia zachodzące podczas fagocytozy różnych fluorescencyjnych cząsteczek przez komórki DC2.4. Wykorzystując opisane tutaj techniki, zbadaliśmy rolę sfingolipidów we wczesnych etapach fagocytozy. W tym celu użyto komórek dendrytycznych DC2.4 z genetycznym niedoborem Sptlc2, enzymu katalizującego pierwszy i limitujący etap szlaku biosyntezy sfingolipidów. W porównaniu z komórkami typu dzikiego, komórki DC2.4 Sptlc2-...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Profesjonalne fagocyty, takie jak makrofagi i komórki dendrytyczne, pochłaniają i eliminują atakujące patogeny, dzięki czemu fagocytoza jest ważnym elementem systemu obronnego gospodarza. Podczas tego procesu fagocyty przechodzą rozległą reorganizację błony i przegrupowanie cytoszkieletu na powierzchni komórki 8,19,20. Aby lepiej zrozumieć ten dynamiczny proces, niezbędna jest wizualizacja różnych etapów fagocytozy. Tutaj opisal...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Dziękujemy Wendy Salmon i Nicki Watson z ośrodka Keck w Instytucie Whiteheada MIT za obrazowanie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
β-MerkaptoetanolAppliChemA1108
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Technologia sygnalizacji komórkowej 9998
DAPI (4',6-diamidyn-2-fenyloindol, mleczan)ThermoFisherD3571
Dimetylosulfotlenek (DMSO)ThermoFisherBP-231-1
DMEM (Dulbecco' s Minimalny Orzeł" s medium)Gibco11965
PBS, 1x (sól fizjologiczna buforowana fosforanami)Corning cellgro21-031-CV
Surowica bydlęcapłodu Sigma Aldrich12003C
Koraliki lateksowe powlekane IgG sprzężone z FITCCayman500290
L-Glutamina 200 mM (100x)ThermoFisher25030081
Roztwór paraformaldehydu (4% w PBS)Affymetrix19943 1 LT
Penicylina-streptomycyna (10 000 U/ml)ThermoFisher15-140-122
Phalloidin-Alexa Fluor 488ThermoFisherA12379
RAW 264,7 ogniwaATCCTIB-71
RPMI (Roswell Park Memorial Institute)Gibco61870
SaponinSigma AldrichS7900
Roztwór błękitu trypanowego (0,4% (w/v) w PBS)Corning cellgroMT25900CI
Trypsin-EDTA (1x) (0,05%)ThermoFisher25300054
Tween 20 Surfact-Amps Roztwór detergentuThermoFisher  85114
Zymosan-Alexa Fluor 594ThermoFisherZ23374
Komorowy 1.0 borokrzemianowy system nakrywkowy (8 komór)ThermoFisher155361
Szkiełko szklane 10 z kratkamiHycor87144

Bibliografia

  1. Janeway, C. A. Jr, Medzhitov, R. Innate immune recognition. Annu. Rev. Immunol. 20, 197-216 (2002).
  2. Underhill, D. M., Goodridge, H. S. Information processing during phagocytosis. Nat. Rev. Immunol. 12, 492-502 (2012).
  3. Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. The cell biology of phagocytosis. Annu Rev Pathol. 7, 61-98 (2012).
  4. Aderem, A., Underhill, D. M. Mechanisms of phagocytosis in macrophages. Annu Rev. Immunol. 17, 593-623 (1999).
  5. Flannagan, R. S., Harrison, R. E., Yip, C. M., Jaqaman, K., Grinstein, S. Dynamic macrophage "probing" is required for the efficient capture of phagocytic targets. J. Cell Biol. 191, 1205-1218 (2010).
  6. Swanson, J. A. Shaping cups into phagosomes and macropinosomes. Nat. Rev. Mol Cell Biol. 9, 639-649 (2008).
  7. Botelho, R. J., et al. Localized biphasic changes in phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate at sites of phagocytosis. J. Cell Biol. 151, 1353-1368 (2000).
  8. Tafesse, F. G., et al. Disruption of Sphingolipid Biosynthesis Blocks Phagocytosis of Candida albicans. PLoS Pathog. 11, e1005188(2015).
  9. Kwik, J., et al. Membrane cholesterol, lateral mobility, and the phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate-dependent organization of cell actin. PNAS. 100, 13964-13969 (2003).
  10. Levin, R., Grinstein, S., Schlam, D. Phosphoinositides in phagocytosis and macropinocytosis. BBA. 1851, 805-823 (2015).
  11. Freeman, S. A., Grinstein, S. Phagocytosis: receptors, signal integration, and the cytoskeleton. Immunol. Rev. 262, 193-215 (2014).
  12. Jutras, I., Desjardins, M. Phagocytosis: at the crossroads of innate and adaptive immunity. Annu. Rev. Cell. 21, 511-527 (2005).
  13. Strijbis, K., et al. Bruton's Tyrosine Kinase (BTK) and Vav1 contribute to Dectin1-dependent phagocytosis of Candida albicans in macrophages. PLoS Pathog. 9, e1003446(2013).
  14. Li, X., et al. The beta-glucan receptor Dectin-1 activates the integrin Mac-1 in neutrophils via Vav protein signaling to promote Candida albicans clearance. Cell Host Microbe. 10, 603-615 (2011).
  15. Esteban, A., et al. Fungal recognition is mediated by the association of dectin-1 and galectin-3 in macrophages. PNAS. 108, 14270-14275 (2011).
  16. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Meth. 9, 671-675 (2012).
  17. Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Meth. Cell Biol. 123, 77-94 (2014).
  18. Khodjakov, A., Rieder, C. L. Imaging the division process in living tissue culture cells. Methods. 38, 2-16 (2006).
  19. Freeman, S. A., et al. Integrins Form an Expanding Diffusional Barrier that Coordinates Phagocytosis. Cell. 164, 128-140 (2016).
  20. Jaumouille, V., et al. Actin cytoskeleton reorganization by Syk regulates Fcgamma receptor responsiveness by increasing its lateral mobility and clustering. Dev. Cell. 29, 534-546 (2014).
  21. Bain, J., Gow, N. A., Erwig, L. P. Novel insights into host-fungal pathogen interactions derived from live-cell imaging. Sem. Immunopath. 37, 131-139 (2015).
  22. Forestier, C. L. Imaging host-Leishmania interactions: significance in visceral leishmaniasis. Para. Immunol. 35, 256-266 (2013).
  23. John, B., Weninger, W., Hunter, C. A. Advances in imaging the innate and adaptive immune response to Toxoplasma gondii. Future Microbiol. 5, 1321-1328 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Mikroskopia konfokalnabarwienie F-aktynypobieranie zymozanuobrazowanie żywych komórekCandida albicanskomórki DC 2.4przebudowa aktynywiązanie cząsteczekanaliza w programie ImageJ
Wizualizacja wczesnych stadiów fagocytozy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.