Indukowane pluripotencjalne wytwarzanie komórek macierzystych z komórek krwi za pomocą wirusa Sendai i wirowania

Podsumowanie

Proponujemy protokół przeprogramowania komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) na indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC). Poprzez posiew transdukowanych komórek krwi na płytkach pokrytych matrycą za pomocą wirowania, iPSC są z powodzeniem indukowane z komórek pływających. Technika ta sugeruje prosty i skuteczny protokół przeprogramowania komórek, takich jak PBMC i CBMC.

Streszczenie

Niedawny rozwój ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) dowiódł, że dojrzałe komórki somatyczne mogą powrócić do niezróżnicowanego, pluripotencjalnego stanu. Teraz przeprogramowywanie odbywa się na różnych typach dorosłych komórek somatycznych: keratynocytach, komórkach moczu, fibroblastach itp. Wczesne eksperymenty były zwykle przeprowadzane na fibroblastach skóry. Wymagało to jednak inwazyjnego zabiegu chirurgicznego w celu uzyskania fibroblastów od pacjentów. Dlatego komórki zawiesinowe, takie jak komórki krwi i moczu, zostały uznane za idealne do przeprogramowania ze względu na wygodę uzyskania komórek pierwotnych. W tym miejscu przedstawiamy skuteczny protokół generowania iPSC z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC). Poprzez posiewanie transdukowanych PBMC szeregowo na nową, pokrytą matrycą płytkę za pomocą wirowania, protokół ten może z łatwością dostarczyć kolonie iPSC. Metodę tę stosuje się również do komórek jednojądrzastych krwi pępowinowej (CBMC). W niniejszym badaniu przedstawiono prosty i skuteczny protokół przeprogramowania PBMC i CBMC.

Wprowadzenie

Komórki macierzyste są jednym z najbardziej atrakcyjnych materiałów w terapii klinicznej od^{kilkudziesięciu lat}. 1. Atrakcyjnymi właściwościami komórek macierzystych są pluripotencja i zdolność do samoodnawiania się. W 1981 roku wyizolowano pierwsze embrionalne komórki macierzyste (ESC) z zarodka myszy². Jednak, gdy technika ta została zastosowana do ludzkich embrionów, napotkała kilka problemów etycznych.

W 2006 roku, kiedy dr Yamanaka i jego zespół przeprogramowali pierwszą pluripotencjalną komórkę z mysich komórek somatycznych, pole komórek macierzystych odzyskało swoją możliwość, a zainteresowanie nim wzrosło^{na nowo 3}. Dostarczając kilka zdefiniowanych czynników, pluripotencjalne komórki macierzyste zostały z powodzeniem "indukowane" z dorosłych komórek somatycznych i dlatego zostały nazwane "indukowanymi pluripotencjalnymi komórkami macierzystymi (iPSC)". W 2007 r. technika ta została zastosowana do komórek^ludzkich4, uzyskując komórki o dokładnych cechach ESC, ale bez debaty etycznej. Teoretycznie iPSC mogą być generowane z dowolnego typu komórek uzyskanych od dowolnej osoby lub pacjenta. Specyficzne dla pacjenta iPSC stają się coraz bardziej potencjalnym narzędziem, które może symulować fenotypy choroby i warunki epigenetyczne każdego pacjenta z osobna. Korzystając z edycji genów lub innych metod, które mogą odwrócić stan patogenny, specyficzne dla pacjenta iPSC mogą być również stosowane w medycynie spersonalizowanej⁵. Co więcej, iPSC są mniej związane z odrzuceniem immunologicznym, ponieważ mają taką samą tożsamość immunologiczną jak dawca, co sprawia, że autotransplantacja jest bardziej możliwa⁶. W związku z tym iPSC stały się najbardziej obiecującą platformą w modelowaniu chorób, badaniach przesiewowych leków i terapiach regeneracyjnych. Biorąc pod uwagę te korzyści, stale opracowywane są ulepszone protokoły, które mogą zapewnić czystsze i wyższe plony w jak najkrótszym czasie z najmniejszego źródła komórek. Jednym z głównych czynników branych pod uwagę przy poszukiwaniu najbardziej wydajnego protokołu do przyszłego zastosowania jest typ komórki podstawowej. Większość wczesnych protokołów generowania iPSC jest zoptymalizowana pod kątem komórek adherentnych, ponieważ pierwotne linie iPSC zostały wyindukowane z fibroblastów skóry⁴. Jednak izolacja i przygotowanie tych komórek są pracochłonne. Ponadto izolacja fibroblastów skóry obejmuje inwazyjne zabiegi chirurgiczne, które mogą stać się poważnym mankamentem w przypadku szerszego zastosowania.

Dlatego, do dalszego korzystania z iPSC, wymagane jest źródło komórek z wygodną akwizycją. Krew jest uważana za idealne źródło komórek, ponieważ uzyskuje się ją za pomocą raczej minimalnie inwazyjnej procedury^7-9. W tym badaniu opracowaliśmy prostą modyfikację protokołu generującego hiPSC z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC). Bez trudnego procesu ekspansji określonego typu komórek, takich jak komórki CD34+, całe komórki krwi lub PBMC były seryjnie siane na płytkach pokrytych matrycą przez wirowanie po transdukcji z wirusem Sendai zawierającym czynniki Yamanaka. Metoda ta skróciła czas potrzebny na przyłączenie transdukowanych komórek pływających i zmniejszyła straty przeprogramowanych komórek, które nie były w stanie samodzielnie się przyłączyć.

Protokół

Oświadczenie etyczne: Niniejszy protokół badania został zatwierdzony przez instytucjonalną komisję rewizyjną Katolickiego Uniwersytetu Korei (KC12TISI0861).

1. Izolacja komórek monocytowych z krwi

1. Izolacja komórek monocytowych (dzień -5)
   1. Uzyskać co najmniej 10 ml świeżej krwi z pobrania krwi do probówki do preparatyki komórkowej (CPT).
   2. Przenieść krew do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml i rozcieńczyć ją sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w stosunku 1:4.
      UWAGA: W celu uzyskania wyższej czystości można zastosować wyższy stosunek rozcieńczenia.
   3. Dodaj 10 ml pożywki o gradionym gęstości do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml i ostrożnie ułóż rozcieńczoną krew na pożywce o gradiencie gęstości. Wirować przy 750 x g przez 30 minut w temperaturze pokojowej (RT) bez przerwy wirowania.
   4. Ostrożnie przenieś warstwę buffy do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml, dodaj 30 ml PBS do probówki i umyj komórki.
   5. Odwirować komórki przy 515 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
   6. Wyrzucić PBS i ponownie zawiesić komórki w 0,5 ml pożywki z krwinkami.
   7. Policz komórki i płytkę 1 x 10⁶ komórek na dołek 24-dołkowej płytki. Dodaj PBS do otaczających studzienek, aby zapobiec parowaniu.
   8. Ustabilizować komórki przez 5 dni w temperaturze 37 °C w 5% CO₂ przed transdukcją. Dodać dodatkowe 0,5 ml świeżej pożywki z krwinkami w dniach 3-4 bez naruszania komórek.

2. Transdukcja przez wirusa Sendai

1. Transdukcja (dzień 0)
   1. Zebrać i przenieść komórki krwi do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i policzyć je za pomocą hemocytometru.
   2. Przygotować 3 x 10⁵ komórek na transdukcję i odwirować komórki przy 515 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
   3. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 0,5 ml pożywki z krwinkami.
   4. Przenieść komórki do dołka na niepowlekanej płytce 24-dołkowej.
   5. Rozmrozić mieszaninę wirusa Sendai w lodzie i dodać ją do zawieszonych komórek. Dodaj wirusa Sendai do komórek zgodnie z zaleceniami producenta.
   6. Uszczelnić płytkę folią uszczelniającą i odwirować ją w temperaturze 1,150 x g przez 30 minut w temperaturze 30 °C.
   7. Po odwirowaniu inkubować komórki w temperaturze 37 °C w 5% CO₂ przez noc (O/N).
2. Transfer komórek do macierzy zasilającej (dzień 1)
   1. Następnego dnia pokryj 24-dołkową płytkę witronektyną. Rozcieńczyć roztwór witronektyny w PBS do uzyskania końcowego stężenia 5 μg/ml. Dodać 1 ml witronektyny do studzienki na 24-dołkowej płytce i inkubować w temperaturze pokojowej przez co najmniej 1 godzinę. Przed użyciem usunąć roztwór powlekający. Powlekane talerze można przechowywać w RT przez 3 dni.
   2. Przenieść wszystkie podłoża zawierające komórki i wirusa do powleczonego dołka.
   3. Zebrać pozostałe komórki z dodatkowymi 0,5 ml świeżej pożywki z krwinkami i dodać ją do studzienki zawierającej komórki.
   4. Odwirować płytkę o sile 1,150 x g przez 10 minut w temperaturze 35 °C.
   5. Po odwirowaniu usunąć supernatant, dodać 1 ml pożywki iPSC i utrzymać komórki w temperaturze 37 °C w 5% CO₂ O/N.
3. Drugi transfer komórek (dzień 2)
   1. Pokryć studzienki nowej 24-dołkowej płytki 5 μg/ml witronektyny, jak opisano w kroku 2.2.1. Do każdej transdukcji należy użyć jednego dołka płytki.
   2. Przenieść zawiesinę komórkową z pierwszej płytki na nowo pokrytą płytkę z witronektyną.
      UWAGA: Jeśli nie są potrzebne, komórki zawiesiny można wyrzucić. Procedurę opisaną w kroku 2.3 można powtórzyć 2-3 razy z komórkami zawiesiny. Jeśli kroki zostaną powtórzone, zbierz komórki.
   3. W międzyczasie dodać 1 ml pożywki iPSC do dołka pierwszej płytki w celu konserwacji i inkubować w temperaturze 37 °C w 5% CO₂ O/N.
   4. Utrzymuj przyłączone komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ i wykonuj codzienną wymianę pożywki na świeżej pożywce iPSC. Kolonie pojawią się w dniach 14-21 po transdukcji.
   5. Odwirować nowo pokrytą płytkę zawierającą komórki zawiesiny w temperaturze 1,150 x g i temperaturze 35 °C przez 10 minut.
   6. Po odwirowaniu inkubować komórki w temperaturze 37 °C w 5% CO₂ O/N.
   7. Następnego dnia usuń supernatant i zastąp go nowym nośnikiem iPSC.
      UWAGA: Procedurę wymienioną w kroku 2.3 można powtórzyć 2-3 razy z komórkami zawiesiny. Jeśli kroki zostaną powtórzone, należy pobrać komórki z supernatantu i powtórzyć krok 2.3.
   8. Utrzymuj przyłączone komórki przy codziennych zmianach pożywki, aż do osiągnięcia 80% konfluencji.

3. Przeprogramowana konserwacja komórek

1. Wczesna konserwacja po hodowli na płytkach 24-dołkowych
   1. 7-10 dni po transdukcji, gdy komórki się zlewają, przygotuj naczynie o średnicy 60 mm pokryte witronektyną. Rozcieńczyć roztwór witronektyny w PBS do uzyskania końcowego stężenia 5 μg/ml. Dodać 1 ml witronektyny do naczynia i inkubować w temperaturze pokojowej przez co najmniej 1 godzinę.
   2. Umyj komórki PBS i dodaj 1 ml PBS/1 mM EDTA w celu odłączenia komórek.
   3. Inkubować je w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ przez 2 minuty.
   4. Zebrać komórki i odwirować je w stężeniu 250 x g i RT przez 2 minuty. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 3 ml świeżej pożywki iPSC.
   5. Umieść wszystkie zawieszone komórki na nowo pokrytej czaszy o średnicy 60 mm.
   6. Dodać 10 mM inhibitora kinazy RHO do komórek i utrzymywać je w temperaturze 37 °C w 5% CO_{2 ,} aż komórki zlewają się w 80%.
2. Podział w celu pojawienia się kolonii (przygotowanie do subklonowania)
   1. Przygotować naczynie o średnicy 100 mm pokryte witronektyną, zgodnie z opisem w kroku 3.1.2.
   2. Umyj komórki PBS i dodaj 1 ml PBS/1 mM EDTA w celu odłączenia komórek.
   3. Inkubować je w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ przez 2 minuty.
   4. Zebrać komórki i odwirować je przy 250 x g i RT przez 2 minuty.
   5. Policz komórki za pomocą hemocytometru i przygotuj 1 x 10⁴ komórki na naczynie.
   6. Odwirować komórki przy 250 x g i RT przez 2 minuty.
   7. Zawiesić 1 x 10⁴ komórki w 6 ml pożywki iPSC, ułożyć je na powlekanej 100-milimetrowej szalce i dodać do pożywki 10 mM inhibitora kinazy RHO.
   8. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w 5% CO₂ przez tydzień, aż pojawią się duże kolonie.
      UWAGA: Utrzymuj i rozbudowuj kolonie do subklonowania. Podklonowanie odbywa się zwykle w mniej niż 5 przejściach.
3. Zbieranie kolonii za pomocą roztworu do odrywania kolonii iPSC
   1. Na tydzień przed zbiorem kolonii wysiewaj 1 x^{10 4} komórki w pokrytym witronektyną, 100-milimetrowym naczyniu, jak wspomniano w kroku 3.2.7.
   2. Przygotować naczynie pokryte witronektyną o średnicy 60 mm, dodając 2 ml roztworu witronektyny i inkubując w temperaturze pokojowej przez co najmniej 1 godzinę.
   3. Obserwując przez mikroskop (powiększenie 40X lub 100X), oznacz kolonie wyraźnymi granicami za pomocą markera. Usunąć roztwór witronektyny z nowej płytki wykonanej w kroku 3.3.2 i dodać 6 ml pożywki iPSC uzupełnionej 10 mM kinazą RHO.
   4. Usunąć pożywkę hodowlaną z komórek i przemyć je 3 ml PBS.
   5. Dodać 1 ml roztworu odłączającego kolonię iPSC i inkubować je przez 30 s w temperaturze pokojowej.
   6. Wyjąć roztwór z płytki i inkubować go w temperaturze pokojowej przez dodatkowe 30 sekund.
   7. Za pomocą pipety P200 pobrać 200 μl pożywki z płytki i odłączyć docelowe kolonie przez pipetowanie. Przenieś rozproszone kolonie do nowej 100-milimetrowej szalki.
   8. Inkubować i utrzymywać komórki w temperaturze 37 °C w 5% CO_{2 .}
      UWAGA: Po uzyskaniu czystej kolonii iPSC, komórki utrzymywano aż do osiągnięcia pasażu 10. Charakterystykę wykonano po co najmniej 10 fragmentach. Rozcieńczenia przeciwciał i informacje o starterze przedstawiono w tabelach 1 i 2.

Wyniki

Ten protokół przedstawia prostą metodę przeprogramowania PBMC wyizolowanych z krwi. Wykorzystując połączenie posiewu seryjnego i wirowania, udało się wygenerować iPSC. Dzięki tej metodzie iPSC mogą być generowane z niewielką ilością pełnych komórek krwi bez izolowania lub rozszerzania określonego typu komórek. Udało nam się wygenerować iPSC z zaledwie 1x10⁴ komórek na małej płytce do hodowli komórek.

Przed przeprogram...

Dyskusja

Ponieważ embrionalne komórki macierzyste (ESC) wykazywały szereg niedociągnięć, konieczne było zastosowanie alternatywnego narzędzia. W związku z tym opracowanie przez firmę Yamanaka indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) znalazło się w centrum uwagi na arenie międzynarodowej. Minęło prawie dziesięć lat, odkąd Yamanaka odkrył, że pluripotencja może być wywołana przez dodanie tylko czterech genów do dorosłych komórek somatycznych. Ponieważ iPSC są "indukowane" z dojrzałych komórek somatycznych, mogą ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Plasticware
100 mm Naczynie	TPP	93100
Płytka 6-dołkowa	TPP	92006
50 ml Probówka rogowa	SPL	50050
15 ml Probówka rogowa	SPL	50015
10 ml Pipeta jednorazowa	Falcon	7551
5 ml Jednorazowa płytka	Falcon	7543
12-dołkowa TPP		92012
Płytka 24-dołkowa	TPP	92024
PBMC Materiały izolacyjne
DPBS	Life Technologies	14190-144
Ficoll	GE Healthcare	17-1440-03
StemSpan	STEMCELL Technologies	9805	Pożywka dla komórek krwi
CC110	STEMCELL Technologies	8697	Krew Suplement pożywki komórkowej (100x)
iPSC Materiały do generowania i hodowli
CytoTune-iPSC Sendai Reprogramming Kit	Life Technologies	A16518
TeSR-E8 Media	STEMCELL Technologies	5940	iPSC
Vitronectin	Life Technologies	A14700
Inhibitor ROCK	Sigma Aldrich	Y0503
TrypLE express (TrypLE)	Life Technologies	12604-039
ReleSR	STEMCELL Technologies	12604-039	Roztwór
Materiały do kontroli jakości
18 mm Szkło osłonowe	Superior	HSU-0111580
4% Paraformaldyhyde	Tech & Innowacja	BPP-9004
Triton X-100	BIOSESANG	9002-93-1
Albumina surowicy bydlęcej	Vector Lab	SP-5050
Przeciwciało anty-SSEA4	Millipore	MAB4304
Przeciwciało anty-Oct4	Santa Cruz	SC9081
Przeciwciało anty-TRA-1-60	Przeciwciało Millipore	MAB4360
Przeciwciało anty-Sox2	Biolegend	630801
Przeciwciało anty-TRA-1-81	Przeciwciało Millipore	MAB4381
Przeciwciało anty-Klf4	Abcam	ab151733
Alexa Fluor 488 kozie przeciwciało anty-mysie IgG (H+L)	Sonda molekularna	A11029
Alexa Fluor 594 kozie przeciwciało anty-królicze IgG (H+L)	Sonda molekularna	A11037
Sonda molekularna	DAPI	D1306
Prolong złoty odczynnik zapobiegający blaknięciu	Invitrogen	P36934
Szkło szkiełkowe, powlekane	Hyun Il Lab-Mate	HMA-S9914
Trizol	Invitrogen	15596-018
Chloroform	Sigma Aldrich	366919
Milipore	izoprypylowego	109634
Etanol	Duksan	64-17-5
Zestaw do syntezy pierwszej nici cDNA RevertAid	Thermo Scientfic	K1622
Polimeraza DNA Taq	iNtRON BIOTECH	25021
UltraPure 10X TBE Buffer	Life Technologies	15581-044
gwiazda ładowania	Dyne Bio	A750
Agaroza	Sigma-Aldrich	9012-36-6
1kb (+) Marker drabinkowy DNA	Enzynomics	DM003
Fosfataza alkaliczna	Milipor	SCR004
Baza Tris	Bufor
Chlorek sodu	Duchefa Biochemie	S0520.1000	Bufor do płukania
Tween-20	BIOSESANG	T1027	Bufor do płukania
Kwas solny	Duksan	1129	Bufor do płukania