Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Zaawansowany zwierzęcy model przerzutów jelita grubego w wątrobie: techniki obrazowania i właściwości klonów z przerzutami

13.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54657

⸱

30 listopada 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, The University of Chicago, 2Department of Radiation and Cellular Oncology and Ludwig Center for Metastasis Research, The University of Chicago

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Zdolność klonów przerzutowych do kolonizacji odległych miejsc zależy od ich zdolności do proliferacji i/lub zdolności do przetrwania w mikrośrodowisku gospodarza bez znaczącej proliferacji. W tym miejscu przedstawiamy model zwierzęcy, który umożliwia ilościową wizualizację obu typów kolonizacji wątroby przez klony z przerzutami.

Streszczenie

Pacjenci z ograniczoną liczbą przerzutów do wątroby i powolnym tempem progresji mogą być skutecznie leczeni za pomocą miejscowych metod leczenia1,2. Jednak niewiele wiadomo na temat niejednorodności przerzutów do wątroby i potrzebne są modele zwierzęce zdolne do oceny rozwoju poszczególnych kolonii przerzutowych. W tym miejscu przedstawiamy zaawansowany model przerzutów do wątroby, który daje możliwość ilościowej wizualizacji rozwoju poszczególnych klonów nowotworowych w wątrobie oraz oszacowania ich kinetyki wzrostu i efektywności kolonizacji. Stworzyliśmy panel monoklonalnych pochodnych ludzkich komórek raka jelita grubego HCT116 stabilnie znakowanych lucyferazyą i tdTomato i posiadających różne właściwości wzrostu. Po wstrzyknięciu śledziony, a następnie splenektomii, większość tych klonów jest w stanie generować przerzuty do wątroby, ale z różną częstotliwością kolonizacji i różnym tempem wzrostu. Za pomocą systemu obrazowania in vivo (IVIS) możliwa jest wizualizacja i ilościowe określenie rozwoju przerzutów za pomocą obrazowania luminescencyjnego in vivo i fluorescencyjnego ex vivo. Ponadto tomografia obrazowania rozproszonego luminescencyjnego (DLIT) zapewnia rozkład 3D przerzutów do wątroby in vivo. Obrazowanie fluorescencyjne ex vivo pobranych wątrob zapewnia pomiary ilościowe poszczególnych kolonii przerzutowych wątroby, pozwalając na ocenę częstości kolonizacji wątroby i kinetyki wzrostu przerzutów. Ponieważ model jest podobny do klinicznie obserwowanych przerzutów do wątroby, może służyć jako metoda wykrywania genów związanych z przerzutami do wątroby oraz do testowania potencjalnych metod leczenia ablacyjnego lub adjuwantowego w chorobie przerzutowej wątroby.

Wprowadzenie

Pacjenci z przerzutami do wątroby z pierwotnego raka jelita grubego (CRC) charakteryzują się złym rokowaniem. Wskaźnik 5-letniego przeżycia w przypadku pierwotnego raka jelita grubego bez przerzutów (stadium I-III) szacuje się na 75 - 88%3,4, podczas gdy pacjenci z przerzutami do wątroby (stopień IV) mają 5-letnie przeżycie wynoszące tylko 8 - 12%5,6. Jednak pacjenci z przerzutami stanowią niejednorodną grupę, charakteryzującą się różną liczbą przerzutów i różnym czasem nawrotu. Obserwacje kliniczne wskazują, że liczba przerzutów (która może być proporcjonalna do zdolności kolonizacyjnych lub częstości kolonizacji) oraz wielkość pojedynczego przerzutu (proporcjonalna do lokalnego tempa wzrostu) są niezależnymi czynnikami prognostycznymi1,7. Innymi słowy, sukces przerzutowych klonów kolonizujących wątrobę zależy od dwóch głównych właściwości: ich zdolności do wzrostu oraz zdolności do rozprzestrzeniania się i przetrwania w mikrośrodowisku wątroby.

Projektowanie udanych modeli klinicznych z możliwością przechwytywania i ilościowego określania właściwości klonów przerzutowych może drastycznie poprawić nasze zrozumienie biologii przerzutów do wątroby i dostarczyć skutecznego narzędzia do projektowania potencjalnych podejść terapeutycznych. Modele eksperymentalnych przerzutów do wątroby zostały wcześniej opisane8,9, ale żaden z nich nie zapewnił możliwości ilościowego uchwycenia i opisania właściwości poszczególnych przerzutowych klonów zarówno in vivo, jak i ex vivo.

Tutaj prezentujemy nowy, zaawansowany model przerzutów do wątroby, który obejmuje generowanie klonów nowotworowych o różnej wydajności kolonizacji wątroby i właściwościach wzrostu. Zastosowaliśmy połączenie podwójnego znakowania komórek rakowych lucyferazyą i białkiem fluorescencyjnym tdTomato z generowaniem linii komórek monoklonalnych, które mają wewnętrzne różnice w zdolności przerzutowej. W tym modelu eksperymentalnym dane wskazują, że rozwój przerzutów do wątroby można opisać w kategoriach częstości kolonizacji i czasu podwojenia (Td), co jest zgodne z obserwacjami klinicznymi. Ilościowy charakter tego modelu sprawia, że można go łatwo zaadaptować do celów odkrywania leków i diagnostyki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt na Uniwersytecie w Chicago (Protokół # 72213-09) i przeprowadzone w sterylnych warunkach.

1. Przygotowania

  1. Przygotuj 500 ml pożywki do hodowli komórek nowotworowych HCT116: zmodyfikowane podłoże Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnione 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 100 U/ml penicyliny i 100 mg/ml streptomycyny.
  2. Autoklaw narzędzi, które mają być używane do modelu iniekcji śledziony, w tym 3-4 ręczniki chirurgiczne, gaza, dwa małe przetworniki Adson, wkrętak igłowy, dwie pary nożyczek, mały zacisk i 3 mikroklipsy, w temperaturze 251 ° F przez 20 minut.
  3. Przygotuj znieczulenie pooperacyjne dla myszy, które należy podać podskórnie po wstrzyknięciu do śledziony. Rozcieńczyć 2 - 4 μg buprenorfiny w 500 μl 0,9 soli fizjologicznej na mysz.
  4. Przygotować podwielokrotności 150 μg/150 μl lucyferyny świetlika do wstrzyknięć dootrzewnowych podczas testów bioluminescencyjnych. Przechowywać w temperaturze -20 °C i chronić przed światłem.

2. Generacja linii komórek monoklonalnych znakowanych lucyferazy/tdPomidorami 10,11

  1. Rozmrozić i utrzymać ludzkie komórki raka jelita grubego HCT116 i ludzkie embrionalne komórki nerkowe 293FT w DMEM z 10% FBS, 100 U / ml penicyliny i 100 mg / ml streptomycyny. Utrzymywać w kulturze na poziomie 5%CO2 i 37 °C.
  2. Wyprodukuj lentiwirusa o wysokim mianie.
    1. Na D 1, płytka 10 - 12 x 106 komórek 293FT między pasażem 3 a 10 w 15 cm szalkach do hodowli komórkowych w 18 ml kompletnego DMEM (cDMEM) z 10% FBS, 1% penicyliny/streptomycyny i 1% aminokwasów endogennych. Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
    2. Na D 2 przeprowadzić transfekcję komórek przy użyciu następującego roztworu do transfekcji:
      1. Do każdej potrawy należy użyć: mieszaniny DNA 37,5 μg wektora lentiwirusowego pFUG wstawionego za pomocą lucyferazy (Luc2) i konstruktów tdTomato11 (prezent od dr Geoffreya Greene'a z University of Chicago), 25 μg pCMVΔ8,74 i 12,5 μg pMD2.G zawieszonych w sumie 1,062 μl sterylnego H2O. Dodać 188 μl 2 M CaCl2.
      2. Dodaj 1,250 μl 2x soli fizjologicznej buforowanej przez Hepes (HBS, 50 mM Hepes, 1,5 mM Na2HPO4 i 180 mM NaCl, pH 7,12) do roztworu DNA/CaCl2, kropla po kropli, wydmuchując bąbelki przez roztwór pipetą.
      3. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut, a następnie dodać 15,5 ml roztworu RT cDMEM i chlorochiny, aby uzyskać końcowe stężenie 25 μM.
    3. Odessać pożywkę w każdym naczyniu komórek 293FT i zastąpić roztworem do transfekcji. Powoli dodawać 16 ml roztworu do transfekcji, ponieważ posiane komórki łatwo się przemieszczają.
    4. W dniu D 3, po 8 - 16 godzinach, usunąć roztwór do transfekcji i raz przemyć komórki solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco, ponownie uważając, aby nie usunąć komórek. Zastąp pożywkę 18 ml świeżego cDMEM 10 mM Hepes.
      UWAGA: Powoli przesuwaj naczynia, odsysaj roztwór do transfekcji i dodaj pożywkę przez boczną ścianę płytek, aby nie usunąć komórek.
    5. W dniu D 4, po 48 godzinach od czasu transfekcji, zebrać pożywkę z szalek, powoli zasysając pipetą, aby nie usunąć komórek. Odwirować zebrane podłoże o sile 300 x g przez 5 minut, aby wytrącić resztki dużych komórek.
    6. Przefiltrować supernatant wirusa za pomocą kolby filtracyjnej o niskiej liczbie wiązań białkowych 0,45 μm i odwirować za pomocą wirnika SW-28 przez 2 godziny w temperaturze 50 000 x g i temperaturze 4 °C. Zdekantować supernatant natychmiast po zakończeniu wirowania i wysuszyć wnętrze probówki za pomocą wycieraczek.
    7. Zawiesić osad wirusa w 50 μl zredukowanej pożywki surowicy (RSM) z 1% FBS. Podwielokrotności mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości (zapas wirusa).
  3. Transdukuj lentiwirusy do komórek HCT116 i wygeneruj panel klonów tdTomato-dodatnich.
    1. Płytki HCT116 o gęstości 1 x 105 w 24 dołkach 1 d przed infekcją wirusową.
    2. Rozcieńczyć 40 μl zawieszonego wirusa (z 2.2.7) w 4 ml RSM (rozcieńczenie 1:100) z 1% penicyliną/streptomycyną i 8 μg/ml polibrenu (cRSM).
    3. W dniu zakażenia przemyć komórki raz DPBS, a następnie dodać 250 μl rozcieńczonego wirusa z kroku 2.3.2 do każdej studzienki. Inkubować przez 4 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 , a następnie dodać 1 ml cDMEM do każdego dołka; inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 48–72 godzin.
    4. Ponownie zawiesić komórki z 1 ml 0,05% trypsyny i 0,53 mM EDTA, a następnie dodać 1 ml cDMEM w celu zneutralizowania trypsyny. Przenieść komórki do probówki do mikrowirówki i osadzać w ilości 300 x g przez 4 min. Umyj granulkę 3x w 1 ml Zbilansowanego Roztworu Soli Hanksa (HBSS) plus 2% FBS.
    5. Zawiesić osad z kroku 2.3.4 z buforem FACS (2% FBCS i 2 mM EDTA w PBS) do zawiesiny jednokomórkowej o stężeniu 1 x 106 komórek/ml.
    6. Posortuj tdPomidorowo-dodatnie komórki HCT116 za pomocą sortera komórek, bramkując dla komórek PE-dodatnich (wzbudzenie/emisja: 556/585 nm). Hoduj zebrane komórki w 10-centymetrowym naczyniu w temperaturze 5% CO2 i 37 °C, aby wytworzyć rodzicielskie tdPomidorowo-dodatnie komórki HCT116 (Figura 1A).
    7. Ponownie zawiesić rodzicielskie tdTomato-dodatnie komórki HCT116 z 2.3.6 z 8 ml 0,05% trypsyny i 0,53 mM EDTA na 3 - 5 minut, a następnie dodać 8 ml cDMEM w celu zneutralizowania trypsyny.
      1. Przenieś komórki do probówki o pojemności 50 ml i osadzaj w 300 x g przez 4 minuty. Usuń supernatant i rozcieńcz rodzicielskie komórki HCT116 tdPomidorowo-dodatnie do 1 komórki na 200 μl w cDMEM (Figura 1B).
    8. Umieścić pojedynczą komórkę (200 μl rozcieńczenia) na basenie w 96-dołkowej płytce w temperaturze 5% CO2 i temperaturze 37 °C (rysunek 1C).
    9. Hodować pojedyncze monoklony w kolbach w temperaturze 5% CO2 i temperaturze 37 °C (rysunek 1D).

3. Kalibracja intensywności sygnału fluorescencyjnego w funkcji liczby komórek

  1. Umieść transfekowane komórki HCT116, obecnie określane jako HCT116-L2T, o gęstości 0, 103, 2 x 104, 3 x 105, 5 x 104, 7 x 104, 9 x 104 i 105 komórek / basenik na 96 dołkach w trzech egzemplarzach dla każdej gęstości.
  2. Po 5 godzinach inkubacji określić ilościowo intensywność fluorescencji tdTomato za pomocą IVIS10.
    1. Kliknij ikonę oprogramowania obrazu na pulpicie, aby uruchomić oprogramowanie. Kliknij przycisk "Inicjalizuj", aby zainicjować system obrazowania. Po zakończeniu inicjalizacji (która trwa około kilku minut) wybierz "Fluorescencja", "4 sekundy" czas ekspozycji, "Średnie" binning, "2" F/stop, filtr wzbudzenia "535" i filtr emisji "580".
    2. Umieść płytkę 96-dołkową na stacji obrazowania i kliknij "Pobierz", aby rozpocząć obrazowanie. Po uzyskaniu obrazu kliknij "Narzędzia ROI" w palecie narzędzi i wybierz 12 x 8 z ikony szczeliny.
    3. Utwórz szczeliny o wymiarach 12 x 8, aby pokryć obszar sygnału na obrazie płytki 96-dołkowej i kliknij kartę pomiarów. Obserwuj okno z tabelą pomiarów ROI z jednostkami fotonów na s na steradian na cm kwadratowy (fotony/s/sr/cm2).
  3. Skonstruuj wykres rozrzutu z argumentem (oś X) równym liczbie komórek i funkcją (oś Y) reprezentującej intensywność sygnału. Oblicz krzywe regresji za pomocą oprogramowania do analizy danych, aby obliczyć liczbę komórek odpowiadającą jednostce natężenia fluorescencji (rysunek 2)10.

4. Zwierzęcy model przerzutów do wątroby

  1. Gdy komórki HCT116-L2T osiągną zbieżność 70 - 80%, przygotuj je około 1 godzinę przed wstrzyknięciem śledziony. Dysocjuj komórki za pomocą 0,05% trypsyny w 0,53 mM EDTA przez 3 - 5 minut, a następnie zneutralizuj je równą ilością cDMEM. Upewnij się, że pipetujesz dokładnie, aby uniknąć zbrylania.
  2. Policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek.
  3. Ponownie zawiesić komórki w 1x DPBS do stężenia 1,2 - 2 x 106 komórek/100 μL. Upewnij się, że dokładnie pipetujesz i ponownie zawieszasz komórki, aby uniknąć zbrylania się.
  4. Komórki należy utrzymywać na lodzie do momentu wstrzyknięcia, od czasu do czasu umieszczając je ponownie w probówce.
  5. Przed znieczuleniem myszy należy podać przedoperacyjne znieczulenie i bolus płynny, wstrzykując podskórnie 500 μl mieszaniny buprenorfiny opisanej w kroku 1.3. Podawać tę samą dawkę dodatkowej mieszaniny buprenorfiny dwa razy na dobę, aż objawy bólu (zmniejszona ruchomość, zgarbiony wzrost, brak pielęgnacji, wokalizacja podczas obchodzenia się) ustąpią.
  6. Znieczulenie 6- do 8-tygodniowych samic nagich myszy atymicznym 2% izofluranem w tlenie w komorze anestezjologicznej. Upewnij się, że myszy są całkowicie pod narkozą, ściskając ogon. Użyj maści weterynaryjnej na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia. Przenieś każdą znieczuloną mysz do indywidualnego stożka nosowego w celu wstrzyknięcia śledziony. Przed nacięciem każda mysz powinna być pokryta sterylną obłożeniem chirurgicznym.
  7. Zidentyfikuj śledzionę jako fioletowy obszar widoczny zewnętrznie przez skórę na lewym boku nagich myszy. Za pomocą nożyczek do mikrodysekcji wykonaj 8 mm nacięcie lewego boku na skórze tuż nad śledzioną.
    1. Następnie unieś się na ścianie brzucha i wykonaj małe nacięcie. Wpuść powietrze do jamy brzusznej, aby narządy wewnętrzne odsunęły się od miejsca nacięcia. Powiększ nacięcie ściany brzucha do około 5 mm.
    2. Odsłoń śledzionę, delikatnie uciskając nacięcie wacikiem. W razie potrzeby tłuszczem trzustkowym można delikatnie manipulować, aby pomóc w ekspozycji, aby nie uszkodzić śledziony.
  8. Powoli wstrzyknąć 100 μl komórek za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml z igłą 27 G w końcówkę odsłoniętej śledziony. Wstrzykiwać powoli, przez okres co najmniej 30 - 60 s, aby uniknąć guzów pozawątrobowych.
  9. Umieścić mikroklips na śledzionie przed wyjęciem igły pod koniec wstrzyknięcia, aby zapobiec wyciekowi zawiesiny komórek, do której wstrzyknięto wstrzyknięte środki.
  10. Pozostaw mikroklips na miejscu na 5 minut.
  11. 5 minut po wstrzyknięciu wykonaj splenektomię za pomocą ręcznego urządzenia do kauteryzacji do hemostazy. Wypreparuj wnękę śledziony, zaczynając od przedniej strony. Podczas preparowania dużych naczyń należy wstępnie skoagulować bliższą stronę naczyń z przylegającą tkanką tłuszczową, stosując kauteryzację, aby uniknąć nadmiernego krwawienia.
    UWAGA: Metody hemostazy: skoagulować punkt krwawienia bezpośrednio za pomocą kauteryzacji, uciskać punkt krwawienia przez 3 - 5 minut lub zszyć miejsce krwawienia jedwabnym krawatem 5-0.
  12. Zamknij nacięcie boczne każdej myszy w dwóch warstwach. Najpierw zamknij ścianę brzucha wchłanialnym szwem plecionym 5-0 (np. vicryl) w jednym poziomym ściegu. Następnie zamknij skórę za pomocą niewchłanialnego szwu monofilamentowego 4-0 (np. prolenu), ponownie za pomocą pojedynczego ściegu poziomego.
  13. Wyczyść wszystkie narzędzia, rozpylając 70% izopropanolu, aby utrzymać sterylne warunki między każdym zabiegiem.
    UWAGA: Upewnij się, że zwierzęta są ogrzane, gdy budzą się ze znieczulenia. Monitoruj wszystkie myszy po operacji, aż zaczną chodzić i powrócą do normalnej aktywności. Zazwyczaj czas rekonwalescencji wynosi około 3 - 5 minut. Nie pozostawiaj zwierząt bez opieki, dopóki nie odzyskają wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą mostka. Nie należy zwracać zwierzęcia, które przeszło operację, do towarzystwa innych zwierząt, dopóki w pełni nie wyzdrowieje.

5. Obrazowanie bioluminescencyjne in vivo

  1. Wykonuj obrazowanie co tydzień, aby zmierzyć i określić ilościowo zmiany bioluminescencji w czasie.
  2. Umieść myszy w komorze anestezjologicznej i znieczul je 2% izofluranem w tlenie. Upewnij się, że myszy są całkowicie pod narkozą, ściskając ogony. Używaj maści weterynaryjnej na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.
  3. Następnie wstrzyknij dootrzewnowo każdej myszy 150 μl wstępnie przygotowanej lucyferyny świetlika z kroku 1.4.
  4. Umieść myszy w IVIS z indywidualnymi stożkami nosowymi, podając izofluran. Umieść myszy w pozycji leżącej na plecach z przekładkami pomiędzy nimi, aby zminimalizować sygnał do sąsiednich myszy. Jednocześnie można obrazować maksymalnie pięć myszy.
  5. Zmierz i przeanalizuj intensywność bioluminescencji 3 minuty po wstrzyknięciu lucyferyny.
    1. Po zainicjowaniu IVIS zgodnie z opisem w kroku 3.2.1 wybierz "Luminescencyjny", "1 sekundowy" czas ekspozycji i "Średni" binning.
    2. Kliknij przycisk "Pobierz", aby rozpocząć obrazowanie. Upewnij się, że wykonujesz każde obrazowanie w stałym czasie (3 minuty) po wstrzyknięciu lucyferyny.
    3. Po pobraniu obrazu pojawi się okno obrazu i paleta narzędzi. Kliknij "Narzędzia ROI" i wybierz "1", "2", "3", "4" lub "5" z ikony koła, odpowiadającej liczbie zobrazowanych myszy.
    4. Aby zdefiniować obszary zainteresowania (ROI), zakreśl obszar sygnału luminescencyjnego w jamie brzusznej myszy, a następnie kliknij "pomiary" ROI jako dowolną jednostkę wydajności promieniowania ((fotony/s/cm2/steradian)/(μW/cm2)). Upewnij się, że masz dodatkowy okrąg ROI w tle.
  6. Po czterech tygodniach od wstrzyknięcia, a przed uśmierceniem zwierzęcia, należy wykonać tomografię obrazowania rozproszonego luminescencyjnego (DLIT) przy użyciu IVIS, aby ocenić obciążenie i rozmieszczenie guza przy użyciu rekonstrukcji 3D intensywności bioluminescencji w czasie rzeczywistym poszczególnych kolonii nowotworowych.
    1. Znieczulić myszy i wstrzyknąć lucyferynę, jak opisano w kroku 5.2.4. DLIT jest wykonywany na jednej myszy na raz.
    2. Po zainicjowaniu IVIS, zgodnie z opisem w kroku 3.2.1, wybierz "Kreator obrazowania", "Bioluminescencja" i kliknij "Dalej". Wybierz "DLIT" i kliknij "Dalej". Wybierz sondy "Firefly" i kliknij "Dalej". Wybierz temat zdjęcia "mysz", parametr ekspozycji "Auto", pole widzenia "C-13 cm" i wysokość obiektu "0,5 cm", a następnie kliknij "Dalej". Kliknij przycisk "Pobierz", aby rozpocząć obrazowanie.
    3. Po pobraniu obrazu wybierz zakładkę "DLIT 3D Reconstruction" i zakładkę "Analyze" i kliknij "Reconstruct", aby wygenerować obraz rekonstrukcji 3D.
    4. Kliknij "Narzędzia" i "Animacja 3D". Wybierz opcję "Obróć w lewo na osi Y" w oknie animacji 3D. Kliknij "Nagraj" i "Zapisz" w pliku w formacie .mov.

6. Obrazowanie fluorescencyjne ex vivo

  1. Myszy należy poświębić przez zwichnięcie szyjki macicy w znieczuleniu lub zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi po 4-6 tygodniach od wstrzyknięcia śledziony.
  2. Zbierz wątrobę. Wykonaj poziome nacięcie od lewej do prawej flanki. Chwytając wyrostek mieczykowaty za pomocą podbieracza, rozetnij sierp, żyłę wątrobową i żyłę główną dolną.
    1. Wypreparuj prawe więzadło wątrobowo-nerkowe, więzadło wątrobowo-nerkowe i lewe więzadło wątrobowo-nerkowe, uważając, aby nie uszkodzić płata ogoniastego podczas preparowania więzadła wątrobowo-nerkowego. Po pobraniu wątroby usuń woreczek żółciowy, ponieważ będzie to wykazywało autofluorescencję. Zwróć uwagę na wszelkie dodatkowe obecne guzy pozawątrobowe.
  3. Zwróć uwagę na liczbę i rozmiary guzów wątroby występujących makroskopowo i umieść pobrane wątroby w DPBS.
    UWAGA: Guzy są makroskopowo widoczne gołym okiem jako białe guzy (reprezentatywny przykład, patrz ryc. 4).
  4. Przed umieszczeniem na arkuszu obrazowania należy pobrać każdą wątrobę i delikatnie usunąć nadmiar płynu, ocierając się o ręcznik papierowy.
  5. Zmierz intensywność fluorescencji z każdej kolonii guza za pomocą IVIS.
    1. Wybierz "Fluorescencja", "4 sekundy" czas ekspozycji, "Średnie" grupowanie, "2" F/stop, filtr wzbudzenia "535" i filtr emisji "580". Kliknij przycisk "Pobierz", aby rozpocząć obrazowanie.
    2. Po pobraniu obrazu zlokalizuj okno obrazu i paletę narzędzi. Kliknij "Narzędzia ROI" i wybierz "1" z ikony koła. Aby zdefiniować ROI, zakreśl obszar sygnału poszczególnych kolonii guza na obrazie, a następnie kliknij "pomiary" ROI jako dowolną jednostkę wydajności promieniowania ((fotony/s/cm2/steradian)/(μW/cm2)). Upewnij się, że masz dodatkowy okrąg ROI w tle.
  6. Oblicz całkowitą objętość guza, zakładając, że jest to kula. Objętość guza = 4 x π x r3 / 3 (r = promień). Oblicz frakcję komórek tworzących kolonię nowotworową (Fc) jako liczbę guzów w wątrobie podzieloną przez liczbę komórek wstrzykniętych w splenionie.
  7. Oblicz całkowitą liczbę komórek na kolonię (=X) na podstawie przybliżenia liniowego z kroku 3.3. Oblicz liczbę podziałów komórek (= Y) jako Y = log2X i Td jako Td (dzień) = 28 / Y.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Celem niniejszego eksperymentu było stworzenie spójnego i łatwo reprodukowalnego modelu zwierzęcego, umożliwiającego seryjną kwantyfikację obciążenia guzem przerzutowym in vivo oraz szacowanie częstotliwości kolonizacji i kinetyki wzrostu rozwijających się przerzutów do wątroby. Ryciny 2-6 wraz z podpisami pochodzą z naszej poprzedniej publikacji udostępnionej na licencji Creative Commons CC-BY10.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Model zwierzęcy przedstawiony w niniejszym raporcie opiera się na dwóch głównych podejściach. Po pierwsze, w celu zapewnienia możliwości obserwacji przerzutowych klonów o różnych skłonnościach do kolonizacji i proliferacji w wątrobie, ustalono panel wysoce heterogenicznych linii komórek monoklonalnych, a nie ustaloną niefrakcjonowaną linię komórek rakowych12,13. Monoklonalne podejście do rozwoju przerzutów jest uzasadnione najnowszymi danymi genomicznymi14 i było z powodzeniem stosowane wcześniej do...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować dr Geoffreyowi L. Greene'owi (University of Chicago) za plazmid Luc2-tdTomato i linię komórkową HCT116, panu Ani Solanki (Animal Resource Center) za zarządzanie myszami, oraz dr Larze Leoni za pomoc w DLIT. Kwantyfikacja intensywności fluorescencji i luminescencji została przeprowadzona w Integrated Small Animal Imaging Research Resource na Uniwersytecie w Chicago na widmie IVIS (PerkinElmer, Hopkinton, MA). Praca ta była wspierana przez Virginia and D.K. Ludwig Fund for Cancer Research, Lung Cancer Research Foundation (LCRF), Prostate Cancer Foundation (PCF) oraz Cancer Center Support Grant (P30CA014599). Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji ani przygotowaniu manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
IVIS Spectrum In Vivo System obrazowaniaCaliper Life Sciences124262In Vivo
Oprogramowanie LivingImage 4.0Caliper Nauki przyrodnicze128165Oprogramowanie do obrazowania
VAD-MGX Research AnestezjologVetamacVAD-MGXAparat do znieczulenia wziewnego
DMEMGibco11965-118Odczynniki do hodowli komórkowych
DPBSGibco14190250Odczynniki do hodowli komórkowych
Penicylina/Streptomycyna, płyn (10 000 jednostek penicyliny; 10 000 μ g streptomycyna)Invitrogen15140163Odczynniki do hodowli komórkowych
HBSSThermoFisher24020117Odczynniki do hodowli komórkowych
Buprenex do wstrzykiwań (0,3 mg / ml)Reckitt Benckiser Healthcare Ltd.12496-0757-5Chlorowodorek buprenorfiny
System kauteryzacji GeminiBraintree ScientificGEM 5917Ręczna kauteryzacja do splenektomii
Micro Clip; Prosty; Ciśnienie 70 gramów; 1.5 mm Szerokość klipsa; Długość szczęki 10 mmInstrument chirurgiczny RobozRS-5426Hemoclip: Instrumenty do hemostazy po wstrzyknięciu śledziony
D-lucyferyna, sól potasowaGoldbio TechnologyLUCK-1GSól potasowa lucyferyny
Opti-MEM I Zredukowane podłoże w surowicyGibco31985062Zredukowane podłoże w surowicy
TC20 Automatyczny licznik komórekBIO-RAD1450102Automatyczny licznik komórek
Oprogramowanie JMP10 SAS InstituteOprogramowanie do analizy danych
BD FACSAria II sorter komórekBD BiocsiencesSorter komórek

Bibliografia

  1. Fong, Y., Fortner, J., Sun, R. L., Brennan, M. F., Blumgart, L. H. Clinical score for predicting recurrence after hepatic resection for metastatic colorectal cancer: analysis of 1001 consecutive cases. Ann. Surg. 230 (3), 309-318 (1999).
  2. Pawlik, T. M., et al. Effect of surgical margin status on survival and site of recurrence after hepatic resection for colorectal metastases. Ann. Surg. 241 (5), 715-722 (2005).
  3. Park, J. H., Watt, D. G., Roxburgh, C. S., Horgan, P. G., McMillan, D. C. Colorectal Cancer, Systemic Inflammation, and Outcome: Staging the Tumor and Staging the Host. Ann. Surg. 263 (2), 326-336 (2016).
  4. Veen, T., et al. Long-Term Follow-Up and Survivorship After Completing Systematic Surveillance in Stage I-III Colorectal Cancer: Who Is Still at Risk. J. Gastrointest. Cancer. 46 (3), 259-266 (2015).
  5. Siegel, R., et al. Cancer treatment and survivorship statistics. CA Cancer J. Clin. 62 (2), 220-241 (2012).
  6. O'Connell, J. B., Maggard, M. A., Ko, C. Y. Colon cancer survival rates with the new American Joint Committee on Cancer sixth edition staging. J. Natl. Cancer Inst. 96 (19), 1420-1425 (2004).
  7. House, M. G., et al. Survival after hepatic resection for metastatic colorectal cancer: trends in outcomes for 1,600 patients during two decades at a single institution. J. Am. Coll. Surg. 210 (5), 744-752 (2010).
  8. Smakman, N., Martens, A., Kranenburg, O., Borel Rinkes, I. H. Validation of bioluminescence imaging of colorectal liver metastases in the mouse. J. Surg. Res. 122 (2), 225-230 (2004).
  9. Rajendran, S., et al. Murine bioluminescent hepatic tumour model. J. Vis. Exp. (41), (2010).
  10. Oshima, G., et al. Imaging of tumor clones with differential liver colonization. Sci. Rep. 5 (10946), (2015).
  11. Liu, H., et al. Cancer stem cells from human breast tumors are involved in spontaneous metastases in orthotopic mouse models. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107 (42), 18115-18120 (2010).
  12. Wang, X. M., et al. Integrative analyses identify osteopontin, LAMB3 and ITGB1 as critical pro-metastatic genes for lung cancer. PLoS One. 8 (2), e55714(2013).
  13. Fidler, I. J., Kripke, M. L. Metastasis results from preexisting variant cells within a malignant tumor. Science. 197 (4306), 893-895 (1977).
  14. Yachida, S., et al. Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature. 467 (7319), 1114-1117 (2010).
  15. Khodarev, N. N., et al. STAT1 pathway mediates amplification of metastatic potential and resistance to therapy. PLoS One. 4 (6), e5821(2009).
  16. Langley, R. R., Fidler, I. J. Tumor cell-organ microenvironment interactions in the pathogenesis of cancer metastasis. Endocr. Rev. 28 (3), 297-321 (2007).
  17. Lussier, Y. A., et al. Oligo- and polymetastatic progression in lung metastasis(es) patients is associated with specific microRNAs. PLoS One. 7 (12), e50141(2012).
  18. Lussier, Y. A., et al. MicroRNA expression characterizes oligometastasis(es). PLoS One. 6 (12), e28650(2011).
  19. Calon, A., et al. Dependency of colorectal cancer on a TGF-beta-driven program in stromal cells for metastasis initiation. Cancer Cell. 22 (5), 571-584 (2012).
  20. Vanharanta, S., Massague, J. Origins of metastatic traits. Cancer Cell. 24 (4), 410-421 (2013).
  21. Khodarev, N. N., Roizman, B., Weichselbaum, R. R. Molecular pathways: Interferon/Stat1 Pathway: Role in the tumor resistance to genotoxic stress and aggressive growth. Clin. Cancer Res. 18 (11), 3015-3021 (2012).
  22. Li, C., et al. Interferon-stimulated gene 15 (ISG15) is a trigger for tumorigenesis and metastasis of hepatocellular carcinoma. Oncotarget. 5 (18), 8429-8441 (2014).
  23. Cespedes, M. V., et al. Orthotopic microinjection of human colon cancer cells in nude mice induces tumor foci in all clinically relevant metastatic sites. Am. J. Pathol. 170 (3), 1077-1085 (2007).
  24. Tseng, W., Leong, X., Engleman, E. Orthotopic mouse model of colorectal cancer. J. Vis. Exp. (10), (2007).
  25. Soares, K. C., et al. A preclinical murine model of hepatic metastases. J. Vis. Exp. (27), e51677(2014).
  26. Evans, J. P., et al. From mice to men: Murine models of colorectal cancer for use in translational research. Crit. Rev. Oncol. Hematol. 98, 94-105 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Przerzuty do w trobyobrazowanie IVISobrazowanie bioluminescencyjneobrazowanie fluorescencyjnewstrzykni cie do ledzionyprocedura splenektomiikom rki HCT116rozproszona tomografia luminescencyjna
Zaawansowany zwierzęcy model przerzutów jelita grubego w wątrobie: techniki obrazowania i właściwości klonów z przerzutami
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.