Artykuł metodologiczny

Prosta mechaniczna procedura powodująca niedobór rąbkowych komórek macierzystych u myszy

DOI:

10.3791/54658

⸱

17 listopada 2016

 ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology and Visual Sciences, University of Illinois at Chicago

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Poniższy artykuł przedstawia łatwą, powtarzalną technikę skutecznego tworzenia trwałego mysiego modelu niedoboru rąbków komórek macierzystych (LSCD). Ten model zwierzęcy jest przydatny w testowaniu i porównywaniu skuteczności leczenia chorób rąbkowych komórek macierzystych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niedobór komórek macierzystych rąbka (LSCD) to stan nieprawidłowego działania lub utraty komórek macierzystych nabłonka rąbka, po którym nabłonek rogówki zostaje zastąpiony spojówką. Pacjenci cierpią z powodu nawracających wad rogówki, bólu, stanów zapalnych i utraty wzroku.

Poprzednio, mysi model LSCD został opisany i porównany z dwoma innymi modelami. Celem było stworzenie spójnego mysiego modelu LSCD, który zarówno naśladuje fenotyp u ludzi, jak i utrzymuje się wystarczająco długo, aby umożliwić badanie patofizjologii choroby i ocenę nowych metod leczenia. Tutaj technika jest opisana bardziej szczegółowo.

Zmotoryzowane narzędzie z obracającym się zadziorem zostało zaprojektowane do usuwania rdzawych pierścieni z powierzchni rogówki lub do wygładzania łożyska skrzydlika u pacjentów. Jest to odpowiednie urządzenie do stworzenia pożądanego modelu LSCD. Jest to łatwo dostępne, łatwe w użyciu narzędzie z cienką końcówką, dzięki czemu nadaje się do pracy z małymi oczami, takimi jak myszy. Jego zastosowanie zapobiega niepotrzebnym urazom oka i nie powoduje niechcianych urazów, jak to często ma miejsce w przypadku modeli urazów chemicznych. W przeciwieństwie do skrobaka usuwa nabłonek wraz z błoną podstawną. W tym protokole obszar rąbka został dwukrotnie przetarty, a następnie cały nabłonek rogówki został ogolony od rąbka do rąbka. Aby uniknąć uszkodzenia zrębu, uważano, aby nie szczotkować powierzchni rogówki, gdy nabłonek został już usunięty.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nabłonek rogówki jest niezbędny do zachowania czystości i integralności rogówki. Jest ona stale odnawiana przez całe życie przez nabłonkowe komórki macierzyste znajdujące się w rąbku - wąskiej strefie na styku rogówki i spojówki. Te samoodnawiające się rąbkowe komórki macierzyste odgrywają kluczową rolę w regeneracji nabłonka rogówki, zarówno normalnie, jak i po urazie. Częściowe lub całkowite wyczerpanie tych komórek macierzystych spowoduje nawracające nadżerki rogówki, ból, bliznowacenie rogówki i neowaskularyzację, pojawienie się komórek kubkowych, a jeśli nie jest leczone, ślepotę rogówki. Ten stan jest znany jako niedobór rąbkowych komórek macierzystych (LSCD) i może być idiopatyczny; dziedziczny; lub nabyte w wyniku urazów chemicznych lub termicznych, długotrwałego noszenia soczewek kontaktowych i przewlekłego stanu zapalnego1-6.

Badania nad LSCD wymagają odpowiedniego modelu zwierzęcego, który nie tylko naśladuje chorobę u ludzi, ale jest powtarzalny i trwały, z najmniejszym uszkodzeniem innych struktur rogówki i oka. Model ten jest niezbędny do oceny leczenia i wyjaśnienia mechanizmów chorobowych na poziomie molekularnym i komórkowym. Jak opisano wcześniejw punkcie 1, za pomocą obrotowego zadzioru można łatwo opracować mysi model LSCD, który charakteryzuje się wyżej wymienionymi zaletami i utrzymuje się przez co najmniej trzy miesiące. Celem tego badania jest przedstawienie prostego, powtarzalnego i zrównoważonego mysiego modelu LSCD.

Obrotowy zadzior jest poręcznym narzędziem, które równomiernie usuwa nabłonek bez uszkadzania leżącego pod nim zrębu1. Był stosowany do wywoływania centralnej erozji rogówki7, 8 w badaniach gojenia się ran. Przedstawiona w niniejszym tekście technika tworzenia LSCD u myszy nie została wcześniej opisana. Wcześniej wprowadzone metody skrobania nabłonka szpatułką skutkują mniej równomiernym uszkodzeniem - szczególnie na rąbku - i bardziej zmiennym fenotypem1, 9, z większym przywróceniem prawidłowego nabłonka rogówki1. W przeciwieństwie do skrobaka, obrotowy zadzior usuwa również błonę podstawną nabłonka7, 8, 10. Inne zgłoszone metody odcinania komórek macierzystych obejmują stosowanie substancji chemicznych, takich jak wodorotlenek sodu, n-heptanol i chlorek benzalkoniowy, które nie tylko mogą wywołać niepożądane uszkodzenie leżących poniżej struktur oka, ale także mogą prowadzić do znacznego stanu zapalnego, a następnie zmętnienia rogówki lub metaplazji płaskonabłonkowejnabłonka 11-15. Obracający się zadzior nie jest związany z tymi poważnymi powikłaniami. Chirurgiczne usunięcie nabłonka rąbka, samodzielnie lub przy użyciu środków chemicznych10, 11, 16, jest trudniejsze do wykonania i nie jest najlepszą opcją u zwierząt o małych oczach i cienkim nabłonku rąbka (takich jak myszy). Ponadto, co zaskakujące, limbektomia może nadal pozostawiać część nabłonka rąbka10.

Niżej opisana technika spowoduje LSCD z neowaskularyzacją i koniunktywalizacją, która naśladuje prezentację pełnego LSCD u pacjentów i trwa co najmniej trzy miesiące1. Jest odpowiedni dla tych, którzy chcą badać LSCD lub patofizjologię gojenia się ran, immunologię i potencjalne metody leczenia u myszy. Możliwe, z pewnymi modyfikacjami, procedurę tę można wykonać u szczurów lub królików10. Ponieważ obracający się zadzior skutecznie usuwa nabłonek, może być wykorzystany we wszelkich badaniach dotyczących ścierania/zraniania nabłonka rogówki oraz we wszelkich powiązanych badaniach klinicznych lub biologii molekularnej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury wykonywane na zwierzętach są zgodne z oświadczeniami Stowarzyszenia Badań nad Widzeniem i Okulistyką dotyczącą wykorzystania zwierząt w badaniach nad widzeniem. Wykorzystano czternaście cztero- do sześciomiesięcznych samców/samic myszy typu dzikiego C57BL/6J: dziesięć myszy do modelu urazowego i cztery jako zwierzęta kontrolne (nieuszkodzone rogówki).

1. Przygotowanie zwierząt

  1. Znieczulić mysz wstrzyknięciem dootrzewnowym mieszaniny 100 mg/kg ketaminy i 5 mg/kg ksylazyny. Po zadziałaniu znieczulenia uszczypnij palec u nogi, aby potwierdzić głębokość znieczulenia; Zwierzę nie powinno reagować.
  2. Przed przeprowadzeniem eksperymentów należy sprawdzić oko pod lampą szczelinową, aby sprawdzić, czy nie doszło do wcześniejszego uszkodzenia rogówki.
  3. Wkroplić kroplę 1% chlorowodorku tetrakainy do oka. Po 60 - 90 sekundach przetestuj odruch rogówkowy, aby potwierdzić brak czucia. Zamiast tego można zastosować chlorowodorek proparakainy 0,5%.
  4. Gdy utrata czucia rogówki jest pewna, delikatnie nanieś kroplę 5% jodu powidonu na oko i na włosy wokół oka. Zetrzyj kroplę po 1 minucie lub rozprowadź ją na włosach wokół oka, aby włosy nie kolidowały z końcówką narzędzia.

2. Ścieranie nabłonka rogówki

  1. Nosić rękawice chirurgiczne i fartuch. Przygotuj wymagane narzędzia: sterylny zadzior obrotowy i parę sterylnych pęset. Aby uzyskać lepszą kontrolę, użyj wygiętej pęsety. Podczas zabiegu umieść narzędzia na sterylnym arkuszu.
  2. Za pomocą zgiętej pęsety ustabilizuj oko, chwytając powieki od strony nosa i delikatnie przesuwając oko. Unikaj używania zbyt dużego nacisku.
  3. Pod mikroskopem chirurgicznym dwukrotnie ogol się o 360° wokół obszaru rąbka za pomocą sterylnego zadzioru obrotowego. Obejdź rąbek z prędkością 5 - 6 sekund na rundę.
    UWAGA: Frez ma jedną stałą prędkość. Jednak, aby obracał się z ustaloną prędkością, "nakrętka końcowa" powinna być całkowicie dokręcona.
  4. Usuń cały nabłonek rogówki od rąbka do rąbka za pomocą obracającego się zadzioru. Aby uzyskać lepsze wyniki, przesuwaj narzędzie po okrężnych stronach i trzymaj je nieco równolegle do powierzchni rogówki, aby pracować z boczną stroną jego końcówki. Uważaj, aby nie uszkodzić zrębu, nie szczotkując ponownie obszarów, w których nabłonek został już usunięty. Nie uciskaj oka. Wyczyść końcówkę szczoteczki zgodnie z wymaganiami.
  5. Wlej kroplę sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami na rogówkę i zetrzyj wszelkie oderwane arkusze nabłonka miękką chusteczką czyszczącą.
  6. Ogol pozostały nabłonek, jeśli występuje.
  7. Zwróć uwagę na ogon myszy podczas zabiegu.
    UWAGA: Jeśli wystąpi jakikolwiek ruch, głębokość znieczulenia zmniejszyła się i wymagane jest dalsze wstrzyknięcie. Jedna trzecia do dwóch trzecich objętości wstrzykniętej pierwotnie powinna być wystarczająca. Nie należy przedawkować zwierzęcia lekiem znieczulającym.
  8. Wysterylizuj wszystkie narzędzia przed użyciem ich na innym oku.

3. Potwierdź całkowite usunięcie nabłonka

  1. Nanieś kroplę 1 mg/ml fluoresceiny sodowej na rogówkę. Oczyść rogówkę po 30 sekundach i zbadaj ją pod mikroskopem z filtrem kobaltowo-niebieskim, aby sprawdzić, czy nabłonek został całkowicie usunięty.
    UWAGA: Obszary rogówki z ubytkami nabłonka są uwidocznione na zielono.

4. Opieka pooperacyjna

  1. Połóż zwierzę na kocu grzewczym i trzymaj je w bezpiecznym miejscu (np. w klatce) podczas rekonwalescencji. Nie trzymaj nieprzytomnego zwierzęcia w towarzystwie tych przytomnych.
  2. Zastosuj 1% maść okulistyczną z erytromycyną. Zapobiegnie to również wysuszeniu oczu. Kontynuuj stosowanie antybiotyku codziennie przez tydzień.
  3. Wstrzyknąć 0,1 mg/kg buprenorfiny podskórnie po zabiegu i ponownie po 12 godzinach. Kontynuować wstrzyknięcie dwa razy dziennie przez dwa dni.
  4. Obserwuj zwierzę przez 30 - 45 minut, aż do całkowitego wyzdrowienia ze znieczulenia.
    UWAGA: Łagodny ruch mięśni oddechowych na powierzchni brzusznej wskazuje na dobre samopoczucie zwierzęcia w okresie rekonwalescencji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ciągu miesiąca od wykonania tej techniki, u 100% rogówek doszło do powierzchownej neowaskularyzacji (Rysunek 1A. Zdjęcia zostały wykonane aparatem podłączonym do lampy szczelinowej pod jasnym polem i filtrem kobaltowo-niebieskim). W 18/20 (90%) oczu neowaskularyzacja objęła całą powierzchnię rogówki (ryc. 1A). W 2/20 (10%) neowaskularyzację obserwowano w trzech z czterech kwadrantów rogówki, ale nadal docierała do środka rogówki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym artykule opisano powtarzalną i stosunkowo prostą technikę tworzenia mysiego modelu LSCD. Jest kilka ważnych aspektów tego modelu, na które warto zwrócić uwagę. Po pierwsze, w przeciwieństwie do modeli, które wykorzystują substancje chemiczne11, 12, uraz obejmuje przede wszystkim nabłonek powierzchniowy (i błonę podstawną), z minimalnym uszkodzeniem leżącego poniżej zrębu rogówki lub innych struktur wewnątrzgałkowych. W związku z tym stan zapalny i bliznowacenie są ograniczone, co może skomplikować proced...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują Ruth Zelkha, MS, za jej hojną pomoc w obrazowaniu. Badania te były wspierane przez Clinical Scientist Development Program Award K12EY021475 dla M.E., grant R01 EY024349-01A1 dla A.R.D., grant podstawowy EY01792 z National Eye Institute, NIH oraz nieograniczony grant z Research to Prevent Blindness. A.R.D. jest laureatem nagrody Career Development Award przyznawanej przez Research to Prevent Blindness.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Frez obrotowy: Środek do usuwania pierścieni rdzy AlgerBrush II Rumex International Co, Clearwater, FL16-141Frez 0,5 mm. Dostępne również w innych firmach.
Mikroskop chirurgicznyWild Heerbrugg, SzwajcariaWild M691
Aparat cyfrowyNikon, Tajlandia
Lampa szczelinowa Nikon FS-2Nikon, Japonia
Poliklonalne przeciwciało anty-CK12Santa Cruz Blotechnology, CA,SC-17101stężenie 1:100
Przeciwciało monoklonalne anty-CK8TROMA-I-s, Iowa City, IAAB_531826Koncentracja 1:50

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Afsharkhamseh, N., et al. Stability of limbal stem cell deficiency after mechanical and thermal injuries in mice. Exp. Eye Res. 145, 88-92 (2015).
  2. Dorà, N. J., Hill, R. E., Collinson, J. M., West, J. D. Lineage tracing in the adult mouse corneal epithelium supports the limbal epithelial stem cell hypothesis with intermittent periods of stem cell quiescence. Stem Cell Res. 15 (3), 665-677 (2015).
  3. Ahmad, S., Osei-Bempong, C., Dana, R., Jurkunas, U. The culture and transplantation of human limbal stem cells. J. Cell Physiol. 225 (1), 15-19 (2010).
  4. Kolli, S., Ahmad, S., Lako, M., Figueiredo, F. Successful clinical implementation of corneal epithelial stem cell therapy for treatment of unilateral limbal stem cell deficiency. Stem Cells. 28 (3), 597-610 (2010).
  5. Ahmad, S., Figueiredo, F., Lako, M. Corneal epithelial stem cells: characterization, culture and transplantation. Regen. Med. 1 (1), 29-44 (2006).
  6. He, H., Yiu, S. C. Stem cell-based therapy for treating limbal stem cells deficiency: A review of different strategies. Saudi J. Ophthalmol. 28 (3), 188-194 (2014).
  7. Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. Removal of the basement membrane enhances corneal wound healing. Exp Eye Res. 93 (6), 927-936 (2011).
  8. Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Exp. Eye Res. 121, 178-193 (2014).
  9. Amirjamshidi, H., et al. Limbal fibroblast conditioned media: a non-invasive treatment for limbal stem cell deficiency. Mol. Vis. 17, 658-666 (2011).
  10. Li, F. J., et al. Evaluation of the AlgerBrush II rotating burr as a tool for inducing ocular surface failure in the New Zealand White rabbit. Exp. Eye Res. 147, 1-11 (2016).
  11. Ti, S. E., Anderson, D., Touhami, A., Kim, C., Tseng, S. C. G. Factors affecting outcome following transplantation of ex vivo expanded limbal epithelium on amniotic membrane for total limbal deficiency in rabbits. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 43 (8), 2584-2592 (2002).
  12. Ma, Y., et al. Reconstruction of chemically burned rat corneal surface by bone marrow-derived human mesenchymal stem cells. Stem Cells. 24 (2), 315-321 (2006).
  13. Bu, P., et al. Effects of activated omental cells on rat limbal corneal alkali injury. Exp. Eye Res. 121, 143-146 (2014).
  14. Luengo Gimeno, F., Lavigne, V., Gatto, S., Croxatto, J. O., Correa, L., Gallo, J. E. Advances in corneal stem-cell transplantation in rabbits with severe ocular alkali burns. J. Cataract Refract. Surg. 33 (11), 1958-1965 (2007).
  15. Lin, Z., et al. A mouse model of limbal stem cell deficiency induced by topical medication with the preservative benzalkonium chloride. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54 (9), 6314-6325 (2013).
  16. Huang, A. J., Tseng, S. C. Corneal epithelial wound healing in the absence of limbal epithelium. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 32 (1), 96-105 (1991).
  17. Liu, C. Y., et al. Cornea-specific expression of K12 keratin during mouse development. Curr. Eye Res. 12 (11), 963-974 (1993).
  18. Nakatsu, M. N., González, S., Mei, H., Deng, S. X. Human limbal mesenchymal cells support the growth of human corneal epithelial stem/progenitor cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 55 (10), 6953-6959 (2014).
  19. Pajoohesh-Ganji, A., Pal-Ghosh, S., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. Corneal goblet cells and their niche: implications for corneal stem cell deficiency. Stem Cells. 30 (9), 2032-2043 (2012).
  20. McCloy, R. A., Rogers, S., Caldon, C. E., Lorca, T., Castro, A., Burgess, A. Partial inhibition of Cdk1 in G 2 phase overrides the SAC and decouples mitotic events. Cell Cycle. 13, 1400-1412 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

model mysitechnika rotacyjnego wiert ausuwanie nab onka rog wkizapobieganie uszkodzeniu stromymonitorowanie znieczuleniaweryfikacja fluoresceinmarkery cytokeratynoweneowaskularyzacja rog wkileczenie antybiotykami

Powiązane artykuły