Mikroglej jako zastępczy bioczujnik do określania neurotoksyczności nanocząstek

Podsumowanie

Mikroglej (komórki odpornościowe mózgu), są używane jako zastępczy bioczujnik do określenia, jak nanocząsteczki wpływają na neurotoksyczność. Opisujemy serię eksperymentów mających na celu zbadanie odpowiedzi mikrogleju na nanocząstki i narażenie neuronów podwzgórza na supernatant z aktywowanego mikrogleju w celu określenia neurotoksyczności.

Streszczenie

Nanocząsteczki znajdujące się w zanieczyszczeniach powietrza mogą zmieniać profile neuroprzekaźników, zwiększać stan zapalny układu nerwowego i zmieniać funkcjonowanie mózgu. Dlatego opisany tutaj test pomoże w wyjaśnieniu roli mikrogleju w zapaleniu nerwów i chorobach neurodegeneracyjnych. Wykorzystanie mikrogleju, rezydujących komórek odpornościowych mózgu, jako zastępczego bioczujnika, dostarcza nowych informacji na temat tego, w jaki sposób reakcje zapalne pośredniczą w uszkodzeniach neuronów. Tutaj wykorzystujemy unieśmiertelnioną mysią linię komórkową mikrogleju, oznaczoną jako BV2, i opisujemy metodę ekspozycji na nanocząstki przy użyciu nanocząstek srebra (AgNP) jako standardu. Opisujemy, jak wystawić mikroglej na działanie nanocząstek, jak usunąć nanocząstki z supernatantu i jak użyć supernatantu z aktywowanego mikrogleju do określenia toksyczności, używając jako miary przeżycia komórek podwzgórza. Po ekspozycji na AgNP aktywację mikrogleju BV2 zwalidowano za pomocą testu immunoenzymatycznego połączonego z czynnikiem martwicy nowotworu alfa (TNF-α) (ELISA). Supernatant przefiltrowano w celu usunięcia AgNP i umożliwienia cytokiny i innych wydzielanych czynników pozostania w kondycjonowanych pożywkach. Komórki podwzgórza poddano następnie działaniu supernatantu z mikrogleju aktywowanego AgNP, a przeżycie neuronów określono za pomocą testu fluorescencyjnego na bazie resazuryny. Technika ta jest przydatna do wykorzystania mikrogleju jako zastępczego biomarkera zapalenia nerwów i określenia wpływu zapalenia nerwów na inne typy komórek.

Wprowadzenie

Zanieczyszczenia środowiska, szczególnie te o zakresie nanocząstek (NP) (średnica 1 - 20 nm), zostały powiązane z otyłością i innymi chorobami neurodegeneracyjnymi ze względu na zdolność do przekraczania bariery krew-mózg ^1-3. Zwiększone narażenie na zanieczyszczenia może wywołać stan zapalny w ośrodkowym układzie nerwowym, w tym w podwzgórzu ¹. Jednym z potencjalnych mechanizmów, w których to zachodzi, może być indukowana przez nanocząstki aktywacja mikrogleju (komórek odpornościowych mózgu) ⁴. We wcześniejszych badaniach wykorzystano modele in vivo do zbadania wpływu nanocząsteczek na zdrowie mózgu, które są czasochłonne, kosztowne i nie dają bezpośredniej odpowiedzi na pytanie, w jaki sposób nanocząsteczki wpływają na mikroglej. Mikroglej odgrywa wieloaspektową rolę w ośrodkowym układzie nerwowym, w tym w utrzymaniu mikrośrodowiska mózgu i komunikowaniu się z otaczającymi neuronami poprzez uwalnianie wydzielanych czynników i cytokin. W zależności od bodźców, mikroglej może być aktywowany do stanu prozapalnego M1 lub przeciwzapalnego M2. Na przykład mikroglej aktywowany M1 uwalnia cytokiny prozapalne, takie jak czynnik martwicy nowotworu alfa (TNF-α), podczas gdy mikroglej aktywowany M2 uwalnia cytokiny przeciwzapalne, w tym interleukinę-4 (IL-4). Aby zwalidować nasz zastępczy bioczujnik in vitro do określania neurotoksyczności zanieczyszczeń powietrza, zmierzyliśmy odpowiedź mikrogleju na nanocząstki srebra (AgNPs) o długości fali 20 nm. Celem tego artykułu jest opisanie w jaki sposób linia komórkowa mikrogleju in vitro może być wykorzystana jako zastępczy marker biosensora do badania mysiej odpowiedzi mikrogleju na NP oraz jak aktywacja mikrogleju wpływa na komórki podwzgórza. Długoterminowym zamierzonym zastosowaniem tego zwalidowanego modelu jest testowanie wpływu rzeczywistych zanieczyszczeń na zdrowie mózgu i choroby neurodegeneracyjne. Przedstawiamy szczegółowy opis 96-dołkowego testu in vitro do pomiaru aktywacji mikrogleju i przeżycia komórek podwzgórza po ekspozycji na pożywki kondycjonowane mikroglejem.

Aktywacja mikrogleju została określona po ekspozycji na AgNP przy użyciu testu immunoenzymatycznego połączonego z TNF-α (ELISA). Aby określić wpływ aktywowanego mikrogleju na komórki podwzgórza, AgNP usunięto z supernatantu mikrogleju (kondycjonowane pożywki) za pomocą urządzenia filtrującego. Urządzenie filtrujące zatrzymuje cytokiny, wykluczając AgNP ze względu na wielkość. Krótko mówiąc, supernatant z mikrogleju potraktowany lub bez AgNP został zebrany, dodany do filtrów i odwirowany przy 14 000 x g przez 15 minut. Udało nam się wówczas określić wpływ cytokin wydzielanych przez mikroglej na żywotność komórek podwzgórza. Toksyczność komórek po ekspozycji na kondycjonowane pożywki (zawierające cytokiny) określono za pomocą testu na bazie resazuryny, jak opisano wcześniej ^5,6. Metabolicznie aktywne komórki redukują rezazurynę i wytwarzają sygnał fluorescencyjny proporcjonalny do liczby żywotnych komórek ⁷.

Istnieje kilka zalet korzystania z tej techniki w porównaniu z innymi (takimi jak kokultura, ustawienia trans-well lub eksperymenty in vivo). Nasz model zapewnia możliwość bezpośredniej aktywacji mikrogleju i określenia, czy wydzielane czynniki są toksyczne dla neuronów ⁸. Obecny protokół wykorzystuje unieśmiertelniony mikroglej BV2 stymulowany nanocząstkami o średnicy 20 nm oraz unieśmiertelnione mysie komórki podwzgórza (oznaczone mHypo-A1/2) ⁹ w celu określenia późniejszej odpowiedzi. Chociaż protokół ten został zoptymalizowany pod kątem tych specyficznych warunków, metody można zmienić, aby można je było zastosować w innych modelach śmierci komórek indukowanej mikroglejem lub w przypadku innych typów komórek, w tym pierwotnego mikrogleju i neuronów.

Protokół

1. Utrzymanie hodowli komórek mikrogleju

1. Pożywka do hodowli komórkowych w ciepłych komórkach (Dulbecco's Modified Eagle Medium; DMEM) uzupełnione 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% penicyliną/streptomycyną/neomycyną (PSN) do 37 °C.
2. Otrzymać zamrożony materiał komórek mikrogleju BV2 w pasażu 18-25 z przechowywania w temperaturze -80 °C. Szybko rozmrozić komórki w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
3. Delikatnie przenieść komórki do kolby z wentylacją o średnicy 75^cm2 zawierającej 10 ml pożywki do hodowli komórkowych.
4. Inkubować kolbę w 5% CO₂ w temperaturze 37 °C. Po 24 godzinach odessać pożywkę i zastąpić ją świeżą pożywką. Hoduj komórki do około 70-80% zbieżności.

2. Liczenie i powlekanie komórek

1. W łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, ciepły DMEM i 1x-trypsyna-EDTA.
2. Odessać pożywkę z komórek i dodać 500 μl trypsyny. Inkubować w temperaturze 37°C przez 2 - 5 minut.
3. Za pomocą skrobaka usunąć komórki z kolby i zawiesić w 5 ml DMEM. Przepuścić komórki przez sitko o średnicy 70 μm do probówki o pojemności 50 ml trzy razy.
4. Policz komórki za pomocą hemocytometru i zasiej 8 000 komórek / studzienkę na przezroczystej płytce dolnej o czarnych ściankach w końcowej objętości 200 μl DMEM uzupełnionej 10% FBS i 1% PSN. Inkubować płytkę w 5% CO₂ w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.
5. Usuń stary DMEM i zastąp go 200 μl podgrzanego DMEM uzupełnionego 1% PSN, aby surowicy zagłodzić mikroglej. Inkubować płytkę w 5% CO₂ w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.

3. Aktywacja mikrogleju

1. W oddzielnych probówkach rozcieńczyć AgNPs (0,01, 0,05 lub 0,1 μg/ml) i kontrolę nośnika/obojętnego (cytrynian sodu, 0,04 mM) w DMEM bez surowicy uzupełnionym 1% PSN do końcowych stężeń roboczych.
2. Usunąć 100 μl pożywki z każdej studzienki i zastąpić 100 μl odpowiedniego środka do uzdatniania.
3. Inkubować płytkę w 5 % CO₂ w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.

4. Filtrowanie mediów kondycjonowanych

1. Zebrać 200 μl supernatantu pożywki z każdej studzienki i przenieść do filtra (odcięcie masy cząsteczkowej 10 kDa) z probówką zbiorczą (pojemność 1,5 do 2 ml).
2. Wirować przy 14 000 x g w temperaturze pokojowej przez 15 min.
3. Wyrzuć przepływowy (supernatant z cząstkami) i umieść filtr do góry nogami w nowej probówce zbiorczej.
4. Wirować przy 1 000 x g w temperaturze pokojowej przez 2 min.
   UWAGA: Powstałe przefiltrowane pożywki (zawierające wydzielane cytokiny) są zagęszczane sześciokrotnie.
5. Zwiększyć objętość koncentratu do 400 μl za pomocą świeżego DMEM uzupełnionego 10% FBS i 1% PSN i przechowywać na lodzie.
   UWAGA: Aby zapewnić usunięcie resztkowych AgNP z przefiltrowanych mediów, należy wygenerować stężenie AgNP w oparciu o charakterystyczny pik przy około 390 - 420 nm ¹⁰. Pokrótce przygotować podwielokrotności niefiltrowanych AgNP (0, 0,01, 0,025, 0,05, 0,1 i 0,2 μg/ml, jak opisano w kroku 3.1) i przefiltrowaną kontrolę nośnika (cytrynian sodu, 0,04 mM) w DMEM bez surowicy. Podwielokrotność 50 μl przefiltrowanych próbek i wzorców na przezroczystą płytkę dolną o czarnych ściankach. Za pomocą spektrofotometru zmierzyć absorbancję przy 390 - 410 nm i porównać odczyty z krzywą stężenia AgNP. Jeżeli przefiltrowane próbki mają taką samą wartość absorbancji jak próbka kontrolna nośnika, można założyć, że resztkowe AgNP zostały usunięte.
6. Użyj połowy przefiltrowanej pożywki, aby określić wydzielanie TNF-α, postępując zgodnie z instrukcjami z dostępnego na rynku zestawu.

5. Utrzymanie hodowli komórek podwzgórza

1. Ciepła pożywka do hodowli komórkowych DMEM uzupełniona 10% FBS i 1% PSN do 37 °C.
2. Otrzymać zamrożony zapas komórek podwzgórza (mHypo-A1/2) w czasie pasażu 18-25, przechowywany w temperaturze 80 °C. Szybko rozmrozić komórki w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
3. Delikatnie przenieść komórki do kolby z wentylacją o średnicy 75^cm2 zawierającej 10 ml pożywki do hodowli komórkowych.
4. Inkubować kolbę w 5% CO₂ w temperaturze 37 °C. Po 24 godzinach odessać pożywkę i zastąpić ją świeżą pożywką. Hoduj komórki do około 70-80% zbieżności.

6. Określanie toksyczności komórek podwzgórza

1. Ciepły roztwór DMEM i 1x-trypsyna-EDTA w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
2. Odessać pożywkę z komórek podwzgórza i dodać 500 μl trypsyny. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 - 5 minut. Usunąć komórki z kolby za pomocą skrobaka, jak opisano powyżej w kroku 2.
3. Policz komórki za pomocą hemocytometru i płytkuj komórki podwzgórza w 5 000 komórek/studzienkę na przezroczystej płytce dolnej o czarnych ściankach w końcowej objętości 200 μl DMEM uzupełnionym 10% FBS i 1% PSN i inkubuj przez noc w 5% CO₂ w temperaturze 37 °C.
4. Usunąć 100 μl starych pożywek za pomocą pipetera wielokanałowego i dodać 100 μl przefiltrowanych, skoncentrowanych kondycjonowanych pożywek, do końcowego stężenia 1x.
5. Inkubować płytkę w 5% CO₂ w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.
6. Dodać 22 μl odczynnika rezazuryny i inkubować płytkę przez 20 minut w 5% CO₂ w temperaturze 37 °C.
7. Za pomocą spektrofotometru wielomodowego zarejestruj fluorescencję (560 nm EX/590 nm EM) w celu zmierzenia żywotności komórek. Raportuj wyniki jako względne jednostki fluorescencji (RFU).

Wyniki

Pokazujemy, że mikroglej funkcjonuje jako zastępczy bioczujnik dla reakcji mózgu na nanocząstki, korzystając z powyższego protokołu. Nasze wyniki obejmują pomiar toksycznego wpływu aktywacji mikrogleju na śmierć komórek neuronalnych w dalszej części łańcucha dewnego. Rycina 1 przedstawia przebieg protokołu w celu aktywacji mikrogleju i określenia, czy wydzielane cytokiny zmniejszają żywotność neuronów podwzgórza. Wydzielanie TNF-α było znacznie zwiększone po ekspozycji na...

Dyskusja

Ostatnie badania potwierdzają, że narażenie środowiskowe przyczynia się do otyłości i innych chorób neurodegeneracyjnych ^11,12. Jednak techniki stosowane w poprzednich badaniach są czasochłonne i kosztowne. Względy ekonomiczne, fizjologicznie istotne systemy dostarczania, kwestie etyczne związane z szerokim wykorzystaniem modeli zwierzęcych in vivo oraz trudności z przełożeniem wyników na znaczące zalecenia zdrowotne to tylko niektóre z głównych wyzwań, które zahamowały postęp w badaniach nad neurotok...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Cells/Reagents
Linia komórkowa mikrogleju myszy (BV2)	Interlab Cell Line Collection (Genua, Włochy)	ATL03001
Linia komórkowa podwzgórza dorosłej myszy mHypoA-1/2	Cellutions Biosystems Inc.	CLU172
Dulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł" s Medium	Invitrogen	10313-039
Surowica bydlęca płodowa	PAA Labs	A15-751
Penicylina/Streptomycyna/Neomycyna	Thermo Fisher Scientific	15640-055
Trypsyna-EDTA	Thermo Fisher Scientific	25200056
Nanocząstki srebra (20 nm)	Sigma-Aldrich	730793
Odczynnik żywotności komórek PrestoBlue	Invitrogen	A13262
Mysz TNF- &alfa; ELISA Max Delux	Biolegend	430904
Lipopolisacharyd	Sigma-Aldrich	L4391
Cytrynian sodu	Sigma-Aldrich	S4641
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Uwagi
Equipment
96 W Optyczna płyta dolna, polistyren, poddana obróbce kultur komórkowych, z pokrywką, sterylna	Thermo Fisher Scientific	165305
Filtr odśrodkowy Amicon Ultra-0,5 z membraną Ultracel-10	EMD Millipore	UFC501008
SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate	Urządzenia molekularne	M5
Falcon 50 ml Rurki	Corning, Inc	14-432-22
Sitka do komórek Falcon 70 μ m	Corning, Inc	08-771-2
Wirówka stołowa 5430	Eppendorf	22620560