Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Techniki obrazowania prometafazy i metafazy mejozy I w utrwalonych oocytach Drosophila

8.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54666

⸱

31 października 2016

 , 
1Waksman Institute, Rutgers University, 2Department of Genetics, Rutgers University

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiamy protokoły pobierania, przygotowania i obrazowania dojrzałych oocytów Drosophila. Metody te pozwalają na wizualizację zachowania chromosomów oraz składania i funkcji wrzeciona podczas mejozy.

Streszczenie

Segregacja chromosomów w ludzkich oocytach jest podatna na błędy, co prowadzi do aneuploidii, która jest główną genetyczną przyczyną poronień i wad wrodzonych. Badania nad zachowaniem chromosomów w oocytach z organizmów modelowych są bardzo obiecujące, jeśli chodzi o odkrycie molekularnych podstaw podatności ludzkich oocytów na aneuploidię. Drosophila melanogaster jest podatna na manipulacje genetyczne, dzięki ponad 100-letnim badaniom, społeczności i rozwojowi technik. Wizualizacja zachowania chromosomów i składania wrzecion w oocytach Drosophila wiąże się jednak ze szczególnymi wyzwaniami, przede wszystkim ze względu na obecność błon otaczających oocyt, które są nieprzepuszczalne dla przeciwciał. Opisujemy tutaj protokoły pobierania, przygotowania i obrazowania składania wrzeciona mejozy I i zachowania chromosomów w oocytach Drosophila, które umożliwiają molekularną analizę segregacji chromosomów w tym ważnym organizmie modelowym.

Wprowadzenie

Badanie mejozy jest czasami opisywane jako "genetyka genetyki". Dzieje się tak, ponieważ podstawowe właściwości dziedziczenia chromosomów i niezależnego asortymentu odbywają się poprzez segregację chromosomów podczas produkcji gamet. Ważna demonstracja chromosomowej teorii dziedziczenia pojawiła się w 1916 roku w pracy Calvina Bridgesa nad Drosophila melanogaster1. To i inne klasyczne badania genetyczne nad Drosophila w znacznym stopniu przyczyniły się do naszego zrozumienia genetyki. Badanie cytologiczne chromosomów mejotycznych w oocytach Drosophila było jednak wyzwaniem. Dzieje się tak przede wszystkim dlatego, że immunofluorescencja oocytów Drosophila w późnym stadium, kiedy wrzeciono się składa, a chromosomy są zorientowane na segregację, jest utrudniona przez obecność błon, które sprawiają, że oocyt jest nieprzepuszczalny dla przeciwciał.

Pomimo tego wyzwania, oocyty Drosophila pozostają atrakcyjnym modelem do badania zachowania chromosomów i składania wrzecion. Dzieje się tak ze względu na potężne narzędzia genetyczne dostępne u Drosophila, ale także dlatego, że oocyty zatrzymują się w metafazie I, kiedy chromosomy są zorientowane, a wrzeciono jest w pełni uformowane. Ułatwia to pobieranie i badanie dużej liczby oocytów na tym ważnym etapie podziału komórek. Ponadto prosty organizm modelowy, który jest podatny na manipulacje genetyczne w celu badania segregacji chromosomów oocytów, może stanowić ważny wkład w nasze zrozumienie zdrowia reprodukcyjnego człowieka. Błędy w liczbie chromosomów są główną genetyczną przyczyną poronień i wad wrodzonych u ludzi2. Większość tych błędów można przypisać do oocytu i są one skorelowane z wiekiem matki. Średni wiek matek w USA rośnie, co sprawia, że jest to poważny problem zdrowia publicznego.

Opisujemy tutaj metody badania cytologicznego oocytów Drosophila, w tym demonstrację, jak usunąć błony oocytów. Metody te są modyfikacjami protokołów opisanych po raz pierwszy przez Theurkaufa i Hawleya3, Zou i wsp.4 oraz Dernburg i wsp.5. Uwzględniamy również metody wzbogacania różnych etapów oocytów, oparte na protokole po raz pierwszy opisanym przez Gillilanda i wsp.Lokal mieszkalny Na koniec dodajemy instrukcje dotyczące leczenia farmakologicznego oocytów Drosophila. Łącznie metody te umożliwiają badanie cytologiczne segregacji chromosomów oocytów i składania wrzecion u Drosophila.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Uwaga: Zabiegi wykonuje się w temperaturze pokojowej, chyba że zaznaczono inaczej. Inkubatory z kontrolowaną temperaturą służą do utrzymywania temperatury podczas chowu much i krzyżówek, chyba że zaznaczono inaczej.

1. Przygotowania

  1. Przygotuj muchy.
    1. Kolekcje oocytów wzbogacone prometafazą.
      1. Wyraźne dorosłe muchy ze zdrowych, młodych stad lub kultur krzyżowych. Butelki leżakowane przez dwa dni w temperaturze 25 °C.
        UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, wystarczą dwie zdrowe butelki, chociaż w przypadku niektórych kultur krzyżowych może być potrzebnych więcej.
      2. Po dwóch dniach zbierz z butelek ~100 do 300 samic (które w tym momencie mają od 0 do 2 dni) z butelek. Kobiety nie muszą być dziewicami. Dodaj odrobinę pasty drożdżowej z boku fiolki i umieść 30 samic i 10 do 15 mężczyzn w fiolkach z drożdżami. Fiolki do leżakowania przez dwa dni w temperaturze 25 °C.
    2. Kolekcje oocytów wzbogacone metafazą.
      1. Zbierz od ~100 do 300 samic z hodowli lub krzyżówek. Dodaj odrobinę pasty drożdżowej z boku fiolki i umieść po 30 samic (bez dodatku samców) w fiolkach z drożdżami. Fiolki leżakujące przez trzy do pięciu dni w temperaturze 25 °C.
  2. Przygotuj roztwory.
    Uwaga: Roztwory można przechowywać przez czas nieokreślony w temperaturze pokojowej, chyba że zaznaczono inaczej.
    1. Przygotuj zmodyfikowany bufor Robba (5x): 500 mM HEPES, 500 mM sacharozy, 275 mM octan sodu, 200 mM octan potasu, 50 mM glukoza, 6 mM chlorek magnezu i 5 mM chlorek wapnia. Użyj 10 N 11:8 wodorotlenku sodu: wodorotlenek potasu, aby doprowadzić pH do 7,4. Sterylizować przez filtrację; Nie sterylizować w autoklawie. Przechowywać w temperaturze -20 °C. Rozmrozić w razie potrzeby, aby przygotować ~200 ml preparatu 1x Robb's na oocyt.
    2. Rozwiązania mocujące.
      1. Opcja #1: Przygotuj utrwalanie formaldehydu/heptanu. Przygotuj bufor utrwalający: 1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) plus 150 mM sacharozy. Aby użyć, przygotuj świeżość za pomocą 687,5 μl buforu utrwalającego i 312,5 μl 16% formaldehydu na oocyt prep.
        UWAGA: Nosić rękawiczki podczas używania roztworów formaldehydu w dygestorium. Utylizuj odpady zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.
      2. Opcja #2: Przygotuj utrwalanie formaldehydu/kakodylanu. Przygotuj Fix Mix: 250 mM sacharozy, 100 mM octanu potasu (pH 7,5), 25 mM octanu sodu (pH 7,0) i 25 mM EGTA (pH 8,0). Aby użyć, przygotuj świeże z 400 μl Fix Mix, 100 μl kakodylanu potasu (1 M, pH 7,2) i 500 μl 16% formaldehydu na oocyt prep.
        UWAGA: Kakodylan potasu zawiera arsen.
    3. Przygotuj PBS/Triton X-100: 1x PBS plus 1% lub 0,05% Triton X-100. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
    4. Przygotuj PBS-Tween 20-albuminę surowicy bydlęcej (BSA) (PTB): 1x PBS, 0,5% BSA (w/v) i 0,1% Tween-20. Może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez jeden tydzień.
    5. Roztwory fluorescencji hybrydyzacji in situ (FISH).
      1. Przygotuj 20X Chlorek Sodu-Cytrynian Sodu (SSC): 3 M chlorek sodu i 0,3 M cytrynian sodu.
      2. Przygotuj 2x SSC-Tween-20 (SSCT): 2x SSC plus 0,1% Tween-20. Przygotuj świeże, ~ 20 ml na przygotowanie oocytów.
      3. Przygotować roztwory formamidu: 2x SSC, 0,1% Tween-20, plus formamid. Przygotuj świeże, 1 ml 20% formamidu, 0,5 ml 40% formamidu i 2 ml 50% formamidu na oocyt przygotowany.
        UWAGA: Nosić rękawice podczas stosowania roztworów formamidu w dygestorium. Utylizuj odpady zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.
      4. Przygotuj roztwór hybrydyzacyjny: 2x SSC, 50% formamid i 10% siarczan dekstranu (w/v). Przechowywać w temperaturze 4 °C.
    6. Sondy FISH.
      1. Zamów oligonukleotydy (patrz tabela 1 dla sekwencji) z oczyszczaniem HPLC i pożądaną modyfikacją 5' fluorescencyjną (np. Cy3 lub Cy5). Zawiesić w Tris-EDTA (TE) przy 50 ng/μl.
        UWAGA: Oligonukleotydy należy chronić przed ekspozycją na światło przez cały czas.

2. Zbiór oocytów Drosophila w późnym stadium

  1. Ponieważ oocyty Drosophila z nienaruszonymi błonami przyklejają się do plastiku i szkła, należy wstępnie pokryć wnętrze jednej probówki o pojemności 5 ml i jednej pipety Pasteura na preparat oocytów PTB.
  2. Znieczulij wszystkie ~100 do 300 drożdżaków muchowych dwutlenkiem węgla i dodaj do blendera zawierającego ~100 ml 1x Robb's Buffer. Pulsuj trzy razy (~1 sekunda każdy). Trzymaj oocyty w Robb's przez <20 minut, aby uniknąć aktywacji.
    UWAGA: Alternatywnie, oocyty mogą być ręcznie preparowane od samic. Zaletą tej metody jest to, że wymaga mniej samic. Należy jednak zachować ostrożność, aby ograniczyć narażenie na dwutlenek węgla do zaledwie kilku minut, aby uniknąć artefaktów związanych z niedotlenieniem7.
  3. Przefiltrować przez duże oczka (~1,500 μm) do zlewki o pojemności 250 ml, aby usunąć duże części ciała. Jeśli na siatce pozostało wiele nienaruszonych brzuchów, ponownie zmiel materiał za pomocą dodatkowego bufora Robba i ponownie przefiltruj. Pozostaw na ~ 2 minuty, a następnie odessaj górną warstwę, usuwając jak najwięcej dużych części ciała.
  4. Przefiltrować przez małe oczka (~300 μm) do zlewki o pojemności 250 ml. Wypłucz pozostałe oocyty z pierwszej zlewki za pomocą dodatkowej pipety Robba i powlekanej pipety Pasteura. Niech się uspokoi ~ 3 min; oocyty ulegną ustabilizowaniu. Odessać wszystko oprócz ~10 ml.
  5. Wlej tyle 10 ml, ile zmieści się w powlekanej tubce o pojemności 5 ml. Pozostaw do osadzenia, usuń płyn i powtórz z pozostałą częścią. Wypłucz pozostałe oocyty ze zlewki za pomocą dodatkowej pipety Robba i powlekanej pipety Pasteura. Pozostaw w probówce o pojemności 5 ml na ~ 3-5 minut.

3. Leczenie farmakologiczne (opcjonalnie)

  1. Pokryj drugą probówkę o pojemności 5 ml PTB dla każdego preparatu oocytów. Dodaj odpowiedni rozpuszczalnik (kontrola) lub lek do 1 ml Robb's każdy na każdy preparat oocytów (Tabela 2).
  2. Podziel oocyty na drugą powlekaną probówkę o pojemności 5 ml. Pozostaw do spoczynku, usuń płyn i dodaj 1 ml rozpuszczalnika Robb's plus do jednej probówki i 1 ml leku Robb's plus do drugiej probówki. Nutian przez odpowiedni czas do leczenia farmakologicznego (Tabela 2). Niech się uspokoi.

4. Fiksacja

  1. Odessać cały płyn i natychmiast dodać 1 ml Fix.
  2. Opcja #1: Utrwalanie formaldehydu/heptanu (bufor utrwalający plus 5% formaldehydu).
    1. Mocuj przez 2,5 minuty na nutatorze. Dodaj 1 ml heptanu i wiruj 1 min. Odstawić ~1 min.
    2. Usuń cały płyn, a następnie dodaj 1 ml 1x PBS. Wir 30 sek. Odstawić ~1 min.
    3. Usuń cały płyn, a następnie napełnij probówkę 1x PBS.
      UWAGA: Oocyty można wykorzystać natychmiast lub przechowywać na nutatorze przez kilka godzin w temperaturze pokojowej.
  3. Opcja #2: Utrwalanie formaldehydu/kakodylu (Fix Mix plus 8% formaldehydu i 100 mM kakodylatu).
    1. Fix przez 6 minut na nutatorze. Odstaw na 2 minuty. Usuń płyn, a następnie napełnij probówkę 1x PBS.
      UWAGA: Oocyty można wykorzystać natychmiast lub przechowywać na nutatorze przez kilka godzin w temperaturze pokojowej.

5. Usuwanie membran ("Rolling")

  1. Używając powlekanej pipety Pasteura, dodaj ~500 do 1,000 oocytów do matowej (piaskowanej) części szkiełka podstawowego. Usuń wszystkie części ciała i obce materiały za pomocą kleszczy. Nie pozwól, aby oocyty wyschły; dodaj 1x PBS w razie potrzeby.
  2. Umieść szkiełko nakrywkowe na oocytach i delikatnie "zwijaj" oocyty, aż wszystkie błony zostaną usunięte (najlepiej sprawdza się przeciąganie krawędzi szkiełka nakrywkowego po oocytach). Okresowo sprawdzaj postęp pod mikroskopem, dodając w razie potrzeby więcej 1x PBS. Uważaj, ponieważ zbyt duży nacisk zniszczy oocyty.
    UWAGA: Tylko w przypadku immunofluorescencji przejdź do kroku 6. W przypadku FISH (z immunofluorescencją lub bez) przejdź do kroku 7.

6. Barwienie przeciwciał oocytów Drosophila

  1. Ekstrakcja i blokowanie
    1. Zwinięte oocyty przepłukać do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej ~15 ml PBS/1% Triton X-100. Nutować oocyty w tym roztworze nie krócej niż 1,5 godziny i nie dłużej niż 2 godziny. Ten krok umożliwia penetrację przeciwciał.
    2. Pozwól oocytom osiąść ~2 min. Usuń płyn wraz z jak największą liczbą błon, a następnie dodaj PBS/0,05% Triton X-100,
      UWAGA: Błony osiadają wolniej niż zwinięte oocyty.
    3. Pozwól oocytom osiąść ~ 2 minuty, a następnie usuń wszystko oprócz ~ 1 ml płynu. Przenieś oocyty do wyskalowanej probówki o pojemności 1,5 ml i usuń pozostały płyn. Dodaj 1 ml PTB do blokowania i nutowania przez 1 godzinę.
  2. Barwienie przeciwciał
    1. Wstępne wchłanianie drugorzędowych przeciwciał przeciwko zarodkom.
      UWAGA: Ten krok eliminuje barwienie tła z niespecyficznych interakcji przeciwciał z białkami Drosophila.
      1. Pobieranie i utrwalanie zarodków Drosophila (~25 μl) zgodnie z typową procedurą8. Przechowywać w metanolu w temperaturze -20 °C.
      2. Usunąć metanol z zarodków, dodać 800 μl metanolu plus 200 μl 1x PBS i nutować przez 15 min. Usunąć 500 μl supernatantu i zastąpić 500 μl 1x PBS. Następnie nutuj przez 15 minut. Powtórz dwa razy (w sumie ~1 godzina prania), a następnie zakończ w PTB.
        UWAGA: Zarodki mogą być wykorzystane natychmiast lub trzymane na nutatorze przez kilka godzin w temperaturze pokojowej.
      3. Usunąć płyn, napełnić PTB do 200 μl na preparat oocytów i dodać znakowane fluorescencyjnie przeciwciała drugorzędowe w odpowiednich rozcieńczeniach (pamiętając, że końcowa objętość wyniesie 300 μl; patrz krok 7.4). Nutować w temperaturze 4 °C przez noc (najlepiej) lub w temperaturze pokojowej przez 3 do 4 godzin.
        UWAGA: Wstępnie wchłonięte przeciwciała zostaną użyte w kroku 6.2.4.
        UWAGA: Próbki należy przechowywać w ciemności tak długo, jak to możliwe po dodaniu przeciwciał fluorescencyjnych.
    2. Usunąć płyn z oocytów, napełnić PTB do 300 μl i dodać przeciwciała pierwszorzędowe w odpowiednich rozcieńczeniach. Nutować w temperaturze 4 °C przez noc (preferowane) lub w temperaturze pokojowej przez 3 do 4 godzin.
    3. Płucz oocyty cztery razy po 15 minut każdym 1 ml PTB.
    4. Usunąć płyn z oocytów, dodać 200 μl supernatantu z zarodków (wstępnie wchłonięte przeciwciała drugorzędowe). Następnie napełnij PTB do 300 μl. Nutować w temperaturze pokojowej przez 3 do 4 godzin (najlepiej) lub w temperaturze 4 °C przez noc.
    5. Myj oocyty raz przez 15 minut 1 ml PTB, usuń płyn. Następnie dodać 0,5 μl Hoechst 33342 i 500 μl PTB i nutować przez 7 min.
    6. Płukać oocyty dwukrotnie przez 15 minut każdy 1 ml PTB.
      UWAGA: Oocyty mogą być natychmiast zamontowane na szkiełku podstawowym lub mogą być przechowywane w PTB w temperaturze 4 °C do czasu uzyskania gotowości do obrazowania.

7. FISH (Kontynuuj od kroku 5 powyżej)

  1. Przepłukać zwinięte oocyty do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej ~15 ml 2x SSCT. Niech oocyty osiądą ~2 min. Usuń wszystko oprócz ~0,5 ml płynu wraz z jak największą liczbą membran.
    UWAGA: Błony osiadają wolniej niż zwinięte oocyty.
  2. Przenieś oocyty do probówki o pojemności 0,5 ml i usuń pozostały płyn. Kolejno dodawać i usuwać 500 μl roztworów formamidu 20%, 40% i 50%, nutując przez 10 minut w każdym roztworze.
    UWAGA: Oocyty wolniej się osadzają przy wyższej zawartości procentowej formamidu.
  3. Usunąć płyn, a następnie dodać 500 μl 50% roztworu formamidu i nutować w temperaturze 37 °C przez 1 do 5 godzin.
    UWAGA: Dłuższe inkubacje skutkują lepszą penetracją sondy.
  4. Usunąć płyn, pozostawiając nie więcej niż ~100 μl oocytów, i dodać 36 μl roztworu hybrydyzacyjnego plus 2 μl sondy (50 ng/μl) i 2 μl wody lub 2 μl drugiej sondy (Tabela 1).
  5. Inkubować w temperaturze 91 °C przez 3 minuty (tylko FISH) lub w temperaturze 80 °C przez 20 minut (FISH plus immunofluorescencja), a następnie inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez noc.
    UWAGA: Te czynności można wykonać w termocyklerze.
  6. Nie usuwaj płynu. Dodać 500 μl 50% roztworu formamidu i nutować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
  7. Pozostawić do spoczynku, usunąć płyn, dodać 500 μl 50% roztworu formamidu i nutować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
  8. Pozostawić do spoczynku, usunąć płyn, dodać 500 μl 20% roztworu formamidu i nutować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
  9. Wykonaj trzy szybkie płukania w 500 μl 2x SSCT (pozwól osiąść, wyjąć, następnie dodaj płyn, odwróć kilka razy, powtórz.) Pozostaw do spoczynku, usuń płyn, a następnie dodaj 500 μl PTB i nutate przez 4 godziny.

8. Barwienie przeciwciał po FISH

  1. Usunąć płyn z oocytów, napełnić PTB do 300 μl i dodać 10 μl przeciwciała anty-α-tubuliny sprzężonego z FITC. Alternatywnie można zastosować inne przeciwciała, zgodnie z powyższym protokołem. Nutate w temperaturze pokojowej przez noc.
  2. Płukać oocyty raz przez 15 min 500 μl PTB, usunąć płyn, następnie dodać 0,5 μl Hoechst 33342 i 500 μl PTB i nutować przez 7 min.
  3. Przemyj oocyty dwukrotnie przez 15 minut każdy 500 μl PTB.
    UWAGA: Oocyty mogą być natychmiast zamontowane na szkiełku podstawowym lub mogą być przechowywane w PTB w temperaturze 4 °C do czasu uzyskania gotowości do obrazowania. Utrzymuj oocyty w ciemności tak długo, jak to możliwe po dodaniu przeciwciał fluorescencyjnych.
TGL jedn. powiedział:
Powtórz nazwęChromosomSekwencja oligologyczna*
Okręg wyborczy 359ZGGGATCGTTAGCACTGGTAATTAGCTGC powiedział:
AACAC (Organizacja Zarządzania Kryzysowegocyfra arabskaAACACAACACAACAACAACAACAACAACAACAACAACAC
Dodeca powiedział:3CCCGTACTGGTCCCGTACTCGGTCCCGTCGGT
1,6862+3AATAACATAGAATAACATAGAATAACATAG
AATAT (Sieć Ratratów)4(+Y)AATATAATAATATAATATAATATATAATAT
*359 sekwencja od Erica Joyce'a, komunikacja osobista, inne sekwencje od Sullivana i wsp.8

Tabela 1: Sondy FISH dla powtórzeń centromerowych Drosophila.

lekrozpuszczalnikKoncentracja zapasówKońcowe stężenieCzas zabieguefekt
kolchicynaetanol125 mM150 μM10 min lub 30 mindestabilizować mikrotubule niekinetochorowe (10 min)9 lub wszystkie (30 min) mikrotubule
PaklitakselDmso10 mM10 μMCzas trwania: 10 minstabilizują mikrotubule
Binukleina 2Dmso25 mM25 μMCzas trwania: 20 minhamują kinazę Aurora B10

Tabela 2: Leczenie farmakologiczne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Opisane tutaj metody pozwolą na wyizolowanie późnych oocytów Drosophila reprezentujących trzy stadia mejozy (Rysunek 1). Oocyty w profazie wyróżniają się obecnością otoczki jądrowej, co objawia się brakiem sygnału tubuliny w obszarze otaczającym kariosom (Rysunek 1A). Prometafaza to okres po rozpadzie otoczki jądrowej, podczas którego formuje się wrzeciono podziałowe. W prometafazie kariosom przyjmuje charakterystyczny kształt, stając się wydłużo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Klasyfikacja oocytów Drosophila

Chociaż wydłużony kariosom jest często obserwowany w oocytach prometafazy, użycie kształtu kariosomu do odróżnienia oocytów prometafazy od metafazy może być problematyczne. Podczas prometafazy kariosom zaczyna się jako okrągły kształt, wydłuża się, a następnie cofa do okrągłego kształtu, gdy oocyt zbliża się do zatrzymania metafazy. Oznacza to, że wiele oocytów prometafazy nie ma wydłużonego kariosomu. Ponadto, jeśli badane są zmutowane...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Christianowi Lehnerowi za dostarczenie przeciwciała CENP-C i Ericowi Joyce'owi za rekomendacje dotyczące FISH. Prace w laboratorium McKima zostały sfinansowane z grantu NIH (GM101955).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówki stożkowe 15 mlRóżne
16% formaldehydTed Pella, Inc.18505NIEBEZPIECZNE; po otwarciu wyrzucić po miesiącu
Zlewki o pojemności 250 mlRóżne
probówki 5 mlRóżne
aktywne suche drożdżeRóżnewymieszać z wodą, aby uzyskać pastę o konsystencji masła orzechowego
przeciwciało anty-&alfa-tubulinowe sprzężone z klonem FITCSigmaF2168DM1A
Binukleina 2SigmaB1186NIEBEZPIECZNY
blenderRóżne
albuminy surowicy bydlęcejSigmaA4161
chlorek wapniaRóżne
kolchicynaSigmaC-9754NIEBEZPIECZNE
szkiełka nakrywkoweVWR48366-227Nr 1 1/2
siarczan dekstranuRóżne
DMSORóżne
EGTARóżne
etanoleRóżne
kleszczeTed Pella, Inc.5622Pęseta Dumont o wysokiej precyzji klasy 5
formamidSigma47670-250ML-F
szkiełkapodstawowe VWR48312-003
glukozaRóżne
probówki z podziałką 1,5 mlRóżne
HEPESVWREM-5330dostępne u kilku sprzedawców
Hoechst 33342Różne
chlorki magnezuRóżne
metanoleRóżne
duże oczka (~ 1,500 &; m)VWRAA43657-NKi inni dostawcy, małe siatki 12 lub 14 (
~ 300 i mikro; m)Spectrum labs146 424różne formaty, np. , 146 422 lub 146 486
nutatorRóżne
pipety PasteuraRóżne
octany potasuRóżne
Kwas kakodylowySigmaC0125NIEBEZPIECZNY; alternatywnie kakodylan sodu może być zastąpiony
potasem wodorotlenekRóżne
octany soduRóżne
chlorki soduRóżne
cytrynian soduRóżne
wodorotlenki soduRóżne
sacharozyRóżne
taksol (paklitaksel)SigmaT1912NIEBEZPIECZNE
Triton X-100FisherPI-28314
Tween 20FisherPI-28320
wirRóżne
Różnorodność formatów

Bibliografia

  1. Bridges, C. B. Non-disjunction as proof of the chromosome theory of heredity. Genetics. 1 (1), 1-52 (1916).
  2. Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).
  3. Theurkauf, W. E., Hawley, R. S. Meiotic spindle assembly in Drosophila females: behavior of nonexchange chromosomes and the effects of mutations in the nod kinesin-like protein. J Cell Biol. 116 (5), 1167-1180 (1992).
  4. Zou, J., Hallen, M. A., Yankel, C. D., Endow, S. A. A microtubule-destabilizing kinesin motor regulates spindle length and anchoring in oocytes. J Cell Biol. 180 (3), 459-466 (2008).
  5. Dernburg, A. F., Sedat, J. W., Hawley, R. S. Direct evidence of a role for heterochromatin in meiotic chromosome segregation. Cell. 86 (1), 135-146 (1996).
  6. Gilliland, W. D., Hughes, S. F., Vietti, D. R., Hawley, R. S. Congression of achiasmate chromosomes to the metaphase plate in Drosophila melanogaster oocytes. Dev Biol. 325 (1), 122-128 (2009).
  7. Gilliland, W. D., et al. Hypoxia transiently sequesters mps1 and polo to collagenase-sensitive filaments in Drosophila prometaphase oocytes. PLoS One. 4 (10), e7544(2009).
  8. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. Drosophila Protocols. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
  9. Radford, S. J., Hoang, T. L., Głuszek, A. A., Ohkura, H., McKim, K. S. Lateral and End-On Kinetochore Attachments Are Coordinated to Achieve Bi-orientation in Drosophila Oocytes. PLoS Genet. 11 (10), e1005605(2015).
  10. Smurnyy, Y., Toms, A. V., Hickson, G. R., Eck, M. J., Eggert, U. S. Binucleine 2, an isoform-specific inhibitor of Drosophila Aurora B kinase, provides insights into the mechanism of cytokinesis. ACS Chem Biol. 5 (11), 1015-1020 (2010).
  11. Mahowald, A. P., Goralski, T. J., Caulton, J. H. In vitro activation of Drosophila eggs. Dev Biol. 98 (2), 437-445 (1983).
  12. Page, A. W., Orr-Weaver, T. L. Activation of the meiotic divisions in Drosophila oocytes. Dev Biol. 183 (2), 195-207 (1997).
  13. Tavosanis, G., Llamazares, S., Goulielmos, G., Gonzalez, C. Essential role for gamma-tubulin in the acentriolar female meiotic spindle of Drosophila. EMBO J. 16 (8), 1809-1819 (1997).
  14. Endow, S. A., Komma, D. J. Spindle dynamics during meiosis in Drosophila oocytes. J Cell Biol. 137 (6), 1321-1336 (1997).
  15. Matthies, H. J., Clarkson, M., Saint, R. B., Namba, R., Hawley, R. S. Drosophila Protocols. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 67-85 (2000).
  16. Colombié, N., et al. Dual roles of Incenp crucial to the assembly of the acentrosomal metaphase spindle in female meiosis. Development. 135 (19), 3239-3246 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Montaż wrzecionazachowanie chromosomówusuwanie błonimmunofluorescencjamikroskopia konfokalnapenetracja przeciwciałfiksacja oocytówanaliza karyosomu
Techniki obrazowania prometafazy i metafazy mejozy I w utrwalonych oocytach Drosophila
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.