Badania morfogenezy neuronów za pomocą neuronów dendrytycznych larw Drosophila korzystają z wizualizacji in situ białek neuronalnych i naskórkowych za pomocą immunofluorescencji. Opisujemy procedurę, która poprawia analizę immunofluorescencyjną neuronów da i otaczających komórek naskórka poprzez usunięcie tkanki mięśniowej ze ściany ciała larwy.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Usuwanie tkanki mięśniowej Drosophila z filetów larwalnych w celu analizy immunofluorescencyjnej neuronów czuciowych i komórek naskórka
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Neurony dendrytyczne larwalne (da) larwalne Drosophila są popularnym modelem do badania mechanizmów morfogenezy neuronów. Neurony Da rozwijają się w komunikacji z komórkami naskórka, które unerwiają, a zatem ich analiza korzysta z wizualizacji in situ białek wyrażanych zarówno neuronalnie, jak i naskórkowo za pomocą immunofluorescencji. Tradycyjne metody przygotowania filetów larwalnych do eksperymentów immunofluorescencyjnych pozostawiają nienaruszoną tkankę mięśniową, która pokrywa większość ściany ciała, co stanowi kilka wyzwań dla obrazowania białek neuronalnych i naskórkowych. W tym miejscu opisujemy metodę usuwania tkanki mięśniowej z filetów larwalnych Drosophila. Protokół ten umożliwia obrazowanie białek, które w przeciwnym razie byłyby zasłonięte przez tkankę mięśniową, poprawia stosunek sygnału do szumu i ułatwia wykorzystanie mikroskopii superrozdzielczej do badania rozwoju neuronów.
Wprowadzenie
Neurony dendrytyczne larwalne (da) Drosophila dostarczają cennego modelu do badania rozwoju neuronów ze względu na ich podatność na manipulacje genetyczne i łatwość, z jaką można je obrazować. Te neurony czuciowe odegrały zasadniczą rolę w identyfikacji licznych szlaków kontrolujących morfogenezę dendrytów1-3.
Badania mające na celu określenie, jak takie czynniki neuronalne i pozaneuronalne kontrolują morfogenezę dendrytów, korzystają z możliwości wykrywania ekspresji białek in situ za pomocą immunofluorescencji. Zewnętrzny naskórek larwy jest nieprzepuszczalny dla przeciwciał, ale przeszkoda ta może być łatwo pokonana przez przygotowanie filetów larwalnych za pomocą dobrze znanych metod preparacji10,11. Jednak tkanka mięśniowa ściany ciała, która leży tuż wewnątrz błony podstawnej, stwarza kilka wyzwań w kierunku wizualizacji neuronów da i komórek naskórka. Po pierwsze, tkanka mięśniowa, która wyściela większość ściany ciała, znacznie zasłania sygnały fluorescencyjne emanujące z tkanki neuronalnej lub naskórka. To znacznie zmniejsza stosunek sygnału do szumu w próbce. Po drugie, wiele istotnych białek może ulegać ekspresji w tkance mięśniowej, a także w neuronach lub naskórku. Ten sygnał fluorescencyjny pochodzący z mięśni prawdopodobnie jeszcze bardziej zaciemni wykrywanie sygnału fluorescencyjnego z neuronu lub naskórka. Wreszcie, postępy w technologiach mikroskopowych pozwalają obecnie na obrazowanie próbek w rozdzielczości subdyfrakcyjnej i mogą być szczególnie pomocne w rozpoznawaniu lokalizacji białek, które ulegają ekspresji w neuronach i otaczających komórkach naskórka12,13. Jednak obrazowanie za pomocą mikroskopii superrozdzielczej korzysta z silnego stosunku sygnału do szumu i bliskiej odległości próbki od szkiełka nakrywkowego. Oprócz zmniejszenia stosunku sygnału do szumu, mięsień ściany ciała larwy oddala neurony od szkiełka nakrywkowego, ograniczając w ten sposób lepszą rozdzielczość obrazu, którą można osiągnąć za pomocą metod mikroskopii superrozdzielczej. Oprócz wyzwań związanych z analizą immunofluorescencyjną, tkanka mięśniowa stanowi barierę dla zapisu elektrofizjologicznego z neuronów czuciowych w ścianie ciała larwy. Jego usunięcie jest zatem korzystne dla neurofizjologicznej manipulacji neuronami czuciowymi14.
Tutaj opisana jest metoda ręcznego usuwania tkanki mięśniowej larw Drosophila. Pokazujemy, że nasz protokół pozwala na obrazowanie immunofluorescencyjne białek, które w przeciwnym razie są zasłonięte przez tkankę mięśniową, poprawia stosunek sygnału do szumu do wizualizacji neuronów da klasy IV i umożliwia zastosowanie mikroskopii superrozdzielczej w celu lepszego rozróżniania relacji przestrzennych białek i struktur komórkowych w neuronach da i naskórku.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Uwaga: Procedura usuwania mięśni (Rysunek 1) jest modyfikacją wcześniej opisanych metod przygotowania filetów larwalnych. Kroki, które poprzedzają i następują po usunięciu mięśni, są pokrótce przedstawione, a czytelnik jest odsyłany do poprzednich prac 10, 11 w celu uzyskania bardziej szczegółowych opisów.
1. Rozkrój larwy w zimnej soli fizjologicznej
- Przygotować robocze rozcieńczenie zimnego roztworu soli fizjologicznej HL3.115 lub zimnego roztworu soli fizjologicznej11 HL3.1 wolnego od Ca2+ (Tabela 1). Umieść larwę w naczyniu z elastomeru silikonowego z taką ilością zimnego soli fizjologicznej, aby pokryć dno naczynia.
UWAGA: Zobacz Dyskusja dotycząca wyboru soli fizjologicznej.
| 1x HL3.1 sól fizjologiczna (pH 7,2) |
| 5 mM SZYBY SZARE |
| 70 mM NaCl |
| 5 mM KCl |
| 1,5 mM CaCl2 (pominąć dla soli fizjologicznej bez Ca2+) |
| 4 mM MgCl2 |
| 10 mM NaHCO3 |
| 5 mM trehalozy |
| 115 mM sacharozy |
| Filtrować, sterylizować i przechowywać w temperaturze 4 °C |
| Uwaga: Kompozycja naśladuje hemolimfę owada |
Tabela 1. Skład zimnej soli fizjologicznej.
- Ustaw larwę brzuszną stroną do góry. Brzuszną powierzchnię larwy można rozpoznać po brzusznych pasach zębowych, a stronę grzbietową po pierwotnych rurkach tchawicy larwalnej biegnących od przedniej do tylnej. Rozciągnij larwę w kierunku przednio-tylnym i przypnij głowę i ogon do naczynia preparacyjnego z elastomeru silikonowego za pomocą szpilek do owadów. Użyj cienkich nożyczek do preparowania, aby ciąć wzdłuż brzusznej linii środkowej, zaczynając od jednego końca i postępując w kierunku drugiego.
UWAGA: Ta orientacja zachowuje powszechnie badane grzbietowe skupisko neuronów da. - Po rozcięciu larwy przypnij cztery rogi do naczynia preparacyjnego, tak jakbyś otwierał książkę. Użyj kleszczy, aby chwycić i usunąć narządy wewnętrzne, w tym OUN, jelito i tchawicę. Wyreguluj szpilki owadów tak, aby filet był napięty, ale nie maksymalnie rozciągnięty.
UWAGA: Mięśnie są zakotwiczone w ścianie ciała na granicach segmentów. Chociaż mięśnie pokrywają większość ściany ciała, są nieobecne w wąskim obszarze w pobliżu grzbietowej linii środkowej.
2. Usuwanie mięśni
- Zlokalizuj grzbietową linię środkową larwy, w której nie ma tkanki mięśniowej. Ustaw pojedynczy ząb kleszczowy tak, aby można go było włożyć pod tkankę mięśniową w możliwie najbardziej płaskiej orientacji.
- Zaczynając od grzbietowej linii środkowej, w pobliżu przedniej granicy segmentu, ostrożnie wsuń kleszcze między mięsień a naskórek, uważając, aby zminimalizować kontakt kleszczyków z naskórkiem.
- Pociągnij kleszcze do góry, aby zerwać przyczep mięśnia do ściany ciała w jednym punkcie kotwiczenia. Powtórz ten proces dla pozostałych segmentów półkuli będących przedmiotem zainteresowania.
UWAGA: Ten protokół optymalizuje zachowanie tylnej części każdego pola dendrytowego neuronu da. Aby zachować przednią część pola dendrytowego, najlepiej jest umieścić bolec kleszczowy na tylnym końcu każdego segmentu. - Ponownie wyreguluj szpilki owadów tak, aby filet larwalny był maksymalnie rozciągnięty we wszystkich kierunkach.
- Utrwal filet, gdy jest jeszcze przypięty do naczynia preparującego, używając zimnego, świeżo przygotowanego 4% formaldehydu w PBS przez 25 minut.
- Spłucz 5 razy w PBS.
- Za pomocą kleszczy ostrożnie odciągnij tkankę mięśniową od pozostałych punktów kotwiczenia, uważając, aby zminimalizować kontakt z naskórkiem.
- Odpiąć filet i wyjąć go z naczynia preparacyjnego do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Wykonaj wszystkie kolejne etapy mycia, blokowania i barwienia immunofluorescencyjnego, jak opisano wcześniej11.
3. Zamontuj filet larwalny
- Najpierw usuń głowę i ogon za pomocą cienkich nożyczek preparacyjnych, aby próbka była jak najbardziej płaska. Zamocować filet na szkiełku nakrywkowym w utrwalaczu zapobiegającym blaknięciu, tak aby wewnętrzna powierzchnia fileta była skierowana w stronę szkiełka nakrywkowego.
- Umieść szkiełko mikroskopowe na szkiełku nakrywkowym i delikatnie dociśnij, aby rozproszyć medium mocujące. Odwróć szkiełko mikroskopu i uszczelnij szkiełko nakrywkowe na szkiełku za pomocą lakieru do paznokci. Preparaty można przechowywać w temperaturze -20 °C przez co najmniej jeden miesiąc.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Przedstawiamy użyteczność procedury usuwania mięśni w celu poprawy stosunku sygnału do szumu w eksperymentach z immunofluorescencją, aby umożliwić jednoczesną wizualizację białek złączy szczelinowych Coracle (Cora) i Discs-large (Dlg) wraz z neuronami da klasy IV znakowanymi markerem błonowym CD4-tdTomato.
Białko Cora było wcześniej wykorzystywane do identyfikacji pasm, w których dendryty neuronów da są otoczone przez komórki epidermy, i jest jednym z wielu zid...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W tym miejscu opisano protokół ręcznego usuwania tkanki mięśniowej z filetów larwalnych Drosophila . Protokół ten modyfikuje wcześniej opisane techniki preparacji larw10,11. Po wycięciu larwy w naczyniu z elastomeru silikonowego znajduje się grzbietowa linia środkowa. Pojedynczy ząb kleszcza, w możliwie najbardziej płaskiej orientacji, jest ostrożnie wprowadzany między tkankę mięśniową a naskórek, w pobliżu grzbietowej linii środkowej. Kleszcze są delikatnie ciągnięte do góry, aby oddzielić tkankę mię...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Dziękujemy Gary'emu Laevsky'emu za pomocne dyskusje na temat mikroskopii. Ta praca została sfinansowana z grantów NIH R01GM061107 i R01GM067758 dla E.R.G.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Pęseta Dumont #5 | Mikroskopia elektronowa Sciences | 72701-D | |
| Mikronożyczki, 8 cm, proste, ostrza 5 mm, końcówki 0,1 mm | World Precision Instruments | 14003 | |
| Zestaw elastomerów silikonowych Sylgard 184 | Dow Corning | 3097358-1004 | do płytek preparacyjnych |
| Szpilki do owadów Austerlitz, 0,1 mm | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Źródło światła Fostec 8375 | Artisan Technology Group | 62792-4 | |
| Zeiss Stemi 2000 | Carl Zeiss Microscopy | ||
| Vectashield antifade medium montażowe | Vector Laboratories | H-1000 | do mikroskopii konfokalnej |
| Prolong Diamentowy uchwyt zapobiegający blaknięciu | Life Technologies | P36970 | do mikroskopii oświetlenia strukturalnego |
| Szkło nakrywkowe z mikro, 22 x 22 mm, nr 1,5 | VWR | 48366-227 | |
| Superfrost Plus, 25 x 75 x 1,0 mm | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Mysie przeciwciało anty-Coracle | Badania rozwojowe Supernatant Hybridoma Bank | C615.16 | , rozcieńczony 1:50 |
| Mysie przeciwciało anty-Disc | duże Badania rozwojowe Hybridoma Bank | 4F3 | supernatant, rozcieńczony 1:50 |
| Królik anty-dsCzerwone przeciwciało | Clontech | 632496 | rozcieńczone 1:1,000 |
| Przeciwciało anty-królicze Kozi, Alexa Fluor 568 sprzężone | ThermoFisher Scientific | A-11011 | rozcieńczone 1:1,000 |
| Przeciwciało anty-mysie Koza, Alexa Fluor 488 sprzężone | ThermoFisher Scientific | A-11001 | rozcieńczone 1:500 |
Bibliografia
- Jan, Y. N., Jan, L. Y. Branching out: mechanisms of dendritic arborization. Nat Rev Neurosci. 11 (5), 316-328 (2010).
- Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila. Development. 136 (7), 1049-1061 (2009).
- Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim, M. D., Jan, Y. N. Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling of dendritic fields. Annu Rev Neurosci. 30, 399-423 (2007).
- Kim, M. E., Shrestha, B. R., Blazeski, R., Mason, C. A., Grueber, W. B. Integrins establish dendrite-substrate relationships that promote dendritic self-avoidance and patterning in Drosophila sensory neurons. Neuron. 73 (1), 79-91 (2012).
- Han, C., et al. Integrins regulate repulsion-mediated dendritic patterning of Drosophila sensory neurons by restricting dendrites in a 2D space. Neuron. 73 (1), 64-78 (2012).
- Parrish, J. Z., Xu, P., Kim, C. C., Jan, L. Y., Jan, Y. N. The microRNA bantam functions in epithelial cells to regulate scaling growth of dendrite arbors in Drosophila sensory neurons. Neuron. 63 (6), 788-802 (2009).
- Jiang, N., Soba, P., Parker, E., Kim, C. C., Parrish, J. Z. The microRNA bantam regulates a developmental transition in epithelial cells that restricts sensory dendrite growth. Development. 141 (13), 2657-2668 (2014).
- Meltzer, S., et al. Epidermis-derived Semaphorin promotes dendrite self-avoidance by regulating dendrite-substrate adhesion in Drosophila sensory neurons. Neuron. 89 (4), 741-755 (2016).
- Han, C., et al. Epidermal cells are the primary phagocytes in the fragmentation and clearance of degenerating dendrites in Drosophila. Neuron. 81 (3), 544-560 (2014).
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ dissection. J Vis Exp. (24), (2009).
- Karim, M. R., Moore, A. W. Morphological analysis of Drosophila larval peripheral sensory neuron dendrites and axons using genetic mosaics. J Vis Exp. (57), e3111(2011).
- Gustafsson, J. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Ashdown, G. W., Cope, A., Wiseman, P. W., Owen, D. M. Molecular flow quantified beyond the diffraction limit by spatiotemporal image correlation of structured illumination microscopy data. Biophys J. 107 (9), L21-L23 (2014).
- Zhang, W., Yan, Z., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Sound response mediated by the TRP channels NOMPC, NANCHUNG, and INACTIVE in chordotonal organs of Drosophila larvae. PNAS. 10 (33), 13612-13617 (2013).
- Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. J Neurogenet. 18 (2), 377-402 (2004).
- Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae. Curr Biol. 19 (10), 799-806 (2009).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
