Artykuł metodologiczny

Równoległy pomiar ekspresji genów zegara okołodobowego i wydzielania hormonów w pierwotnych hodowlach komórkowych człowieka

DOI:

10.3791/54673

⸱

11 listopada 2016

 ,  ,  , 
1Department of Medical Specialties, Division of Endocrinology, Diabetes, Hypertension and Nutrition, Diabetes Center, University of Geneva Medical School, Institute of Genetics and Genomics in Geneva (iGE3), 2Population Epidemiology Unit (UEP), Community Medicine, Geneva University Hospital

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy ustawienia do równoległego monitorowania bioluminescencji okołodobowej i aktywności wydzielniczej ludzkich komórek wysp trzustkowych i pierwotnych miotub. W tym celu zastosowaliśmy dostarczanie genu lentiwirusowego za pomocą reportera zegara rdzeniowego lucyferazy, a następnie synchronizację in vitro i zbieranie pożywki odpływowej przez ciągłą peryfuzję komórek.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zegary okołodobowe działają we wszystkich organizmach wrażliwych na światło, umożliwiając adaptację do świata zewnętrznego poprzez przewidywanie codziennych zmian środowiska. W ciągu ostatniej dekady w naszej wiedzy na temat ścisłego związku między zegarem okołodobowym a większością aspektów fizjologii poczyniono w tej dziedzinie. Jednak odkrycie molekularnych podstaw, które leżą u podstaw funkcji oscylatora okołodobowego u ludzi, pozostaje najwyższym wyzwaniem technicznym. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy opis eksperymentalnego podejścia do długoterminowego (2-5 dni) zapisu bioluminescencji i zbierania pożywki odpływowej w hodowanych ludzkich komórkach pierwotnych. W tym celu przeprowadziliśmy transdukcję komórek pierwotnych za pomocą reportera lucyferazy lentiwirusowej, który jest pod kontrolą promotora genu zegara rdzeniowego, co pozwala na równoległą ocenę wydzielania hormonów i bioluminescencji okołodobowej. Ponadto opisujemy warunki zakłócenia zegara okołodobowego w pierwotnych komórkach ludzkich poprzez transfekcję siRNA ukierunkowanego na ZEGAR. Nasze wyniki dotyczące dobowej regulacji wydzielania insuliny przez ludzkie wyspy trzustkowe i wydzielania miokin przez ludzkie komórki mięśni szkieletowych przedstawiono tutaj, aby zilustrować zastosowanie tej metodologii. Ustawienia te można wykorzystać do badania składu molekularnego ludzkich zegarów peryferyjnych i do analizy ich funkcjonalnego wpływu na komórki pierwotne w warunkach fizjologicznych lub patofizjologicznych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

System pomiaru czasu okołodobowego (z łaciny "Circa diem") pojawił się u wszystkich organizmów wrażliwych na światło, jako mechanizm adaptacyjny do ruchu obrotowego Ziemi. U ssaków jest zorganizowany w sposób hierarchiczny, obejmujący zegar centralny, który znajduje się w jądrze nadskrzyżowaniowym brzusznego podwzgórza oraz oscylatory obwodowe (lub niewolnicze), które działają w różnych narządach. Co więcej, te autonomiczne oscylatory samopodtrzymujące się działają w prawie każdej komórce ciała 1. Sygnały fototyczne stanowią dominującą wskazówkę synchronizującą (Zeitgeber) dla neuronów SCN, podczas gdy sygnały neuronalne i humoralne emanujące z SCN resetują zegary peryferyjne. Ponadto rytmy spoczynkowo-aktywne, które z kolei napędzają cykle karmienia i postu, są kolejnymi synchronizatorami dla zegarów peryferyjnych 2. Zgodnie z naszym obecnym zrozumieniem, skład molekularny zegara rdzeniowego opiera się na transkrypcyjnych i translacyjnych pętlach sprzężenia zwrotnego, które są zachowane między organizmami. Obejmuje on aktywatory transkrypcji BMAL1 i CLOCK, które razem aktywują transkrypcję ujemnych genów PER i CRY zegara rdzeniowego. Wysoki poziom białek PER i CRY hamuje ich własną transkrypcję poprzez hamowanie kompleksu BMAL1/CLOCK. Pętla pomocnicza składa się z receptorów jądrowych REV-ERB i OR, które również regulują transkrypcję BMAL1 i CLOCK. Ponadto zdarzenia potranslacyjne, w tym fosforylacja, sumoilacja, acetylacja, O-GlcNAcylacja, degradacja i wejście jądrowe białek zegara rdzeniowego, stanowią dodatkową ważną warstwę regulacyjną w ustanawianiu 24-godzinnego cyklu oscylacyjnego 3.

Gromadzenie dowodów wynika z badań na modelach gryzoni i podkreśla kluczową rolę systemu okołodobowego w koordynacji funkcji metabolicznych i hormonalnych 4-5. Szereg wielkoskalowych analiz transkryptomu sugeruje, że cykle karmienie – post odgrywają kluczową rolę w synchronizacji oscylatorów obwodowych 6-8. Zgodnie z tymi badaniami, analiza metabolomiczna i lipidomiczna u gryzoni i ludzi wykazała, że duża liczba metabolitów oscyluje w tkankach, osoczu i ślinie w sposób okołodobowy 9-11. Co ważne, większość hormonów wykazuje rytm okołodobowy we krwi 5,12-13. Co więcej, zegary okołodobowe odpowiedniej tkanki obwodowej produkującej hormony mogą lokalnie regulować wydzielanie hormonów. Autonomiczne dla komórek oscylatory okołodobowe zostały opisane w komórkach wysp trzustkowych gryzoni i ludzkich 14-16. Oscylatory te odgrywają istotną rolę w regulacji transkryptomu i funkcji wysp trzustkowych 15,17-18. Co więcej, niedawno wykazano, że wydzielanie miokin przez ludzkie miorurki szkieletowe wykazuje wzorzec okołodobowy, który jest regulowany przez autonomiczne oscylatory komórkowe działające w tych komórkach 19.

Kilka podejść do badania rytmów okołodobowych u ludzi in vivo zostało szeroko zastosowanych. Na przykład poziom melatoniny lub kortyzolu w osoczu, a także temperatura powierzchni skóry klatki piersiowej (przegląd w piśmiennictwie 3,20) badano w celu oceny endogennych zegarów okołodobowych. Chociaż metody te pozwalają na badanie ogólnoustrojowych oscylacji okołodobowych in vivo, są one dalekie od zapewnienia wiarygodnej oceny swobodnie działających autonomicznych rytmów okołodobowych w różnych narządach i tkankach. Niemniej jednak takie oddzielenie od regulacji ogólnoustrojowej byłoby niezbędnym narzędziem do zrozumienia specyficznego wpływu wewnątrzkomórkowych zegarów molekularnych na funkcję tych komórek. W związku z tym podjęto znaczne wysiłki w celu opracowania wiarygodnych podejść do badania ludzkich zegarów w unieśmiertelnionych lub pierwotnych komórkach hodowanych in vitro. Co ważne, wykazano, że charakterystyki zegara mierzone w hodowanych pierwotnych komórkach fibroblastów skóry ściśle odzwierciedlają indywidualne właściwości zegara całego organizmu 21. Rozwój fluorescencyjnych i bioluminescencyjnych reporterów okołodobowych znacznie rozwinął to podejście 22-27. Co więcej, badanie pierwotnych zegarów komórkowych, które pochodzą z różnych narządów obwodowych, pozwala na badanie właściwości molekularnych zegarów specyficznych dla tkanek ludzkich 3,5,16,19-20,28. Tak więc ocena zegarów okołodobowych w zsynchronizowanych in vitro pierwotnych eksplantatach lub komórkach, przy użyciu bioluminescencyjnych reporterów, stanowi bardzo przydatną metodę badania składu molekularnego ludzkich zegarów obwodowych i ich wpływu na funkcjonowanie narządów.

W tym artykule przedstawimy szczegółowe protokoły oceny ekspresji genów okołodobowych w ludzkich pierwotnych komórkach wysp trzustkowych i mięśni szkieletowych zsynchronizowanych in vitro, a także wpływ autonomicznego zakłócenia zegara komórkowego na funkcję wydzielniczą tych komórek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oświadczenie etyczne: Manipulacje zawarte w tym protokole zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki Szpitala Uniwersyteckiego w Genewie oraz przez Komitet Etyczny SUD EST IV (Umowa 12/111) 19. Ludzkie wyspy trzustkowe wyizolowano z trzustki dawców wielonarządowych w stanie śmierci mózgowej w Centrum Transplantacji Wysp Trzustkowych w Szpitalu Uniwersyteckim w Genewie (Szwajcaria), jak opisaliśmy w odnośnikach 16,18, lub uzyskano ze źródła komercyjnego.

1. Przygotowanie pierwotnej hodowli komórkowej

  1. Izolacja, dysocjacja i hodowla wysp trzustkowych u ludzi
    UWAGA: Każdą probówkę, plastikową końcówkę lub pipetę należy pokryć podłożem Connaught Medical Research Laboratories (CMRL), aby zapobiec przywieraniu wysp trzustkowych lub komórek wysp trzustkowych do powierzchni tworzywa sztucznego, co może prowadzić do znacznej utraty materiału komórkowego.
    1. Na jeden dzień przed dysocjacją komórek wysp trzustkowych dodać 1 ml bogatej w lamininę 5-5 macierzy zewnątrzkomórkowej (pochodzącej z komórek 804G, jak opisano w odnośniku 29) na 3,5 cm szalkę. Przed posiewem komórek odessać matrycę i umyć naczynie 3 razy sterylną wodą dwudestylowaną. Pozostaw naczynie do wyschnięcia pod komorą z przepływem laminarnym na 5 minut.
    2. Wewnątrz komory z przepływem laminarnym rozprowadzić otrzymane wysepki z pożywką CMRL do probówki (probówek) o pojemności 15 ml. Wirować przy 272 x g przez 5 min.
    3. Odessać supernatant, a następnie ponownie zawiesić osad w 1 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco, podgrzanego do temperatury 37 °C bez zawartości wapnia i magnezu. Wirować przy 272 x g przez 5 min.
    4. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 1 ml DPBS.
    5. Aby obliczyć całkowitą liczbę wysp trzustkowych, należy odpipetować 10 μl z 1 ml zawiesiny wysp trzustkowych do nowego naczynia o średnicy 3,5 cm. Policz liczbę wysp trzustkowych w kropli 10 μl pod mikroskopem i na tej podstawie oblicz całkowitą liczbę wysp trzustkowych w zawiesinie 1 ml wysp trzustkowych. Dodać 14 ml DPBS i ponownie odwirować zawiesinę komórkową w temperaturze 272 x g przez 5 minut.
    6. W przypadku dysocjacji komórek wysp trzustkowych należy odessać supernatant i dodać 1 ml roztworu do odrywania komórek, aby uzyskać maksymalnie 1 000 ekwiwalentów wysp trzustkowych (IEQ). Umieścić probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i delikatnie wymieszać wysepki, pipetując w górę i w dół kilka razy na minutę, przez 6-10 minut
      UWAGA: Aby sprawdzić jakość trawienia, odpipetować kroplę zawiesiny o objętości 2 μl na szkiełko podstawowe i sprawdzić pod mikroskopem, czy wszystkie komórki są dobrze oddzielone i czy nie pozostały żadne dublety ani grudki komórek.
    7. Zatrzymaj reakcję, dodając 14 ml zimnego CMRL z suplementami (10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 1% dipeptydu L-alanylo-L-glutaminy, 1% penicyliny-streptomycyny (P/S), 1% gentamycyny, 1% pirogronianu sodu). Wirować przy 425 x g przez 5 min. Odessać supernatant i dodać 15 ml pożywki CMRL do osadu komórkowego.
    8. Zawiesić osad w małej objętości CMRL z suplementami. Policz liczbę komórek pod mikroskopem za pomocą hemocytometru, dostosuj objętość CMRL w celu uzyskania stężenia komórek ~650 000 komórek/ml.
    9. Odpipetować 3 oddzielone krople po 100 μl każda z zawiesiny komórek dyspersyjnych otrzymanej w kroku 1.1.8 w naczyniu o średnicy 3,5 cm wstępnie pokrytym lamininą.
      UWAGA: Komórki przyczepiają się do naczynia w ciągu około 24 godzin.
    10. Inkubować komórki (ryc. 1A) w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C w wilgotnej komorze. Zmieniaj pożywkę w kroplach komórkowych co 2-3 dni, odsysając 100 μl z każdej kropli i zastępując ją tą samą objętością świeżej pożywki.
  2. Ludzka pierwotna kultura mioblastów i różnicowanie się w miotubes
    1. Biopsja tkankowa, satelitarna izolacja komórek i hodowla mioblastów
      Uwaga: Biopsje mięśni uzyskano z grupy Etienne Lefai (INSERM, Lyon, Francja) 19.
      1. Oczyść pierwotne mioblasty szkieletowe zgodnie z wcześniej opisaną procedurą 30.
    2. Różnicowanie pierwotnych ludzkich mioblastów w miotubach
      1. Pobrać jedną fiolkę (1 x 106 komórek) ludzkich mioblastów przechowywanych w ciekłym azocie i szybko rozmrozić komórki, umieszczając fiolkę na 30 sekund do 1 minuty w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C z mieszaniem.
      2. Pipetować komórki (1 ml) do 24 ml pożywki wzrostowej składającej się z HAM F-10 uzupełnionej 20% FBS, 1% P/S, 0,5% gentamycyny i 0,2% amfoterycyny B.
      3. Wirować 5 min przy 150 x g.
      4. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki za pomocą 15 ml świeżej pożywki wzrostowej na 2,5 x 105 komórek.
      5. Umieścić na płytce co najmniej 2,5 x 105 komórek na kolbę przylegającą F75. Przechowywać mioblasty w inkubatorze komórkowym w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
      6. Gdy komórki osiągną 60-80% zbieżności, dysocjuj komórki za pomocą trypsyny-EDTA 0,05% przez 1-2 minuty i umieść je w 2 ml pożywki wzrostowej na przylegających 3,5 cm szalkach Petriego.
      7. Po osiągnięciu konfluencji usuń podłoże wzrostowe.
      8. Rozpocznij protokół różnicowania ludzkich mioblastów w miotubach, hodując je w 2 ml zmodyfikowanego podłoża Eagle (DMEM) firmy Dulbecco zawierającego 1 g/l glukozy, 2% FBS, 1% P/S, 0,5% gentamycyny i 0,2% amfoterycyny B (pożywki różnicującej) w inkubatorze komórkowym w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Zmieniaj podłoże co 2 do 3 dni.
        UWAGA: Rurki Myotube powstają zwykle w ciągu 7-10 dni.
      9. Sprawdź różnicowanie komórek mięśniowych pod mikroskopem (ryc. 2A), obserwując fuzję mioblastów w wielojądrowe miorurki 19.

2. Transfekcja małego interferującego RNA (siRNA)

  1. Transfekcja siRNA ludzkich komórek wysp trzustkowych
    UWAGA: Protokół transfekcji wykonuje się w kroplach po 100 μl następnego dnia po dysocjacji komórek (kroki 1.1.1-1.1.10).
    1. Odessać 100 μl pożywki CMRL z każdej kropli i zastąpić ją tą samą objętością pożywki Minimal Essential Medium (MEM) bez surowicy na 2 godziny przed transfekcją przez pipetowanie.
    2. Przygotować mieszaninę odczynnika do transfekcji na bazie MEM i 50 nM docelowego siRNA (siClock) lub 50 nM niedocelowego siControl zgodnie z instrukcjami producenta.
      1. Na jedno danie z 3 kroplami przygotuj dwie probówki o pojemności 1,5 ml z 200 μl MEM każda.
      2. Dodać do jednej z tych probówek 4 μl odczynnika do transfekcji.
      3. Dodać do drugiej probówki 1 μl odpowiedniego roztworu podstawowego siRNA (20 μM).
      4. Mieszaj te dwie probówki powoli na wytrząsarce orbitalnej przez 5 minut, a następnie wymieszaj zawartość probówek razem i mieszaj przez kolejne 20 minut.
    3. Odessać 100 μl MEM z każdej kropli i zastąpić ją tą samą objętością mieszaniny transfekcyjnej, otrzymaną w poprzednim kroku przez pipetowanie.
    4. Zastąpić roztwór do transfekcji pożywką CMRL po 4 godzinach inkubacji w temperaturze 37 °C. Powtórzyć kroki 2.1.1-2.1.3 następnego dnia w celu ponownego przetransfekcji komórek.
  2. Transfekcja siRNA ludzkich Myotub
    1. Przed transfekcją zastąpić pożywkę (patrz krok 1.2.2.8) 2 ml świeżej pożywki różnicującej na 3,5 cm płytki Petriego.
    2. W sterylnej probówce o pojemności 1,5 ml przygotować mieszaninę 20 nM siRNA (siControl lub siClock), co odpowiada 2,4 μl 20 μM roztworu siRNA i 12 μl odczynnika do transfekcji rozcieńczonego w 100 μl pożywki różnicującej. Inkubować roztwór w temperaturze pokojowej przez 15 minut, delikatnie mieszając.
    3. Komórki transfekcyjne z 114,4 μl siRNA miesza się na szalkę Petriego o średnicy 3,5 cm i umieszcza komórki w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 24 godziny.

3. Ciągła długoterminowa rejestracja bioluminescencji okołodobowej wykonywana równolegle z oceną wydzielania hormonów w żywych ludzkich komórkach pierwotnych

  1. Wprowadzenie okołodobowych reporterów bioluminescencyjnych do ludzkich komórek pierwotnych metodą transdukcji lentiwirusowej
    UWAGA: Wszystkie zabiegi z cząstkami lentiwirusa muszą być wykonywane w obiekcie o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 w celu podjęcia dodatkowych środków ostrożności podczas pracy z czynnikami, które stanowią umiarkowane potencjalne zagrożenie dla personelu i środowiska.
    1. Przygotować cząstki lentiwirusa reporterowego przez kotransfekcję interesującego wektora pLenti6.4 / R4R2 / V5-DEST / Bmal1-luc lub plazmidu 31 pLV156-Per2-dLuc (zwanych odpowiednio Bmal1-luc i Per2-luc) z wektorami lentiwirusowymi pMD2G i psPAX do komórek 293T przy użyciu metody polietyleneniminy (szczegółowa procedura znajduje się w odnośniku 16).
    2. Miareczkować otrzymane cząstki lentiwirusa (szczegółowe informacje na temat miareczkowania można uzyskać pod adresem http://lentilab.unige.ch/). Do dalszych eksperymentów należy użyć lentiwirusów o mianach w zakresie od 104 do 105 jednostek transdukcyjnych [TU/μl].
    3. Umieścić szalki z ludzkimi komórkami wysp trzustkowych lub ludzkimi mioblastami (przy 30-50% zgryzie) w komorze z przepływem laminarnym i zastąpić pożywkę odpowiednio 2 ml świeżo uzupełnionej pożywki CMRL (patrz krok 1.1.7) lub pożywki wzrostowej (patrz krok 1.2.2.2).
    4. Oblicz wielokrotność infekcji (MOI) (tj. cząstki zakaźne (jednostki transdukcyjne)/liczbę komórek).
    5. Transdukować pierwotną hodowlę komórkową, pipetując roztwór lentiwirusa do naczynia w celu uzyskania MOI = 3 (na przykład dla 65 000 przyłączonych komórek dodać 3 μl roztworu wirusa o mianie 6,5 x 104 do 100 μl kropli pożywki).
    6. Inkubować przez noc w inkubatorze do hodowli tkankowych. Zmień podłoże następnego dnia.
      UWAGA: Ludzkie komórki wysp trzustkowych należy przetransdukować co najmniej 4 dni przed zapisem bioluminescencji, aby osiągnąć wystarczającą ekspresję konstruktu reporterowego. Mioblasty są transdukowane w fazie ekspansji, a następnie rozwijane do konfluencji, a następnie różnicowane w miotuby.
  2. Synchronizacja in vitro ludzkich komórek pierwotnych
    1. Dodać 10 μM aktywatora cyklazy adenylowej do 2 ml pożywki na 3,5 cm płytki Petriego, zawierającej komórki pierwotne uprzednio transdukowane w kroku 3.1.5.
    2. Inkubować przez 60 minut w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli komórkowych.
    3. Zmienić pożywkę zawierającą aktywator cyklazy adenylowej na 2,5 ml pożywki rejestrującej zawierającej 100 μM lucyferyny.
      UWAGA: W przypadku ludzkich komórek wysp trzustkowych należy stosować CMRL uzupełniony 10% FBS, 1% dipeptydu L-alanylo-L-glutaminy, 1% P / S, 1% gentamycyny; dla ludzkich miotub użyj DMEM wolnego od czerwieni fenolowej z 1 g / L glukozy uzupełnionej 2% FBS, 2% dipeptydu L-alanylo-L-glutaminy, 1% P / S, 0,5% gentamycyny i 0,2% amfoterycyny B.

4. Równoległa ocena okołodobowych profili bioluminescencji i wydzielania hormonów w zsynchronizowanych ludzkich komórkach wydzielniczych

  1. Ustawianie długoterminowego, stałego zapisu peryfuzji i bioluminescencji dla ludzkich komórek pierwotnych.
    UWAGA: Podczas pracy na zewnątrz komory z przepływem laminarnym należy oczyścić wszystkie powierzchnie kontaktowe i ograniczyć narażenie kultur lub pożywki na działanie powietrza, aby uniknąć zanieczyszczenia.
    1. Aby przygotować pożywkę peryfuzyjną, dodaj 100 μM lucyferyny do pożywki.
      UWAGA: W przypadku ludzkich komórek wysp trzustkowych należy stosować CMRL uzupełniony 10% FBS, 1% dipeptydu L-alanylo-L-glutaminy, 1% P / S, 1% gentamycyny; dla ludzkich miotub użyj czerwieni fenolowej – wolnego DMEM z 1 g / L glukozy uzupełnionej 2% FBS, 2% dipeptydu L-alanylo-L-glutaminy, 1% P/S, 0,5% gentamycyny i 0,2% amfoterycyny B.
    2. Wewnątrz komory z przepływem laminarnym otworzyć 3,5 cm szalki zawierające transdukowane, transfekowane i zsynchronizowane pierwotne kultury komórkowe (komórki wysp trzustkowych lub miotuby), jak opisano powyżej. Włóż sterylne metalowe nakrętki (opracowane we własnym zakresie) (Rysunek 1B2) do naczyń o średnicy 3,5 cm, które są wyposażone w silikonowe rurki łączące dopływ/odpływ (Rysunek 1B1/B5).
    3. Umieść naczynia na platformie pomiarowej w inkubatorze szczelnym o temperaturze 37 °C. Przymocuj naczynia do platformy za pomocą przykręcanego adaptera (Rysunek 1B3). Włóż rurki dopływu/odpływu systemu peryfuzyjnego do odpowiednich silikonowych rurek nasadki (Rysunek 1B1/B5) i ustaw prędkość pompy na natężenie przepływu ~0,5 ml medium na 1 godzinę.
    4. Otwórz opracowane przez nas oprogramowanie Drip-biolumicorder, które rejestruje sygnały z detektora fotopowielacza (PMT). Wybierz katalog, w którym będą przechowywane dane i rozpocznij ciągły zapis bioluminescencji z każdej anteny, klikając ikonę "start".
      UWAGA: Alternatywnie do oprogramowania Drip-biolumicorder, do rejestracji sygnałów z detektora PMT można wykorzystać inne programy (np. LumiCycle).
    5. Umieść sterylne 6-dołkowe płytki do hodowli tkankowych w pojemniku zbiorczym na lodzie.
    6. Otwórz oprogramowanie sterujące, które steruje czasem automatycznego przełączania między studzienkami zbiorczymi. Skonfiguruj przedział czasu zbierania nośnika (s). Pobieranie pożywki odpływowej należy rozpocząć co 4 godziny (14 400 sek.; ~2 ml na punkt czasowy), klikając ikonę "uruchom".
    7. Przenieść i odmierzyć wypływającą pożywkę z każdej kolekcji do sterylnych probówek o pojemności 2 ml za pomocą pipetowania. Przechowuj probówki w zamrażarce w temperaturze -20 °C przed rozpoczęciem następnego kroku. Powtarzaj kroki 4.1.5-4.1.6 co 24 godziny.
    8. Zatrzymaj zapis bioluminescencji i przepływ medium, klikając ikonę "zatrzymaj" w odpowiednim oprogramowaniu. Usuń metalowe nakrętki i odessaj pozostałą pożywkę z naczyń.
    9. W celu normalizacji wartości wydzielanych białek uzyskanych w różnych eksperymentach, albo wyekstrahuj DNA (normalizacja przez zawartość genomowego DNA dla miotub 19), albo dodaj 1 ml buforu kwasu lizyczno-etanolowego (normalizacja przez całkowitą zawartość hormonu dla komórek wysp trzustkowych 18) do szalek.

5. Pomiar poziomu hormonu wysp trzustkowych i miokin w ośrodku odpływowym, uzyskany przez ciągłą peryfuzję ludzkich pierwotnych komórek endokrynnych

  1. insulina
    1. Określić ilościowo poziomy insuliny podstawowej w pożywce odpływowej na podstawie zebranych punktów czasowych za pomocą zestawu do testu immunoenzymatycznego (ELISA) ludzkiego enzymu insulinowego zgodnie z instrukcjami producenta.
    2. Znormalizować dane do bezwzględnej objętości zebranej pożywki w każdym basenie oraz do całkowitej zawartości insuliny ekstrahowanej z komórek poddanych działaniu kwasu etylowego na koniec doświadczenia (krok 4.1.9) 18.
  2. Interleukina-6 (IL-6)
    1. Określ ilościowo podstawowe poziomy IL-6 w podłożu odpływowym na podstawie zebranych punktów czasowych przy użyciu zestawu ELISA IL-6 dla człowieka, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.
    2. Znormalizować dane do bezwzględnej objętości zebranej pożywki w każdym dołku oraz do zawartości genomowego DNA na końcu doświadczenia (etap 4.1.9).

6. Analizy zbiorów danych okołodobowych dla profili bioluminescencji i wydzielania hormonów

  1. Analiza bioluminescencyjna
    1. Analizuj profil bioluminescencji za pomocą dostarczonego oprogramowania 19.
  2. Analiza cyklu JTK
    1. Analizuj profile wydzielania hormonów i wyniki rejestracji bioluminescencji przy użyciu algorytmu JTK_CYCLE 32.
    2. Ustaw szerokość okresu okołodobowego na 20-24 godz.
      UWAGA: W przypadku, gdy warunki eksperymentalne zostały zarejestrowane równolegle, można przeprowadzić sparowaną analizę statystyczną w celu porównania eksperymentów.
  3. Analiza CosinorJ
    1. Alternatywnie, przeanalizuj profile wydzielania hormonów i bioluminescencji okołodobowej za pomocą oprogramowania CosinorJ 28.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ocena wydzielania hormonu wysp trzustkowych z równoległym zapisem bioluminescencji okołodobowej z perifused ludzkich komórek wysp trzustkowych

Po dostarczeniu pierwszej molekularnej charakterystyki zegara okołodobowego, działającego w ludzkich komórkach wysp trzustkowych 16, skupiliśmy się na badaniu wpływu zakłóceń zegara na funkcję wysp trzustkowych i transkrypcję 18. Ustaliliśmy skuteczny protokół transf...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisane tutaj warunki eksperymentalne składają się z dobowego dostarczania dobowych reporterów bioluminescencji do hodowanych ludzkich komórek pierwotnych, a następnie synchronizacji in vitro i ciągłego rejestrowania bioluminescencji przez kilka dni oraz równoległej analizy wydzielania hormonów przez te same komórki. Stanowią one skuteczne podejście do badania mechanizmów molekularnych i funkcjonalnych aspektów zegarów okołodobowych w ludzkich komórkach pierwotnych.

Jakość materiału d...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jesteśmy wdzięczni naszym kolegom z Uniwersytetu Genewskiego: Jacques'owi Philippe'owi za konstruktywne uwagi na temat tej pracy, Ueli Schibler za nieocenioną pomoc w rozwoju systemu peryfuzji i za inspirację naukową, André Liani za pomysł, zaprojektowanie, produkcję i uruchomienie systemu perfuzyjnego, firmie Lesa-Technology LTD za pomoc w tworzeniu systemu peryfuzyjnego i rozwoju oprogramowania Drip-biolumicorder, George'owi Severiemu za pomoc w eksperymentach peryfuzyjnych, Ursuli Loizides-Mangold za krytyczną lekturę manuskryptu i Anne-Marie Makhlouf za przygotowanie lentiwirusa; Etienne'owi Lefai, Stéphanie Chanon i Hubertowi Vidalowi (INSERM, Lyon) za przygotowanie ludzkich pierwotnych mioblastów; oraz Domenico Bosco i Thierry'emu Berneyowi (Centrum Transplantacji Wysp Trzustkowych, Szpital Uniwersytecki w Genewie) za dostarczenie ludzkich wysp trzustkowych. Praca ta została sfinansowana przez Szwajcarską Narodową Fundację Nauki Grant nr 31003A_146475/1, Sinergia Swiss National Science Foundation Grant No. CRSII3-154405, Fondation Romande pour la Recherche sur Diabète, Bo Hjelt Foundation, Fondation Ernst et Lucie Schmidheiny oraz Société Académique de Genève (CD).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Trypsin-EDTAInvitrogen25300-054Do biopsji mięśni, trawienie
DPBS, bez wapnia, bezmagnezu Invitrogen14190-094
HAM F-10Invitrogen41550-021Do hodowli mioblastów
FBSInvitrogen10270Suplement do podłoża hodowlanego
Penicylina-StreptomycynaSigmaP0781-100Suplement do pożywki
Akson gentamycyny A1492.0001Suplement do podłoża hodowlanego
FungizoneInvitrogen15290-026Amfoterycyna B, suplement do pożywki
DMEM 1g/L glukozy + Na pirogronian + glutamax Invitrogen21885-025Do hodowli myotubes
DMEM 1g/L glukozy -Na Pirogronian - glutamaxInvitrogen11880-028Nośnik danych dla LumiCycle
GlutamaxInvitrogen35050-028Dipeptyd L-alanylo-L-glutaminy, suplement do podłoża rejestrującego
AccutaseInnovative Cell TechnologiesAT-104Roztwór do odłączania komórek, do dysocjacji komórek wysp trzustkowych
CMRLGibco21530-027Pożywka hodowlana dla komórek wysp trzustkowych
Pirogronian soduGibco11360-039Dodatek do pożywki
15 ml Probówka stożkowa polipropylenowa o wysokiej czystościKolba Falcon352096
F75BD Falcon353136
3,5 cm szalka Petriego BD Falcon353001
FoskolinSigmaF6886Aktywator cyklazy adenylylowej, używany do synchronizacji
LuciferinProlume LTD260150Suplement do nośnika zapisu
OptiMEM Invitrogen51985-026Bez surowicy Minimal Essential Medium (MEM) stosowany do transfekcji ludzkich komórek wysp trzustkowych
Odczynnik Lipofectamine RNAiMAX Odczynnikdo transfekcjiInvitrogen13778-150
Odczynnik HiPerFectQiagen301705Odczynnik do transfekcji
ON-TARGET plus siCLOCK smartpool DharmaconL-008212-00
ON-TARGET plus nieukierunkowane siRNA #1 (siControl)DharmaconD-001810-01
DNeasy Blood & Zestaw chusteczek Qiagen69504Do ekstrakcji DNA myotubes
RNeasy Plus Mini kit Qiagen74104Do ekstrakcji RNA myotubes
QIAshredder Qiagen79654Do ekstrakcji RNA miotubek
2 ml probówki zbiorczeAxygen311-10-051Aby zebrać pożywkę z peryfuzją
Płytka do hodowli tkankowej, 6 WellBD Falcon 353046Do zbierania pożywki za pomocą zestawu perifusion
RNeasy Plus Micro Qiagen74034Do ekstrakcji RNA wysp trzustkowych
Ludzki zestaw IL-6 Instant ELISA eBioscience88-7066-22
Zestaw insuliny ludzkiej Mercodia Mercodia10-1113-01
Kwas solny, min,37%,p.d.Acros organics124630010Służy do przygotowania buforu do lizy (375 ml Etanol + 7,5%HCl + 117,5% H2O)
Etanol (>99,8%)Fluka Analytical02860-1LSłuży do przygotowania buforu do lizy (375 ml Etanol + 7,5%HCl + 117,5% H2O)
Ludzkie wysepki do badańProdo Laboratories
NazwaFirma<strong>Numer katalogowyKomentarze
Sprzęt:
WirówkaHeraeusMegafuge 1.0R
Łaźnia wodnaVWR1112A  w 37 ° C
Kaptur hodowlany TissuSzybciej Inkubator kultur SafeFastElite
TissuHeraeusHeraCell 1505% CO2 przy 37 stopniach; C, brak wody z powodu instalacji LumiCycle
Inkubator kultur TissuHeraeusHeraCell 1505% CO2 przy 37 ° C, brak wody z powodu instalacji LumiCycle
Inkubator kultur TissuThermo ScientificHera Cell 150i5% CO2 przy 37 stopniach; C
ShakerHeidolph InstrumentsUnimax 1010Do mieszania mieszanki siRNA
LumiCycleActimetrics
LumiCycle oprogramowanie LumiCycleActimetrics
CosinorJ oprogramowanieEPFLBezpłatnie dostępne pod adresem: http://bigwww.epfl.ch/algorithms/cosinorj/
Rheodyne titan MX Oprogramowanie sterujące ERC GmbHktóre steruje czasem pracy automatycznego przełącznika
, ,

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Albrecht, U. Timing to perfection: the biology of central and peripheral circadian clocks. Neuron. 74 (2), 246-260 (2012).
  2. Dibner, C., Schibler, U., Albrecht, U. The mammalian circadian timing system: organization and coordination of central and peripheral clocks. Annu Rev Physiol. 72, 517-549 (2010).
  3. Dibner, C., Schibler, U. Circadian timing of metabolism in animal models and humans. J Intern Med. , (2015).
  4. Marcheva, B., et al. Circadian clocks and metabolism. Handb Exp Pharmacol. (217), 127-155 (2013).
  5. Philippe, J., Dibner, C. Thyroid circadian timing: roles in physiology and thyroid malignancies. J Biol Rhythms. 30 (2), 76-83 (2015).
  6. Andrews, J. L., et al. CLOCK and BMAL1 regulate MyoD and are necessary for maintenance of skeletal muscle phenotype and function. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (44), 19090-19095 (2010).
  7. McCarthy, J. J., et al. Identification of the circadian transcriptome in adult mouse skeletal muscle. Physiol Genomics. 31 (1), 86-95 (2007).
  8. Shostak, A., Husse, J., Oster, H. Circadian regulation of adipose function. Adipocyte. 2 (4), 201-206 (2013).
  9. Dallmann, R., Viola, A. U., Tarokh, L., Cajochen, C., Brown, S. A. The human circadian metabolome. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (7), 2625-2629 (2012).
  10. Adamovich, Y., et al. Circadian clocks and feeding time regulate the oscillations and levels of hepatic triglycerides. Cell Metab. 19 (2), 319-330 (2014).
  11. Chua, E. C., et al. Extensive diversity in circadian regulation of plasma lipids and evidence for different circadian metabolic phenotypes in humans. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (35), 14468-14473 (2013).
  12. Kalsbeek, A., Fliers, E. Daily regulation of hormone profiles. Handb Exp Pharmacol. (217), 185-226 (2013).
  13. Hastings, M., O'Neill, J. S., Maywood, E. S. Circadian clocks: regulators of endocrine and metabolic rhythms. J Endocrinol. 195 (2), 187-198 (2007).
  14. Muhlbauer, E., Wolgast, S., Finckh, U., Peschke, D., Peschke, E. Indication of circadian oscillations in the rat pancreas. FEBS Lett. 564 (1-2), 91-96 (2004).
  15. Marcheva, B., et al. Disruption of the clock components CLOCK and BMAL1 leads to hypoinsulinaemia and diabetes. Nature. 466 (7306), 627-631 (2010).
  16. Pulimeno, P., et al. Autonomous and self-sustained circadian oscillators displayed in human islet cells. Diabetologia. 56 (3), 497-507 (2013).
  17. Perelis, M., et al. Pancreatic beta cell enhancers regulate rhythmic transcription of genes controlling insulin secretion. Science. 350 (6261), (2015).
  18. Saini, C., et al. A functional circadian clock is required for proper insulin secretion by human pancreatic islet cells. Diabetes Obes Metab. , (2015).
  19. Perrin, L., et al. Human skeletal myotubes display a cell-autonomous circadian clock implicated in basal myokine secretion. Mol Metab. 4 (11), 834-845 (2015).
  20. Saini, C., Brown, S. A., Dibner, C. Human peripheral clocks: applications for studying circadian phenotypes in physiology and pathophysiology. Front Neurol. 6, 95(2015).
  21. Brown, S. A., et al. Molecular insights into human daily behavior. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (5), 1602-1607 (2008).
  22. Asher, G., et al. SIRT1 regulates circadian clock gene expression through PER2 deacetylation. Cell. 134 (2), 317-328 (2008).
  23. Dibner, C. On the robustness of mammalian circadian oscillators. Cell Cycle. 8 (5), 681-682 (2009).
  24. Dibner, C., et al. Circadian gene expression is resilient to large fluctuations in overall transcription rates. EMBO J. 28 (2), 123-134 (2009).
  25. Nagoshi, E., et al. Circadian gene expression in individual fibroblasts: cell-autonomous and self-sustained oscillators pass time to daughter cells. Cell. 119 (5), 693-705 (2004).
  26. Sage, D., Unser, M., Salmon, P., Dibner, C. A software solution for recording circadian oscillator features in time-lapse live cell microscopy. Cell Div. 5, (2010).
  27. Kowalska, E., Moriggi, E., Bauer, C., Dibner, C., Brown, S. A. The circadian clock starts ticking at a developmentally early stage. J Biol Rhythms. 25 (6), 442-449 (2010).
  28. Mannic, T., et al. Circadian clock characteristics are altered in human thyroid malignant nodules. J Clin Endocrinol Metab. 98 (11), 4446-4456 (2013).
  29. Parnaud, G., et al. Proliferation of sorted human and rat beta cells. Diabetologia. 51 (1), 91-100 (2008).
  30. Agley, C. C., Rowlerson, A. M., Velloso, C. P., Lazarus, N. L., Harridge, S. D. Isolation and quantitative immunocytochemical characterization of primary myogenic cells and fibroblasts from human skeletal muscle. J Vis Exp. (95), e52049(2015).
  31. Liu, A. C., et al. Redundant function of REV-ERBalpha and beta and non-essential role for Bmal1 cycling in transcriptional regulation of intracellular circadian rhythms. PLoS Genet. 4 (2), e1000023(2008).
  32. Hughes, M. E., Hogenesch, J. B., Kornacker, K. JTK_CYCLE: an efficient nonparametric algorithm for detecting rhythmic components in genome-scale data sets. J Biol Rhythms. 25 (5), 372-380 (2010).
  33. Dyar, K. A., et al. Muscle insulin sensitivity and glucose metabolism are controlled by the intrinsic muscle clock. Mol Metab. 3 (1), 29-41 (2014).
  34. Innominato, P. F., et al. The circadian timing system in clinical oncology. Ann Med. 46 (4), 191-207 (2014).
  35. Chitikova, Z., et al. Identification of new biomarkers for human papillary thyroid carcinoma employing NanoString analysis. Oncotarget. 6 (13), 10978-10993 (2015).
  36. Pagani, L., et al. The physiological period length of the human circadian clock in vivo is directly proportional to period in human fibroblasts. PLoS One. 5 (10), e13376(2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Rejestracja bioluminescencjitransdukcja lentywirusowatransfekcja siRNAsekrecja insulinysekrecja miokinaktywacja cyklazy adenylowejpobieranie medium odp ywowego

Powiązane artykuły