Tutaj opisujemy ustawienia do równoległego monitorowania bioluminescencji okołodobowej i aktywności wydzielniczej ludzkich komórek wysp trzustkowych i pierwotnych miotub. W tym celu zastosowaliśmy dostarczanie genu lentiwirusowego za pomocą reportera zegara rdzeniowego lucyferazy, a następnie synchronizację in vitro i zbieranie pożywki odpływowej przez ciągłą peryfuzję komórek.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Równoległy pomiar ekspresji genów zegara okołodobowego i wydzielania hormonów w pierwotnych hodowlach komórkowych człowieka
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Zegary okołodobowe działają we wszystkich organizmach wrażliwych na światło, umożliwiając adaptację do świata zewnętrznego poprzez przewidywanie codziennych zmian środowiska. W ciągu ostatniej dekady w naszej wiedzy na temat ścisłego związku między zegarem okołodobowym a większością aspektów fizjologii poczyniono w tej dziedzinie. Jednak odkrycie molekularnych podstaw, które leżą u podstaw funkcji oscylatora okołodobowego u ludzi, pozostaje najwyższym wyzwaniem technicznym. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy opis eksperymentalnego podejścia do długoterminowego (2-5 dni) zapisu bioluminescencji i zbierania pożywki odpływowej w hodowanych ludzkich komórkach pierwotnych. W tym celu przeprowadziliśmy transdukcję komórek pierwotnych za pomocą reportera lucyferazy lentiwirusowej, który jest pod kontrolą promotora genu zegara rdzeniowego, co pozwala na równoległą ocenę wydzielania hormonów i bioluminescencji okołodobowej. Ponadto opisujemy warunki zakłócenia zegara okołodobowego w pierwotnych komórkach ludzkich poprzez transfekcję siRNA ukierunkowanego na ZEGAR. Nasze wyniki dotyczące dobowej regulacji wydzielania insuliny przez ludzkie wyspy trzustkowe i wydzielania miokin przez ludzkie komórki mięśni szkieletowych przedstawiono tutaj, aby zilustrować zastosowanie tej metodologii. Ustawienia te można wykorzystać do badania składu molekularnego ludzkich zegarów peryferyjnych i do analizy ich funkcjonalnego wpływu na komórki pierwotne w warunkach fizjologicznych lub patofizjologicznych.
Wprowadzenie
System pomiaru czasu okołodobowego (z łaciny "Circa diem") pojawił się u wszystkich organizmów wrażliwych na światło, jako mechanizm adaptacyjny do ruchu obrotowego Ziemi. U ssaków jest zorganizowany w sposób hierarchiczny, obejmujący zegar centralny, który znajduje się w jądrze nadskrzyżowaniowym brzusznego podwzgórza oraz oscylatory obwodowe (lub niewolnicze), które działają w różnych narządach. Co więcej, te autonomiczne oscylatory samopodtrzymujące się działają w prawie każdej komórce ciała 1. Sygnały fototyczne stanowią dominującą wskazówkę synchronizującą (Zeitgeber) dla neuronów SCN, podczas gdy sygnały neuronalne i humoralne emanuj....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Oświadczenie etyczne: Manipulacje zawarte w tym protokole zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki Szpitala Uniwersyteckiego w Genewie oraz przez Komitet Etyczny SUD EST IV (Umowa 12/111) 19. Ludzkie wyspy trzustkowe wyizolowano z trzustki dawców wielonarządowych w stanie śmierci mózgowej w Centrum Transplantacji Wysp Trzustkowych w Szpitalu Uniwersyteckim w Genewie (Szwajcaria), jak opisaliśmy w odnośnikach 16,18, lub uzyskano ze źródła komercyjnego.
1. Przygotowanie pierwotnej hodowli komórkowej
- Izolacja, dysocjacja i hodowla wysp trzustkowych u ludzi
UWAGA: Każdą probówkę, plastikową końcówkę lub ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Ocena sekrecji hormonów wysepek za pomocą równoległego okołodobowego pomiaru bioluminescencji z perifuzowanych ludzkich komórek wysepek
Po przeprowadzeniu pierwszej charakterystyki molekularnej zegara okołodobowego działającego w ludzkich komórkach wysepek trzustkowych 16, postanowiliśmy zbadać wpływ zaburzeń pracy zegara na funkcję i transkrypcję wysepek 18. Opracowaliśmy efektywny protokół transfekcji
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisane tutaj warunki eksperymentalne składają się z dobowego dostarczania dobowych reporterów bioluminescencji do hodowanych ludzkich komórek pierwotnych, a następnie synchronizacji in vitro i ciągłego rejestrowania bioluminescencji przez kilka dni oraz równoległej analizy wydzielania hormonów przez te same komórki. Stanowią one skuteczne podejście do badania mechanizmów molekularnych i funkcjonalnych aspektów zegarów okołodobowych w ludzkich komórkach pierwotnych.
Jakość materiału d.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Jesteśmy wdzięczni naszym kolegom z Uniwersytetu Genewskiego: Jacques'owi Philippe'owi za konstruktywne uwagi na temat tej pracy, Ueli Schibler za nieocenioną pomoc w rozwoju systemu peryfuzji i za inspirację naukową, André Liani za pomysł, zaprojektowanie, produkcję i uruchomienie systemu perfuzyjnego, firmie Lesa-Technology LTD za pomoc w tworzeniu systemu peryfuzyjnego i rozwoju oprogramowania Drip-biolumicorder, George'owi Severiemu za pomoc w eksperymentach peryfuzyjnych, Ursuli Loizides-Mangold za krytyczną lekturę manuskryptu i Anne-Marie Makhlouf za przygotowanie lentiwirusa; Etienne'owi Lefai, Stéphanie Chanon i Hubertowi Vidalowi (INSERM, Lyon) za przygotow....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300-054 | Do biopsji mięśni, trawienie |
| DPBS, bez wapnia, bez | magnezu Invitrogen | 14190-094 | |
| HAM F-10 | Invitrogen | 41550-021 | Do hodowli mioblastów |
| FBS | Invitrogen | 10270 | Suplement do podłoża hodowlanego |
| Penicylina-Streptomycyna | Sigma | P0781-100 | Suplement do pożywki |
| Akson gentamycyny | A1492.0001 | Suplement do podłoża hodowlanego | |
| Fungizone | Invitrogen | 15290-026 | Amfoterycyna B, suplement do pożywki |
| DMEM 1g/L glukozy + Na pirogronian + glutamax | Invitrogen | 21885-025 | Do hodowli myotubes |
| DMEM 1g/L glukozy -Na Pirogronian - glutamax | Invitrogen | 11880-028 | Nośnik danych dla LumiCycle |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-028 | Dipeptyd L-alanylo-L-glutaminy, suplement do podłoża rejestrującego |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT-104 | Roztwór do odłączania komórek, do dysocjacji komórek wysp trzustkowych |
| CMRL | Gibco | 21530-027 | Pożywka hodowlana dla komórek wysp trzustkowych |
| Pirogronian sodu | Gibco | 11360-039 | Dodatek do pożywki |
| 15 ml Probówka stożkowa polipropylenowa o wysokiej czystości | Kolba Falcon | 352096 | |
| F75 | BD Falcon | 353136 | |
| 3,5 cm szalka Petriego | BD Falcon | 353001 | |
| Foskolin | Sigma | F6886 | Aktywator cyklazy adenylylowej, używany do synchronizacji |
| Luciferin | Prolume LTD | 260150 | Suplement do nośnika zapisu |
| OptiMEM | Invitrogen | 51985-026 | Bez surowicy Minimal Essential Medium (MEM) stosowany do transfekcji ludzkich komórek wysp trzustkowych |
| Odczynnik Lipofectamine RNAiMAX Odczynnik | do transfekcji | Invitrogen | 13778-150 |
| Odczynnik HiPerFect | Qiagen | 301705 | Odczynnik do transfekcji |
| ON-TARGET plus siCLOCK smartpool | Dharmacon | L-008212-00 | |
| ON-TARGET plus nieukierunkowane siRNA #1 (siControl) | Dharmacon | D-001810-01 | |
| DNeasy Blood & Zestaw chusteczek | Qiagen | 69504 | Do ekstrakcji DNA myotubes |
| RNeasy Plus Mini kit | Qiagen | 74104 | Do ekstrakcji RNA myotubes |
| QIAshredder | Qiagen | 79654 | Do ekstrakcji RNA miotubek |
| 2 ml probówki zbiorcze | Axygen | 311-10-051 | Aby zebrać pożywkę z peryfuzją |
| Płytka do hodowli tkankowej, 6 Well | BD Falcon | 353046 | Do zbierania pożywki za pomocą zestawu perifusion |
| RNeasy Plus Micro | Qiagen | 74034 | Do ekstrakcji RNA wysp trzustkowych |
| Ludzki zestaw IL-6 Instant ELISA | eBioscience | 88-7066-22 | |
| Zestaw insuliny ludzkiej Mercodia Mercodia | 10-1113-01 | ||
| Kwas solny, min,37%,p.d. | Acros organics | 124630010 | Służy do przygotowania buforu do lizy (375 ml Etanol + 7,5%HCl + 117,5% H2O) |
| Etanol (>99,8%) | Fluka Analytical | 02860-1L | Służy do przygotowania buforu do lizy (375 ml Etanol + 7,5%HCl + 117,5% H2O) |
| Ludzkie wysepki do badań | Prodo Laboratories | ||
| Nazwa | Firma< | strong>Numer katalogowy | Komentarze |
| Sprzęt: | |||
| Wirówka | Heraeus | Megafuge 1.0R | |
| Łaźnia wodna | VWR | 1112A | w 37 ° C |
| Kaptur hodowlany Tissu | Szybciej | Inkubator kultur SafeFastElite | |
| Tissu | Heraeus | HeraCell 150 | 5% CO2 przy 37 stopniach; C, brak wody z powodu instalacji LumiCycle |
| Inkubator kultur Tissu | Heraeus | HeraCell 150 | 5% CO2 przy 37 ° C, brak wody z powodu instalacji LumiCycle |
| Inkubator kultur Tissu | Thermo Scientific | Hera Cell 150i | 5% CO2 przy 37 stopniach; C |
| Shaker | Heidolph Instruments | Unimax 1010 | Do mieszania mieszanki siRNA |
| LumiCycle | Actimetrics | ||
| LumiCycle oprogramowanie LumiCycle | Actimetrics | ||
| CosinorJ oprogramowanie | EPFL | Bezpłatnie dostępne pod adresem: http://bigwww.epfl.ch/algorithms/cosinorj/ | |
| Rheodyne titan MX | Oprogramowanie sterujące ERC GmbH | które steruje czasem pracy automatycznego przełącznika |
Bibliografia
- Albrecht, U. Timing to perfection: the biology of central and peripheral circadian clocks. Neuron. 74 (2), 246-260 (2012).
- Dibner, C., Schibler, U., Albrecht, U. The mammalian circadian timing system: organization and coordination of cent....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
