Pętla tętniczo-żylna (AV) w małym modelu zwierzęcym do badania angiogenezy i inżynierii tkanek unaczynionych

Annika Weigand; Justus P. Beier; Andreas Arkudas; Majida Al-Abboodi; Elias Polykandriotis; Raymund E. Horch; Anja M. Boos

doi:10.3791/54676

Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Pętla tętniczo-żylna (AV) w małym modelu zwierzęcym do badania angiogenezy i inżynierii tkanek unaczynionych

12.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54676

⸱

2 listopada 2016

Annika Weigand¹ , Justus P. Beier¹ , Andreas Arkudas¹ , Majida Al-Abboodi¹^,² , Elias Polykandriotis³ , Raymund E. Horch¹ , Anja M. Boos¹

¹Department of Plastic and Hand Surgery and Laboratory for Tissue Engineering and Regenerative Medicine, University Hospital of Erlangen, Friedrich-Alexander University of Erlangen-Nürnberg (FAU), ²Genetic Engineering and Biotechnology Institute for Postgraduate Studies, Baghdad University, ³Department of Plastic, Hand and Microsurgery, Sana Klinikum Hof GmbH

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy mikrochirurgiczne podejście do generowania pętli tętniczo-żylnej (AV) jako model do analizy unaczynienia in vivo w izolowanym i dobrze scharakteryzowanym środowisku. Model ten jest nie tylko przydatny do badania angiogenezy, ale jest również optymalnie przystosowany do inżynierii osiowo unaczynionych i przeszczepialnych tkanek.

Streszczenie

Funkcjonalna sieć naczyń krwionośnych jest warunkiem koniecznym do przetrwania i wzrostu prawie wszystkich tkanek i organów w ludzkim ciele. Co więcej, w sytuacjach patologicznych, takich jak rak, unaczynienie odgrywa wiodącą rolę w postępie choroby. W związku z tym istnieje silne zapotrzebowanie na ustandaryzowany i dobrze scharakteryzowany model in vivo w celu wyjaśnienia mechanizmów neowaskularyzacji i opracowania różnych podejść do unaczynienia dla inżynierii tkankowej i medycyny regeneracyjnej.

Opisujemy podejście mikrochirurgiczne dla małego modelu zwierzęcego do indukcji osi naczyniowej składającej się z żyły i tętnicy, które są połączone z pętlą tętniczo-żylną (AV). Pętla przedsionkowo-komorowa jest przenoszona do zamkniętej komory implantacyjnej w celu wytworzenia izolowanego mikrośrodowiska in vivo, które jest połączone z żywym organizmem tylko za pomocą osi naczyniowej. Za pomocą obrazowania 3D (MRI, mikrotomografia komputerowa) i immunohistologii można uwidocznić rosnące naczynia krwionośne w czasie. Poprzez wszczepienie różnych komórek, czynników wzrostu i matryc, ich funkcja w tworzeniu sieci naczyń krwionośnych może być analizowana bez żadnych zakłócających wpływów z otoczenia w dobrze kontrolowanym środowisku.

Oprócz badań nad angiogenezą i antyangiogenezą, model pętli AV doskonale nadaje się również do inżynierii unaczynionych tkanek. Po pewnym czasie prewaskularyzacji wytworzone tkanki mogą zostać przeszczepione w miejsce ubytku i mikrochirurgicznie połączone z lokalnymi naczyniami, zapewniając w ten sposób natychmiastowe ukrwienie i integrację zmodyfikowanej tkanki. Poprzez różnicowanie matryc, komórek, czynników wzrostu i architektury komór możliwe jest generowanie różnych tkanek, które następnie mogą być dostosowane do indywidualnych potrzeb pacjenta.

Wprowadzenie

Większość tkanek i organów w ludzkim ciele jest zależna od funkcjonalnej sieci naczyń krwionośnych, która dostarcza składniki odżywcze, wymienia gazy i usuwa produkty przemiany materii. Nieprawidłowe działanie tego systemu spowodowane miejscowymi lub ogólnoustrojowymi problemami naczyniowymi może prowadzić do wielu poważnych chorób. Ponadto w obszarach badawczych, takich jak inżynieria tkankowa czy medycyna regeneracyjna, funkcjonalna sieć naczyń krwionośnych w sztucznie wytworzonych tkankach lub przeszczepionych narządach jest niezbędna do skutecznego zastosowania klinicznego.

Przez dziesięciolecia badacze badali dokładne mechanizmy związane z rosnącym naczyniem, aby uzyskać głębszy wgląd w sytuacje patologiczne w celu znalezienia nowych interwencji terapeutycznych i zapewnienia lepszej profilaktyki zaburzeń naczyniowych. W pierwszym etapie podstawowe procesy, takie jak interakcje komórka-komórka lub wpływ cząsteczek na komórki układu naczyniowego, są zwykle badane za pomocą eksperymentów 2D lub 3D in vitro. Tradycyjne modele 2D są łatwe do wykonania, mają ugruntowaną pozycję i w znacznym stopniu przyczyniły się do lepszego zrozumienia tych procesów. Po raz pierwszy w 1980 roku Folkman i wsp. Opisano angiogenezę in vitro wysiewanie komórek śródbłonka naczyń włosowatych na płytkach pokrytych żelatyną¹. To natychmiast utorowało drogę do publikacji wielu dalszych eksperymentów angiogenezy 2D dotyczących testu tworzenia rurki komórkowej śródbłonka², testu migracji³ i kohodowli^{różnych typów} komórek4, a także innych. Testy te są nadal stosowane i akceptowane jako standardowe metody in vitro.

Jednak ta eksperymentalna konfiguracja nie zawsze jest odpowiednia do badania zachowania komórek in vivo, ponieważ większość typów komórek wymaga środowiska 3D do tworzenia odpowiednich fizjologicznych struktur tkankowych⁵. Można wykazać, że architektura matrycy 3D ma decydujące znaczenie dla morfogenezy naczyń włosowatych⁶ oraz że interakcje komórka-macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) i warunki hodowli 3D regulują ważne czynniki zaangażowane w angiogenezę nowotworu⁷. Matryca 3D dostarcza złożonych danych mechanicznych, może wiązać białka efektorowe i ustalać gradienty stężeń substancji rozpuszczonej w skali tkankowej. Ponadto uważa się, że jest to konieczne w celu naśladowania in vivo etapów morfogenetycznych i przebudowy w złożonych tkankach⁵. W tych układach można badać zarówno angiogenezę, jak i waskulogenezę. Podczas gdy angiogeneza opisuje kiełkowanie naczyń włosowatych z wcześniej istniejących naczyń krwionośnych⁸, waskulogeneza odnosi się do tworzenia naczyń krwionośnych de novo przez komórki śródbłonka lub ich przodków^9,10. Dojrzewanie naczyń jest opisywane w procesie zwanym "arteriogenezą" poprzez rekrutację komórek mięśni gładkich¹¹. Typowym angiogennym modelem in vitro jest kiełkowanie komórek śródbłonka z istniejących monowarstw osadzonych jako monowarstwa na powierzchniach żelu, na powierzchni mikrosfer osadzonych w żelu lub poprzez budowanie sferoid komórek śródbłonka¹². W modelach naczyniopochodnych pojedyncze komórki śródbłonka są uwięzione w żelu 3D. Oddziałują one z sąsiednimi komórkami śródbłonka, tworząc struktury i sieci naczyniowe de novo, zwykle w połączeniu z komórkami podporowymi¹².

Jednakże, nawet skomplikowane modele 3D in vitro nie są w stanie całkowicie naśladować ustawień in vivo, biorąc pod uwagę mnogość interakcji komórka-komórka i komórka-ECM¹³. Substancje o wysokiej aktywności in vitro nie wykazują automatycznie takich samych skutków in vivo i odwrotnie¹⁴. W celu kompleksowej analizy procesów unaczynienia istnieje pilna potrzeba opracowania modeli in vivo, które lepiej symulują sytuację w organizmie. W literaturze opisano szeroki zakres testów angiogenezy in vivo, w tym test błony kosmówkowo-omoczniowej piskląt (CAM), model danio pręgowanego, test angiogenezy rogówki, model grzbietowego worka powietrznego, grzbietową komorę fałdu skórnego, modele guzów podskórnych¹⁴. Jednak testy te często wiążą się z ograniczeniami, takimi jak szybkie zmiany morfologiczne, problemy z odróżnieniem nowych naczyń włosowatych od już istniejących w teście CAM lub ograniczona przestrzeń w teście angiogenezy rogówki¹⁵. Ponadto stosuje się systemy inne niż ssaki (np. model danio pręgowanego¹⁶), co prowadzi do problemów w ksenotransplantacji¹⁷. W podskórnym modelu guza nie można analizować angiogenezy pochodzącej tylko z samego guza, ponieważ sąsiednia tkanka w znacznym stopniu przyczynia się do procesu unaczynienia. Co więcej, otaczająca tkanka może odgrywać decydującą rolę w kształtowaniu mikrośrodowiska guza¹⁸.

Nie tylko do badania angiogenezy czy waskulogenezy istnieje silne zapotrzebowanie na ustandaryzowany i dobrze scharakteryzowany model in vivo, ale także do badania różnych strategii unaczynienia w inżynierii tkankowej i medycynie regeneracyjnej. Obecnie wytwarzanie złożonych sztucznych narządów lub tkanek jest możliwe zarówno in vitro, jak i in vivo. Biodruk 3D zapewnia technikę wytwarzania na żądanie do generowania złożonych, funkcjonalnych żywych tkanek 3D¹⁹. Co więcej, bioreaktory mogą być wykorzystywane do generowania tkanek²⁰, a nawet własne ciało może być używane jako bioreaktor²¹. Jednak główną przeszkodą w skutecznym zastosowaniu sztucznie wygenerowanych tkanek jest brak unaczynienia w obrębie zmodyfikowanych konstrukcji. Natychmiastowe połączenie z układem naczyniowym gospodarza po przeszczepie jest głównym warunkiem przeżycia, zwłaszcza w przypadku sztucznych tkanek lub narządów na dużą skalę.

Różne strategie prewaskularyzacji in vitro lub in vivo zostały opracowane w celu ustanowienia funkcjonalnej mikrokrążenia w konstruktach przed implantacją²². Wszczepienie rusztowania z uformowanymi naczyniami włosowatymi in vitro na grzbietowej skórze myszy doprowadziło do szybkiego zespolenia naczyń krwionośnych myszy w ciągu jednego dnia²³. W przeciwieństwie do tego, kokultura sferoidalna składająca się z ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych i ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej połączonych w trójwymiarową sieć przednaczyniową rozwinęła się dalej po implantacji in vivo. Jednak zespolenie z układem krwionośnym gospodarza było ograniczone²⁴. Przede wszystkim w przypadku słabo unaczynionych defektów, takich jak obszary martwicze lub napromieniowane, ta tak zwana unaczynienie zewnętrzne – wrastanie naczyń z otoczenia w rusztowanie – często kończy się niepowodzeniem. Z drugiej strony unaczynienie wewnętrzne opiera się na osi naczyniowej jako źródle nowych naczyń włosowatych wrastających do rusztowania²⁵. Korzystając z podejścia opartego na unaczynieniu osiowym, zmodyfikowaną tkankę można przeszczepić wraz z osią naczyniową i połączyć z lokalnymi naczyniami w miejscu biorczym. Bezpośrednio po przeszczepie tkanka jest odpowiednio wspierana przez tlen i składniki odżywcze, co stwarza odpowiednie warunki do optymalnej integracji.

Ze względu na ograniczoną dostępność modeli do badania angiogenezy in vivo oraz w uznaniu rosnącego znaczenia generowania osiowo unaczynionej tkanki, rozwinęliśmy podejście mikrochirurgiczne Erola i Spiry, aby wygenerować pętlę tętniczo-żylną (AV) w modelu zwierzęcym²⁶. Zastosowanie całkowicie zamkniętej komory implantacyjnej sprawia, że metoda ta bardzo dobrze nadaje się do badania powstawania naczyń krwionośnych w "kontrolowanych", dobrze scharakteryzowanych warunkach in vivo (ryc. 1). Model ten jest nie tylko przydatny do badania angiogenezy, ale jest również optymalnie przystosowany do osiowego unaczynienia rusztowań do celów inżynierii tkankowej.