Method Article

Ocena funkcji fagocytarnej mikrogleju siatkówki in vivo przy użyciu testu opartego na cytometrii przepływowej

DOI:

10.3791/54677

⸱

October 18th, 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cell and Molecular Biology, The Scripps Research Institute, 2Department of Chemical Physiology, The Scripps Research Institute, 3The Lowy Medical Research Institute

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fagocytoza mikrogleju jest kluczowa dla utrzymania homeostazy tkanek, a nieodpowiednia funkcja fagocytarna została zamieszana w patologię. Jednak ocena funkcji mikrogleju in vivo jest technicznie trudna. Opracowaliśmy prostą, ale solidną technikę precyzyjnego monitorowania i ilościowego określania potencjału fagocytarnego mikrogleju w warunkach fizjologicznych.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroglej to makrofagi rezydujące w tkankach ośrodkowego układu nerwowego (OUN) i pełnią różne funkcje wspierające homeostazę OUN, w tym fagocytozę uszkodzonych synaps lub komórek, szczątków i/lub atakujących patogenów. Upośledzona funkcja fagocytarna jest zaangażowana w patogenezę chorób, takich jak choroba Alzheimera i zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem, w których gromadzi się odpowiednio blaszka β amyloidem i druzy. Pomimo swojego znaczenia, fagocytoza mikrogleju jest trudna do oceny in vivo. W tym miejscu opisujemy prostą, ale solidną technikę precyzyjnego monitorowania i ilościowego określania potencjału fagocytarnego mikrogleju siatkówki in vivo. Poprzednie metody opierały się na barwieniu immunohistochemicznym i technikach obrazowania. Nasza metoda wykorzystuje cytometrię przepływową do pomiaru wychwytu mikrogleju przez cząstki znakowane fluorescencyjnie po podaniu do ciała szklistego do oka u żywych gryzoni. Metoda ta zastępuje konwencjonalne praktyki, które obejmują pracochłonne cięcie tkanek, barwienie immunologiczne i obrazowanie, pozwalając na bardziej precyzyjne określenie ilościowe funkcji fagocytarnej mikrogleju w niecałe sześć godzin. Procedura ta może być również dostosowana do testowania, jak różne związki zmieniają fagocytozę mikrogleju w warunkach fizjologicznych. Chociaż technika ta została opracowana w oku, jej zastosowanie nie ogranicza się do badań nad wzrokiem.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ogólnym celem tej metody jest dokładna ocena i ilościowe określenie fagocytozy mikrogleju in vivo. Mikroglej to rezydujące w tkankach makrofagi ośrodkowego układu nerwowego (OUN). Pełnią one różnorodne funkcje zapewniające utrzymanie homeostazy tkanek. Należą do nich nadzór immunologiczny, wydzielanie czynników neurotroficznych i, co ma kluczowe znaczenie, fagocytoza1. Fagocytoza mikrogleju ma kluczowe znaczenie w kilku ważnych wydarzeniach podczas rozwoju mózgu i siatkówki, takich jak fagocytoza nieistotnych synaps (przycinanie synaptyczne) i usuwanie neuronów apoptotycznych2-4. Ponadto wykazano, że fagocytoza mikrogleju uszkodzonych lub apoptotycznych neuronów, szczątków komórkowych i inwazyjnych drobnoustrojów jest niezbędna do utrzymania homeostazy OUN w wieku dorosłym5. Wreszcie, fagocytoza mikrogleju jest zaangażowana w patogenezę kilku chorób neurodegeneracyjnych, w tym choroby Alzheimera i zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem, gdzie zasugerowano, że wadliwa lub niewystarczająca zdolność fagocytarna może przyczyniać się do gromadzenia się blaszek β amyloidu (Aβ) i druz, odpowiednio6,7.

Funkcja mikrogleju jest ściśle regulowana przez ich mikrośrodowisko, zwłaszcza przez rozpuszczalne czynniki, takie jak czynnik wzrostu nowotworu β lub interakcje komórka-komórka. Neurony konstytutywnie wyrażają kilka ligandów powierzchniowych komórek, takich jak CD200 i CX3CL1, podczas gdy mikroglej wyraża wyłącznie odpowiednie receptory CD200R i CX3CR1. Receptory te zawierają immunoreceptorowe motywy hamowania oparte na tyrozynie (ITIMs) w swojej części wewnątrzkomórkowej. Te receptory inhibitorów mają kluczowe znaczenie dla zapobiegania nadmiernej stymulacji mikrogleju, która może przyczyniać się do zapalenia nerwów. Tak więc w normalnych warunkach fizjologicznych interakcje komórka-komórka między neuronami a mikroglejem utrzymują mikroglej w stanie spoczynku. Jednak podczas uszkodzenia tkanki neurony mogą zmniejszać ekspresję tych ligandów, usuwając ich hamujący wpływ na aktywację mikrogleju. Funkcja mikrogleju (w tym fagocytoza) jest zatem ściśle związana z ich mikrośrodowiskiem8. Niemniej jednak do tej pory nie ma standaryzowanych testów do badania fagocytozy mikrogleju w kontekście fizjologicznym lub w sposób, który w pełni replikuje ich mikrośrodowisko OUN.

Opracowano kilka testów do pomiaru aktywności fagocytarnej mikrogleju in vitro, gdzie pierwotne linie komórkowe mikrogleju lub mikrogleju są hodowane z komórkami docelowymi (np. neuronami apoptotycznymi) lub fluorescencyjnie znakowanymi kulkami. Wychwyt docelowy jest następnie oceniany za pomocą mikroskopii obrazowania fluorescencyjnego lub cytometrii przepływowej9-12. Testy te pozwalają na sprawdzenie, w jaki sposób manipulacja farmakologiczna lub genetyczna może wpływać na fagocytozę mikrogleju i, choć dostarcza informacji, nie jest w stanie w pełni odtworzyć złożonego środowiska in vivo. Opisano pośrednie metody badania fagocytozy mikrogleju in vivo: osiąga się je poprzez barwienie cząsteczek uważanych za zaangażowane w fagocytozę (np. CD68), ocenę fizycznej bliskości mikrogleju i celów fagocytozy (np. Uszkodzone neurony lub elementy synaptyczne) lub przez immunohistochemiczne wykrywanie celów fagocytarnych w komórkach mikrogleju (np. Aβ)13-17. W dwóch badaniach zastosowano bardziej bezpośrednie podejścia do oceny fagocytozy mikrogleju in vivo. Hughes i współpracownicy wykorzystali techniki obrazowania do pomiaru wychwytu mikrogleju przez kulki dostarczane drogą wewnątrzczaszkową18. Sierra i wsp. Opracowano udoskonaloną metodę ilościowej oceny fagocytozy mikrogleju komórek apoptotycznych przy użyciu złożonych technik obrazowania4. Jednak metody te obejmują skomplikowane protokoły przygotowania tkanek, cięcia, obrazowania i analizy. Wcześniej stosowaliśmy analizę cytometrii przepływowej do oceny fagocytozy zewnętrznych segmentów fotoreceptorów przez komórki nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) w hodowli19. W tym miejscu opisujemy protokół szybkiej oceny wychwytu cząstek znakowanych fluorescencyjnie przez mikroglej siatkówki jako ilościową miarę fagocytozy mikrogleju in vivo.

Protokół, który tutaj opisujemy, pozwala na wiarygodny i ilościowy pomiar fagocytozy mikrogleju siatkówki w ciągu niecałych sześciu godzin w trzech kluczowych krokach: (1) doszklistkowe dostarczanie fluorescencyjnie znakowanych cząstek, (2) pobieranie i przygotowanie tkanki siatkówki oraz (3) analiza cytometryczna przepływowa. Opracowana przez nas metoda jest solidną metodą oceny fagocytozy mikrogleju w siatkówce i może być z powodzeniem stosowana do testowania, w jaki sposób różne związki lub manipulacje genetyczne zmieniają tę kluczową funkcję mikrogleju w warunkach fizjologicznych. Jako wyspecjalizowany obszar OUN, siatkówka jest łatwo dostępnym systemem modelowym do badania funkcji mikrogleju20. Chociaż metoda ta została opracowana w oku, uważamy, że może być przydatna dla wszystkich neurobiologów badających funkcję fagocytarną mikrogleju.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie zwierzęta były leczone zgodnie z wytycznymi etycznymi ustalonymi przez Instytut Badawczy Scripps.

1. Przygotowanie materiałów do iniekcji

  1. Wysterylizować igłę i strzykawkę o strzale 33 G: zdemontować i sterylizować w autoklawie w temperaturze 115 οC. Przygotować igły do wstrzykiwań, podnosząc je w sterylnym roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
  2. Rozmrażać fluorescencyjnie znakowane cząstki w temperaturze pokojowej przez 5 - 10 minut. Przygotować roztwór cząstek do wstrzykiwań, rozpuszczając do roztworu 50 mg/ml w sterylnym PBS z Ca2+/Mg2+,
    UWAGA: Cząstki pochodzenia grzybowego znakowane AF488, które zostały zwalidowane do testów fagocytozy, są używane w tym protokole21-23. Aby uzyskać optymalne wchłanianie, należy przygotować cząsteczki świeże i bezpośrednio przed wstrzyknięciem.
    Uwaga 2: Stężenia cząstek mogą być zoptymalizowane dla każdego konkretnego eksperymentu.

2. Doszklistkowe wstrzykiwanie roztworu kulek

UWAGA: Do wykonania wstrzyknięcia wymagane są dwie osoby w taki sposób, aby osoba wykonująca wstrzyknięcie mogła trzymać mysz i utrzymywać ostrość na gałce ocznej, podczas gdy druga osoba podaje załadowaną strzykawkę i naciska tłok.

  1. Znieczulić gryzonia przez wstrzyknięcie dootrzewnowe 100 mg/ml ketaminy i 10 mg/ml ksylazyny w dawce 20 μl/10 g masy ciała. Przed wstrzyknięciem należy użyć szczypania palca u nogi, aby ocenić poziom znieczulenia.
    UWAGA: Izofluran ma głęboki wpływ na funkcję komórek szpikowych, dlatego należy unikać jego stosowania w tym teście24,25.
  2. Załadować igłę 0,5 μl znakowanego fluorescencyjnie roztworu cząstek.
  3. Połóż mysz bokiem pod mikroskopem chirurgicznym (ryc. 1A-B). Użyj miękkiego materiału, np. wkładu żelowego, dla lepszego ułożenia myszy. W przypadku młodych myszy, u których oczy nie są jeszcze otwarte, delikatnie otwórz powieki za pomocą cienkich kleszczy pod kątem 45o, tworząc szczelinę wzdłuż szczeliny, z której powieki ostatecznie się otworzą.
    1. Za pomocą cienkich kleszczyków ustawionych pod kątem 45o ostrożnie dociśnij okolice powieki, tak aby gałka oczna lekko wyskoczyła z oczodołu. Przytrzymaj głowę dwoma palcami tuż nad uchem i za szczękę i delikatnie rozciągnij skórę równolegle do powiek, aby oko było lekko poza oczodołem. Uważaj, aby nie chwycić zbyt blisko gardła (Rysunek 1B).
  4. Aby przebić gałkę oczną, należy włożyć igłę strzykawki w rąbek rogówki (w miejscu, w którym rogówka i twardówka łączą się). Jest to widoczne jako szare kółko u pigmentowanych myszy. Lekko wycofać igłę, aby usunąć niewielką objętość płynu szklistego, a następnie wstrzyknąć. Osoba wykonująca wstrzyknięcie powinna delikatnie trzymać jedną ręką mysz, a drugą igłę; Druga osoba powinna powoli naciskać tłok.
  5. Powoli wycofać strzykawkę. Stosuj krople nawilżające do oczu, aby utrzymać nawilżenie oka.
  6. Pozwól gryzoniowi dojść do siebie w klatce nad poduszką grzewczą i kontynuuj monitorowanie zwierzęcia. Jeśli pracujesz ze szczeniętami, nie umieszczaj zwierzęcia w klatce z innymi czujnymi zwierzętami, dopóki nie zacznie oddychać i nie będzie zdolne do spontanicznych ruchów. Jeśli pracujesz z dorosłymi, nie umieszczaj gryzonia w klatce z innymi czujnymi zwierzętami, dopóki nie odzyska pozycji mostka.

3. Pobieranie tkanki siatkówki

UWAGA: Tkanka siatkówki z oczu, do której nie wstrzyknięto cząstek znakowanych fluorescencyjnie, powinna być pobrana jako kontrola do analizy cytometrii przepływowej. Chociaż test można wykonać przy użyciu pojedynczej siatkówki, aby uzyskać najlepszą wydajność, dwie siatkówki powinny być połączone razem.

  1. Pobrać tkankę siatkówki 3 godziny po wstrzyknięciu do ciała szklistego fluorescencyjnie znakowanych cząstek.
    UWAGA: Chociaż czas po wstrzyknięciu roztworu cząstek może być zoptymalizowany dla każdego konkretnego eksperymentu, stwierdziliśmy, że 3 godziny po wstrzyknięciu wychwyt cząstek można było zaobserwować w większości warstw siatkówki (ryc. 1C-D).
  2. Ofiaruj myszy przez zwichnięcie szyjki macicy.
  3. Zbierz gałki oczne, delikatnie naciskając na powiekę za pomocą cienkich kleszczy pod kątem 45o, aby podeprzeć gałkę oczną. Umieść kleszcze za gałką oczną i pociągnij.
  4. Wypreparuj siatkówkę pod mikroskopem preparacyjnym. Przenieść gałkę oczną na szalkę Petriego zawierającą niewielką ilość PBS z Ca2+/Mg2+. W suchym miejscu szalki Petriego przebij gałkę oczną w rąbku rogówki końcówką bardzo cienkich kleszczyków.
  5. Przytrzymaj gałkę oczną za pomocą cienkich kleszczy pod kątem 45o i użyj nożyczek sprężynowych, aby przeciąć wokół rąbka rogówki, aż zostanie przecięta mniej więcej połowa obwodu rąbka rogówki.
  6. Przytrzymaj gałkę oczną cienkimi kleszczami pod kątem 45o i wprowadź gałkę oczną do PBS. Drugą parą cienkich kleszczy pod kątem 45o rozerwij rogówkę i twardówkę. Soczewka i siatkówka wyjdą nienaruszone.
  7. Oddziel soczewkę i siatkówkę. Zebrać siatkówkę i przenieść do probówki z polistyrenu o pojemności 5,4 ml zawierającej 2 ml PBS z Ca2 + / Mg2 +.

4. Przygotowanie zawiesiny jednokomórkowej

  1. Przygotuj zawiesiny pojedynczych komórek za pomocą zestawu do dysocjacji tkanek nerwowych z niewielkimi modyfikacjami w stosunku do instrukcji producenta. Krótko mówiąc, rozcierać siatkówki, pipetując w górę i w dół pipetą P1000 i przeprowadzając trawienie enzymatyczne w temperaturze 37 oC bez wstrząsania.

5. Barwienie zawiesin pojedynczych komórek do analizy cytometrycznej przepływowej

  1. Ponownie zawiesić komórki w 200 μl buforu barwiącego (sól fizjologiczna buforowana fosforanami Dulbecco z 0,2% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) i 0,09% azydkiem sodu) i przenieść na 96-dołkową płytkę z dnem w kształcie litery U. Wirować przez 5 minut przy 130 x g.
    UWAGA: Azydek sodu jest szkodliwy dla ludzi i środowiska. Używaj odpowiednich środków ochrony osobistej i wyrzucaj odpady zgodnie z lokalnymi przepisami.
  2. Odwróć talerz nad zlewem, aby wyrzucić supernatant. Aby zablokować receptory Fc, należy ponownie zawiesić komórki w 25 μl buforu barwiącego zawierającego 5 μg/ml przeciwciała anty-mysiego CD16/CD32 na dołek. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Dodać 25 μl buforu barwiącego zawierającego 0,5 μg/ml anty-mysiego Ly6C-APC-Cy7, 0,5 μg/ml anty-mysiego Ly6G-Pe-Cy7 i 2,5 μg/ml anty-mysiego CD11b-AF650. Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
  4. Wirować przez 5 minut przy 130 x g. Odwrócić płytkę, aby odrzucić supernatant. Przemyć przez ponowne zawieszenie komórek w 200 μl buforu barwiącego.
  5. Wirować przez 5 minut przy 130 x g. Zawiesić w 200 μl buforu barwiącego zawierającego 0,5 μg/ml jodku propidyny (PI). Przenieść do probówek do mikromiareczkowania o pojemności 1,2 ml.
  6. Przemyć studzienki dodatkowymi 100 μl buforu barwiącego zawierającego 0,5 μg/ml PI i połączyć poprzednie 200 μl w probówkach do mikromiareczkowania o pojemności 1,2 ml. Uzyskuje się całkowitą objętość 300 μl barwionych komórek.

6. Analiza cytometryczna przepływowa

  1. Używając konwencjonalnych trzech laserów (fioletowego, niebieskiego i czerwonego lasera), unikaj barwników PE, PerCP-Cy5.5, BV510 i PI ze względu na znaczne rozlanie się niezwykle jasnych cząstek fluorescencyjnych AF488. Użyj czwartego (żółtego) lasera, aby zoptymalizować ten test, ponieważ pozwala on na użycie przeciwciał znakowanych PE i PI (w kanale mCherry zamiast kanału PerCP-Cy5.5) (Figura 2).
    UWAGA: Jeśli żółty laser nie jest dostępny, użyj barwnika wykluczającego martwe komórki w innym kanale.
  2. Bramka na komórkach ujemnych PI (PI-), aby wykluczyć martwe komórki (Figura 2B).
  3. Po wykluczeniu martwych komórek, bramka na komórkach dodatnich CD11b (CD11b +), obejmie to wszystkie komórki szpikowe (Figura 2C).
  4. W populacji CD11b+, brama na Ly6C-/Ly6G- w celu wykluczenia neutrofili (CD11b+/Ly6G+) i monocytów (CD11b+/Ly6C+; Rysunek 2D). Po bramkowaniu na mikrogleju (tutaj zdefiniowanym jako CD11b+/Ly6C-/Ly6G- dla uproszczenia) powinny być widoczne dwie wyraźne populacje; jeden ujemny i jeden dodatni dla cząstek znakowanych fluorescencyjnie. Komórki fagocytarne będą pobierać cząstki i dlatego są AF488+ (Figura 2E).
    UWAGA: Populacje Ly6C dodatnie lub Ly6G dodatnie mogą być również analizowane w celu zmierzenia wychwytu cząstek przy użyciu tego podejścia do barwienia. Odsetek komórek fagocytarnych CD11b + dobrze koreluje z odsetkiem mikrogleju fagocytarnego (Figura 2F). Dla badaczy bez doświadczenia w cytometrii przepływowej można przeprowadzić prostszą analizę z samym barwieniem CD11b, choć będzie to obejmować neutrofile fagocytarne i monocyty, a także mikroglej. W tej populacji CD11b+/Ly6C-/Ly6G- komórki te są > 99% mikrogleju, co oceniano na podstawie barwienia markerami F4/80 i CX3CR1; Te markery można dodawać, ale nie są one konieczne w naszych rękach.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy metodę szybkiego i niezawodnego ilościowego określania liczby fagocytarnych mikrogleju siatkówki w warunkach fizjologicznych za pomocą analizy cytometrycznej przepływowej (Rysunek 2). Metodę tę można dostosować do badania wpływu związków i/lub manipulacji genetycznych na zdolność fagocytarną mikrogleju (ryc. 3A, 3B). Może być również stosowany u młodych (10-20 dni po porodzie) lub dorosłych myszy (ryc. 3C). Różne ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tej metodzie istnieją trzy kluczowe etapy: (1) wstrzyknięcie do ciała szklistego fluorescencyjnie znakowanych cząstek; 2) pobieranie i preparacja tkanki siatkówki; oraz (3) analiza metodą cytometrii przepływowej. Zalecamy, aby badacze przećwiczyli iniekcje doszklistkowe przed wykonaniem metody, którą tutaj prezentujemy. Myszy albinosy (np. BALB/c) i kolorowy roztwór (np. cząstki znakowane fluorescencyjnie) mogą być używane do łatwej wizualizacji igły i wstrzykniętego roztworu. Wstrzyknięcia do ciała s...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Salome Murinello jest wspierana przez grant Amerykańskiego Towarzystwa Diabetologicznego #1-16-PDF-072. Prace te były wspierane przez granty dla Martina Friedlandera z National Institutes of Health (National Eye Institute EY11254 i EY22025) oraz Lowy Medical Research Institute.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Mikroskop stereoskopowyNikonwycofany z produkcji
Hamilton  strzykawka, seria 600Sigma26702
33 gauge, Small Hub RN NDL, 0,5 cala, typ punktowy 4 - 12oHamilton7803-05
Zymosan A (S. cerevisiae) BioParticles, koniugat Alexa Fluor 488ThermoFisher ScientificZ-23373Przygotować bezpośrednio przed wstrzyknięciem
DPBSCorning21-030-CV
Dumont #5/45 KleszczeNarzędzia do nauki11251-35Potrzebujesz dwóch
kleszczyków Dumont #5SFNarzędzia do nauki o sztuce11252-00
Nożyczki sprężynowe Vannas - 3 mm Krawędź tnącaNarzędzia do nauki o wysokiej15000-10Zestaw do
dysocjacji zakrzywionej tkanki nerwowej – Neurony poporodoweMiltenyi Biotec130-094-802
5 ml Polistyrenowa probówka okrągłodennaFalcon352054
96-dołkowa płytka denna w kształcie litery UBufor353077
(BSA)BD Biosciences554657
CD11b-BV650 PrzeciwciałoBioLegend101259
Ly6C-APC-Cy7BioLegend
Ly6G-PE-Cy7BioLegend127617
Jodek PropidiumBD Biosciences556463
Oczyszczone przeciwciało anty-mysie CD16/32BioLegend101301
pięknej jakości do barwienia Falcon 128025

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gomez-Nicola, D., Perry, V. H. Microglial dynamics and role in the healthy and diseased brain: a paradigm of functional plasticity. Neuroscientist. 21, 169-184 (2015).
  2. Tremblay, M. E., Lowery, R. L., Majewska, A. K. Microglial interactions with synapses are modulated by visual experience. PLoS Biol. 8, e1000527(2010).
  3. Schafer, D. P., et al. Microglia sculpt postnatal neural circuits in an activity and complement-dependent manner. Neuron. 74, 691-705 (2012).
  4. Sierra, A., et al. Microglia shape adult hippocampal neurogenesis through apoptosis-coupled phagocytosis. Cell Stem Cell. 7, 483-495 (2010).
  5. Sierra, A., Abiega, O., Shahraz, A., Neumann, H. Janus-faced microglia: beneficial and detrimental consequences of microglial phagocytosis. Front Cell Neurosci. 7 (6), (2013).
  6. Chan, G., et al. CD33 modulates TREM2: convergence of Alzheimer loci. Nat Neurosci. 18, 1556-1558 (2015).
  7. Murinello, S., Mullins, R. F., Lotery, A. J., Perry, V. H., Teeling, J. L. Fcgamma receptor upregulation is associated with immune complex inflammation in the mouse retina and early age-related macular degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, 247-258 (2014).
  8. Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses. Annu Rev Immunol. 27, 119-145 (2009).
  9. Derecki, N., Cronk, J., Kipnis, J. Assay of phagocytic function in primary murine microglia. Protoc Exchange. , (2012).
  10. Fricker, M., Oliva-Martin, M. J., Brown, G. C. Primary phagocytosis of viable neurons by microglia activated with LPS or Abeta is dependent on calreticulin/LRP phagocytic signalling. J Neuroinflammation. 9, 196(2012).
  11. Koenigsknecht-Talboo, J., Landreth, G. E. Microglial phagocytosis induced by fibrillar beta-amyloid and IgGs are differentially regulated by proinflammatory cytokines. J Neurosci. 25, 8240-8249 (2005).
  12. Neher, J. J., et al. Inhibition of microglial phagocytosis is sufficient to prevent inflammatory neuronal death. J Immunol. 186, 4973-4983 (2011).
  13. Fricker, M., et al. MFG-E8 mediates primary phagocytosis of viable neurons during neuroinflammation. J Neurosci. 32, 2657-2666 (2012).
  14. Mildner, A., et al. Distinct and non-redundant roles of microglia and myeloid subsets in mouse models of Alzheimer's disease. J Neurosci. 31, 11159-11171 (2011).
  15. Neher, J. J., et al. Phagocytosis executes delayed neuronal death after focal brain ischemia. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, E4098-E4107 (2013).
  16. Perego, C., Fumagalli, S., De Simoni, M. G. Temporal pattern of expression and colocalization of microglia/macrophage phenotype markers following brain ischemic injury in mice. J Neuroinflammation. 8, 174-174 (2011).
  17. Preissler, J., et al. Altered microglial phagocytosis in GPR34-deficient mice. Glia. 63, 206-215 (2015).
  18. Hughes, M. M., Field, R. H., Perry, V. H., Murray, C. L., Cunningham, C. Microglia in the degenerating brain are capable of phagocytosis of beads and of apoptotic cells, but do not efficiently remove PrP(Sc), even upon LPS stimulation. Glia. 58, 2017-2030 (2010).
  19. Westenskow, P. D., et al. Using flow cytometry to compare the dynamics of photoreceptor outer segment phagocytosis in iPS-derived RPE cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53, 6282-6290 (2012).
  20. London, A., Benhar, I., Schwartz, M. The retina as a window to the brain-from eye research to CNS disorders. Nat Rev Neurol. 9, 44-53 (2013).
  21. Fritzenwanger, M., Jung, C., Goebel, B., Lauten, A., Figulla, H. R. Impact of short-term systemic hypoxia on phagocytosis, cytokine production, and transcription factor activation in peripheral blood cells. Mediators Inflamm. , 429501(2011).
  22. Ragsdale, R. L., Grasso, R. J. An improved spectrofluorometric assay for quantitating yeast phagocytosis in cultures of murine peritoneal macrophages. J Immunol Methods. 123, 259-267 (1989).
  23. Stokes, L., Surprenant, A. Dynamic regulation of the P2X4 receptor in alveolar macrophages by phagocytosis and classical activation. Eur J Immunol. 39, 986-995 (2009).
  24. Kotani, N., et al. Intraoperative modulation of alveolar macrophage function during isoflurane and propofol anesthesia. Anesthesiology. 89, 1125-1132 (1998).
  25. Xu, X., Feng, J., Zuo, Z. Isoflurane preconditioning reduces the rat NR8383 macrophage injury induced by lipopolysaccharide and interferon gamma. Anesthesiology. 108, 643-650 (2008).
  26. abd-el-Basset, E., Fedoroff, S. Effect of bacterial wall lipopolysaccharide (LPS) on morphology, motility, and cytoskeletal organization of microglia in cultures. J Neurosci Res. 41, 222-237 (1995).
  27. Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. J Vis Exp. , (2014).
  28. Jackson, W. S. Selective vulnerability to neurodegenerative disease: the curious case of Prion Protein. Dis Model Mech. 7, 21-29 (2014).
  29. O'Koren, E. G., Mathew, R., Saban, D. R. Fate mapping reveals that microglia and recruited monocyte-derived macrophages are definitively distinguishable by phenotype in the retina. Sci Rep. 6, 20636(2016).
  30. Usui, Y., et al. Angiogenesis and Eye Disease. Annu Rev Vision. 1, 155-184 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Retinal MicrogliaPhagocytic FunctionFlow CytometryIntravitreal InjectionFluorescent ParticlesTissue DissociationCell SuspensionFc Receptor BlockingViability DyeLPS Challenge

Related Articles