Method Article

Ocena funkcji fagocytarnej mikrogleju siatkówki in vivo przy użyciu testu opartego na cytometrii przepływowej

DOI:

10.3791/54677

⸱

October 18th, 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cell and Molecular Biology, The Scripps Research Institute, 2Department of Chemical Physiology, The Scripps Research Institute, 3The Lowy Medical Research Institute

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fagocytoza mikrogleju jest kluczowa dla utrzymania homeostazy tkanek, a nieodpowiednia funkcja fagocytarna została zamieszana w patologię. Jednak ocena funkcji mikrogleju in vivo jest technicznie trudna. Opracowaliśmy prostą, ale solidną technikę precyzyjnego monitorowania i ilościowego określania potencjału fagocytarnego mikrogleju w warunkach fizjologicznych.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroglej to makrofagi rezydujące w tkankach ośrodkowego układu nerwowego (OUN) i pełnią różne funkcje wspierające homeostazę OUN, w tym fagocytozę uszkodzonych synaps lub komórek, szczątków i/lub atakujących patogenów. Upośledzona funkcja fagocytarna jest zaangażowana w patogenezę chorób, takich jak choroba Alzheimera i zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem, w których gromadzi się odpowiednio blaszka β amyloidem i druzy. Pomimo swojego znaczenia, fagocytoza mikrogleju jest trudna do oceny in vivo. W tym miejscu opisujemy prostą, ale solidną technikę precyzyjnego monitorowania i ilościowego określania potencjału fagocytarnego mikrogleju siatkówki in vivo. Poprzednie metody opierały się na barwieniu immunohistochemicznym i technikach obrazowania. Nasza metoda wykorzystuje cytometrię przepływową do pomiaru wychwytu mikrogleju przez cząstki znakowane fluorescencyjnie po podaniu do ciała szklistego do oka u żywych gryzoni. Metoda ta zastępuje konwencjonalne praktyki, które obejmują pracochłonne cięcie tkanek, barwienie immunologiczne i obrazowanie, pozwalając na bardziej precyzyjne określenie ilościowe funkcji fagocytarnej mikrogleju w niecałe sześć godzin. Procedura ta może być również dostosowana do testowania, jak różne związki zmieniają fagocytozę mikrogleju w warunkach fizjologicznych. Chociaż technika ta została opracowana w oku, jej zastosowanie nie ogranicza się do badań nad wzrokiem.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ogólnym celem tej metody jest dokładna ocena i ilościowe określenie fagocytozy mikrogleju in vivo. Mikroglej to rezydujące w tkankach makrofagi ośrodkowego układu nerwowego (OUN). Pełnią one różnorodne funkcje zapewniające utrzymanie homeostazy tkanek. Należą do nich nadzór immunologiczny, wydzielanie czynników neurotroficznych i, co ma kluczowe znaczenie, fagocytoza1. Fagocytoza mikrogleju ma kluczowe znaczenie w kilku ważnych wydarzeniach podczas rozwoju mózgu i siatkówki, takich jak fagocytoza nieistotnych synaps (przycinanie synaptyczne) i usuwanie neuronów apoptotycznych2-4. Ponadto wykazano, że fagocytoza mikrogleju uszkodzonych lu....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie zwierzęta były leczone zgodnie z wytycznymi etycznymi ustalonymi przez Instytut Badawczy Scripps.

1. Przygotowanie materiałów do iniekcji

  1. Wysterylizować igłę i strzykawkę o strzale 33 G: zdemontować i sterylizować w autoklawie w temperaturze 115 οC. Przygotować igły do wstrzykiwań, podnosząc je w sterylnym roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
  2. Rozmrażać fluorescencyjnie znakowane cząstki w temperaturze pokojowej przez 5 - 10 minut. Przygotować roztwór cząstek do wstrzykiwań, rozpuszczając do roztworu 50 mg/ml w sterylnym PBS z Ca2+/Mg2+,
    UWAGA: Cząstki pochodzenia gr....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy metodę szybkiego i niezawodnego ilościowego określania liczby fagocytarnych mikrogleju siatkówki w warunkach fizjologicznych za pomocą analizy cytometrycznej przepływowej (Rysunek 2). Metodę tę można dostosować do badania wpływu związków i/lub manipulacji genetycznych na zdolność fagocytarną mikrogleju (ryc. 3A, 3B). Może być również stosowany u młodych (10-20 dni po porodzie) lub dorosłych myszy (ryc. 3C). Różne .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tej metodzie istnieją trzy kluczowe etapy: (1) wstrzyknięcie do ciała szklistego fluorescencyjnie znakowanych cząstek; 2) pobieranie i preparacja tkanki siatkówki; oraz (3) analiza metodą cytometrii przepływowej. Zalecamy, aby badacze przećwiczyli iniekcje doszklistkowe przed wykonaniem metody, którą tutaj prezentujemy. Myszy albinosy (np. BALB/c) i kolorowy roztwór (np. cząstki znakowane fluorescencyjnie) mogą być używane do łatwej wizualizacji igły i wstrzykniętego roztworu. Wstrzyknięcia do ciała s.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Salome Murinello jest wspierana przez grant Amerykańskiego Towarzystwa Diabetologicznego #1-16-PDF-072. Prace te były wspierane przez granty dla Martina Friedlandera z National Institutes of Health (National Eye Institute EY11254 i EY22025) oraz Lowy Medical Research Institute.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Mikroskop stereoskopowyNikonwycofany z produkcji
Hamilton  strzykawka, seria 600Sigma26702
33 gauge, Small Hub RN NDL, 0,5 cala, typ punktowy 4 - 12oHamilton7803-05
Zymosan A (S. cerevisiae) BioParticles, koniugat Alexa Fluor 488ThermoFisher ScientificZ-23373Przygotować bezpośrednio przed wstrzyknięciem
DPBSCorning21-030-CV
Dumont #5/45 KleszczeNarzędzia do nauki11251-35Potrzebujesz dwóch
kleszczyków Dumont #5SFNarzędzia do nauki o sztuce11252-00
Nożyczki sprężynowe Vannas - 3 mm Krawędź tnącaNarzędzia do nauki o wysokiej15000-10Zestaw do
dysocjacji zakrzywionej tkanki nerwowej – Neurony poporodoweMiltenyi Biotec130-094-802
5 ml Polistyrenowa probówka okrągłodennaFalcon352054
96-dołkowa płytka denna w kształcie litery UBufor353077
(BSA)BD Biosciences554657
CD11b-BV650 PrzeciwciałoBioLegend101259
Ly6C-APC-Cy7BioLegend
Ly6G-PE-Cy7BioLegend127617
Jodek PropidiumBD Biosciences556463
Oczyszczone przeciwciało anty-mysie CD16/32BioLegend101301
pięknej jakości do barwienia Falcon 128025

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gomez-Nicola, D., Perry, V. H. Microglial dynamics and role in the healthy and diseased brain: a paradigm of functional plasticity. Neuroscientist. 21, 169-184 (2015).
  2. Tremblay, M. E., Lowery, R. L., Majewska, A. K. Microglial interactions with ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Retinal MicrogliaPhagocytic FunctionFlow CytometryIntravitreal InjectionFluorescent ParticlesTissue DissociationCell SuspensionFc Receptor BlockingViability DyeLPS Challenge

Related Articles