Narzędzia do badania roli architektonicznego białka HMGB1 w przetwarzaniu zniekształcających helisę, specyficznych dla miejsca wiązań międzyniciowych DNA

Podsumowanie

Ukierunkowane uszkodzenie DNA można osiągnąć poprzez przywiązanie czynnika uszkadzającego DNA do oligonukleotydu tworzącego triplex (TFO). Za pomocą zmodyfikowanych TFO, asocjacji białek specyficznych dla uszkodzenia DNA i modyfikacji topologii DNA można badać w komórkach ludzkich poprzez wykorzystanie zmodyfikowanych testów immunoprecypitacji chromatyny i testów superzwijania DNA opisanych w niniejszym dokumencie.

Streszczenie

Białko HMGB1 o wysokiej mobilności jest białkiem o architekturze niehistonowej, które bierze udział w regulacji wielu ważnych funkcji w genomie, takich jak transkrypcja, replikacja DNA i naprawa DNA. HMGB1 wiąże się ze strukturalnie zniekształconym DNA z większym powinowactwem niż do kanonicznego B-DNA. Na przykład odkryliśmy, że HMGB1 wiąże się z wiązaniami krzyżowymi międzyniciowymi DNA (ICL), które kowalencyjnie łączą dwie nici DNA, powodują zniekształcenie helisy, a jeśli nie zostaną naprawione, mogą spowodować śmierć komórki. Ze względu na ich potencjał cytotoksyczny, kilka środków indukujących ICL jest obecnie stosowanych jako środki chemioterapeutyczne w klinice. Podczas gdy czynniki tworzące ICL wykazują preferencje dla pewnych sekwencji zasad (np. 5'-TA-3' jest preferowanym miejscem sieciowania dla psoralenu), w dużej mierze indukują uszkodzenia DNA w sposób bezkrytyczny. Jednak poprzez kowalencyjne sprzężenie czynnika indukującego ICL z oligonukleotydem tworzącym triplex (TFO), który wiąże się z DNA w sposób specyficzny dla sekwencji, można osiągnąć celowe uszkodzenie DNA. Tutaj używamy TFO kowalencyjnie sprzężonego na końcu 5' z psoralem 4'-hydroksymetylo-4,5',8-trimetylopsoralenu (HMT) do wygenerowania specyficznego dla miejsca ICL na plazmidzie reporterowym mutacji do wykorzystania jako narzędzie do badania modyfikacji architektonicznej, przetwarzania i naprawy złożonych zmian DNA przez HMGB1 w komórkach ludzkich. Opisujemy techniki eksperymentalne do przygotowania ICL skierowanych przez TFO na plazmidach reporterowych oraz do badania związku HMGB1 z ICL skierowanymi na TFO w kontekście komórkowym za pomocą testów immunoprecypitacji chromatyny. Ponadto opisujemy testy superzwijania DNA w celu oceny specyficznej modyfikacji architektonicznej uszkodzonego DNA poprzez pomiar ilości zwojów superhelisów wprowadzonych na plazmid usieciowany psoralenem przez HMGB1. Techniki te mogą być wykorzystane do badania ról innych białek biorących udział w przetwarzaniu i naprawie ICL kierowanych przez TFO lub innych ukierunkowanych uszkodzeń DNA w dowolnej linii komórkowej będącej przedmiotem zainteresowania.

Wprowadzenie

Oligonukleotydy tworzące tripleksy (TFO) wiążą DNA dupleksowe w sposób specyficzny dla sekwencji poprzez wiązanie Hoogsteena z wodorem, tworząc struktury potrójnej helisy^1-5. Technologia Triplex została wykorzystana do badania różnych mechanizmów biomolekularnych, takich jak transkrypcja, naprawa uszkodzeń DNA i celowanie w geny (omówione w bibliograficznych^{źródłach 6-8}). TFO były szeroko stosowane do indukowania specyficznych dla miejsca uszkodzeń plazmidów reporterowych^9,10. Nasze laboratorium i inne wcześniej używały TFO, AG30, połączonego z cząsteczką psoralenu w celu indukowania specyficznych dla miejsca wiązań międzyniciowych DNA (ICL) w genie supF na plazmidzie pSupFG1^5,10-12. ICL są wysoce cytotoksyczne, ponieważ zmiany te kowalencyjnie sieciują dwie nici DNA, a jeśli nie zostaną naprawione, mogą blokować transkrypcję genów i utrudniać maszynerię replikacji DNA^13,14. Ze względu na ich potencjał cytotoksyczny, środki indukujące ICL są stosowane jako leki chemioterapeutyczne w leczeniu raka i innych chorób¹⁵. Jednak przetwarzanie i naprawa ICL w komórkach ludzkich nie jest dobrze poznana. W związku z tym lepsze zrozumienie mechanizmów związanych z przetwarzaniem ICL w komórkach ludzkich może pomóc w poprawie skuteczności schematów chemioterapeutycznych opartych na ICL. ICL indukowane przez TFO i ich produkty pośrednie naprawy mogą potencjalnie powodować znaczne zniekształcenia strukturalne helisy DNA. Takie zniekształcenia są prawdopodobnym celem dla białek architektonicznych, które wiążą się ze zniekształconym DNA z większym powinowactwem niż do kanonicznego dupleksowego DNA w formie B^16-20. Tutaj badaliśmy związek bardzo obfitego białka architektonicznego, HMGB1 z ICL w komórkach ludzkich za pomocą testów immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) na plazmidach usieciowanych psoralenem i zidentyfikowaliśmy rolę HMGB1 w modulowaniu topologii DNA plazmidu usieciowanego psoralenem w ludzkich lizatach komórek rakowych.

HMGB1 to bardzo obfite i wszechobecne w ekspresji niehistonowe białko architektoniczne, które wiąże się z uszkodzonym DNA i alternatywnie ustrukturyzowanymi substratami DNA o wyższym powinowactwie niż kanoniczne DNA w formie B^17-20. HMGB1 bierze udział w kilku procesach metabolicznych DNA, takich jak transkrypcja, replikacja DNA i naprawa DNA^16,21-23. Wcześniej wykazaliśmy, że HMGB1 wiąże się z ICL skierowanymi na TFO in vitro z wysokim powinowactwem²⁰. Ponadto wykazaliśmy, że brak HMGB1 zwiększył mutagenne przetwarzanie ICL skierowanych do TFO i zidentyfikowaliśmy HMGB1 jako kofaktor naprawy przez wycinanie nukleotydów (NER)^23,24. Ostatnio odkryliśmy, że HMGB1 jest związany z ICL skierowanymi przez TFO w komórkach ludzkich, a jego rekrutacja do takich zmian zależy od białka NER, XPA¹⁶. Wykazano, że ujemne superzwijanie DNA sprzyja skutecznemu usuwaniu zmian w DNA przez NER²⁵ i odkryliśmy, że HMGB1 indukuje ujemne superzwijanie preferencyjnie na skierowanych do TFO substratach plazmidowych zawierających ICL (w stosunku do substratów plazmidów nieuszkodzonych)¹⁶, zapewniając lepsze zrozumienie potencjalnej roli (ról) HMGB1 jako kofaktora NER. Przetwarzanie ICL w komórkach ludzkich nie jest w pełni zrozumiałe; w związku z tym techniki i testy opracowane w oparciu o narzędzia molekularne opisane w niniejszym dokumencie mogą prowadzić do identyfikacji dodatkowych białek zaangażowanych w naprawę ICL, które z kolei mogą służyć jako cele farmakologiczne, które można wykorzystać do poprawy skuteczności schematów chemioterapii raka.

Tutaj omówiono skuteczne podejście do oceny efektywności formowania ICL kierowanego przez TFO w plazmidowym DNA poprzez denaturację elektroforezy w żelu agarozowym. Ponadto, wykorzystując plazmidy zawierające ICL skierowane przez TFO, opisano techniki określania związku HMGB1 z plazmidami uszkodzonymi przez ICL w kontekście komórkowym przy użyciu zmodyfikowanych testów ChIP. Ponadto ustalono łatwą metodę badania modyfikacji topologicznych wprowadzanych przez białko architektoniczne HMGB1, w szczególności na uszkodzonych przez ICL substratach plazmidowych w lizatach komórek ludzkich, przeprowadzając testy superzwijania za pomocą dwuwymiarowej elektroforezy w żelu agarozowym. Opisane techniki mogą być wykorzystane do pogłębienia wiedzy na temat udziału białek naprawczych i architektonicznych DNA w przetwarzaniu ukierunkowanych uszkodzeń DNA na plazmidach w komórkach ludzkich.

Opisujemy szczegółowe protokoły tworzenia specyficznych dla miejsca PSORALEN ICL na plazmidowym DNA, a następnie plazmidowe testy ChIP i supercoilingu w celu identyfikacji białek, które wiążą się ze zmianami chorobowymi, oraz białek, które zmieniają topologię DNA. Testy te można modyfikować tak, aby działały z innymi czynnikami uszkadzającymi DNA, TFO, substratami plazmidowymi i interesującymi liniami komórkowymi ssaków. W rzeczywistości wykazaliśmy, że istnieje co najmniej jedno potencjalne unikalne i wysoce powinowactwo do wiązania TFO w każdym opisanym genie w ludzkim genomie²⁶. Jednak dla jasności opisaliśmy te techniki użycia specyficznego TFO sprzężonego z psoralenem (pAG30) na specyficznym plazmidzie reporterowym mutacji (pSupFG1) w ludzkich komórkach U2OS, jak zastosowaliśmy w Mukherjee i Vasquez, 2016¹⁶.

Protokół

1. Przygotowanie ICL skierowanych TFO na substratach plazmidowych

1. Inkubować równomolowe ilości plazmidowego DNA pSupFG1^10,11 (5 μg plazmidowego DNA jest dobrym punktem wyjścia) z TFO AG30 sprzężonym z psoralenem w 8 μl potrójnego buforu wiążącego [50% glicerolu, 10 mM Tris (pH 7,6), 10 mM MgCl₂] i dH₂O do końcowej objętości 40 μl w bursztynowej probówce. Dokładnie wymieszać, pipetując w górę i w dół. Inkubować reakcję w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 12 godzin.
2. Rozgrzej lampę UVA, aby zapewnić pełną moc wyjściową. Umieścić reakcję triplex na folii parafinowej i umieścić folię parafinową na lodzie pod lampą UVA (365 nM). Umieść filtr Mylar między lampą a reakcją.
3. Naświetlanie promieniowaniem UVA w dawce całkowitej 1,8 J/^cm2. Próbki należy przechowywać w temperaturze 4 °C do dalszego wykorzystania.
   Ostrzeżenie: Nosić odpowiednie okulary i odzież ochronną z promieniowaniem UVA.
4. Linearyzować 200 ng wyżej przygotowanego plazmidu enzymem restrykcyjnym EcoR1 w całkowitej objętości 20 μl, korzystając z dostarczonego przez producenta 10-krotnego buforu. Denaturacja enzymu na gorąco przez 20 minut w temperaturze 65 °C. Próbki należy wirować przez 10 minut w temperaturze 10 000 x g i przechowywać w temperaturze 4 °C.
5. Przygotować 50x bufor alkaliczny [1,5 M NaOH, 50 mM kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)]. Dodać 0,5 mg agarozy do 50 ml dH₂O. Zagotować do rozpuszczenia agarozy i umieścić ją w łaźni wodnej o temperaturze 50 °C.
6. Gdy temperatura rozpuszczonej agarozy spadnie do 50 °C, dodaj 1 ml 50x buforu alkalicznego, wymieszaj, a następnie wlej żel do tacki na żel. Przed użyciem odczekaj czas, aż żel stężeje w temperaturze pokojowej.
7. Dodać 4 μl 0,5 M EDTA do 20 μl zlinearyzowanej próbki DNA i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
8. Dodać 6x alkaliczny bufor ładujący żel (300 mM NaOH, 6 mM EDTA, 18% (w/v) polisacharydu o wysokiej masie cząsteczkowej, 0,06% zieleni bromokrezolowej w dH₂O) do próbek i do drabinki DNA 1 kb.
   UWAGA: Ważne jest, aby używać 6x bufora ładującego żel alkaliczny, zobacz dyskusję.
9. Załaduj próbki do żelu w chłodni i uruchom przez noc w 1x buforze alkalicznym (12-16 godzin) przy napięciu 3,2 V na cm. Gdy próbki dostaną się do żelu, umieść szklaną płytkę na żelu, aby zapobiec jego unoszeniu się na wodzie.
10. Zneutralizować próbki, mocząc żel w buforze neutralizacyjnym [1 M Tris-Cl (pH 7,6), 1,5 M NaCl, 3 M octan sodu (pH 5,2)] przez 45 minut w temperaturze pokojowej.
11. Wybarwić żel do DNA 4 μl 1% bromku etydyny (EtBr) w 50 ml wody przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Odplamić wodą przez 15 min. Wizualizacja DNA za pomocą systemu obrazowania.
    Uwaga: EtBr jest silnym mutagenem i może być wchłaniany przez skórę. Unikaj bezpośredniego kontaktu z EtBr.

2. Transfekcja i immunoprecypitacja plazmidów zawierających ICL kierowanych TFO w komórkach ludzkich

1. Płytka 400 000 komórek ssaków (np. komórek kostniakomięsaka U2OS) na 60 mm szalka w zmodyfikowanym pożywce Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) bez antybiotyków na 24 godziny przed transfekcją. Inkubować komórki przez noc w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ .
2. Przed transfekcją ciepłe podłoża wzrostowe i sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) do temperatury 37 °C w łaźni wodnej. Ogrzej odczynnik do transfekcji do temperatury pokojowej.
3. Inkubować 30 μl odczynnika do transfekcji z 500 μl 1x pożywki wzrostowej (mix 1) i 2 μg plazmidów zawierających ICL skierowanych TFO w 500 μl 1x pożywki wzrostowej (mix 2) w oddzielnych probówkach okrągłodennych o pojemności 14 ml przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
4. Dodaj mieszankę 1 do mieszanki 2, dobrze wymieszaj, pipetując w górę iw dół. Inkubować przez 25-30 minut w temperaturze pokojowej.
5. Umyj komórki dwukrotnie ciepłym PBS. Dodaj mieszankę do transfekcji kroplami, równomiernie rozprowadzając na płytce komórek. Dodać 1 ml pożywki wzrostowej do płytki i doprowadzić końcową objętość do 2 ml. Dobrze wymieszaj. Umieścić płytki hodowlane w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO₂ na 4 godziny.
6. Zastąp pożywkę 3 ml pożywki wzrostowej uzupełnionej 10% FBS i kontynuuj inkubację przez 16 godzin. Nie należy stosować antybiotyków.
7. Potraktuj komórki 80 μl 37% świeżego formaldehydu na płytkę do końcowego stężenia około 1% i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej przy braku światła.
   Uwaga: Formaldehyd jest toksyczny i należy obchodzić się z nim zgodnie z instrukcjami bezpieczeństwa. Narażenie na formaldehyd może powodować szkody dla skóry, oczu i dróg oddechowych.
8. Usieciowanie formaldehydu należy ugasić, dodając 300 μl schłodzonej glicyny (dostarczanej w dostępnych na rynku zestawach) na płytkę i inkubując przez 5 minut. Usunąć pożywkę i przemyć dwukrotnie schłodzonym PBS, a następnie zebrać komórki, zeskrobując 1 ml schłodzonego (4 °C) PBS do probówki mikrowirówkowej. Próbki należy zawsze przechowywać na lodzie.
9. Przygotować granulki komórkowe przez odwirowanie w temperaturze 4 °C przez 5 minut przy 13 400 x g przy użyciu wirówki stołowej z chłodzeniem. Odpipetować supernatant i umieścić osad komórkowy na lodzie.
10. Jednorodnie zawiesić osad w 1 ml schłodzonego (4 °C) buforu A (dostarczanym w dostępnych na rynku zestawach) i inkubować na lodzie przez 10 minut. Mieszać od czasu do czasu, odwracając probówkę. Ogniwa peletowe jak poprzednio (patrz krok 2.9 powyżej).
11. Jednorodnie zawiesić osad w 1 ml schłodzonego (4 °C) buforu B (dostarczanym w dostępnych na rynku zestawach) i inkubować na lodzie przez 10 minut, od czasu do czasu mieszając przez odwrócenie. Osadzanie komórek przez odwirowanie jak poprzednio (patrz krok 2.9 powyżej).
12. Ponownie zawiesić komórki w 200 μl schłodzonego buforu B. Dodać 2 μl nukleazy mikrokokowej (MNazy) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Od czasu do czasu mieszać reakcję, przesuwając probówkę. Zatrzymaj reakcję MNazy, umieszczając probówkę na lodzie i dodając 40 mM EDTA. Ogniwa peletowe jak poprzednio (patrz krok 2.9 powyżej).
13. Zawieś komórki w 100 μl 1x buforze buforu immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) (dostarczanym w dostępnych na rynku zestawach) uzupełnionym koktajlem inhibitorów proteazy.
14. Umieść zawieszone komórki w cienkościennej probówce do mikrofuge. Sonikować próbki, unosząc je na sonikatorze w łaźni wodnej przez 20 sekund, a następnie inkubując przez 20 sekund na lodzie. Powtórz kroki sonikacji 9 razy, aby wygenerować fragmenty o wartości ~800-1,200 pz.
    1. Do 20 μl sonizowanych próbek dodać 3 μl 5 M NaCl i 1 μl RNazy A. Dobrze wymieszać przez wirowanie i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 min. Następnie dodać 2 μl proteinazy K i inkubować przez 2 godziny w temperaturze 65 °C. Oczyścić próbki za pomocą zestawu do oczyszczania PCR. Uruchom próbki na 1% żelu agarozowym i wizualizuj za pomocą EtBr.
       UWAGA: Maksymalna intensywność otrzymanego DNA powinna wynosić 1,000 pz lub mniej.
15. W trzech oddzielnych probówkach dodaj 30 μl lizatu do wstępnie schłodzonej silikonowanej probówki, a następnie dodaj 70 μl schłodzonego buforu 1x ChIP z dodatkiem inhibitorów proteazy. Dodać 1 μg przeciwciał antyimmunoglobuliny G (IgG), antyhistonu H3 (jako kontrola pozytywna) lub przeciwciał anty-HMGB1 do odpowiednich probówek. Inkubować przez noc w chłodnym pomieszczeniu z ciągłą rotacją.
16. Zawiesić kulki białka G równomiernie w chłodni. Dodać 4 μl kulek białka G do probówki i inkubować przez kolejne 2-4 godziny w chłodni z rotacją.
17. Za pomocą stojaka magnetycznego obierz kulki i usuń supernatant. Dodać 200 μl 1x bufor ChIP zmieszany z koktajlem inhibitorów proteazy do granulatu i myć przez 5 minut w chłodni z rotacją. Powtórz pranie dwa razy.
18. Wykonaj jedno dodatkowe przemycie 1x buforem ChIP o wysokiej zawartości soli (zawierającym 70 mM NaCl).
19. Zawiesić osady za pomocą buforu elucyjnego o pojemności 160 μl (dostarczanego w dostępnych na rynku zestawach) i inkubować w temperaturze 37 °C z rotacją przez 30 minut.
20. Granuluj kulki i zbierz supernatant do świeżej probówki. Dodać 6 μl 5 M NaCl i 2 μl proteinazy K i inkubować przez noc w temperaturze 65 °C.
21. Oczyść DNA za pomocą zestawu do oczyszczania produktu PCR i eluuj DNA za pomocą 50 μl dH₂O.
22. Przeprowadzić reakcje PCR¹⁶ przy użyciu zestawów starterów do obszaru (regionów) zainteresowania i rozpuścić produkty na 1% żelu agarozowym barwionym EtBr.

3. Test superzwijania i 2-wymiarowa elektroforeza w żelu agarozowym

1. Przygotować bufor do syntezy naprawy DNA (45 mM Hepes-KOH, pH 7,8; 70 mM KCl; 7,4 mM MgCl₂; 0,9 mM DTT; 0,4 mM EDTA; 2 mM ATP, 20 μM dNTPs, 3,4% glicerolu i 18 μg albuminy surowicy bydlęcej). Przechowywać w temperaturze -80 °C. Rozmrozić na lodzie i przed użyciem dodać 40 mM fosfokreatyny i 2,5 μg fosfokinazy kreatyny.
2. Przygotuj 10x bufor supercoiling [500 mM Tris (pH 8,0), 500 mM NaCl, 25 mM MgCl₂, 1 mM EDTA] i przechowuj w temperaturze pokojowej.
3. Linearyzuj 300 ng superskręconego plazmidowego DNA pSupFG1 całkowicie przy użyciu 1 μl topoizomerazy krowianki I (5-15 U / μl) z 1x buforem superzwijającym w reakcji 10 μl. Inkubować mieszaninę w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
4. Rozmrozić bezkomórkowy ekstrakt^{HeLa 24} na lodzie. Do całkowicie zrelaksowanych plazmidów dodaj 25 μl bezkomórkowego ekstraktu HeLa i bufor syntezy naprawy DNA. Dobrze wymieszaj. Dodać dodatkowo 1 μl topoizomerazy krowianki I do mieszanki i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
5. Zakończ reakcje, dodając dodecylosiarczan sodu (SDS) (1% stężenie końcowe) i proteinazę K (stężenie końcowe 0,25 mg/ml). Inkubować w temperaturze 65 °C przez 2 godziny.
6. Odlej 1% żel agarozowy z 1x buforem Tris Borate EDTA (TBE). Dodaj barwnik ładujący DNA i załaduj reakcje bezpośrednio na żel w odległości co najmniej 4 pasów od siebie. Uruchom żel przez 8-10 godzin przy 2 V/cm w 1x TBE (wymiar 1) w temperaturze pokojowej, aby rozpuścić topoizomery.
   UWAGA: Przygotować 5 x roztwór podstawowy TBE w 1 L dH₂O, dodając 54 g zasady Tris. 27,5 g kwasu borowego i 20 ml 0,5 M EDTA (pH 8,0).
7. Przygotować 2 l 1x TBE z 3 μg/ml fosforanu chlorochiny. Namocz żel w 200 ml tego roztworu przez 20 minut. Przykryj tackę na żel folią aluminiową.
8. Aby elektroforezować żel w drugim wymiarze, obróć żel o 90° w kierunku zgodnym z ruchem wskazówek zegara i uruchom go na 4-6 godzin przy 2 V/cm w chlorochinie zawierającej 1x TBE, aby rozdzielić dodatnie i ujemne supercewki.
9. Zabarwić żel EtBr przez 1 godzinę na bujaku. Odbarwić żel za pomocą_dH2O przez 15 minut, a następnie zobrazować rozkład termiczny topoizomerów za pomocą imagera.

Wyniki

Tworzenie ICL kierowanego przez TFO jest kluczowe dla testów opartych na plazmidach, które są używane do badania ról białek architektonicznych w przetwarzaniu ICL w komórkach ludzkich. Denaturyzacja elektroforezy w żelu agarozowym jest łatwym sposobem określenia skuteczności tworzenia ICL kierowanego przez TFO. Plazmidy zawierające ICL skierowane przez TFO migrują z wolniejszą ruchliwością przez matrycę żelu agarozowego (Figura 1A, tor 3) w porównaniu z nieusieciowanymi p...

Dyskusja

Skuteczne tworzenie ICL skierowanych do TFO zależy od dwóch kluczowych czynników: po pierwsze, odpowiednich składników buforowych (np. MgCl₂) i czasu inkubacji TFO z docelowym substratem DNA (w zależności od powinowactwa wiązania TFO do docelowego dupleksu i zastosowanych stężeń); a po drugie, odpowiednia dawka promieniowania UVA (365 nm) w celu skutecznego tworzenia wiązań krzyżowych psoralenu. Optymalne tworzenie triplex można osiągnąć za pomocą HPLC lub oczyszczonych żelem TFO. Zanieczyszczenia zan...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
5'HMT Psoralen-AG30	Midland Certified Reagent Co., Midland, TX	Na zamówienie HPLC	(lub żel) oczyszczony
prosty zestaw chromatyny enzymatycznej ChIP	Signaling Inc.	9003	Sugerowany przez producenta protokół jest zoptymalizowany pod kątem IP chromatyny, a nie dla IP plazmidu. Kontrolne przeciwciała IgG i H3, a także kulki białka G i nukleaza mikrokokkowa są dostarczane przez producenta.
GoTaq Green	Promega	M7122	PCR master mix
Przeciwciało HMGB1	Abcam	Ab18256
Wizard Gel i zestaw do czyszczenia PCR	Promega	A9281
Sól difosforanowa chlorochiny	Sigma	C6628-50G	Do dwuwymiarowej elektroforezy w żelu agarozowym
EcoRI	New England BioLabs	R0101S
Odczynnik do transfekcji GenePORTER	Genlantis	T201015
Vaccinia Topoisomerase I	Invitrogen	38042-024
Długofalowa lampa ultrafioletowa Blak-Ray	Upland, CA	B 100 AP	Lampa UVA
EpiSonic Multi-Functional Bioprocessor 1100 Epigentek		EQC-1100	Sonikator do kąpieli wodnej
Filtr Mylar	GE Healthcare Nauki przyrodnicze
Agaroza	Sigma-Aldrich	A6111
BIO-RAD Chemidoc	System BIO-RAD	XRS+	System obrazowania DNA
Glicyna	Fisher Scientific	BP381-500
37% Formaldehyd	Sigma-Aldrich	F8775-25ML	Służy do sieciowania
Proteinaza K	New England Biolabs	P8107S
DMEM	ThermoFisher	11965092	Pożywki do hodowli komórkowych
PBS	ThermoFisher	70013073	Hodowla komórkowa
Trypsyna-EDTA	ThermoFisher	25200056	Hodowla komórkowa
Bromokrazol zielony	Sigma-Aldrich	114-359	Barwnik ładujący DNA
Rurki silikonowane	Fisher Naukowy	02-681-320	Rurka do mikrofugi o niskiej retencji
Podstawa Tris	Fisher Scientific	BP152-1
Kwas borowy	Fisher Scientific	A74-1
EDTA	Fisher Scientific BP24731
Fotometr	InternationalLight Technologies	ILT1400-A	Pomiar dawki UVA
Linie komórkowe
Kostniakomięsak ludzki U2OS	ATCC	ATCC HTB-96	Hodowany według dostawcy rekomendacja
Ludzki gruczolakorak szyjki macicy HeLa	ATCC	ATCC-CCL-2	Hodowany według dostawcy s rekomendacja
Proksymalny starter do przodu	5′-gcc ccc ctg acg agc atc ac
Proksymalny starter odwrotny	5′-tag tta ccg gat aag gcg cag cgg
Dystalny starter do przodu	5′-aat acc gcg cca cat agc Ag
Dystalny podkład odwrotny	5′-agt att caa cat ttc cgt gtc gcc